STORIA

1919: Levene scopre il ribosio (zucchero dell’RNA) e il desossiribosio (zucchero del DNA).

Agli inizi degli anni Quaranta era noto che i geni determinano i La prova decisiva fu fornita nel 1952
caratteri ereditari e che sono localizzati sui cromosomi ma non da Hershey e Chase che dimostrarono
se ne conosceva l’esatta natura chimica. Poiché si sapeva che i che i batteriofagi, per introdurre nel
cromosomi sono costituiti principalmente da DNA e proteine, il batterio ospite il loro materiale
depositario dell’informazione biologica doveva essere una di ereditario, iniettano una molecola di
queste due molecole. DNA
 L’esperimento di Frederick Griffith (biologo inglese) fu uno dei primi esperimenti a suggerire che i batteri sono in grado di
trasferire informazioni genetiche attraverso un processo noto come trasformazione.

I batteri innocui si trasformavano nella forma

patogena in grado di causare la malattia, QUINDI
tutti i discendenti dei batteri ereditavano la
capacità di trasmettere la malattia

Egli concluse che mettendo a coltivare batteri

innocui in un terreno in cui si trovano batteri
patogeni (anche se morti), i primi ereditano il
DNA dei secondi e diventano patogeni.
 HERSHEY E CHASE ESPERIMENTO: TRASDUZIONE

Usarono isotopi radioattivi diversi per marcare il DNA e le proteine del fago T2 (involucro proteico e DNA) .
Allevarono il fago e le cellule di Escherichia coli (batterio) in una soluzione di zolfo radioattivo e poi un altro gruppo di fagi in una
soluzione di fosforo radioattivo.
Fecero infettare dai due gruppi di virus due differenti gruppi di batteri e frullarono le due colture.
Centrifugarono i campioni ottenuti e misurarono la radioattività nel liquido sovrastante e nel precipitato. Il fago T2 inietta il
proprio DNA nella cellula ospite, lasciando all’esterno tutte le proteine.

Dimostrarono che
erano proprio le
molecole di DNA
iniettate a indurre
un’ulteriore
produzione virali.
Dunque tutte le
istruzioni
necessario per
produrre nuovi fagi
dovevano essere
contenute nel DNA.
 WATSON E 1951

CRICK
Grazie
Grazie ad
ad altre
altre ricerche,
ricerche, tra
tra cui
cui le
le fotografie
fotografie del
del DNA
DNA di
di Rosalind
Rosalind
Franklin
Franklin ottenute
ottenute grazie
grazie alla
alla tecnica
tecnica della
della cristallografia
cristallografia aa raggi
raggi x,
x,
costruirono
costruirono la la doppia
doppia elica
elica de
de DNA.
DNA.
Vinsero
Vinsero ilil premio
premio Nobel
Nobel della
della Medicina.
Medicina.
 REGOLAZIONE
Tutte le cellule, dalle più semplici alle più complesse, possiedono moltissimi geni, ma in nessuno caso

DELL’ESPRESSIONE GENICA
vengono tutti espressi contemporaneamente. Ogni cellula, infatti, svolge le sue attività in maniera coordinata,
traducendo in proteine solo i geni necessari a seconda delle circostanze.

Grazie all’insieme di meccanismi chiamati «regolazione genica» la cellula riesce a

capire quali geni devono essere espressi e quali devono rimanere silenti.

Per comprendere questi

meccanismi, uno degli organismi più
studiati è il batterio Escherichia coli.
Questo organismo utilizza di solito il
glucosio, ma in mancanza di questo
composto può sfruttare anche il
lattosio. Per utilizzare questo
zucchero, sono necessari degli
enzimi che in condizioni normali
sono praticamente assenti nella
cellula batterica e vengono
sintetizzati solo quando il lattosio è
presente nell’ambiente al posto del
glucosio.
 NEI PROCARIOTI
Nei procarioti, la regolazione genica avviene essenzialmente a livello della trascrizione. Essa è controllata da
specifiche proteine di regolazione, codificate da geni regolatori, che possono agire come repressori (si lega al
DNA e blocca la trascrizione del gene) o attivatori.

L’efficienza e la semplicità di questo sistema di controllo dipendono anche dal fatto che nei procarioti, mancano il
nucleo, la trascrizione è strettamente accoppiata alla traduzione, per cui l’mRNA inizia essere tradotto dai ribosomi
prima ancora che ola sua sintesi sia terminata.
 IL MODELLO
DELL’OPERONE
Il sistema più noto di regolazione genica nei procarioti è rappresentato dal modello dell’operone, individuato negli anni sessanta
da Jacob e Monod.
Un operone è un tratto del cromosoma batterico costituito da un promotore, un operatore e uno o più geni strutturali. Il
promotore è il sito di attacco dell’RNA polimerasi; l’operatore segue il promotore.

Sono noti due tipi di operoni:

OPERONI INDUCIBILI:
grazie a questi gli enzimi
vengono sintetizzati solo
quando è presente il loro
substrato e quindi soltanto
quando sono
effettivamente necessari.
OPERONI REPRIMIBILI
Un esempio è l’operone-lac che contiene i tre geni necessari per
l’utilizzazione del lattosio in Escherichia coli. In assenza di lattosio,
l’operone è inattivo e i tre geni non vengono espressi. In presenza di
lattosio, l’RNA polimerasi può così legarsi al promotore e trascrivere i tre
geni in blocco, formando un’unica molecola di mRNA
Un esempio è l’operone-trp che è attivo in assenza dell’amminoacido
triptofano per sintetizzarlo. Quando il triptofano è presente, la
produzione degli enzimi cessa bruscamente.
 NEGLI EUCARIOTI
La regolazione dell’espressione genica negli eucarioti è diversa e più articolata di quella dei procarioti poiché il
materiale genetico degli eucarioti è molto più complesso di quello dei procarioti.
Si trova alla base di molti processi come il differenziamento cellulare
(specializzazione delle cellule per compiti diversi).

CONTROLLO
CONFORMAZIONALE:
La cromatina si presenta in
due forme: eucromatina
(poco condensata) e
eterocromatina (più
condensata).
L’eterocromatina non viene
trascritta perché è troppo
compatta mentre
l’eucromatina si poiché più
accessibile come stampo.
 CONTROLLO DELLA
TRASCRIZIONE
Il controllo della trascrizione è legato a modifiche chimica a carico del DNA:
Questo processo coinvolge la metilazione (modificazione del gruppo metile del DNA) di alcuni
nucleotidi di citosina nelle sequenze geniche che non vengono trascritte

MOLTI TUMORI SONO ASSOCIATI ALLA PRESENZA DI

VARIAZIONI ANOMALE NELLA METILAZIONE DEL DNA

La trascrizione dipende anche dalla presenza di particolari sequenze dette

intensificatori (o enhancer), poste a volte anche a grande distanza dal gene
trascritto, che aumentano notevolmente la velocità di sintesi dell’RNA.

Elementi analoghi agli enhacer sono i silencer

che agiscono a distanza inibendo la
trascrizione.
La regolazione della trascrizione coinvolge
proteine regolatrici dette fattori di trascrizione
che possono fungere da attivatori o inibitori
 EPIGENETICA
L’epigenetica riguarda i meccanismi di controllo dell’attività genica.
Una di queste, la metilazione, agisce direttamente a livello del DNA; altre agiscono sugli istoni o su altri enzimi

Le modifiche epigenetiche hanno un

ruolo importante in alcune patologie
dell’uomo. Attualmente si ritiene che
questi meccanismi siano coinvolti nello
sviluppo embrionale, nella
differenziazione delle cellule staminali,
nell’origine dei tumori e nell’attività del
sistema immunitari. E’ noto inoltre che
nelle piante meccanismi epigenetici
controllano la fioritura e lo sviluppo dal
seme alla pianta.
 BIOLOGIA DEI
SISTEMI
L’espressione genica determina le caratteristiche delle cellule, dei tessuti e dei vari stadi di sviluppo.
Per analizzare quali geni sono espressi nelle cellule in funzione del tipo di tessuto si ricorre alla BIOLOGIA DEI
SISTEMI: insieme dei metodi di analisi che permette di ottenere un quadro globale di come l’espressione genica
regoli le funzioni di una cellula.
1. TRASCRITTOMA> contenuto di mRNA di una cellula
2. PROTEOMA> insieme di proteine di una cellula
3. METABOLOMA> insieme dei metaboliti di una cellula
4. PROTO-ONCOGENI> possono essere inseriti nel genoma dai virus e possono codificare per fattori di crescita. Il
processo di integrazione dei geni proto-oncogeni è detto trasduzione

GENI OMEOTICI: Regolano altri geni

determinando quali parti del corpo si
svilupperanno in ogni regione dando vita a
organismi diversi dal loro stadio naturale
 Prima di lasciare il nucleo, l’RNA subisce modifiche post-trascrizionali in un processo chiamato mutazione dell’RNA.

Le due estremità vengono modificate>aggiunta di due nucleotidi

chiamati cappuccio e coda che aiutano i ribosomi nel
riconoscimento della molecola e proteggono l’RNA dall’attacco di
enzimi.

Gli introni vengono rimossi, così rimangono solo gli esoni. Questo
spiega come il genoma umano, pur avendo un basso numero di
geni codificanti, ha tanti geni (SPLICING ALTERNATIVO)

Viene controllato il microRNA

I polipeptidi, controllati dalla cellula, vengono modificati per poi

ottenere le proteine attraverso il CLIVAGGIO (taglio di una parte
del polipeptide).
 SPIRALIZZAZIONE
DEL DNA
A differenza di quello dei procarioti, il DNA degli eucarioti è sempre associato a proteine di vario tipo. Il
complesso formato da DNA e proteine è detto cromatina

LE PROTEINE PIU ABBONDANTI SONO GLI ISTONI: PICCOLE PROTEINE CARICHE

POSITIVAMENTE (LEGATE TRA LORO ELETTROSTATICAMENTE) CHE SI LEGANO
AL DNA, CARICO NEGATIVAMENTE. LA FUNZIONE DEGLI ISTONI E’ QUELLA DI
AVVOLGERE E COMPATTARE I LUNGHISSIMI FILAMENTE DI DNA IN MODO TALE
DA POTERLI CONTENERE NEL RISTRETTO SPAZIO NUCLEARE. IL DNA SI AVVOLGE
INTORNO A GRUPPI DI OTTO ISTONI, FORMANDO I NUCLEOSOMI UNITI TRA
LORO ATTRAVERSO I LINKER.

Il DNA di un singolo cromosoma è molto più grande del nucleo però quest’ultimo riesce a contenerlo grazie
al sistema di spiralizzazione: ripiegamento e avvolgimento di ciascun cromosoma.
 LE BIOTECNOLOGIE
Insieme di tecniche di biologia molecolare e genetica molecolare (anche chiamate ingegneria genetica) sviluppatesi a partire
dagli anni 70 del XX secolo (1978) con cui manipolare organismi e il DNA per produrre sostanze utili in ambiente medico-
farmaceutico, alimentare, agricolo, ecc…

ES: fermentazione, produzione

Si tratta di applicazioni tecnologiche di fenomeni naturali: sono derivate da processi
di insulina, OGM, vaccini,
naturali, sfruttano le proprietà biologiche delle molecole (DNA, RNA, proteine) e i
pesticidi, enzimi industriali,
processi fisiologici (replicazione de DNA, risposta immunitaria ecc).
microorganismi, animali e
piante con particolari
caratteristiche come la
resistenza alla muffa o al gelo,
cloni (es. maiali per le valvole
cardiache)

TECNICHE DI UTILIZZO
DNA RICOMBINANTE: Ottenuto artificialmente assemblando
diverse sequenze nucleotidiche per ottenere una nuova molecola
di DNA
MAPPE DI RESTRIZIONE
LIBRERIE GENOMICHE
CNOLOGIE DEL DNA RICOMBINA
Gli strumenti di un ingegnere genico sono:
 Enzimi di restrizione: minuscole forbici che tagliano il DNA in punti specifici per ottenere breve tratti di DNA contenenti i geni
che si vogliono studiare
 Enzima DNA ligasi: una colla molecolare che lega i frammenti di DNA
 I vettori: plasmidi (anelli di DNA contenuti nei batteri capaci di passare da un batterio all’altro) e i virus capaci di entrare nelle
cellule e trasportare il DNA
 DNA polimerasi: enzima che funziona come una fotocopiatrice perché consente di produrre molte copie di DNA ricombinante
 ENZIMI DI RESTRIZIONE
Forbici speciali naturalmente prodotti dai batteri per proteggersi dall’intrusione di eventuali DNA esterni.
RESTRIZIONE= questi enzimi causano la limitazione (restrinction) delle possibilità di crescita dei virus e tagliano il DNA
virale distruggendolo

SCOPERTA:
Agiscono solo sul DNA esterno che viene fatto a pezzi tramite un sistema che
Per caso alcuni scienziati scoprirono per
ne restringe (ovvero ne limita) le capacità di infettare il batterio.
caso questi enzimi nei batteri (anni 60), li
Vengono formati frammenti di lunghezza variabile (frammenti di restrizione).
isolarono e iniziarono ad utilizzarli nelle
Ognuno di questi taglia il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche dette
biotecnologie. Oggi ne sono noti più di 300.
siti di restrizione. Sono forbici molto precise e agiscono sempre su sequenze
Nel 1978 Smith, Arber e Nathans vinsero il
chiamate palindromi che si leggono ugualmente sia da destra che da sinistra
premio Nobel per la medicina.
in base alla direzione 5’3’ o 3’5’
 SHOTGUN CLONING
Clonazione rapida, da mitragliatrice

Gli enzimi di restrizione più comuni sono le endonucleasi di tipo II che riconoscono certe sequenze palindromiche.
La maggior parte di questi enzimi opera effettuando un taglio sfalsato, alle estremità delle sequenze formando estremità adesive.

ESTREMITA’ ADESIVE o COESIVE:

Alcuni enzimi di restrizione
operano tagli netti in entrambi i
filamenti di DNA, altri, più
interessanti ai fini
dell’ingegneria genetica, tagliano
i due filamenti con uno scarto di
alcuni nucleotidi che sono
spaiati su ciascuna estremità
complementare del taglio detta
estremità adesiva.

La DNA ligasi (collante) permette di formare i legami tra i

frammenti formando una nuova molecola di DNA
ricombinante con una nuova sequenza di geni
 GENETICA DEI
o Non sono esseri viventi in quanto sono acellulari

VIRUS
o Non sono in grado di riprodursi da soli;
o Sono parassiti obbligati endocellulari -> per riprodursi devono entrare in una cellula
o Sono entità formate da un solo acido nucleico racchiuso da un involucro (RNA o DNA).

La riproduzione di un virus può avvenire in più modi: in alcuni

casi entrano nella cellula che, replicando il materiale genetico,
riproduce il virus; in altri casi il virus infetta la cellula, ma non si
riproduce fino ad un certo momento.
Per le cellule tumorali parte del materiale genetico del virus si
integra con quello della cellula modificandola.

STORIA
Nel 1892 il russo Ivanowski notò
che le foglie di tabacco si coloravano di
giallo , e frullandole e poi filtrandole
ottenne dalle foglie un liquido
giallognolo: il giallume delle foglie.
I virus sono quasi sempre letali a differenza dei batteri; vengono utilizzati come veicoli per
gli esperimenti di modificazione genetica, attaccano solo determinate cellule, che
riconoscone tramite dei reattori presenti sulla membrana cellulare.

Composti da capside (involucro

proteico esterno) e talvolta il
pericapside (involucro di natura
lipidica) formato da spicule
(filamenti di natura proteica)
che racchiudono l’acido
nucleico.

Presentano una dimensione dell'ordine di grandezza

dei nanometri, generalmente compresa tra i 20 e i
300 nm, i più grandi possono raggiungere i 450 nm.
• VIRUS DNA NUDI
• adenovirus = infetta le cellule di rivestimento e le vie
respiratorie;
• papilloma virus = causa verruche su mani e piedi;
• parvovirus = attacca l’apparato digerente e causa
gastroenterite.
• VIRUS A RNA CON PERICAPSIDE
• Rubivirus: provoca la rosolia;
• Paramixovirus: virus influenzali, della parotite e del
morbillo;
• Morbillivirus: causa il morbillo e la peste bovina;
• Vesciculovirus: infetta vertebrati e insetti causando la
stomatite vescicolare. Inoltre sono in corso esperimenti
sul suo utilizzo nella preparazione di vaccini o nella
terapia oncologica.
• Lyssavirus: è il virus della rabbia
• Epatite A/B/C
• VIRUS DNA CON PERICAPSIDE
HERPES VIRUS
• simplex 1 = causa herpes labiali;
• simplex 2 = herpes labiali e mucose
• zooster = causa varicella e fuoco di Sant’Antonio, determinando
immunità permanente
• epestein Barr = è pericoloso per le cellule del fegato, causa
monunucleosi
• citomegalovirus = non molto pericoloso tranne per le donne
incinta , va a colpite il feto e determina malformazioni
(teratogena).
• VIRUS A RNA NUDI
• Esterovirus: causa gastroenteriti e meningiti;
• Rhinovirus: causa riniti;
• Reavirus e colicivirus: causano gastroenteriti;
• Virus delle zecche: provoca gastroenteriti.
 VIROIDI
Agenti patogeni costituiti da
piccole molecole circolari di RNA a
singolo filamento. Sono noti
soltanto nelle piante, dove
provocano numerose malattie;
possono essere trasmessi da una
pianta all’altra attraverso il contatto
con lesioni infette oppure da una
generazione a quelle successive.
Non sono noti i meccanismi che permettono a viroidi e prioni di esercitare un effetto patogeno.
PRIONI
Particelle di natura esclusivamente proteica (no
acido nucleico) responsabili di malattie che
colpiscono il sistema nervoso. Sono note forme
che colpiscono gli animali come l’encefalopatia
spongiforme bovina ma anche gli uomini come la
malattia di Jakob-Creutzfeldt caratterizzata da
demenza, scosse muscolari di tipo epilettico e
degenerazione del sistema nervoso, fino alla
morte. Il cosiddetto morbo della mucca pazza è
una variante della malattia di Jakob-Creutzfeldt
che può essere trasmessa all’uomo da mucche
affette da encefalopatia spongiforme bovina.
 HIV E’ un virus emergente (sconosciuto) come l’ebola
Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) è l'agente responsabile della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS).
È un retrovirus del genere lentivirus, caratterizzato dal dare origine a infezioni croniche, che
evolvono lentamente ma progressivamente e che, se non trattate, possono avere un esito
fatale.
Il virus presenta diverse modalità di trasmissione:
• sessuale;
• ematica;
• verticale (madre-figlio).
La più diffusa (85%) è quella sessuale seguita dal contatto
con sangue o emoderivati infetti.

In base alle conoscenze attuali, HIV è suddiviso in due

ceppi: HIV-1 e HIV-2.
Il primo dei due è prevalentemente localizzato in
Europa, America e Africa centrale.
HIV-2, invece, si trova per lo più in Africa occidentale
e Asia e determina una sindrome clinicamente più
moderata rispetto al ceppo precedente.
 AIDS
La malattia interferisce con il sistema immunitario limitandone l'efficacia, rendendo le persone colpite più
suscettibili alle infezioni e allo sviluppo di tumori. Questa vulnerabilità aumenta con il progredire della
malattia. Anche se i trattamenti per l'HIV/AIDS possono rallentare o arrestare il decorso della malattia, non
vi è cura conosciuta o vaccino contro l'HIV. Per fini pratici l'infezione venne suddivisa in tre stadi, di facile
applicazione ma estremamente grossolani
1. infezione acuta
2. stadio di latenza clinica
3. stadio sintomatico. Solo con l'ultimo stadio, in cui la sindrome inizia a manifestarsi
con infezioni opportunistiche, si parla di immunodeficienza e
quindi di AIDS.
 MENINGITE
La meningite è un’infiammazione delle membrane (le
meningi) che avvolgono il cervello e il midollo spinale. La
malattia è generalmente di origine infettiva e può essere
virale, batterica o causata da funghi. La forma virale, detta
anche meningite asettica, è quella più comune: di solito non
ha conseguenze gravi e si risolve nell’arco di 7-10 giorni. I
sintomi della meningite sono indipendenti dal germe che
causa la malattia. All'inizio i sintomi possono essere
aspecifici: sonnolenza, cefalea, inappetenza. In genere dopo
2-3 giorni peggiorano e compaiono nausea e vomito,
febbre, pallore, fotosensibilità. Per le meningiti virali, non
c'è cura antibiotica, ma i sintomi si risolvono di solito nel
corso di una settimana, senza necessità di alcuna terapia
specifica. 
 INFEZIONE DELLA
CELLULA OSPITE
I virus possono entrare nelle cellule ospiti in diversi modi: la maggior parte inietta nella cellula solo il proprio acido nucleico;
altri entrano invece per intero nella cellula, liberando il loro acido nucleico solamente una volta entrati.
Una volta penetrato all’interno della cellula ospite, il virus deve essenzialmente:
1. Replicare il proprio genoma
2. Produrre proteine
3. Autoassemblarsi: consente la produzione di centinaia di nuovi virus

REPLICAZIONE DEL GENOMA: dipende dal tipo di acido nucleico virale

VIRUS A DNA> Il DNA virale si replica normalmente e viene trascritto sotto forma di mRNA
VIRUS A RNA> In alcuni l’acido nucleico è replicato da un enzima detto RNA replicasi; in altri detti retrovirus avviene grazie alla
trascrittasi inversa.

I virus completi fuoriescono dalla cellula ospite attraverso la lisi

(distruzione) della cellula infettata oppure possono essere espulsi
mediante un processo simile all’esocitosi che permette la
moltiplicazione virale senza uccidere la cellula ospite.
 CICLO LITICO E
Alcuni batteriofagi (virus che attaccano batteri), una volta penetrati nella cellula ospite, possono dar luogo a due tipi di cicli

LISOGENO
Entrambi i cicli cominciano con l'iniezione dell'acido nucleico virale nella cellula ospite. Questa fase rappresenta un bivio tra i
due possibili cicli.

CICLO LITICO> distruzione cellula ospite CICLO LISOGENO> NON distruzione cellula ospite
Nel ciclo litico il genoma virale prende il controllo della Nel ciclo lisogeno il genoma virale, invece, si integra nel DNA
cellula ospite inducendola a sintetizzare nuovo acido nucleico dell’ospite, prendendo il nome di provirus (nei batteriofagi
virale e proteine che, una volta assemblate con il genoma, profago) e causando a volte mutazioni negli eucarioti (es.
andranno a costituire nuovi virioni, i quali usciranno dalla forme tumorali, AIDS). Una volta che la cellula si duplica
cellula uccidendola (lisi) o verranno da essa secreti. viene trasmesso anche il DNA virale alle cellule figlie
formando così in un breve periodo una vasta colonia di
genomi virali senza che avvenga la lisi. Il profago può
rimanere integrato nel cromosoma batterico oppure può
fuoriuscirne, riprendendo il ciclo litico. Il passaggio dal ciclo
lisogenico a quello litico può essere spontaneo o indotto in
laboratorio da raggi X, UV o altri agenti mutogeni.
FASI:
Aggancio: si attacca alla cellula Maturazione
Spogliazione: il virus perde il rivestimento Liberazione del virus
Replicazione e costruzione di proteine virali
 COMBATTERE I
VIRUS
La maggioranza delle infezioni da virus è incurabile. In alcuni casi si riesce a trattare la malattia che provocano anche se
non si riesce a sconfiggere il virus. Sono stati sviluppati alcuni farmaci per combattere efficacemente qualche virus anche
se al momento sono pochissimi e spesso risultano avere gravi effetti collaterali

È’ molto difficile aggredire le cellule

infettate senza danneggiare anche
quelle sane. Un mezzo molto
efficace per sconfiggere un virus
sono i vaccini permettono la
prevenzione dell'infezione perché
preparano il nostro sistema
immunitario a reagire prontamente
nel momento in cui si contrae il virus
contro il quale ci siamo vaccinati.
 GENETICA DEI BATTERI
I batteri si riproducono in modo asessuato per scissione (prima di ogni divisione la loro molecola di DNA viene replicata e le
due molecole identiche con lo stesso materiale genetico (salvo mutazioni) vengono distribuite alle cellule figlie, ma possono
ricombinare i propri geni attraverso tre meccanismi: trasformazione, trasduzione e coniugazione.
TRASFORMAZIONE

E’ un processo mediante il quale il frammento di DNA, presente nell’ambiente in seguito

alla morte di una cellula batterica, penetra in un altro batterio e si integra nel genoma di
quest’ultimo, sostituendo il tratto omologo nel suo DNA e creando una nuova
combinazione di geni.
Non tutte le specie di batteri possono normalmente inglobare DNA in questo modo; quelle
in grado di farlo, dette «competenti», lo sono grazie alla presenza sulla superficie cellulare
di recettori per il DNA. I batteri che non lo sono, possono essere resi competenti con
particolari metodologie di laboratorio.
 TRASDUZIONE

Alcuni batteriofagi possono agire come vettori di geni, trasportando geni batterici da una
cellula a un’altra. Ci sono due tipi:
1. Trasduzione generalizzata: viene incorporato nel capside un frammento qualsiasi del
DNA dell’ospite
2. Trasduzione specializzata: viene trasferito un frammento di DNA batterico adiacente al
punto di inserimento del profago
 CONIUGAZIONE

Processo in cui il DNA del plasmide è trasferito da un batterio donatore ad uno ricevente
attraverso un ponte citoplasmatico formato da pili coniugativi.
Un esempio è quello del plasmide F (plasmide della fertilità) del batterio Escherichia Coli.
Le cellule di E.coli prive del plasmide F sono dette cellule F-, mentre quelle che lo contengono
sono dette F+. Durante la coniugazione tra la cellula F+ (donatore) e una F- (ricevente), la cellula
F+ replica il proprio plasmide e ne trasferisce una copia alla cellula F- tramite un pilo coniugativo
così da diventare F+.

La coniugazione è per alcuni aspetti

simile alla trasduzione ma in questo
processo i geni sono trasportati da
plasmidi anziché da virus

Il plasmide F può talvolta integrarsi nella

molecola principale di DNA detta cromosoma
batterico, trasformando la cellula F+ in cellula Hfr
 CLONAGGIO MOLECOLARE
Una delle principali applicazioni del DNA ricombinante è il clonaggio molecolare che consente di ottenere molte copie (cloni) di
uno specifico gene o segmento di DNA.

VETTORI
Quest’ultimo viene inserito in una molecola di DNA in grado di replicarsi
autonomamente (vettore di clonaggio) che solitamente è un plasmide
(vettore ricombinante o chimerico).
Vengono utilizzati i batteri perché sono facilmente coltivabili e si
riproducono velocemente (un ciclo produttivo dura circa 20 minuti). Altri
microorganismi utilizzati sono i lieviti.

TRASFORMAZIONE
Per inserire un vettore ricombinante in un batterio si ricorre alla
trasformazione batterica (acquisizione del materiale genetico presente
nell’ambiente extracellulare). Questa ha una efficienza bassa perciò viene
aiutata dai marcatori che verificano se il vettore è stato inserito: geni
reporter che determinano un particolare fenotipo facilmente riconoscibile
attraverso la resistenza ad un antibiotico o la colorazione delle colonie del
gene lacZ (enzima galattosidasi) o la luciferasi che catalizza una reazione di
bioluminescenza.
 I PLASMIDI
In molti batteri, oltre alla molecola di DNA principale (detta a volte «cromosoma batterico»), sono presenti piccole molecole
circolari di DNA, chiamate plasmidi, contenenti pochi geni che determinano caratteristiche utili alla cellula, ma non
indispensabili per la sopravvivenza (per esempio la resistenza agli antibiotici). I plasmidi si replicano in modo autonomo.
Attualmente si conoscono diversi tipi di plasmidi come il plasmide R (resistenza ai farmaci), F (della fertilità).
1. Taglio del DNA esogeno e del DNA
di un plasmide con lo stesso enzima
nei siti di restrizione
2. Isolamento del gene che si vuole
produrre
3. Costruzione del DNA ricombinante
4. Le estremità del DNA del plasmide
tagliato e quello del gene di
interesse costituiscono le estremità
adesive
5. Chiusura anello con legami
covalenti tramite l’impiego della
DNA ligasi
6. Inserimento del DNA ricombinante
in una cellula batterica
7. Moltiplicazione dei batteri con
clonaggio del gene, cioè produzione
di numerose copie del gene.
 VETTORI
I vettori di clonaggio sono diversi ma hanno tutti dimensioni inferiori al genoma della cellula
ospite e determinate caratteristiche:
• Un tratto contenente siti di taglio per molti enzimi di restrizione (sito di clonaggio)
• Un origine di replicazione
• Un genere reporter che funziona come marcatore che permette di riconoscere le cellule in
cui è stato inserito il DNA ricombinante

I plasmidi batterici sono i vettori di clonaggio più utilizzati ma, dato che la maggior parte de geni eucarioti ha dimensioni maggiori,
si ricorre ad altri vettori tra cui i cromosomi artificiali di lievito detti YAC che sono costruiti in laboratorio.
I BAC (batteri artificiali) sono grossi plasmidi, il vantaggio di usarli è che possono portare frammenti di DNA più grandi.
I fagi (virus) sono utilizzati per la loro alta capacità infettiva mentre un altro vettore è l’mRNA che permette di ottenere un singolo
filamento di cDNA (DNA complementare) mediante un enzima chiamato trascrittasi inversa, penetrato nella cellula
------------------------------------------------------------------------ infettata insieme all’acido nucleico de virus
 TRASCRITTASI
Per isolare l’mRNA di una cellula a partire dalla miscela di tutto l’RNA, si sfrutta la loro caratteristica di avere una

INVERSA
sequenza all’estremità 3’ costituita da circa 200 residui di adenosina (coda poli-A)

La miscela degli RNA cellulari viene messa in contatto con una resina a cui sono attaccati deI corti oligonucleotidi
costituiti da timidine (poli-T)

Gli mRNA vengono successivamente staccati dalla resina e

raccolti in forma pura

La trascrittasi inversa copia il singolo filamento dell’mRNA,

generando un doppio filamento ibrido DNA/RNA

La trascrittasi inversa è in grado di degradare il filamento a RNA,

esponendo la singola elica di DNA; sintetizza il filamento complementare
di DNA, generando un cDNA a doppia elica.

Per inserire i cDNA all’interno di una cellula si utilizzano molecole di DNA

circolare: i plasmidici-> si tratta di elementi genetici dei batteri (plasmidi)
modificati dall’uomo.
 Il cDNA e il vettore di clonaggio vengono digeriti con la stessa
endonucleasi di restrizione. In questo modo le due estremità sono
complementari.

Tramite la DNA ligasi, i cDNA vengono saldati all’interno del vettore

plasmidico.
I DNA ricombinanti (vettori contenenti cDNA) vengono inseriti nelle
cellule batteriche.

Le cellule geneticamente modificate

(ovvero contenenti il vettore) acquisiranno
la le caratteristiche del vettore stesso (es.
resistenza all’antibiotico). Ogni singola
cellula originerà un clone di un singolo
cDNA che creerà la biblioteca di DNA.
 PROTEINE ottenute dal DNA ricombinante

RICOMBINANTI
Hanno determinato la bioindustria per la produzione di farmaci e altri prodotti utili
all’uomo.
La prima proteina ricombinante ottenuta usando i batteri risale al 1977 ed è stata la
somatostatina .Successivamente l’insulina e altre proteine.

Oggi circa il 50% dei nuovi farmaci e delle terapie per la cura di malattie sono ottenuti con le biotecnologie.
RERIA GENOMICA o GENOTEC
L’intera collezione di plasmidi ricombinanti, all’interno delle cellule batteriche, prende il nome di libreria genomica o libreria di
cDNA a seconda che i frammenti clonati siano derivati dal DNA genomico di un organismo o dal DNA complementare (cDNA)

La libreria genomica contiene frammenti derivati da tutto
il genoma, gli stessi indipendentemente dal tessuto o
dalle cellule da cui è derivato il DNA genomico di
partenza.
Per individuare una libreria genomica viene usata una
sonda nucleotidica marcata
La libreria di cDNA contiene soltanto quelle regioni che sono
trascritte in un RNA messaggero.
Un’intera libreria di cDNA è utile per studiare i geni responsabili
delle funzioni specializzate di un particolare tipo di cellule (es.
cervello, fegato ecc.). Essendo prive di introni, le molecole di cDNA
sono più corte e quindi più maneggevoli in laboratorio.
 LE SONDE NUCLEOTIDICHE
A volte il compito più difficile nella clonazione genica è quello di trovare il giusto scaffale della libreria genomica (ovvero trovare i
cloni contenenti il gene desiderato). Perciò si usano sonde nucleotidiche

Brevi filamenti di DNA o RNA marcati radioattivamente o fluorescente che si legano

ad un determinato gene.
 ALTRE TECNICHE
Altre tecniche che permettono di introdurre il DNA esogeno in una cellula ospite batterica o eucariote:
 Trattamento con una combinazione di cationi di calcio sottoforma di sale CaCl2 seguito dallo shock termico che crea pori nella
membrana per l’ingresso de DNA.
 Elettroporazione: applicazione di una scarica elettrica in una provetta in cui vi sono le cellule e il DNA che crea i pori
 Metodo gene gun o biolistico: tramite una pistola, vengono sparati particolari microproiettili di oro o tungsteno rivestiti con
DNA che viene inserito nelle cellule
 Infezione con virus
 Microiniezione di DNA: per i mammiferi in cui si inietta direttamente nel nucleo il DNA
 PCR
Quando il DNA è scarso per determinare profili
genetici (es. indagini forense), la reazione a Questa tecnica venne ideata nel 1985, è
catena della polimerasi (PCR) è molto efficace molto rapida (2-3 ore) ed è oggi utilizzata
per amplificare un segmento specifico di una per la diagnosi di malattie ereditarie,
molecola di DNA e ottenere milioni di copie studio del DNA ricavato da fossili e reperti
identiche. archeologici, test di paternità.
I primer (o innesti) innescano l’amplificazione e sono due sequenze di 17-20
nucleotidi di DNA a filamento singolo complementare alle sequenze stampo di inizio e
di fine. La reazione di replicazione avviene in uno strumento detto termociclatore e
prevede il succedersi di diversi cicli di amplificazione.
Il processo si svolge in tre fasi:
1-La miscela contenente il campione di DNA
viene riscaldata e i filamenti stampo vengono aperti (denaturazione a 94°C)
2-I filamenti vengono raffreddati e le molecole
dei primer si appaiono con le sequenze del DNA bersaglio
formando legami idrogeno (ibridazione, appaiamento a 30-65°C).
3-Una DNA polimerasi sintetizza nuovi filamenti e li estende nella direzione 5’3’
(estensione a 65-75°C).
Dal 1989 si usa una polimerasi termostabile estratta da un batterio termoresistente
(Thermus aquaticus) che permette una maggiore resa del processo.
 SEQUENZIAMENTO DEL DNA
E’ un processo che serve a mettere in fila le basi A,T,G, e C in modo tale da poter leggere e analizzare il DNA: poter leggere il
nostro genoma come un libretto di istruzione che descrive il funzionamento dell’organismo.
I metodi di sequenziamento (mappatura) possono
Il sequenziamento è utile in ogni campo della biologia: in medicina
essere divisi in due tipi:
è usato per diagnosticare malattie ereditarie e sviluppare nuovi
MAPPATURA GENETICA: rappresenta la distanza
trattamenti; nelle scienze forensi e in quelle alimentari.
relativa tra geni
MAPPATURA FISICA: rappresenta la posizione dei geni
rispetto a particolari sequenze di DNA
 MAPPE DI RESTRIZIONE
Confrontando la lunghezza di frammenti derivati da una certa regione di DNA trattati con diversi enzimi di restrizione, si può
determinare la posizione di ogni sito di taglio e costruire una mappa di restrizione. I frammenti vengono separati e poi analizzati
con l’elettroforesi su gel. In questo modo si analizza il genoma di un organismo, si visualizza l’impronta genetica (profilo genetico)
indicato con il termine inglese DNA fingerprint/DNA profiling.

Utilizzato per la prima volta come tecnica di identificazione nel 1985 nelle indagini
forense. E’ una mappa genetica che consiste nel comparare frammenti di DNA
proveniente da diversi individui e confrontare i marcatori genetici che sono
sequenze di genoma più simili tra individui con legami di parentela che tra quelli
che non ne hanno.
ODO DELLA TERMINAZIONE A CA
Nel 1975 fu introdotta una nuova tecnica: il sequenziamento del DNA con terminatori (metodo di Sanger: biologo inglese a cui si
deve l’invenzione) che oggi è la più utilizzata.

Prevede l’uso di inneschi (nucleotidi modificati) che

si appaiono su un frammento di DNA a singolo
frammento di sequenza ignota.
La DNA polimerasi inizia l’allungamento utilizzando i
desossiribonucluotiditrifosfato (dNTP). Inoltre, nella
miscela vengono messi piccole quantità di ddNTP
(didesossitrifosfasto) particolari detti TERMINATORI.
Con questa tecnica si ottengono filamenti di diversa
lunghezza che si concludono tutti con un ddNTP
solitamente anche marcati (radioattivamente o per
fluorescenza) in modo da poterli visualizzare.
Il sequenziamento tramite questo metodo permette
di sequenziare frammenti fino a 1000 basi

Negli ultimi anni tuttavia si stanno sviluppando nuove metodiche definite sequenziamento ad elevato parallelismo, in grado di
produrre enormi quantità di sequenze di lunghezza inferiore del metodo Sanger ma ad un costo minore e soprattutto ad una
velocità superiore. Si stima che si possano ottenere fino a 20 milioni di basi per corsa.
 ELETTROFORESI
L’elettroforesi su gel di agarosio o policrilammide è una tecnica che prevede l’impiego di una macchina che sfrutta energia
elettrica che prevede l’impiego di una sottile lastra di gel che serve a dividere le macromolecole.

I frammenti di DNA ottenuti (aventi carica negativa per la

presenza del gruppo fosfato) migrano verso il polo positivo
dal quale vengono attratti con velocità differente in base al
loro peso molecolare e alla loro lunghezza (i più corti e
leggeri sono i più veloci).

Le diverse bande sarebbero invisibili, sul gel, ma vengono rese

evidenti trattando il campione con coloranti che si legano al DNA
rendendolo fluorescente, oppure con ³²P, isotopo radioattivo del
fosforo che rende radioattivo il campione.
ALTRI MARCATORI MOLECOLAR
I marcatori, oltre ad essere un importante strumento per gli studi filogenetici, trovano applicazione in campo forense, diagnosi di
patologie, malattie ereditarie e in ambito vegetale.

Altri marcatori sono:

RIPETIZIONI BREVI> in tandem STR
(sequenze di 4 nucleotidi) o
microsatelliti
RIPETIZIONI IN NUMERO VARIABILE> in
tandem VNTR o minisatelliti ovvero
tratti di DNA contenente corte sequenze
(1-5 per STR e 10-60 per VNTR) ripetute
più volte. Il numero di ripetizioni varia
da individuo a individuo e definisce una
rapporto di parentela.
RIPETIZIONI DA SINGOLO NUCLEOTIDE
SNP> Variazioni dette «Polimorfismo a
singolo nucleotide» specifiche (es.
anemia falciforme dovuta al
cambiamento di una base da A a T che
altera la struttura dell’emoglobina).
Trattando un tessuto con un certo enzima di restrizione si ottengono sempre gli stessi
frammenti di DNA. Gli SNP possono alterare un sito di restrizione
• La presenza di frammenti di lunghezza diversa indica un’anomalia nel DNA spesso
correlabile a malattie genetiche.
• I frammenti di lunghezza diversa dal normale, indicati con RFLP (che sta per
«Polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione») vengono ricercati per
diagnosticare alcune malattie genetiche.
 IL PROGETTO GENOMA
UMANO
Il programma di mappatura dell’intero genoma dell’uomo, che ha impegnato centinaia di laboratori di ricerca in tutto il mondo,
ha fornito un primo set di risultati nel 2003.
La prima sorpresa è venuta dalla stima del numero dei geni umani, risultati non più 25.000, mentre le previsioni erano di circa
100.000.

Il 97% del nostro DNA non è codificante e comprende altre sequenze che
un tempo venivano definite spazzatura ma che oggi si ritengono con
importanti funzioni di regolazione che hanno un unico problema di tipo
etico:
Sequenze regolatrici> promotori, enhacer, introni
Sequenze ripetute> nelle zone dei centromeri e telomeri per la
conservazione dei cromosomi
Trasposoni> Geni mobili capaci di duplicarsi e spostarsi che costituiscono
fino al 50% del genoma umano. Forse sono coinvolti nell’insorgenza di
tumori
Pseudogeni> Antichi gene che hanno perso funzionalità in seguito a
mutazioni. Si ritiene che possano favorire la comparsa di nuovi geni o
riacquistare per mutazione la funzione perduta. Il numero è pari forse al
10% de DNA totale
 POST-
GENOMICA
Il progetto Encode (Europa e Stati Uniti) studia il DNA oscuro del progetto genoma e la loro funzione (genomica funzionale).
Per conoscere le funzioni si può ricorrere a diversi metodi:
ANALISI BIOINFORMATICHE: ricerca di geni con sequenza simile
KO GENICO: knock-out genico, silenziamento/spegnimento del gene.
La funzione di un particolare gene viene annullata sostituendo la
sequenza nucleotidica attiva con una modificata attraverso:
• la ricombinazione omologa: i filamenti di DNA caratterizzati da
sequenze omologhe, simili si appaiono e scambiano pezzi di DNA
• Oligonucleotidi antisenso: brevi frammenti di DNA o RNA
sintetizzati in laboratorio con sequenze complementari al gene
codificante (senso)o dell’mRNA del gene de spegnere.
• iRNA: tecnica post-trascrizionale-> meccanismo epigenetico
mediante il quale alcuni frammenti di RNA sono in grado di
interferire sull’espressione genica e spegnerla. L’iRNA può essere
frammentato in siRNA (short interfering) che impedisce la
traduzione ed è una tecnica molto efficace nella terapia di alcune
patologie.
• microRNA: piccole molecole di 20-22 nucleotidi di RNA non
codificante, a singolo filamento. Sono utilizzati nella terapia di
molte patologie.
 TERAPIA
Consiste nel trasferimento di uno o più geni sani in una cellula malata, al fine di curare una patologia causata dall’assenza o dal

GENICA
difetto di uno o più geni (mutati). La sostituzione si fa sfruttando come vettore un virus reso inattivo, svuotato del suo corredo
genetico e riempito con il gene sano prelevato da cellula dello stesso tipo di quelle che hanno gene difettoso.
 OGM
L’inserimento di geni nuovi ed estranei nelle piante o animali (mutazione del proprio patrimonio genetico) ha lo scopo di
produrre organismi modificati (transgenici se il gene introdotto proviene da specie diverse) con caratteristiche utili all’uomo.

PIANTE OGM
Bisogna manipolare il DNA di una ANIMALI OGM
singola cellula somatica. Il vettore più Le cellule uovo vengono prelevate da
utilizzato è il plasmide Ti una femmina e fecondate in vitro. Nel
(Agrobacterium tumefaciens) nucleo si inietta un gene già clonato.
Una pecora transgenica potrebbe
produrre lana di qualità migliore o
latte con proteine utili a curare
patologie.
• 1982> Si inserì nel genoma di un
topo il gene dell’ormone della
crescita per la cura del nanismo.
Gli OGM servono a produrre sostanze utili
all’uomo come l’anticoagulante (antitrombina
umana) secreta nel latte, l’insulina, organi
animali per il trapianto (es. valvola bovina)
 CLONAZIONE
La clonazione in biologia è la riproduzione agamica, naturale o artificiale, di individui o cellule con identici patrimonio genetico.
Esempi di processi clonogenici naturali sono la scissione binaria dei batteri o la mitosi nelle cellule eucariotiche.

Per clonazione artificiale si intende la generazione di un intero

organismo a partire da una cellula non zigotica.
Questa tecnica permette di ottenere copie geneticamente
identiche dell’organismo di partenza e trova applicazioni nella
zootecnica per riprodurre animali dalle caratteristiche eccellenti
come cavalli da corsa, mucche da latte; ma anche nella
conservazione dell’ambiente (per esempio per ripopolare
alcune specie animali in via di estinzione); per la ricerca ecc

PIANTE: Si parte da una cellula del corpo della pianta

ANIMALI: si opera su embrioni di non più di 8 cellule(SPLITTING)

• In genere lo fanno alcuni allevatori per ottenere più esemplari di

bestiame pregiato
• I singoli embrioni, dopo essere stati suddivisi, vengono poi inseriti
nell’utero delle madri che porteranno a termine la gravidanza
CLONAZIONE DI ANIMALI
La procedura più usata per la clonazione degli animali è il trasferimento nucleare

Il primo mammifero clonato è stata la pecora Dolly creata in Scozia nel 1997 da Ian Wilmut e vissuta per sette anni, durante i
quali diede alla luce diversi cuccioli. Ora è conservata in un museo a Edimburgo.
 CELLULE STAMINALI
Le cellule staminali sono i “fornitori” di tutte le nuove cellule.
Quando una cellula staminale si divide, può creare altre cellule
staminali oppure cellule di altri tipi. Ad esempio, le cellule
staminali della pelle possono creare altre cellule staminali della
pelle o possono originare cellule più differenziate, con compiti
specifici come produrre il pigmento della melanina. Le cellule
staminali che che producono il sangue sono dette
ematopoietiche.
Quando ci ammaliamo o ci facciamo
male, anche le nostre cellule possono
venire danneggiate o morire. Quando ciò
accade, le cellule staminali si attivano,
riparando i nostri tessuti lesionati e
rimpiazzando le cellule che
costantemente muoiono. In questo modo
le cellule staminali ci mantengono sani e
evitano l’invecchiamento precoce.

Inoltre, esistono altre cellule staminali che sono presenti dai primi stadi dello sviluppo, e queste vengono chiamate cellule
staminali embrionali. Molti scienziati sono interessati alle cellule staminali embrionali perché il loro ruolo fisiologico e’ di costruire
tutti gli organi e i tessuti del nostro corpo e hanno una maggiore capacità naturale di riparare tessuti malati o danneggiati.
 IPS Cellule staminali pluripotenti indotte

Medici e scienziati sono molto interessati ad un nuovo tipo di cellule staminali, chiamate cellule IPS. Infatti le cellule IPS
hanno quasi le stesse caratteristiche delle cellule staminali embrionali, ma non vengono ricavate da embrioni. Di
conseguenza, le cellule IPS non comportano dilemmi di natura etica.
Inoltre queste cellule vengono ricavate a partire dalle cellule del paziente stesso, e perciò non comportano problemi di
rigetto, cosa molto importante in tutti di casi di trapianti.
Gli scienziati hanno pensato di utilizzarle per curare
malattie. Per esempio, se il paziente ha un infarto si
vorrebbero trapiantare cellule staminali per riparare il
tessuto cardiaco danneggiato. Sarebbe però
necessario il trapianto di un milione di cellule
staminali .
Ci sono ancora degli aspetti da risolvere prima che le
terapie con le cellule staminali diventino una pratica
comune, in particolare riguardo la loro sicurezza:
infatti le cellule staminali potrebbero potenzialmente
generare tumori, o innescare reazioni immunitarie.
Al momento ci sono solo pochi tipi di trapianti di
cellule staminali che sono stati dimostrati sia efficaci
che totalmente sicuri. Il miglior esempio è il trapianto
di midollo osseo.