Espressione del Genoma

LEspressione del genoma specifica del tipo di cellula e del suo stato. Essa richiede la sintesi di molecole di RNA (trascrizione) che eventualmente dirigeranno la sintesi di proteine (traduzione). - lRNA polimerasi non ha bisogno di un primer - lRNA sintetizzato non rimane appaiato allo stampo - la trascrizione meno accurata della replicazione (1 mismatch/1000 nt, assenza di meccanismi di riparazione).

Le RNA polimerasi
I batteri hanno una unica RNA polimerasi, mentre le cellule eucariotiche ne hanno 3*: le RNA Pol I, Pol II e Pol III. La RNA Pol II responsabile della trascrizione della maggior parte dei geni, inclusi quelli codificanti per proteine, e alcuni piccoli RNA nucleari (U1,

U2,

U4, U5) . La RNA Pol I , localizzata nel nucleolo, trascrive il gene per il precursore degli
RNA ribosomiali (40% dei trascritti totali), la RNA Pol III trascrive i geni per i tRNA, alcuni piccoli RNA nucleari (es. U6) e lRNA ribosomiale 5S. La struttura 3D dellRNA polimerasi ricorda una chela (simile alla mano delle DNA polimerasi).

Procarioti Batteri Archebatteri ! A'/A'' !' B "# D "## L $ K (+ altre 6)

RNAP I RPA1 RPA2 RPC5 RPC9 RPB6 (+ altre 9)

Eucarioti RNAP II RPB1 RPB2 RPB3 RPB11 RPB6 (+ altre 7)

RNAP III RPC1 RPC2 RPC5 RPC9 RPB6 (+ altre 11)

(*) Nella cellula eucariotica esistono altre RNA polimerasi : lRNA polimerasi mitocondriale (simile a quella del fago T7) e lRNA polimerasi dei cloroplasti (simile a quella batterica).

Gli RNA
Caratteristiche: Catena polinucleotidica a singolo filamento Ribosio anzich 2-deossiribosio Uracile al posto della timina Idrolizzabile in acido a caldo o in NaOH a freddo Assorbono luce a una lunghezza donda di 260 nm Assumono strutture secondarie complesse (si usano agenti denaturanti, come formaldeide o gliossale, per lanalisi elettroforetica)
Procarioti specie stabili rRNA 23S rRNA 16S rRNA 5S tRNA 4S specie labili mRNA Eucarioti specie stabili rRNA 25-28S rRNA 17-18S rRNA 5.8S rRNA 5S tRNA 4S specie labili pre-mRNA mRNA

Le tre fasi della trascrizione

La trascrizione si sviluppa in tre fasi distinte: inizio, allungamento e terminazione. Linizio richiede lintervento di un promotore, ovvero una sequenza di DNA, cui si lega la RNA polimerasi (insieme ad altri fattori di inizio), prima di iniziare la sintesi dellRNA in direzione 5 ! 3. Il promotore monodirezionale dato che sono uno dei due filamenti funge da stampo. Dopo la sintesi di un piccolo frammento di RNA (ca. 10 nt) si passa alla fase di allungamento nella quale la polimerasi si lega ancora pi saldamente allRNA, svolge il DNA davanti, lo riavvolge dietro, stacca la catena di RNA dallo stampo, funziona da correttore di bozze. Quando tutto il gene stato trascritto, la polimerasi si ferma e rilascia lRNA prodotto.

Separazione di circa 14 basi

Formazione del complesso ternario

Le trascrizione nei batteri

Il nucleo (core) dellRNA polimerasi ha unaffinit intrinseca per il DNA basata su interazioni fra lenzima (basico) e il DNA (acido) e si lega stabilmente a siti di legame aspecifici sul DNA. La specificit della RNA polimerasi per il promotore conferita da un fattore proteico, chiamato sigma, che forma con la proteina core la RNA polimerasi oloenzima. Il fattore sigma predominante "70 che lega due sequenze consenso a -35 e a -10.

Le sequenze consenso sono degenerate

Se analizziamo gli elementi -35 di 250 promotori di E.coli (arep.med.harvard.edu/ecoli_matrices/rpoD.html) osserviamo 147 differenti esanucleotidi (nella tabella i 6 pi frequenti).
TTGACA TTGAAA TTTACA TTGATA TTGTCA TTTTCA 10 8 8 6 6 6

La relativa Matrice Posizionale di Frequenza (PWM):

pos A C G T 1 16 19 13 202 2 18 10 12 210 3 21 24 161 44 4 137 46 20 47 5 55 126 20 49 6 143 24 41 42

Dalla quale si pu calcolare il relativo sequence logo applicando le seguenti equazioni:

H(i) = " # f (b,i) $ log 2 f (b,i)

b= A

I(i) = 2 " H(i)

h(i,b) = I(i) $ f (b,i)

Promotori in E.coli
Filamento coding TSS

Filamento stampo

Il ruolo del fattore "

Il fattore " media il legame della polimerasi al promotore. Lefficienza con cui lenzima si lega al promotore e inizia la trascrizione varia in funzione delle sequenze consenso e della loro distanza (promotori forti e deboli). Nel fattore "70 si possono individuare 4 regioni (1-4), la 2 e la 4 sono coinvolte nel legame al DNA. La regione 4 (helix-turn-helix) assicura il legame della RNA polimerasi al promotore, la regione 2 ha anche la funzione di stabilizzare lapertura del DNA.

La struttura del complesso tra RNA polimerasi e promotore

La transizione tra complesso chiuso e complesso aperto (isomerizzazione) irreversibile ed provocata da una transizione strutturale energeticamente favorita. Nellenzima possiamo distinguere 5 canali.

1 2

NTP uptake

3 -

Transizione strutturale tra complesso chiuso e aperto

La RNA polimerasi non richiede un primer

La trascrizione non richiede lintervento di un primer, ma necessaria una interazione molto specifica con il ribonucleotide di inizio, che normalmente una A. Dopo lingresso del ribonucleotide di inizio nel sito attivo, segue una fase denominata inizio abortivo, nella quale la polimerasi sintetizza brevi frammenti di RNA (<10 nt) che vengono rilasciati senza che la polimerasi si dissoci dallo stampo, sul quale inizia poi la sintesi di un nuovo frammento. Dopo diversi tentativi, quando la RNA polimerasi riesce a sintetizzare un frammento pi lungo di 10 nt, inizia la fase di allungamento (v=50 nt/s) e si ha poi il distacco del fattore ". La transizione dalla fase di inizio abortivo a quella di allungamento comporta un cambiamento strutturale della regione "3.1. Un meccanismo analogo viene ricapitolato dalla RNA polimerasi a singola subunit come la RNA polimerasi T7.

polimerasi T7

Terminazione della trascrizione

Alcune sequenze, dette terminatori inducono il rilascio della RNA polimerasi e del trascritto. I terminatori batterici sono di due tipi: i) rho-indipendenti, e ii) rho-dipendenti. Nel secondo caso la terminazione richiede il fattore proteico rho (che lega siti specifici detti rut). I terminatori rho-indipendenti, detti anche terminatori intrinseci, sono costituiti da una corta sequenza palindromica (ca. 20 nt) cui segue una sequenza di 8 coppie A:T. Linterferenza provocata dalla struttura stem-loop unita alla debolezza del legame A:U favorisce il distacco del trascritto dallo stampo.

La struttura stem-loop assunta dallRNA provoca la rottura del complesso di allungamento

Sono evidenziate le mutazioni che hanno dimostrato un effetto deleterio sullattivit del terminatore

La proteina Rho
La proteina Rho, una proteina essenziale per E.coli. Ha una struttura omoesamenrica (monomero di 46 kDa) e assume una forma ad anello, contiene un dominio di legame al ssRNA e un dominio di legame allATP. Si lega allRNA nascente ed ha attivit elicasica. La proteina Rho, utilizzando lenergia fornita dallidrolisi dellATP, scorre lungo lRNA e induce la terminazione della trascrizione staccando lRNA dai suoi contatti con il DNA templato e lRNA polimerasi.

La trascrizione eucariotica
La struttura della RNA polimerasi eucariotica molto simile a quella batterica. Tuttavia, mentre nei procarioti interviene un solo fattore addizionale ("), negli eucarioti sono richiesti numerosi fattori di inizio addizionali denominati GTF (fattori generali di trascrizione). Dato che In vivo, il DNA avvolto sui nucleosomi, sono richiesti anche ulteriori fattori proteici quali il complesso mediatore, proteine che modificano la cromatina, ecc. Il promotore base (core promoter) riconosciuto dalla RNA Pol II costituito da circa 40 bp a monte e a valle del sito di inizio e contiene sequenze consenso quali BRE, TATA box, INR e DPE, riconosciute da specifici fattori proteici. Di fatto i promotori eucariotici contengono solo alcuni (2 o 3) di questi 4 elementi.

Altre sequenze regolatorie sono localizzate ad una distanza variabile dal core promoter, principalmente a monte, quali UAS (upstream activating sequences), enhancers, silencers, boundary elements e insulators, che a loro volta sono riconosciuti da proteine regolatorie che attivano o reprimono il processo di trascrizione.

Il complesso di pre-inizio
Linsieme dei GTF, la RNA polimerasi e il promotore formano il complesso di pre-inizio (PIC). Il principale fattore di trascrizione della RNA Pol II TFIID (TPB + TAFs). Il di legame di TBP al DNA ne induce una marcata distorsione e consente il reclutamento di altri fattori GTF e della stessa RNA polimerasi. Lapertura dei due filamenti a livello del promotore richiede lintervento di TFIIH e lidrolisi di ATP. Il passaggio dallinizio abortivo alla fase di allungamento segnato dalla fosforilazione della coda CTD (C-terminal domain) dellenzima su residui di Ser allinterno di ripetizioni eptapeptidiche (PTSPSYS, 52 ripetizioni nei
mammiferi).

La

fosforilazione

dellenzima

facilita

levasione della polimerasi dal promotore.

I Fattori Generali di Trascrizione

Il legame di TBP al promotore determina un marcato ripiegamento del DNA, facilitata dalla sequenza TATA.

GTF TBP (TFIID) TAF (TFIID) TFIIA TFIIB TFIIE TFIIF TFIIH
(Lievito)

Subunit 1 11 2 1 2 3 9

Tutti i GTF hanno ruoli specifici nel processo di inizio. Alcuni TAF hanno una similarit strutturale con le proteine istoniche (es. TAF42:TAF62 in Drosophila formano un complesso simile ad H3:H4). Di particolare importanza il ruolo di TFIIH che ha attivit ATPasica, chinasica e elicasica.

Il ruolo degli altri fattori proteici

Il DNA normalmente impaccato nei nucleosomi e nella cromatina. Pertanto, linizio della trascrizione in vivo richiede lintervento di altri fattori proteici quali il complesso mediatore, proteine regolatrici della trascrizione (attivatori) e enzimi che rimodellano la cromatina.

Allungamento della Trascrizione

La fosforilazione del CTD, che avviene in concomitanza con linizio della fase di allungamento, provoca uno scambio tra i fattori di inizio e quelli necessari per lallungamento e la maturazione dellRNA. I fattori di allungamento includono P-TEFb (fosforilazione S2), hSPT5, TAT-SF1, TFIIS (correzione di bozze)

Fattori di splicing

Fattori di capping

Maturazione dellmRNA capping

Prima di essere esportato dal nucleo e poi tradotto lmRNA deve subire un porcesso di maturazione che prevede: i) laggiunta di un cap al 5; ii) la rimozione degli introni; iii) laggiunta della coda di polyA al 3. I fattori di allungamento reclutano alcune delle componenti dei macchinari di maturazione delmRNA, evidenziando una stretta correlazione tra i due processi. Il capping consiste nellaggiunta di una 7mG allestremit del trascritto con un insolito legame 5-5. Esso avviene quando lRNA lungo 20-40 nt, ovvero nella fase di transizione tra inizio e allungamento.

Maturazione dellmRNA aggiunta della coda di polyA

Quando la polimerasi raggiunge il segnale di poliadenilazione, in prossimit della fine del gene, vengono reclutati dal CTD due fattori proteici: CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) e CstF (cleavage stimulation factor) che a loro volta reclutano altre proteine che effettuano il taglio dellRNA e laggiunta della coda di polyA. LmRNA cos maturo viene rilasciato dalla polimerasi, che per un tratto continua la sintesi di RNA sullo stampo, e quindi trasferito dal nucleo al citoplasma dove sar tradotto.

RNA Polimerasi I
Il promotore della RNA Pol I dedicato alla espressione di un singolo gene (presente nel genoma in copie multiple in tandem): il precursore degli rRNA, il cui livello di espressione molto pi alto di quello di tutti gli altri geni.

Il promotore di Pol I ha una struttura bipartita: il core promoter e lUCE (upstream control element). LUCE lega due fattori: UBF e SL1 (TBP+TAFs), che a loro volta stimolano la trascrizione reclutando la Pol I sul core promoter,

RNA Polimerasi III

I promotori della RNA Pol III possono avere strutture differenti. Alcuni hanno linsolita caratteristica di essere posizionati a valle del sito di inizio della trascrizione. I promotori per i tRNA hanno una struttura bipartita (box A e B) e, come gli altri promotori, richiedono fattori di trascrizione addizionali, oltre alla RNA polimerasi.

I geni eucariotici sono discontinui

I geni eucariotici sono discontinui. Il trascritto maturo (mRNA) viene generato a partire da un RNA precursore attraverso la rimozione degli introni e la concatenazione degli esoni (il termine esone (exon) deriva dal nome del gene hexon di adenovirus in cui nel 1977 stato scoperto lo splicing). Unit trascrizionale
promotore

Esone 1

GTintroneAG

Esone 2 GTintroneAG Esone 3

Trascrizione

Esone 1

GUintroneAG Esone 2 GUintroneAG Esone 3

Splicing

Esone 1

Esone 2

Esone 3

5UTR

CDS
mRNA

3UTR

I geni umani
I geni umani hanno le seguenti caratteristiche (valori medi): Lunghezza: Numero di esoni: Lunghezza esoni (interni): Lunghezza introni : Lunghezza 5UTR: Lunghezza CDS: Lunghezza 3UTR: 27 kbp 8.8 146 bp 3365 bp 300 bp 1341 bp (447 aa) 770 bp

Il numero di esoni pu variare da 1 fino ad oltre 300 (titina). La lunghezza complessiva degli esoni pari a circa il 10% della lunghezza complessiva degli introni, che possono essere anche molto lunghi, fino a 800 kbp. Il gene umano pi grande la distrofina (2,4 Mbp).

Lo splicing dellmRNA
La precisa rimozione delle sequenze introniche dipende dalla presenza di specifiche sequenze che segnano le estremit degli introni: i siti di splicing al 5 e al 3.

La rimozione degli introni richiede due reazioni successive di transesterificazione (SN2).

Lo splicing dellmRNA
Lintrone rimosso dallo splicing contiene una struttura a cappio (lariat) e viene rapidamente degradato assicurando lirreversibilit della reazione di splicing.

Trans-splicing
E possibile che lo splicing concateni, con un meccanismo analogo a quello del cis-splicing, due esoni derivanti da molecole distinte di mRNA. Ad esempio, molti trascritti di C.elegans e C.intestinalis, contengono uno Spliced Leader (SL) aggiunto per trans-splicing.

SL di C. intestinalis

TTCTACCTCAGAGGAG

Lo Spliceosoma
Le reazioni di splicing sono realizzate - utilizzando lenergia fornita da diverse molecole di ATP da un grosso complesso ribonucleoproteico, denominato Spliceosoma, costituito da 5 RNA e circa 150 proteine. Gli RNA componenti lo spliceosoma, detti small nuclear RNAs (snRNA), sono gli RNA U1, U2, U4, U5 e U6, hanno lunghezza compresa tra 100 e 300 nt, e formano complessi con diverse proteine costituendo le cosiddette small nuclear ribonucleoprotein (snRNP). Il ruolo delle snRNP : 1) riconoscere il sito di splicing al 5 e il punto di ramificazione; 2) avvicinare tra loro questi siti; 3) catalizzare le reazioni di transesterificazione. Tali funzioni coinvolgono: i) interazioni RNA-RNA; ii) interazioni RNA-proteina; iii) interazioni proteina-proteina.

Poly-Py

Complesso precoce Complesso A

Il meccanismo dello splicing

Dopo la formazione del complesso precoce, ls snRNP U2 si lega al punto di ramificazione spiazzando BBP (branching point binding protein). Lappaiamento con lRNA U2 espone la A (branching point) in modo da attivarla per la prima reazione di transesterificazione.

Complesso B

Nella fase successiva si ha lavvicinamento di tutti e tre i siti coinvolti nello splicing, attraverso lintervento della tripla snRNP U4/U6*U5. Nel passaggio successivo U6 rimpiazza U1.

Poly-Py

Complesso precoce Complesso A

Il meccansimo dello splicing

Completato lassemblaggio, U4 lascia il complesso e permette a U6 di interagire con U2.

Complesso B

Si forma in questo modo il complesso C nel quale si produce il sito attivo. Si realizza quindi la prima reazione di transesterificazione. Subito dopo si ha la seconda reazione di transesterificazione supportata dalla snRNP U5.
Complesso C

Tre tipi di splicing nelle cellule

Gli introni del gruppo I e del gruppo II sono capaci di autosplicing (self-splicing). Gli introni capaci di self-splicing hanno una lunghezza compresa tra 400 e 1000 nt e presentano una estesa conservazione sia nella sequenza che nella struttura secondaria. Lavvento delle proteine - nel corso dellevoluzione - ha rilassato le costrizioni funzionali a livello delle sequenze introniche.
Macchinario Classe Diffusione Meccanismo due reazioni di pre-mRNA nucleari mRNA eucariotici transesterificazione (A al punto di ramificazione) due reazioni di Introni del gruppo II alcuni geni di organelli e eucarioti, alcuni geni procariotici transesterificazione (A al punto di ramificazione) due reazioni di transesterificazione (una G Introni del gruppo I rRNA nucleari di alcuni eucarioti, geni degli organelli e qualche gene procariotico libera catalizza la prima transesterificazione) Enzima a RNA codificato dall'introne Enzima a RNA codificato dall'introne Spliceosoma maggiore catalitico

Tre tipi di splicing nelle cellule

Gli introni del gruppo I sono pi piccoli di quelli di gruppo II e contengono una tasca un grado di legare qualunque nucleoside o nucleotide, e una sequenza guida che riconosce il sito al 5.

Meccanismi per la corretta selezione dei siti di splicing

Possono essere commessi errori nella selezione dei siti di splicing.

Vi sono due modi diversi per minimizzare gli errori: 1) man mano che la trascrizione procede i siti di splicing vengono caricati di specifiche componenti proteiche dalla coda CTD della polimerasi, in questo modo un sito 3 a valle di un sito 5 viene riconosciuto proma che gli altri competori siano sintetizzati; 2) gli esoni vengono marcati dalle proteine SR (Ser+Arg) che si legano agli ESE (exonic splicing enhancers) e reclutano alcune componenti del macchinario di splicing.

Lo splicing alternativo
Uno stesso gene pu generare diversi trascritti (e prodotti proteici) in seguito alluso di diversi promotori (d), siti di terminazione della trascrizione (e) o splicing alternativo (a, b, c, f, g).

Lo splicing alternativo
Splicing alternativo del gene per la troponina T

Splicing alternativo del gene DSCAM in Drosophila

12x48x33x2= 38,016

Lo splicing alternativo
Lo splicing alternativo pu essere costitutivo o regolato. Nel primo caso vengono sempre generate diverse isoforme dal trascritto primario. Nel secondo caso diverse forme vengono generate in tempi diversi, in differenti tessuti, o in risposta a stimoli e condizioni differenti.
Splicing alternativo dellantigene T di SV40

Lo splicing aternativo regolato da proteine che si legano a specifici attivatori (enhancer) o repressori (silencers) dello splicing che si trovano negli esoni (ESE, ESS) o negli introni (ISE, ISS).

Regolazione dello splicing alternativo

Lo splicing alternativo regolato pu avvalersi sia di attivatori che di repressori. Le proteine SR (attivatori) si legano allRNA mediante un dominio RRM (RNA Recognition Motif) e contengono nella regione cterminale anche un dominio RS (Arg+Ser) che media le interazioni tra la proteine SR e le altre proteine componenti del macchinario di splicing.

Regolazione dello splicing alternativo

I silenziatori vengono riconosciuti dalle proteine hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) che bloccano specifici siti di splicing, impedendone il loro utilizzo.

Le proteine alternative generate dallo splicing (isoforme) possono avere funzioni simili, distinte o perfino antagoniste. In alcuni casi lo splicing alternativo viene semplicemente usato per spegnere un gene generando un trascritto non funzionale che viene immediatamente degradato.

Alcuni RNA sono processati da uno spliceosoma alternativo

Esiste una forma minore di spliceosoma, costituito da alcune componenti in comune con lo spliceosoma maggiore e altre invece specifiche, come U11 e U12 che sostituiscono le componenti U1 e U2. Gli introni rimossi da questo splicesoma hanno siti di splicing differenti, quali AT-AC.

Le sequenze consenso dei diversi tipi di introne

E stato proposto che gli introni AT-AC siano evoluti per primi dagli introni di classe II, per poi dare origine agli introni canonici GT-AG.

Due teorie sullorigine degli introni

Sono state fatte due ipotesi per spiegare lorigine degli introni: 1) ipotesi degli introni precoci (intron early); 2) ipotesi degli introni tardivi (intron late). Probabilmente, lipotesi intron early pi convincente, anche se non possibile giungere ad una conclusione. Gli introni offrono due grossi vantaggi: 1) generare molti trascritti e proteine differenti a partire da un unico gene. 2) creare nuovi geni attraverso il rimescolamento degli esoni (il 50% degli introni hanno fase 0).

Exon Shuffling
Lipotesi del rimescolamento degli esoni (exon shuffling) supportata dallosservazione che molti esoni codificano per domini proteici indipendenti. Questo offre un notevole grado di flessibilit per la creazione di innovazioni funzionali.

RNA Editing
Lediting dellRNA un meccanismo posttrascrizionale per modificare il significato dellinformazione presente nel trascritto. Esso prevede due meccanismi: 1) deaminazione sitospecifica della citosina; 2) inserzione o delezione di uridine diretta da specifici RNA guida.

RNA Editing: C!U e A!I

Lediting C!U molto diffuso nei mitocondri di piante e riguarda molte posizioni in numerosi mRNA, modificando il significato di circa il 10% dei codoni.

Un altro esempio di editing nei mammiferi la deaminazione delladenosina che produce inosina. Tale modificazione che ha luogo a livello del pre-mRNA pu sia cambiare il pattern di splicing che il significato dei codoni. Difatti, dato che linosina si appaia con la citosina, il il processo di editing A!I pu modificare laminoacido codificato dal codone. Lediting catalizzato dallenzima ADAR (adenosine deaminases acting on RNA) che riconosce una struttura appaiata nellRNA. Un importante bersaglio di questo enzima un canale ionico espresso specificamente nel cervello. Un singolo evento A!I cambia una glutamina in arginina, modificando la permeabilit al calcio del canale. Senza questo editing sia lo sviluppo del cervello che del sistema ematopoietico sono gravemente compromessi.

RNA Editing: inserimento di U

Una forma particolare di editing riguarda i trascritti mitocondriali del tripanosoma. In questo caso il gene codificato sul DNA (criptogene) viene completato dallaggiunta di numerose U nel trascritto, ad opera della TUTasi (terminal uridil transferasi) e guidata da specifici RNA guida di lunghezza compresa tra 40 e 80 nt e codificati da geni differenti.

Il trasporto nucleo-citoplasmatico dellmRNA

Perch lmRNA maturo venga tradotto in una proteina deve essere trasportato nel citoplasma. Questo processo viene regolato per impedire lesportazione di RNA impropri avviene per mezzo di un trasporto attivo mediato dal complesso del poro nucleare che richiede energia fornita dallidrolisi di GTP da una GTPasi denominata Ran. Solo le molecole di mRNA associate al giusto corredo di proteine sono selezionate per il trasporto.