Dima Jenny 23/11/2021

3^BTCS Esperienza n°6

Titolo : Colorazione semplice di un preparato batteriologico , parte A & B

Scopo: Osservare il batterio Escherichia coli ed Eterococco faecalis mediante colorazione semplice,
valutandole disposizione e forma

Cenni teorici:

PARTE A

 L'Escherichia coli (E. coli) è la specie di batterio più nota del genere Escherichia. Costituisce parte
integrante della normale flora intestinale dell'uomo e di altri animali. Nonostante la maggior parte
dei ceppi di E. coli siano innocui, ne esistono tuttavia alcuni che mettono a rischio la salute umana
causando disturbi di diversa gravità – crampi addominali, vomito, diarrea con sangue.

PARTE B

 Enterococcus faecalis è un batterio gram positivo che popola abitualmente il tratto

gastrointestinale di molti uomini ed altri mammiferi.
Enterococcus faecalis veniva identificato all'interno del genere degli streptococchi non-emolitici di
gruppo D. Solo negli anni Ottanta, venne creato un nuovo genere a sé stante, in cui Enterococcus
faecalis - insieme a Enterococcus faecium - ricopre un ruolo preminente.
l'Enterococcus faecalis subisce una trasformazione da microorganismo simbionte a patogeno
opportunista: in simili circostanze, il batterio, divenuto patogeno, può costituire un serio problema
all'uomo dunque scatenare infezioni potenzialmente fatali.

 La fissazione, e il passaggio in cui si cerca di fissare le molecole di un tessuto allo stato chimico
e nella posizione in cui si trovavano in vivo, inoltre, per evitare l’autolisi, si agisce sulle
componenti proteiche inattivando degli enzimi, essa favorisce l’osservazione e la colorazione,
consente ai coloranti di penetrare nei tessuti e di fissarsi a particolari strutture. Questa e una
delle fasi più importanti, in quanto tende a prevenire la decomposizione e mantiene inalterato
il quadro strutturale dei tessuti.
 I fissativi utilizzati si distinguono in fissativi fisici e  fissativi chimici.
La fissazione fisica  può avvenire per rapido  riscaldamento, in cui il campione viene essiccato
eliminando l’acqua e denaturando la componente proteica, oppure tramite congelamento. Il
congelamento prevede due metodi: il metodo del  congelamento-
essiccamento e  congelamento-sostituzione.

 Essiccamento e il passaggio che permette al preparato di seccarsi sempre di più per fare in modo
anche disperdendo alcune gocce di colorante il preparato non si perda

Materiale:

 Vetrino porta oggetto (76•26•1,2 mm)

 Microscopio ottico
 Olio di cedro (Osservazione 1000X)
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 Carta da laboratorio
 Alcol etilico
 Ansa
 Vaschetta di colorazione
 Pinza di legno
 Piastra di E.Faecalis
 Provetta brodo coltura di E.coli
 Blu di Metilene:

Pittogramma di rischio: GHS7

FRASI H: 226 = Liquido e vapori infiammabili.

FRASI P: 210= Tenere lontano da fonti di calore, superfici riscaldate,

scintille, fiamme e altre fonti di innesco. Vietato fumare

Rischio e prevenzione

Rischio

Rischio Fisico / Chimico

 Possibile rischio di taglio con i vetrini

 Utilizzo improprio del materiale e del colorante
 Microscopio ottico utilizzato non adeguatamente
 Blu di Metilene

Prevenzione

 Fare attenzione all'uso dei materiali

 Smaltimento adeguato dei materiali utilizzati
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Procedimento:

Parte A

 Prendere occorrente per esperienza

 Sgrassare i vetrini
 Siglare su vetrino con il nome ,cognome ,il tipo di battere e la data
 Accendere il bunsen, e portare la fiamma da riducente a ossidante
 Afferrare l'ansa e con movimenti verticali portare alla sterilizzazione di essa in modo che non ci
siano rischi per operatore
 Aprire leggermente la provetta batteriologia in modo che quando andremo a prelevare con ansa
non avremo il rischio di romperla
 Stappata la provetta batteriologica essa viene messa all'esterno dell'ambiente quindi portare
vicino il collo della provetta alla fiamma ossidante e passarla due, tre volte
 Con ansa precedentemente sterilizzata quindi ancora calda quindi poggiarlo sui lati della
provetta per raffreddarla e subito dopo iniziare a prelevare un po' di brodo coltura
 In seguito chiudere la provetta e iniziare a compiere dei movimenti circolari sul vetrino in modo
che tutto il preparato sia diluito in seguito appoggiare tutto delicatamente sul porta provette e
iniziare a distendere il preparato sul vetrino con movimenti circolari
 Prendere il bunsen
 Arroventare di nuovo ansa in modo che non ci siano rischi biologici
 Afferrare il vetrino attraverso utilizzo delle pinze di legno nelle sue estremità e posizionarlo
sopra la fiamma in modo che tutto il preparato si asciughi , la posizione del vetrino deve essere
alta in modo che il vetrino non si bruci
 Durante questo passaggio il vetrino dovrebbe risultare opaco
 Prendere la vaschetta e appoggiarci il vetrino e far cadere sopra delle gocce di colorante di blu di
metilene
 Aspettare tre minuti in modo che il colorante agisca
 Passato il tempo rovesciare il colorante sulla vaschetta e il rimasuglio di colorante smaltirlo
utilizzando acqua distillata
 Il preparato successivamente deve essere ripulito tamponando utilizzando della carta di
laboratorio
 Prendere il microscopio ed igienizzarlo
 Porto all'ingrandimento esplorativo e iniziare ad osservare con tutti i tipi d'ingrandimento e
determinare la composizione e la forma
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 Quando si arriva a dover osservare ingrandimento 1000X togliere il vetrino

 Porci sopra olio di cedro e prima metter a fuoco con gli altri ingrandimenti fino ad arrivare
all'utilizzo dell'olio facendo attenzione a non danneggiare il microscopio
 Finita osservazione igienizzare il microscopio portandolo all'ingrandimento 40X e con tutto il
tavolino abbassato e riporlo nel suo posto

Parte B

 Prendere occorrente per esperienza

 Sgrassare i vetrini
 Siglare su vetrino con il nome e cognome il tipo di battere a la data
 Accendere il bunsen, e portare la fiamma da riducente a ossidante
 Afferrare l'ansa e con movimenti verticali portare alla sterilizzazione di essa in modo che non ci
siano rischi per operatore
 Successivamente aprire leggermente la piastra e riuscire a prendere nelle colonie che vediamo
nelle piastre cercando di non raccoglierne troppo materiale che può portare alla non adeguata
osservazioni di essi
 In seguito appoggiare tutto delicatamente sul porta provette e iniziare a distendere il preparato
sul vetrino con movimenti circolari
 Prendere il bunsen
 Arroventare di nuovo ansa in modo che non ci siano rischi biologici
 Afferrare il vetrino attraverso utilizzo delle pinze di legno nelle sue estremità e posizionarlo
sopra la fiamma in modo che tutto il preparato si asciughi , la posizione del vetrino deve essere
alta in modo che il vetrino non si bruci
 Durante questo passaggio il vetrino dovrebbe risultare in opaco
 Prendere la vaschetta e appoggiarci il vetrino e far cadere sopra delle gocce di colorante di blu di
metilene
 Aspettare tre minuti in modo che il colorante agisca
 Passato il tempo rovesciare il colorante sulla vaschetta e il rimasuglio di colorante smaltirlo
utilizzando acqua distillata
 Il preparato successivamente deve essere ripulito tamponando utilizzando della carta di
laboratorio
 Prendere il microscopio ed igienizzarlo
 Portare all'ingrandimento esplorativo e iniziare ad osservare con tutti i tipi d'ingrandimento e
determinare la composizione
 Quando si arriva a dover osservare ingrandimento 1000X togliere il vetrino
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 Porci sopra olio di cedro e prima cercare di mettere a fuoco con gli altri ingrandimenti fino ad
arrivare all'utilizzo dell'olio facendo attenzione a non danneggiare il microscopio
 Finita osservazione igienizzare il microscopio portandolo all'ingrandimento 40X e con tutto il
tavolino abbassato e riporlo nel suo posto

Dati sperimentali:

Parte A

Ingrandimento 1000 X : Il preparato si presenta in forma bastoncillare quindi

esso appartine alla famiglia dei bacilli , possiamo notare che e di colore blu a
cause del colorante.

Sono molto ridotti quindi capiamo che questo tipo di preparato è stato
difficile da allestire , è la non riuscita può essere causata dal fatto che ci
possono essere stati dei passaggi non eseguiti adeguatamente come la
fissazione per esempio e questo porta alla non osservazione del preparato

Parte B

Ingrandimento 40 X :

il preparato si presenta in colorazione blu e possiamo notare come

in questo ingrandimento non riusciamo a distinguere nessuna forma
perché si sta utilizzando un ingrandimento che permette
osservazione superficiale del preparato
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Ingrandimento 100 X : in questo ingrandimento iniziamo a notare il

E.faecalis sempre più avvicinato e riusciamo quasi a determinare la
forma sferica di esso , si presenta sempre in colorazione blu e da questa
immagine possiamo notare come in esso le forme sferiche saranno tutte
insieme unite tra di loro

ingrandimento 400 X:

In questo ultimo ingrandimento ad aria riusciamo ad osservare che questo

preparato avrà una foto sferica perché nei bordi della porzione di preparato
possiamo vedere già delle forme sferiche

Ingrandimento 1000X

Il preparato già anticipato ha una forma sferica quindi determiniamo già che
essa fa parte della famiglia dei cocchi, alcuni sono vicini tra di loro forse
perché abbiamo prelevato troppo preparato pero comuqnue lo riusciamo a
determinare. Il colorante invece ci da sempre idea di come risulti la sua
forma

Conclusioni:

In questa esperienza non abbiamo solo allestito un preparato con successo ama anche determinato
ancora determinato uso de microscopio ma anche esplorazione e osservazione di entrambi i batteri con
successo attraverso uso dei coloranti , questi due preparati hanno derivazione e forma diversa perche nella
parte A abbiamo E. coli che e un batterio che fa parte della famiglia dei bacilli invece nella parte B abbiamo
E.faecalis che fa parte della famiglia dei cocchi