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Espressione del Genoma

L’Espressione del genoma è specifica del tipo di cellula e del suo stato. Essa richiede la sintesi di molecole di RNA (trascrizione) che eventualmente dirigeranno la sintesi di proteine (traduzione).

- l’RNA polimerasi non ha bisogno di un primer

- l’RNA sintetizzato non rimane appaiato allo stampo

- la trascrizione è meno accurata della replicazione (1 mismatch/1000 nt, assenza di meccanismi di riparazione).

stampo - la trascrizione è meno accurata della replicazione (1 mismatch/1000 nt, assenza di meccanismi di

Le RNA polimerasi

I batteri hanno una unica RNA polimerasi, mentre le cellule eucariotiche ne hanno 3*: le

RNA Pol I, Pol II e Pol III. La RNA Pol II è responsabile della trascrizione della maggior

parte dei geni, inclusi quelli codificanti per proteine, e alcuni piccoli RNA nucleari (U 1 , U 2 ,

U 4 , U 5 ) . La RNA Pol I , localizzata nel nucleolo, trascrive il gene per il precursore degli

RNA ribosomiali (40% dei trascritti totali), la RNA Pol III trascrive i geni per i tRNA, alcuni

piccoli RNA nucleari (es. U 6 ) e l’RNA ribosomiale 5S. La struttura 3D dell’RNA polimerasi

ricorda una chela (simile alla mano delle DNA polimerasi).

Procarioti

Eucarioti

Batteri

Archebatteri RNAP I

RNAP II

RNAP III

!

A'/A'' B D L K (+ altre 6)

RPA1

RPB1

RPC1

! '

RPA2

RPB2

RPC2

" #

RPC5

RPB3

RPC5

" ##

RPC9

RPB11

RPC9

$

RPB6

RPB6

RPB6

(+ altre 9)

(+ altre 7)

(+ altre 11)

(*) Nella cellula eucariotica esistono altre RNA polimerasi : l’RNA polimerasi mitocondriale (simile a quella del fago T7) e l’RNA polimerasi dei cloroplasti (simile a quella batterica).

Gli RNA

Caratteristiche:

• Catena polinucleotidica a singolo filamento

• Ribosio anzichè 2’-deossiribosio

• Uracile al posto della timina

• Idrolizzabile in acido a caldo o in NaOH a freddo

• Assorbono luce a una lunghezza d’onda di 260 nm

• Assumono strutture secondarie complesse (si usano agenti denaturanti, come formaldeide o gliossale, per l’analisi elettroforetica)

Procarioti

specie stabili rRNA 23S rRNA 16S rRNA 5S tRNA 4S

specie labili mRNA

Eucarioti

specie stabili rRNA 25-28S rRNA 17-18S rRNA 5.8S rRNA 5S tRNA 4S specie labili pre-mRNA mRNA

Separazione di circa 14 basi Formazione del complesso ternario
Separazione di
circa 14 basi
Formazione
del complesso
ternario

Le tre fasi della trascrizione

La trascrizione si sviluppa in tre fasi distinte: inizio, allungamento e terminazione. L’inizio richiede l’intervento di un promotore, ovvero una sequenza di DNA, cui si lega la RNA polimerasi (insieme ad altri fattori di inizio), prima di iniziare la sintesi dell’RNA in direzione 5’ ! 3’. Il promotore è monodirezionale dato che sono uno dei due filamenti funge da stampo.

Dopo la sintesi di un piccolo frammento di RNA (ca. 10 nt) si passa alla fase di allungamento nella quale la polimerasi si lega ancora più saldamente all’RNA, svolge il DNA davanti, lo riavvolge dietro, stacca la catena di RNA dallo stampo, funziona da correttore di bozze.

Quando tutto il gene è stato trascritto, la polimerasi si ferma e rilascia l’RNA prodotto.

Le trascrizione nei batteri

Il nucleo (core) dell’RNA polimerasi ha un’affinità intrinseca per il DNA basata su interazioni fra l’enzima (basico) e il DNA (acido) e si lega stabilmente a siti di legame aspecifici sul DNA. La specificità della RNA polimerasi per il promotore è conferita da un fattore proteico, chiamato sigma, che forma con la proteina core la RNA polimerasi oloenzima. Il fattore sigma predominante è " 70 che lega due sequenze consenso a -35 e a -10.

RNA polimerasi oloenzima. Il fattore sigma predominante è " 7 0 che lega due sequenze consenso

Le sequenze consenso sono degenerate

Se analizziamo gli elementi -35 di 250 promotori di E.coli (arep.med.harvard.edu/ecoli_matrices/rpoD.html ) osserviamo 147 differenti esanucleotidi (nella tabella i 6 più frequenti).

TTGACA TTGAAA TTTACA TTGATA TTGTCA TTTTCA 10 8 8 6 6 6

TTGACA

TTGAAA

TTTACA

TTGATA

TTGTCA

TTTTCA

10

8

8

6

6

6

La relativa Matrice Posizionale di Frequenza (PWM):

pos

1

2

3

4

5

6

A

16

18

21

137

55

143

C

19

10

24

46

126

24

G

13

12

161

20

20

41

T

202

210

44

47

49

42

Dalla quale si può calcolare il relativo “sequence logo” applicando le seguenti equazioni:

H (i ) = "

I (i) = 2 " H (i )

T

# f (b, i) $ log 2 f (b, i )

b = A

h (i, b) = I (i ) $ f (b, i )

2 " H ( i ) T # f ( b , i ) $ log

Promotori in E.coli

Filamento coding TSS
Filamento coding
TSS

Filamento stampo

Promotori in E.coli Filamento coding TSS Filamento stampo

Il ruolo del fattore "

Il fattore " media il legame della polimerasi al promotore. L’efficienza con cui l’enzima si lega al promotore e inizia la trascrizione varia in funzione delle sequenze consenso e della loro distanza (promotori forti e deboli). Nel fattore " 70 si possono individuare 4 regioni (1-4), la 2 e la 4 sono coinvolte nel legame al DNA. La regione 4 (helix-turn-helix) assicura il legame della RNA polimerasi al promotore, la regione 2 ha anche la funzione di stabilizzare l’apertura del DNA.

il legame della RNA polimerasi al promotore, la regione 2 ha anche la funzione di stabilizzare
il legame della RNA polimerasi al promotore, la regione 2 ha anche la funzione di stabilizzare

La struttura del complesso tra RNA polimerasi e promotore

La transizione tra complesso chiuso e complesso aperto (isomerizzazione) è irreversibile ed è provocata da una transizione strutturale energeticamente favorita. Nell’enzima possiamo distinguere 5 canali.

1
1

NTP uptake

2 3 - 4 Transizione strutturale tra complesso chiuso e aperto 5
2
3
-
4
Transizione strutturale tra
complesso chiuso e aperto
5

La RNA polimerasi non richiede un primer

La trascrizione non richiede l’intervento di un primer, ma è necessaria una interazione molto specifica con il ribonucleotide di inizio, che normalmente è una A.

Dopo l’ingresso del ribonucleotide di inizio nel sito attivo, segue una fase denominata inizio abortivo, nella quale la polimerasi sintetizza brevi frammenti di RNA (<10 nt) che vengono rilasciati senza che la polimerasi si dissoci dallo stampo, sul quale inizia poi la sintesi di un nuovo frammento. Dopo diversi tentativi, quando la RNA polimerasi riesce a sintetizzare un frammento più lungo di 10 nt, inizia la fase di allungamento (v=50 nt/s) e si ha poi il distacco del fattore ". La transizione dalla fase di inizio abortivo a quella di allungamento comporta un cambiamento strutturale della regione "3.1. Un meccanismo analogo viene ricapitolato dalla RNA polimerasi a singola subunità come la RNA polimerasi T7.

Un meccanismo analogo viene ricapitolato dalla RNA polimerasi a singola subunità come la RNA polimerasi T7.

polimerasi T7

Terminazione della trascrizione

Alcune sequenze, dette terminatori inducono il rilascio della RNA polimerasi e del trascritto. I terminatori batterici sono di due tipi: i) rho-indipendenti, e ii) rho-dipendenti. Nel secondo caso la terminazione richiede il fattore proteico rho (che lega siti specifici detti rut). I terminatori rho-indipendenti, detti anche terminatori intrinseci, sono costituiti da una corta sequenza palindromica (ca. 20 nt) cui segue una sequenza di 8 coppie A:T. L’interferenza provocata dalla struttura stem-loop unita alla debolezza del legame A:U favorisce il distacco del trascritto dallo stampo.

La struttura stem-loop assunta dall’RNA provoca la rottura del complesso di allungamento
La struttura stem-loop assunta
dall’RNA provoca la rottura del
complesso di allungamento

Sono evidenziate le mutazioni che hanno dimostrato un effetto deleterio sull’attività del terminatore

La proteina Rho

La proteina Rho, è una proteina essenziale per E.coli. Ha una struttura omoesamenrica (monomero di 46 kDa) e assume una forma ad anello, contiene un dominio di legame al ssRNA e un dominio di legame all’ATP. Si lega all’RNA nascente ed ha attività elicasica.

La proteina Rho, utilizzando l’energia fornita dall’idrolisi dell’ATP, scorre lungo l’RNA e induce la terminazione della trascrizione staccando l’RNA dai suoi contatti con il DNA templato e l’RNA polimerasi.

e induce la terminazione della trascrizione staccando l’RNA dai suoi contatti con il DNA templato e

La trascrizione eucariotica

La struttura della RNA polimerasi eucariotica è molto simile a quella batterica. Tuttavia, mentre nei procarioti interviene un solo fattore addizionale ( " ), negli eucarioti sono richiesti numerosi fattori di inizio addizionali denominati GTF (fattori generali di trascrizione). Dato che In vivo, il DNA è avvolto sui nucleosomi, sono richiesti anche ulteriori fattori proteici quali il complesso mediatore, proteine che modificano la cromatina, ecc.

Il promotore base (core promoter) riconosciuto dalla RNA Pol II è costituito da circa 40 bp a monte e a valle del sito di inizio e contiene sequenze consenso quali BRE, TATA box, INR e DPE, riconosciute da specifici fattori proteici. Di fatto i promotori eucariotici contengono solo alcuni (2 o 3) di questi 4 elementi.

contengono solo alcuni (2 o 3) di questi 4 elementi. Altre sequenze regolatorie sono localizzate ad

Altre sequenze regolatorie sono localizzate ad una distanza variabile dal core promoter, principalmente a monte, quali UAS (upstream activating sequences), enhancers, silencers, boundary elements e insulators, che a loro volta sono riconosciuti da proteine regolatorie che attivano o reprimono il processo di trascrizione.

Il complesso di pre-inizio L’insieme dei GTF, la RNA polimerasi e il promotore formano il

Il complesso di pre-inizio

L’insieme dei GTF, la RNA polimerasi e il promotore formano il complesso di pre-inizio (PIC). Il principale fattore di trascrizione della RNA Pol II è TFIID (TPB + TAFs). Il di legame di TBP al DNA ne induce una marcata distorsione e consente il reclutamento di altri fattori GTF e della stessa RNA polimerasi. L’apertura dei due filamenti a livello del promotore richiede l’intervento di TFIIH e l’idrolisi di ATP. Il passaggio dall’inizio abortivo alla fase di allungamento è segnato dalla fosforilazione della coda CTD (C-terminal domain) dell’enzima su residui di Ser all’interno di ripetizioni eptapeptidiche (PTSPSYS, 52 ripetizioni nei mammiferi). La fosforilazione dell’enzima facilita l’evasione della polimerasi dal promotore.

I Fattori Generali di Trascrizione

Il legame di TBP al promotore determina un marcato ripiegamento del DNA, facilitata dalla sequenza TATA.

ripiegamento del DNA, facilitata dalla sequenza TATA. GTF Subunità TBP (TFIID) TAF (TFIID) TFIIA TFIIB

GTF

Subunità

TBP (TFIID) TAF (TFIID) TFIIA TFIIB TFIIE TFIIF TFIIH

1

11

2

1

2

3

9

(Lievito)

Tutti i GTF hanno ruoli specifici nel processo di inizio. Alcuni TAF hanno una similarità strutturale con le proteine istoniche (es. TAF42:TAF62 in Drosophila formano un complesso simile ad H3:H4). Di particolare importanza il ruolo di TFIIH che ha attività ATPasica, chinasica e elicasica.

Il ruolo degli altri fattori proteici

Il DNA è normalmente impaccato nei nucleosomi e nella cromatina. Pertanto, l’inizio della trascrizione in vivo richiede l’intervento di altri fattori proteici quali il complesso mediatore, proteine regolatrici della trascrizione (attivatori) e enzimi che rimodellano la cromatina.

quali il complesso mediatore, proteine regolatrici della trascrizione (attivatori) e enzimi che rimodellano la cromatina.
quali il complesso mediatore, proteine regolatrici della trascrizione (attivatori) e enzimi che rimodellano la cromatina.

Allungamento della Trascrizione

La fosforilazione del CTD, che avviene in concomitanza con l’inizio della fase di allungamento, provoca uno scambio tra i fattori di inizio e quelli necessari per l’allungamento e la maturazione dell’RNA. I fattori di allungamento includono P-TEFb (fosforilazione S2), hSPT5, TAT-SF1, TFIIS (correzione di bozze)

includono P-TEFb (fosforilazione S2), hSPT5, TAT-SF1, TFIIS (correzione di bozze) Fattori di splicing Fattori di capping
includono P-TEFb (fosforilazione S2), hSPT5, TAT-SF1, TFIIS (correzione di bozze) Fattori di splicing Fattori di capping

Fattori di

splicing

Fattori di

capping

Maturazione dell’mRNA - capping Prima di essere esportato dal nucleo e poi tradotto l’mRNA deve

Maturazione dell’mRNA - capping

Prima di essere esportato dal nucleo e poi tradotto l’mRNA deve subire un porcesso di maturazione che prevede: i) l’aggiunta di un cap al 5’; ii) la rimozione degli introni; iii) l’aggiunta della coda di polyA al 3’. I fattori di allungamento reclutano alcune delle componenti dei macchinari di maturazione del’mRNA, evidenziando una stretta correlazione tra i due processi.

Il capping consiste nell’aggiunta di una 7mG all’estremità del trascritto con un insolito legame 5’-5’. Esso avviene quando l’RNA è lungo 20-40 nt, ovvero nella fase di transizione tra inizio e allungamento.

Maturazione dell’mRNA - aggiunta della coda di polyA Quando la polimerasi raggiunge il segnale di

Maturazione dell’mRNA - aggiunta della coda di polyA

Quando la polimerasi raggiunge il segnale di poliadenilazione, in prossimità della fine del gene, vengono reclutati dal CTD due fattori proteici: CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) e CstF (cleavage stimulation factor) che a loro volta reclutano altre proteine che effettuano il taglio dell’RNA e l’aggiunta della coda di polyA. L’mRNA così maturo viene rilasciato dalla polimerasi, che per un tratto continua la sintesi di RNA sullo stampo, e quindi trasferito dal nucleo al citoplasma dove sarà tradotto.

RNA Polimerasi I

Il promotore della RNA Pol I è dedicato alla espressione di un singolo gene (presente nel genoma in copie multiple in tandem): il precursore degli rRNA, il cui livello di espressione è molto più alto di quello di tutti gli altri geni.

è molto più alto di quello di tutti gli altri geni. B A Il promotore di
è molto più alto di quello di tutti gli altri geni. B A Il promotore di

B

A

Il promotore di Pol I ha una struttura bipartita: il core promoter e l’UCE (upstream control element). L’UCE lega due fattori: UBF e SL1 (TBP+TAFs), che a loro volta stimolano la trascrizione reclutando la Pol I sul core promoter,

RNA Polimerasi III

I promotori della RNA Pol III possono avere strutture differenti. Alcuni hanno l’insolita caratteristica di essere posizionati a valle del sito di inizio della trascrizione. I promotori per i tRNA hanno una struttura bipartita (box A e B) e, come gli altri promotori, richiedono fattori di trascrizione addizionali, oltre alla RNA polimerasi.

(box A e B) e, come gli altri promotori, richiedono fattori di trascrizione addizionali, oltre alla

I geni eucariotici sono discontinui

I geni eucariotici sono discontinui. Il trascritto maturo (mRNA) viene generato a partire da un RNA precursore attraverso la rimozione degli introni e la concatenazione degli esoni (il termine esone (exon) deriva dal nome del gene hexon di adenovirus in cui nel 1977 è stato scoperto lo splicing).

Unità trascrizionale

1977 è stato scoperto lo splicing). Unità trascrizionale promotore Esone 1 GT…introne…AG Esone 2
1977 è stato scoperto lo splicing). Unità trascrizionale promotore Esone 1 GT…introne…AG Esone 2

promotore

Esone 1

promotore Esone 1 GT…introne…AG Esone 2 GT…introne…AG Esone
promotore Esone 1 GT…introne…AG Esone 2 GT…introne…AG Esone

GT…introne…AG

Esone 2

GT…introne…AG

Esone

3

TrascrizioneEsone 2 GT…introne…AG Esone 3 Esone 1 GU…introne…AG Esone 2

Esone 1

Esone 1

GU…introne…AG

Esone 2

GU…introne…AG

Esone 3

SplicingEsone 2 GU…introne…AG Esone 3 Esone 1 Esone 2 Esone 3 5’UTR CDS 3’UTR

Esone 1

Esone 2

Esone 3

Esone 2 GU…introne…AG Esone 3 Splicing Esone 1 Esone 2 Esone 3 5’UTR CDS 3’UTR mRNA
Esone 2 GU…introne…AG Esone 3 Splicing Esone 1 Esone 2 Esone 3 5’UTR CDS 3’UTR mRNA

5’UTR

CDS

3’UTR

mRNA

I geni umani

I geni umani hanno le seguenti caratteristiche (valori medi):

Lunghezza:

27 kbp

Numero di esoni:

8.8

Lunghezza esoni (interni):

Lunghezza introni :

Lunghezza 5’UTR:

Lunghezza CDS:

Lunghezza 3’UTR:

146 bp 3365 bp 300 bp 1341 bp (447 aa) 770 bp

Il numero di esoni può variare da 1 fino ad oltre 300 (titina). La lunghezza complessiva degli esoni è pari a circa il 10% della lunghezza complessiva degli introni, che possono essere anche molto lunghi, fino a 800 kbp. Il gene umano più grande è la distrofina (2,4 Mbp).

Lo splicing dell’mRNA

La precisa rimozione delle sequenze introniche dipende dalla presenza di specifiche sequenze che segnano le estremità degli introni: i siti di splicing al 5’ e al 3’.

La rimozione degli introni richiede due reazioni successive di transesterificazione (S N 2).
La rimozione degli introni richiede
due reazioni successive di
transesterificazione (S N 2).

Lo splicing dell’mRNA

L’introne rimosso dallo splicing contiene una struttura a cappio (lariat) e viene rapidamente degradato assicurando l’irreversibilità della reazione di splicing.

una struttura a cappio (lariat) e viene rapidamente degradato assicurando l’irreversibilità della reazione di splicing.
una struttura a cappio (lariat) e viene rapidamente degradato assicurando l’irreversibilità della reazione di splicing.

Trans-splicing

E’ possibile che lo splicing concateni, con un meccanismo analogo a quello del cis-splicing, due esoni derivanti da molecole distinte di mRNA. Ad esempio, molti trascritti di C.elegans e C.intestinalis, contengono uno Spliced Leader (SL) aggiunto per trans-splicing.

C.intestinalis , contengono uno Spliced Leader (SL) aggiunto per trans-splicing. SL di C. intestinalis TTCTACCTCAGAGGAG

SL di C. intestinalis

TTCTACCTCAGAGGAG

Lo Spliceosoma

Le reazioni di splicing sono realizzate - utilizzando l’energia fornita da diverse molecole di ATP - da un grosso complesso ribonucleoproteico, denominato Spliceosoma, costituito da 5 RNA e circa 150 proteine.

RNA e c i r c a 1 5 0 p r o t e i

Gli RNA componenti lo spliceosoma, detti small nuclear RNAs (snRNA), sono gli RNA U1, U2, U4, U5 e U6, hanno lunghezza compresa tra 100 e 300 nt, e formano complessi con diverse proteine costituendo le cosiddette small nuclear r i b o n u c l e o p r o t e i n (snRNP). Il ruolo delle snRNP è: 1) riconoscere il sito di splicing al 5’ e il punto di ramificazione; 2) avvicinare tra loro questi siti; 3) catalizzare le reazioni di transesterificazione. Tali funzioni coinvolgono: i) interazioni RNA-RNA; ii) interazioni RNA-proteina; iii) interazioni proteina-proteina.

Poly-Py
Poly-Py

A

Complesso

precoce

Complesso

Complesso

B

Il meccanismo dello splicing

Dopo la formazione del complesso precoce, ls snRNP U2 si lega al punto di ramificazione spiazzando BBP (branching point binding protein). L’appaiamento con l’RNA U2 espone la A (branching point) in modo da attivarla per la prima reazione di transesterificazione.

da attivarla per la prima reazione di transesterificazione. Nella fase successiva si ha l’avvicinamento di tutti

Nella fase successiva si ha l’avvicinamento di tutti e tre i siti coinvolti nello splicing, attraverso l’intervento della tripla snRNP U4/U6*U5. Nel passaggio successivo U6 rimpiazza U1.

coinvolti nello splicing, attraverso l’intervento della tripla snRNP U4/U6*U5. Nel passaggio successivo U6 rimpiazza U1.
Poly-Py
Poly-Py

A

Complesso

precoce

Complesso

Complesso

B

Complesso

C

Il meccansimo dello splicing

Completato l’assemblaggio, U4 lascia il complesso e permette a U6 di interagire con U2.

U4 lascia il complesso e permette a U6 di interagire con U2. Si forma in questo

Si forma in questo modo il complesso C nel quale si produce il sito attivo. Si realizza quindi la prima reazione di transesterificazione. Subito dopo si ha la seconda reazione di transesterificazione supportata dalla snRNP U5.

Tre tipi di splicing nelle cellule

Gli introni del gruppo I e del gruppo II sono capaci di autosplicing (self-splicing). Gli introni capaci di self-splicing hanno una lunghezza compresa tra 400 e 1000 nt e presentano una estesa conservazione sia nella sequenza che nella struttura secondaria. L’avvento delle proteine - nel corso dell’evoluzione - ha rilassato le costrizioni funzionali a livello delle sequenze introniche.

  Macchinario Classe Diffusione Meccanismo catalitico pre-mRNA due reazioni di transesterificazione (A al
  Macchinario Classe Diffusione Meccanismo catalitico pre-mRNA due reazioni di transesterificazione (A al
  Macchinario Classe Diffusione Meccanismo catalitico pre-mRNA due reazioni di transesterificazione (A al
 

Macchinario

Classe

Diffusione

Meccanismo

Classe Diffusione Meccanismo catalitico

catalitico

pre-mRNA

due reazioni di transesterificazione (A al punto di ramificazione)

 

nucleari

mRNA eucariotici

 

Spliceosoma maggiore

Introni del

due reazioni di transesterificazione (A al punto di ramificazione)

 

gruppo II

alcuni geni di organelli e eucarioti, alcuni geni procariotici

 

Enzima a RNA codificato dall'introne

Introni del

due reazioni di transesterificazione (una G libera catalizza la prima transesterificazione)

 

gruppo I

rRNA nucleari di alcuni eucarioti, geni degli organelli e qualche gene procariotico

 

Enzima a RNA codificato dall'introne

di alcuni eucarioti, geni degli organelli e qualche gene procariotico   Enzima a RNA codificato dall'introne

Tre tipi di splicing nelle cellule

Gli introni del gruppo I sono più piccoli di quelli di gruppo II e contengono una tasca un grado di legare qualunque nucleoside o nucleotide, e una sequenza guida che riconosce il sito al 5’.

una tasca un grado di legare qualunque nucleoside o nucleotide, e una sequenza guida che riconosce

Meccanismi per la corretta selezione dei siti di splicing

Possono essere commessi errori nella selezione dei siti di splicing.

essere commessi errori nella selezione dei siti di splicing. Vi sono due modi diversi per minimizzare

Vi sono due modi diversi per minimizzare gli errori: 1) man mano che la trascrizione procede i siti di splicing vengono caricati di specifiche componenti proteiche dalla coda CTD della polimerasi, in questo modo un sito 3’ a valle di un sito 5’ viene riconosciuto proma che gli altri competori siano sintetizzati; 2) gli esoni vengono marcati dalle proteine SR (Ser+Arg) che si legano agli ESE (exonic splicing enhancers) e reclutano alcune componenti del macchinario di splicing.

(Ser+Arg) che si legano agli ESE ( exonic splicing enhancers ) e reclutano alcune componenti del

Lo splicing alternativo

Uno stesso gene può generare diversi trascritti (e prodotti proteici) in seguito all’uso di diversi promotori (d), siti di terminazione della trascrizione (e) o splicing alternativo (a, b, c, f, g).

all’uso di diversi promotori (d), siti di terminazione della trascrizione (e) o splicing alternativo (a, b,

Lo splicing alternativo

Splicing alternativo del gene per la troponina T

alternativo Splicing alternativo del gene per la troponina T Splicing alternativo del gene DSCAM in Drosophila

Splicing alternativo del gene DSCAM in Drosophila

12x48x33x2= 38,016

Lo splicing alternativo

Lo splicing alternativo può essere costitutivo o regolato. Nel primo caso vengono sempre generate diverse isoforme dal trascritto primario. Nel secondo caso diverse forme vengono generate in tempi diversi, in differenti tessuti, o in risposta a stimoli e condizioni differenti.

tessuti, o in risposta a stimoli e condizioni differenti. Splicing alternativo dell’antigene T di SV40 Lo

Splicing alternativo dell’antigene T di SV40

Lo splicing aternativo è regolato da proteine che si legano a specifici attivatori (enhancer) o repressori (silencers) dello splicing che si trovano negli esoni (ESE, ESS) o negli introni (ISE, ISS).

Regolazione dello splicing alternativo

Lo splicing alternativo regolato può avvalersi sia di attivatori che di repressori.

regolato può avvalersi sia di attivatori che di repressori. Le proteine SR (attivatori) si legano all’RNA

Le proteine SR (attivatori) si legano all’RNA mediante un dominio RRM (RNA Recognition Motif) e contengono nella regione c- terminale anche un dominio RS (Arg+Ser) che media le interazioni tra la proteine SR e le altre proteine componenti del macchinario di splicing.

Regolazione dello splicing alternativo

I silenziatori vengono riconosciuti dalle proteine hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) che bloccano specifici siti di splicing, impedendone il loro utilizzo.

specifici siti di splicing, impedendone il loro utilizzo. Le proteine alternative generate dallo splicing (isoforme)

Le proteine alternative generate dallo splicing (isoforme) possono avere funzioni simili, distinte o perfino antagoniste. In alcuni casi lo splicing alternativo viene semplicemente usato per spegnere un gene generando un trascritto non funzionale che viene immediatamente degradato.

Alcuni RNA sono processati da uno spliceosoma alternativo Esiste una spliceosoma, costituito da alcune componenti

Alcuni RNA sono processati da uno spliceosoma alternativo

Esiste una

spliceosoma, costituito da alcune componenti in comune con lo spliceosoma maggiore e altre invece specifiche, come U11 e U12 che sostituiscono le componenti U1 e U2. Gli introni rimossi da questo splicesoma hanno siti di splicing differenti, quali AT-AC.

di

forma

minore

Le sequenze consenso dei diversi tipi di introne

Le sequenze consenso dei diversi tipi di introne E’ stato proposto che gli introni AT-AC siano

E’ stato proposto che gli introni AT-AC siano evoluti per primi dagli introni di classe II, per poi dare origine agli introni canonici GT-AG.

Due teorie sull’origine degli introni

Sono state fatte due ipotesi per spiegare l’origine degli introni: 1) ipotesi degli introni precoci (intron early); 2) ipotesi degli introni tardivi (intron late). Probabilmente, l’ipotesi “intron early” è più convincente, anche se non è possibile giungere ad una conclusione.

Gli introni offrono due grossi vantaggi:

1) generare molti trascritti e proteine differenti a partire da un unico gene. 2) creare nuovi geni attraverso il rimescolamento degli esoni (il 50% degli introni hanno fase 0).

da un unico gene. 2) creare nuovi geni attraverso il rimescolamento degli esoni (il 50% degli

Exon Shuffling

L’ipotesi del rimescolamento degli esoni (exon shuffling) è supportata dall’osservazione che molti esoni codificano per domini proteici indipendenti. Questo offre un notevole grado di flessibilità per la creazione di innovazioni funzionali.

domini proteici indipendenti. Questo offre un notevole grado di flessibilità per la creazione di innovazioni funzionali.

RNA Editing

L’editing dell’RNA è un meccanismo post- trascrizionale per modificare il significato dell’’informazione presente nel trascritto. Esso prevede due meccanismi: 1) deaminazione sito- specifica della citosina; 2) inserzione o delezione di uridine diretta da specifici RNA guida.

1) deaminazione sito- specifica della citosina; 2) inserzione o delezione di uridine diretta da specifici RNA
1) deaminazione sito- specifica della citosina; 2) inserzione o delezione di uridine diretta da specifici RNA

RNA Editing: C! U e A! I

L’editing C !U è molto diffuso nei mitocondri di piante e riguarda molte posizioni in numerosi mRNA, modificando il significato di circa il 10% dei codoni.

Un altro esempio di editing nei mammiferi è la deaminazione dell’adenosina che produce inosina. Tale modificazione che ha luogo a livello del pre-mRNA può sia cambiare il pattern di splicing che il significato dei codoni. Difatti, dato che l’inosina si appaia con la citosina, il il processo di editing A ! I può modificare l’aminoacido codificato dal codone. L’editing èè

catalizzato dall’enzima ADAR (adenosine deaminases acting on RNA) che riconosce una

struttura appaiata nell’RNA. Un importante bersaglio di questo enzima è un canale ionico

espresso specificamente nel cervello. Un singolo evento A !I

arginina, modificando la permeabilità al calcio del canale. Senza questo editing sia lo sviluppo del cervello che del sistema ematopoietico sono gravemente compromessi.

cambia una glutamina in

editing sia lo sviluppo del cervello che del sistema ematopoietico sono gravemente compromessi. cambia una glutamina
editing sia lo sviluppo del cervello che del sistema ematopoietico sono gravemente compromessi. cambia una glutamina

RNA Editing: inserimento di U

Una forma particolare di editing riguarda i trascritti mitocondriali del tripanosoma. In questo caso il gene codificato sul DNA (criptogene) viene completato dall’aggiunta di numerose U nel trascritto, ad opera della TUTasi (terminal uridil transferasi) e guidata da specifici RNA guida di lunghezza compresa tra 40 e 80 nt e codificati da geni differenti.

transferasi) e guidata da specifici RNA guida di lunghezza compresa tra 40 e 80 nt e
transferasi) e guidata da specifici RNA guida di lunghezza compresa tra 40 e 80 nt e

Il trasporto nucleo-citoplasmatico dell’mRNA

Perché l’mRNA maturo venga tradotto in una proteina deve essere trasportato nel citoplasma. Questo processo viene regolato per impedire l’esportazione di RNA impropri avviene per mezzo di un trasporto attivo mediato dal complesso del poro nucleare che richiede energia fornita dall’idrolisi di GTP da una GTPasi denominata Ran. Solo le molecole di mRNA associate al giusto corredo di proteine sono selezionate per il trasporto.

GTPasi denominata Ran. Solo le molecole di mRNA associate al giusto corredo di proteine sono selezionate