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Proprietà della fluorescenza

 Tempo di vita dello stato eccitato

kr= costante di decadimento radiativo

kn.r.= costante di decadimento attraverso i processi non radiativi
 Tempo di vita dello stato eccitato
Eccitazione IMPULSATA (δ di Dirac)

kr= costante di decadimento radiativo

kn.r.= costante di decadimento attraverso i
processi non radiativi
[N1]= concentrazione di molecole nello stato
eccitato

d [ N1 ] d [ N1 ]
= −(k r + k nr )[ N1 ] = −(k r + k nr )dt
dt [ N1 ]
 [N ] 
[ N1 ] t
d [ N1 ]
∫
[ N1 ]0
[ N1 ]
= −(k r + k nr ) ∫ dt
0
ln 1  = −(k r + k nr )t
 [ N1 ]0 
[ N1 ]
= e −( kr + knr )t [ N1 ] = [ N1 ]0 e −( kr + knr )t
[ N1 ]0
 Tempo di vita dello stato eccitato
t
− 1
[ N1 ] = [ N1 ]0 e − ( k r + k nr ) t
[ N1 ] = [ N1 ]0 e τ
τ=
t
k r + k nr
−
F ∝ k r [ N1 ] F = F0 e τ
N.B.
[ N1 ] F −
t
τ dipende anche da knr
= =e τ
[ N1 ]0 F0 τ F ≈ ns τ P ≈ ms − min.
1

τ=10 ns
1
τ=10 ns

0
0

[N ]/[N ] o F/F
[N ]/[N ] o F/F

1 0
1 0

0.5
1 0.1
1

0 0.01
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
Time (ns)
 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 =

τ =
∞
∫0 𝑡𝑡�𝑑𝑑 𝑁𝑁1 𝑡𝑡
∞ =
∫0 𝑑𝑑 𝑁𝑁1 𝑡𝑡
= ∞ 𝑑𝑑 𝑁𝑁
∫0 𝑡𝑡� 𝑑𝑑𝑑𝑑1 �𝑑𝑑𝑑𝑑
tempo =
𝑁𝑁1 0
∞ =

di =
−1
𝑁𝑁1 0
𝑡𝑡 𝑁𝑁1
∞
0
∞
− ∫0 𝑁𝑁1 � 𝑑𝑑𝑑𝑑 =
vita ∞ −𝑡𝑡 −𝜏𝜏
𝑡𝑡 ∞
=∫0 𝑒𝑒 𝜏𝜏 � 𝑑𝑑𝑑𝑑 − 𝑡𝑡𝑒𝑒 =
medio ∞ ∞
0

𝑡𝑡 𝑡𝑡
−𝜏𝜏 −𝜏𝜏
= −𝜏𝜏𝑒𝑒 0 − 𝑡𝑡𝑒𝑒 0 =
𝑡𝑡
−𝜏𝜏
=0 + 𝜏𝜏 − lim 𝑡𝑡𝑒𝑒 + 0=
𝑡𝑡→∞

= 𝜏𝜏
 Resa quantica di un processo di rilassamento
decadimenti tramite il processo j kj
Φj = =
totale decadimenti ∑ ki
∑Φ j = 1
i
0 ≤ Φ j ≤1
j

Resa quantica di fluorescenza

decadimenti radiativi kr fotoni emessi
ΦF = = ΦF =
totale decadimenti k r + k nr fotoni assorbiti

Sperimentalmente, per molecole organiche, si trova 105 s −1 ≤ kr ≤ 109 s −1

kr ∝ ε 105 s −1 ≤ knr ≤ 1011 s −1
 kr 1
ΦF = τF = Φ F = krτ F
kr + knr kr + knr
ΦF 1 1 ΦF 1
kr = knr = − kr = − = (1 − Φ F )
τF τF τF τF τF

1,1‘-dietil-2,2’-cianina
Chem. Phys Lett. 1986 130: 426.
11
0.6 10

k
T=84 K r

k
10 nr
0.4 10
Resa quantica

k (s )
-1 9
0.2 10

T=298 K 8
0 10
0 0.5 1 1.5 2 100 150 200 250 300
τ (ns) T (K)
Competizione tra processi radiativi e non radiativi

N.B. ogni
singola
molecola
decade in un
modo o
nell’altro

k nr >> k r k nr << k r
kr kr
ΦF = ≅0 ΦF = ≅1
k r + k nr k r + k nr
Molecola non fluorescente Molecola molto fluorescente
 Fluorescenza vs Fosforescenza

• Fluorescenza: S1 ->S0
• Fosforescenza: T1->S0
• kr(fluor.)>>kr (fosf.)
• Tipicamente
Φ(fluor.)>>Φ(fosf.)
• Tipicamente
τ(fluor.)∼ns; τ(fosf.)≥μs
 Solo alcune molecole sono fluorescenti: fluorofori
Questa è una limitazione, ma anche un vantaggio per sensibilità e selettività
La «brillanza» dipende dal coefficiente di estinzione molare e dalla resa quantica
•Minore probabilità di transizioni radiative
•Maggiore probabilità di conversione intersistema
 Rigidità e resa quantica

•Processi non radiativi inibiti

•Geometria di S0 ed S1 simile →elevati fattori FC
Fluorofori naturali
Fluorescenza
intrinseca di
proteine

Quantum yields:
•Phe 0.03
•Tyr 0.14
•Trp 0.13
 Green Fluorescent Protein (GFP)
• Proteina isolata da una medusa fluorescente
(Aequorea victoria).
• Sequenziata nel 1992, espressa nel 1994.
• Fluoresce nel verde!
• Il cromoforo è formato da una ciclicizzazione
autocatalitica dei residui Ser65, Tyr66, Gly67.

2008 Chimica
 GFP
• Poiché la formazione del fluoroforo è autocatalitica, la proteina
può essere espressa in qualunque cellula e rimane fluorescente.
• In questo modo, creando delle proteine di fusione, è possibile
marcare in modo selettivo qualunque proteina di interesse, in
vivo.
• Esistono molti mutanti con fluorescenza di diversi colori.
• Espressione genica, localizzazione, etc.
• Nota: questa proteina è un cilindro di circa 2.4 x 4.2 nm
(perturbazione!)
Conseguenze del diagramma di Jablonski
Spostamento di Stokes

• La luce emessa ha
sempre energie minori
di quella assorbita.
 Stokes e la scoperta della fluorescenza
(1852)
Chinino:
• farmaco antimalarico
• estratto dalla corteccia dell’albero della china
• usato fin dall’antichità in Perù
• meccanismo d’azione ancora non chiaro.
• molto amaro, veniva mischiato insieme al gin, acqua, zucchero nelle
colonie inglesi: gin & tonic, acqua tonica.

“It was certainly a curious sight to see the tube instantaneously lighted up when plunged into
the invisible rays: it was literally darkness visible. Altogether the phenomenon had something
of an unearthly appearance.” Stokes, G. G. Philos. Trans. 1852, 142, 463–562.
 Perché «fluorescenza»? Che c’entra il fluoro?
I am almost inclined to coin a word, and call the appearance fluorescence,
from fluorspar, as the analogous term opalescence is derived from the
name of a mineral.
• Fluorite (CaF2, fluoruro di calcio)
• Il nome (da cui deriva quello del fluoro) ha due possibili origini
• dal latino: fluere che significa fluire, per il suo utilizzo come fondente in metallurgia (per
rimuovere le impurezze ed aumentare la fluidità del metallo fuso);
• dai minatori del Medioevo che la chiamavano fiore minerale per la sua bellezza.
• La luminescenza deriva dalla presenza di impurezze di terre rare.

Luce bianca UV
 E fosforescenza?
• Deriva dal greco φῶς (luce) e φέρω (portare)
• Sin dall’antichità, i materiali che, dopo essere stati illuminati,
continuavano ad emettere luce, venivano chiamati «fosfori».
• Nel 1677 venne isolato l’elemento fosforo (dall’urina), a cui venne
dato questo stesso nome perché, quando esposto all’aria, brucia
spontaneamente, rilasciando vapori luminescenti (ma si tratta di
chemiluminescenza)
Regola di Kasha
• Lo spettro di emissione è
indipendente dalla lunghezza
d’onda di eccitazione

Spiegazione:L’emissione avviene sempre

dal livello vibrazionale fondamentale di S1
 Eccezione: azulene
Emette da S2 per la grande differenza energetica tra S2 ed S1
Regola di Vavilov
• La resa quantica di
fluorescenza è indipendente
dalla lunghezza d’onda di
eccitazione

Spiegazione:
L’emissione avviene sempre
dal livello vibrazionale fondamentale di S1
 Eccezioni

Wavelength dependence of the quantum yield

of fluorescence and photoionization of
indoles
H. B. Steen
J Chem Phys 61, 3997 (1974)
 Conseguenze:
Regola dell’immagine speculare
• Lo spettro di emissione
può essere l’immagine
speculare di quello di
assorbimento.
• Vale se le curve di energia
elettronica dello stato
eccitato e fondamentale
sono simili.
 Perilene

Rispettata

7-amminonaftalene-1,3-disolfonato di sodio (ANDA)

Violata