Progetto: Espressione del gene TAS2R16: ruolo dello SNP rs978739

Lo SNP rs978739 si trova nel promotore del gene TAS2R16. E stato mostrato che una sua variante allelica pi frequente nelle persone anziane. Da queste evidenze scaturita lipotesi che lo SNP possa influenzare lespressione del gene e quindi la percezione del gusto amaro. Per valutare un eventuale ruolo funzionale del polimorfismo in questione, saranno effettuati dei saggi in vitro in cui le cellule saranno trasfettate con il plasmide contenente il promotore del gene TAS2R16 con la variante allelica A o, alternativamente la variante allelica G dello SNP rs978739. Il promotore sar clonato a monte del gene Luc la cui espressione facilmente rilevabile con il luminometro. Se lo SNP gioca un ruolo nellespressione del gene sar possibile apprezzare differenze nei valori di luminescenza.

caatgactttcactttgtctctgtcaccaactagcaattagaataacctc tcatttctgaagccacttattacatatttggtgtctatttggaagagttg tcctgaactgaaggaaaacgtattccttttatagcctgcttgtatagcta tgaaatgatgcctgcacatttagaagtaatacgctttactagtggtaaga gggtcctctttcaattcttcctgagcaatgggagcagtgacaaaaagaac ctagccatgtaagagaaaaaaaaaaacacacagtgatgttaatgggacaa gaacaattcctgaaaatatataaggcatatgctcaaagcatcggaattgg cagaagaacaatagctaagagaggctgtgtgcagtgttttctctgcagtt tgatttctctaagtgggggaattcaatgggcagttatgagagtggcctgc attggatggaaatacttgaaggtctggggttcagcaattttgtggaattt cggaggaaagacttttcattatcatttttatttaccctcacactttggtt gtagcatccaccactagctgccatgagaactgggaagatagggcttctga ggttcgctttggtactgcactcaacagagcagaaacatcatgcaggacgt gaatgaacagggaaggattcatctttcttgttgctcaaattttaggttaa aagagtgaagatgtcatttaaagaagataaggaaataagctaagtgcacc tcagaaaaagaggaaataaacaacatggttatgaaatacatatgcctttt tggaataatcaaatcacctcaggagcaggaatccacatttaaacatttcc ctacattcagatgtgatagcaaaccagcaagcaaagcataaacaaattct atagataggaaaatgacaaaatcaaaaatgagcttgggaaaatttgcttc cagagagaggggttttcttgtaccagacagtggtggaatcaggaacccat tctctacctggaaattggtacagagattcagagtctttgtccaggaagac actttggagtagaagaATGATACCCATCCAACTCACTGTCTTCTTCATGA TCATCTATGTGCTTGAGTCCTTGACAATTATTGTGCAGAGCAGCCTAATT GTTGCAGTGCTGGGCAGAGAATGGCTGCAAGTCAGAAGGCTGATGCCTGT GGACATGATTCTCATCAGCCTGGGCATCTCTCGCTTCTGTCTACAGTGGG CATCAATGCTGAACAATTTTTGCTCCTATTTTAATTTGAATTATGTACTT TGCAACTTAACAATCACCTGGGAATTTTTTAATATCCTTACATTCTGGTT AAACAGCTTGCTTACCGTGTTCTACTGCATCAAGGTCTCTTCTTTCACCC ATCACATCTTTCTCTGGCTGAGGTGGAGAATTTTGAGGTTGTTTCCCTGG ATATTACTGGGTTCTCTGATGATTACTTGTGTAACAATCATCCCTTCAGC TATTGGGAATTACATTCAAATTCAGTTACTCACCATGGAGCATCTACCAA GAAACAGCACTGTAACTGACAAACTTGAAAATTTTCATCAGTATCAGTTC CAGGCTCATACAGTTGCATTGGTTATTCCTTTCATCCTGTTCCTGGCCTC CACCATCTTTCTCATGGCATCACTGACCAAGCAGATACAACATCATAGCA CTGGTCACTGCAATCCAAGCATGAAAGCGCGCTTCACTGCCCTGAGGTCC CTTGCCGTCTTATTTATTGTGTTTACCTCTTACTTTCTAACCATACTCAT CACCATTATAGGTACTCTATTTGATAAGAGATGTTGGTTATGGGTCTGGG AAGCTTTTGTCTATGCTTTCATCTTAATGCATTCCACTTCACTGATGCTG AGCAGCCCTACGTTGAAAAGGATTCTAAAGGGAAAGTGCTAGgcctagag gttgcctgaggcacaggataaaagactcccgagcaattgatataat

TAS2R16

IN ROSSO= 1000bp UPSTREAM IN VIOLA= rs978739 IN BLU=5UTR IN NERO= coding region del gene TAS2R16 IN VERDE= 3 UTR

Frequenze alleliche e genotipiche (dbSNP)

1) Scelta della linea cellulare opportuna su cui effettuare saggi in vitro Il modello migliore una linea cellulare in cui si esprima fisiologicamente il geneTAS2R16. A questo scopo stata scelta la linea SAS della quale sono elencate le principali caratteristiche nella taballa sottostante. Si pu acquistare presso la Riken bioresource center cell bank
RCB1974: SAS

Comment Animal

Human cell line derived from tongue cancer. Squamous cell carcinoma. TKG0470 (Deposited from Tohoku Univ) human

Tissue
Morphology Anchoraged Medium Antibiotics

tongue
epithelial-like Yes RPMI1640+10%FBS Free

2) scelta del plasmide di espressione Il plasmide di espressione il pGL3-basic Luciferase Reporter Vectors. Il multiple cloning site a monte del gene Luc. In questo sito sar clonato il promotore del gene TAS2R16 (900bp)

2) scelta del plasmide per la normalizzazione Eventuali fluttuazioni sperimentali dovute ad un numero diverso di cellule piastrate e/o a differente efficienza di trasfezione vengono ovviate normalizzando la luminescenza del gene Luc-2 a quella del gene renilla che espresso dal plasmide pRL Renilla

Luciferase.

Disegno sperimentale
CREAZIONE DEl VETTORE PLASMIDICO CONTENENTE LA VARIANTE G DEL SNP rs978739

MUTAGENESI SITO-SPECIFICA
QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis

DISEGNO PRIMERS MUTAGENICI

SINTESI FILAMENTO MUTANTE

DIGESTIONE PLASMIDE WT METILATO (DpnI)

TRASFORMAZIONE (XL10-Gold Ultracompetent Cells)

SELEZIONE con Ampicillina

TRASFEZIONE TRANSIENTE DELLE CELLULE SAS

Pre-crescita delle cellule fino al 40-80% della confluenza

Preparazione complessi plasmidi/Polyfect

Aggiungere complessi alle cellule, incubare 24 ore a 37C

 lettura al luminometro (24 ora) Lettura: 20 L di lisato + 100 L di Luciferase Assay Substrate

Stop & Glo

calcolo del rapporto Luciferasi/Renilla e analisi statistica dei dati

Spese:
Vettore con il promotore del gene TAS2R16 (GENSCRIPT) 500

Pgl3 Basic Vector (PROMEGA) 147,25

pRL-TK vector (PROMEGA) 130,15 MINI PREP (PROMEGA) 304,30 Plasmid Maxi Kit (QIAGEN) 157,25 Linea cellulare (Riken bioresource center cell bank) 150 PolyFect Transfection Reagent (QIAGEN) 179,35 DUAL-LUCIFERASE (PROMEGA) 229,90

TOTALE: 1798,2+IVA= 2175,822