IL MICROSCOPIO: principi e componenti di base 

Che cos’è un microscopio? 

Il microscopio è uno strumento che rende visibili i dettagli più piccoli 

Il microscopio compie tre operazioni: 
1)  Ingrandimento: l’immagine del campione è ingrandita 
2)  Risoluzione: i dettagli nell’immagine sono separati 
3)  Contrasto: i dettagli sono resi visibili all’occhio umano o 
ad altri strumenti atti a rilevarli
Relazioni tra il microscopio e l’occhio umano 

L’occhio umano percepisce i colori del visibile e le differenze di intensità 
luminosa (intensità che varia dal nero al bianco e tra tutte le tonalità di grigio) 

Sezione occhio umano  Sezione retina 

I recettori dei colori sono le cellule coniche (cone cells) e quelle che rilevano 
l’intensità luminosa sono le cellule a bastoncino (rod cells). Entrambi presenti 
nella retina. 
La retina è situata nella parte posteriore dell’interno dell’occhio. 
La cornea e le lenti determinano il meccanismo di far entrare e di focalizzare la 
luce verso la retina. 
Da qui, parte ilo messaggio elettrochimico verso il cervello
 L’occhio distingue chiaramente i dettagli di un immagine 
quando questa è diffusa sulla retina con un sufficiente angolo 
visuale 

Oggetto posto lontano dall’occhio 

Oggetto posto vicino dall’occhio
Il microscopio semplice 
A causa della limitata capacità delle lenti dell’occhio di modificare la propria 
forma, gli oggetti molto vicini all’occhio non possono avere una immagine 
focalizzata sulla retina 

Lenti convesse (spesse al centro) sono stati utilizzati 
come lente d’ingrandimento o microscopio semplice 

Il campione è focalizzato sulla retina grazie 
ad una lente d’ingrandimento posta tra 
l’oggetto e l’occhio 

Limiti 
Posizionamento del campione 
Illuminazione 
Aberrazione delle lenti 
costruzione
Microscopio di Von Leeuwenhoek
Il microscopio composto (Galileo) 
Il microscopio composto mostra 
1. due lenti convesse allineati in serie: una lente vicino all’oggetto (obiettivo) 
e una lente vicino all’occhio (oculare) 
2. Mezzi che permettono il movimento delle lenti e del campione 

Il microscopio composto determina un 
ingrandimento a due stadi: 
1. l’obiettivo proietta un’immagine ingrandita 
del campione nel tubo del microscopio 
2. l’oculare ingrandisce ulteriormente tale 
immagine 

Ad esempio: se si utilizza un obiettivo 10X ed un 
oculare 15X, l’ingrandimento totale sarà di 150X
Funzionamento di un microscopio 

1. la luce di una lampada passa attraverso 
un condensatore; 
2. quindi attraversa il vetrino con il 
campione posto su un’apertura della 
piastra porta­oggetti 
3. la luce è poi raccolta dall’obiettivo 
4. l’obiettivo insieme alle lenti posti nel 
tubo, focalizzano l’immagine del campione 
a livello del diaframma dell’oculare 
5. l’immagine è poi vista dall’osservatore 
come se essa è posizionata a 250 mm 
dall’occhio
Considerazioni sulla formazione dell’immagine 

L’immagine non deve essere solamente ingrandita ma deve essere anche chiara. 

Risoluzione 
Apertura numerica 

Quando la luce dai vari punti del campione passa 
attraverso l’obiettivo, questi punti sono visti 
nell’immagine come piccoli dischi e non punti. Questo è 
causato dalla diffrazione e diffusione della luce. 
Tali dischi sul piano dell’immagine, consistono di piccoli 
cerchi concentrici luminosi e bui. 
Più piccoli sono questi dischi, meno si sovrappongono e 
maggiore saranno i dettagli dell’immagine. 

La capacità di distinguere chiaramente i dettagli più minuti del 
campione è conosciuta con il nome di potere di risoluzione
Il potere risolvente del microscopio è misurato dalla minima distanza che 
separa due punti o due linee vicine ma ancora distinguibili.
Se si riduce l’apertura del diaframma di apertura del condensatore, il contrasto 
aumenta ma diminuisce il potere risolvente. 
Comunemente si trova un compromesso fra i due estremi
 La capacità di un obiettivo di comprendere i vari raggi della luce 
provenienti da ciascuna parte illuminata del campione, è direttamente 
relativa all’apertura angolare dell’obiettivo 

Apertura numerica = n * siin m

n= indice di rifrazione del materiale presente nello spazio tra il 
campione e la lente frontale
m = grado di apertura angolare dell’obiettivo
L’apertura numerica del microscopio è data da quella dell’obiettivo più 
quella del condensatore 

Comparazione di un microscopio a bassa ed alta apertura numerica
 I dettagli dell’immagine possono essere rilevati anche con obiettivi di bassa 
apertura numerica. 
Infatti, gli obiettivi a bassa apertura numerica hanno una maggiore 
profondità di campo e quindi una maggiore distanza tra l’obiettivo e il 
campione rispetto agli obiettivi di alta apertura numerica 

Comparazione della profondità di campo di un sistema a bassa ed alta apertura numerica
 Correzione dell’aberrazione 
cromatica: i principali colori 
sono proiettati in un unico 
punto di focalizzazione 

Correzione dell’aberrazione sferica: i 
raggi di luce che passano in posizioni 
diverse attraverso la lente sono 
proiettati in un punto di focalizzazione
Componenti ottici di un microscopio 
L’obiettivo è il più importante componente ottico del 
microscopio ed è costituito da una serie di lenti

1. La sua funzione di base è acquisire la luce che passa attraverso il 
campione ed proiettare un’immagine invertita del campione nel corpo del 
microscopio 

2. Dovrebbe avere la capacità di ricostruire i vari punti del campione in 
corrispondenti punti dell’immagine chiamati “ anti.punti”  (disco circolare di 
diametro definito) 

3. Deve essere costruito in modo tale che possa fuocalizzare ad una 
distanza più vicina possibile al campione e quindi proiettare un immagine 
ingrandita nel microscopio 

4.Dovrebbe avere la parte frontale della lente ritraibile in modo da 
proteggerla nel caso in cui l’obiettivo richiede di focalizzare molto vicino al 
campione 
Tipi di obiettivi 
1. Acromatico 
A) Meno costoso 
B) Sono corretti cromaticamente per la luce blu e rossa 
C) Sono corretti per le aberrazioni sferiche per il colore 
verde 
D) Migliori risultati sono ottenuti con luce che passa 
attraverso un filtro verde e con immagini in bianco e nero 
2. Fluorite 
A)  Più costoso dell’acromatico 
B) Sono corretti crormaticamente per la luce blu, rossa ed anche verde 
C) Sono corretti per le aberrazioni sferiche per il blu ed il rosso 
D) Sono uitili per la fotomicrogrsfis a colori 

3. Apocromatico 
A) Più costosi 
B) Sono corretti cromaticamente per il blu profondo, blu, verde e rosso 
C) Sono corretti sfericamente per il blu profondo, blu e verde 
D) Sono i migliori obiettivi per la registrazione e l’osservazione a colori 
E) Maggiore numero di aperture
Al fine di ottenere immagini piane e non curve esistono degli 
obiettivi chiamati “ Acromatico piano”  o (Fluorite piano”  o 
“ Apocromatico piano”  

La correzione della curvatura di campo è 
indispensabile per la registrazione delle 
immagini
Complessità del sistema delle lenti che costituiscono un obiettivo 
apocromatico all’incrementare dell’ingrandimento
Descrizione delle caratteristiche sull’obiettivo 

1. Ingrandimento (10X, 20X, 
40X, ecc.) 

2. Il segno ∞ la correzione 
per l’infinito 

3. lo spessore del copri 
vetrino (0.17 mm) 

4. Il tipo di obiettivo 

5. Se l’obiettivo è costruito per operare in immersione 

6. apertura numerica (0.04­1.4) 

7. Banda colorata per distinguere l’ingrandimento
L’oculare 

Gli obiettivi devono essere utilizzati in combinazione con gli 
oculari per ottenere i migliori risultati 

Caratteristiche funzionali dell’oculare 
1. La sua funzione base è “ guardare”  l’immagine ingrandita proiettata 
dall’obiettivo ed ingrandire una seconda volta l’immagine (immagine 
virtuale); 

2. Un piccolo oculare serve per acquisire l’immagine (quella proiettata 
dall’obiettivo) mediante sistemi fotografici o video. 

3. Nell’oculare alloggia un diaframma fisso. Ed è sul piano di questo 
diaframma che sarà proiettata l’immagine dall’obiettivo; 

4. Sulla montatura del diaframma fisso si può inserire un reticolo per le
 Tipi di oculari 
Ramsden (oculare positivo) 
Huygenian (oculare negativo) 

Nel tipo negativo sono presenti due  Nel tipo positivo, le lenti costituite da 
lenti: la superiore e l’inferiore o lente  diversi elementi uniti insieme, sono 
di campo. Entrambe le lenti sono  posti sopra il diaframma fisso. 
piano­convessi con la parte  La porzione in basso dell’oculare si 
convessa rivolta verso il campione  può svitare per poi, a seconda 
A metà distanza tra queste due lenti  dell’uso, porre un reticolo che serve 
è presente il diaframma fisso per conteggiare o misurare. 
Il condensatore 

Il condensatore è posto sotto la piastra portaoggetti ed, in particolare, tra la 
lampada per l’illuminazione ed il campione. 

Caratteristiche funzionali dell’oculare

1. La sua funzione base è quella di “ raccogliere”  la luce proveniente 

dal sistema di illuminazione e concentrarla a raggi paralleli sul 
campione e, attraversato questo, sul piano focale dell’obiettivo; 

2. Esso è costruito in modo tale che la luce arrivi a focalizzarsi 
all’apertura del suo diaframma; 

3. I nuovi modelli di condensatore sono provvisti sistemi di correzione 
delle lenti; 

4. In alcuni microscopi, nel condensatore sono alloggiati gli accessori 
per il contrasto di fase 
 Condensatore di tipo Abbe  Condensatore di tipo 
Apertura numerica di 1.25  Aplanatico­Acromatico 
Non è ben corretto per le aberrazioni  Le aberrazioni cromatiche e 
cromatiche e sferiche  sferiche sono ben corrette 
Utilizzato per le osservazioni di routine  Utilizzato per l’osservazioni a 
colori
Considerazioni sull’utilizzo 

L’appropriato utilizzo dell’apertura del diaframma del condensatore è 
importante nel determinare l’ottimo livello di illuminazione e di 
contrasto 

L’apertura del diaframma controlla l’angolo dei raggi 
luminosi che passano attraverso il campione e vanno 
nell’obiettivo 

Quando si utilizzano obiettivi di basso ingrandimento è preferibile svitare la 
lente superiore del condensatore oppure utilizzare un condensatore di 
basso potere 

L’altezza del condensatore è regolata da uno o due viti. 
L’aggiustamento di tale altezza è importante per 
l’illuminazione (vedi dopo)
 1. Alla base del condensatore,  Altre componenti ottici del microscopio 
sotto il condensatore, è presente 
uno specchio (la superficie 
frontale è argentata) la cui 
funzione è quella di riflettere la 
luce che arriva dal sistema di 
illuminazione verso il 
condensatore. Prima dello 
specchio è posto un diaframma 
definito diaframma di campo. 

2. Nella parte più bassa del tubo di 
osservazione è incorporata una 
lente (tube lens) la cui funzione è 
quella di raccogliere i raggi 
paralleli del proiettati dall’obiettivo 
e condurli al piano del diaframma 
fisso dell’oculare 

3. la base del microscopio 
contiene una lente (collector lens) 
che è posta di fronte il sistema di 
illuminazione e la sua funzione è 
quella di indirizzare la luce, 
attraverso lo specchio, sul piano
Componenti meccanici/elettrici 

1. la base del microscopio, a 
forma differente, permette una 
grande stabilità. Inoltre, in essa 
sono presenti i componenti 
elettrici per azionare e 
controllare il sistema di 
illuminazione. Questo è posto 
nella parte bassa e posteriore 
della base. La base inoltre 
presenta il diaframma di 
campo. 

2. Il piano del microscopio 
presenta un’apertura che 
permette il passaggio della luce 
e dove è posto il vetrino con il 
campione. Inoltre sono presenti 
delle manopole che muovono il 
campione (sopra/sotto e 
sinistra/destra);
 3. Sulla parte destra e 
sinistra del sostegno del 
microscopio sono presenti 
le manopole per la messa a 
fuoco sia grossolana (vite 
macrometrica) sia fine (vite 
micrometrica) 

4. sotto il piano o piastra è 
posto un contenitore per 
l’alloggiamento del 
condensatore. Questo 
contenitore può essere 
svitato e potrebbe avere 
delle viti per centrare il 
condensatore all’asse ottico 
del microscopio 

5. sul supporto del 
microscopio è posto un 
portaobiettivi (nosepiece) 
che è fissato o rimovibile, e 
su esso sono montati gli 
obiettivi di diverso
 6. Tubi rimovibili, sia 
binoculari sia trinoculari, 
sono attaccati al sostegno 
del microscopio sopra il 
portaobiettivi. Il binoculare è 
utilizzato solo per vedere 
mentre il trinoculare è 
utilizzato anche per 
fotografare. Essi sono 
posizionati ad un angolo di 
30° per facilitare 
l’osservazione
 L’intelaiatura del microscopio ha le seguenti funzioni: 

1. Assicurare la stabilità e rigidità al microscopio; 
2. Fornire il supporto per alloggiare gli obiettivi e l’oculare; 
3. Contenere il campione su una superficie piana e permettere il 
movimento di questo campione mediante apposite manopole 
4. Fornire il supporto al condensatore, al sistema di illuminazione 
ed al sistema elettrico 

I moderni microscopi hanno le caratteristiche di essere ergonomici ed modulari 

A) Le viti per la messa a fuoco sono concentrici e posti 
Diversi componenti 
sulla parte superiore del microscopio facilitando così 
l’operatore (le mani o le braccia non devono essere in alta  sono 
posizione);  intercambiabili: 
B) La base frontale è stretta per permettere un facile 
accesso agli accessori;  condensatori, 
C) L’angolo per l’osservazione permette lunghi periodi di  obiettivi, oculari, 
lavoro senza affaticarsi; 
lampade, tubi di 
D) Il portaobiettivi è costruito in modo tale che, quando un 
obiettivo è utilizzato, gli altri due non ostacolano le dita  osservazione, ecc. 
dell’operatore.
 Sistema di illuminazione 

Inizialmente, la sorgente di luce era costituita dalla luce solare mentre 
successivamente sono state adottate delle lampade elettriche di vario 
tipo. 
Queste sorgenti luce erano focalizzate direttamente sul campione 
mediante un condensatore. 

Problemi: 
Scarsa uniformità di illuminazione determinata da: 

1. Limitata dimensione della sorgente di luce (poca luce); 

2. L’immagine della luce era inopportunamente sovrapposta sull’immagine del campione 

Nei primi anni del 1900, August Kohler progettò un sistema di 
illuminazione (Illuminazione Koehler) che superò tali problemi
Illuminazione Koehler 
Metodo: 
Una lente (collector lens) è posta di fronte 
alla sorgente di illuminazione e proietta 
un’immagine allargata della luce verso il 
diaframma di apertura del condensatore 

1. Poiché la luce è focalizzata di fronte 
al piano focale del condensatore, la 
luce emergente attraversa il campione 
per raggi paralleli; 

2. Poiché la luce non è focalizzata sul 
piano del campione, essa si presenta 
estesa e non sgranata
La regolazione del diaframma di apertura 
del condensatore controlla l’angolo del 
cono di luce che raggiunge il campione; 
Un secondo diaframma (diaframma di 
campo) invece controlla il diametro (e non 
l’angolo) della luce che attraversa il 
campione. 
Manipolando questi due diaframmai si 
raggiunge il miglior compromesso tra 
risoluzione e contrasto
Procedura per settare l’illuminazione di Koehler 

1. Accendere la lampada del microscopio, aprire totalmente entrambi i 
diaframmi (diaframma di apertura e diaframma di campo); 

2. Ruotare il portaobiettivi per portare l’obiettivo 10X sulla il percorso della 
luce. 

3. Porre il campione sulla piastra e focalizzare mediante le viti; 

4. Chiudere totalmente il diaframma di campo. Quindi, salire il condensatore e 
focalizzare l’immagine del diaframma di campo (forma poligono) su quella del 
campione; 
Se l’immagine del diaframma di campo non è centrata, usa la manopole del 
condensatore per centrarla. Poi aprire il diaframma di campo fino alla sua 
scomparsa dalla vista; 

5. Tirare fuori un oculare e guarda dentro il tubo. Nel guardare, aprire e 
chiudere il diaframma di apertura del condensatore ed aggiustare la sua 
apertura che sia aperta di 2/3 o ¾ (miglior compromesso tra risoluzione e 
contrasto). Quindi riporre l’oculare; 

6. Osservare i suddetti steps ogniqualvolta si cambia l’obiettivo
Procedura per focalizzare il microscopio 

1. Accendere la lampada e settare l’intensità di luce per un’osservazione 
confortevole 

2. Guardando attraverso l’oculare, afferrare i due tubi con le mani ed 
avvicinarli o allontanarli fino a che si osserva un solo cerchio di visione; 

3. Porre un vetrino con il campione sulla piastra ed aumentare o diminuire 
l’altezza della piastra utilizzando la vite macrometrica. Portare a fuoco e 
quindi utilizzare la vite micrometrica per una perfetta messa a fuoco; 

4. Se si desidera utilizzare un altro obiettivo, la nuovo messa a fuoco sarà 
eseguita solamente con la vite micrometrica
Tipi di microscopio 

Microscopio ottico: 

1. Per luce trasmessa (quando 
all’obiettivo giunge la luce che 
attraversa il campione) 

2. Per luce diffusa (quando il 
campione è illuminato in modo 
che all’obiettivo giunge solo la 
luce da esso diffusa) 

3. Per luce riflessa (quando 
l’obiettivo raccoglie la luce 
riflessa dalla superficie 
dell’oggetto) 

Campioni opachi 

Campioni trasparenti colorati 
(metodo della colorazione
 Per campioni trasparenti sui quali la colorazione può interferire con i processi 
oggetti di studio (ad esempio, cellula vivente o amebe), si utilizza 
Microscopio a contrasto di fase 
Converte in differenze di intensità le differenze di fase che si producono tra 
la luce che attraversa le parti interne del campione e la luce diretta 
proveniente dal piano su cui questo è posto 
Come si forma un’immagine? 
L’immagine si forma in quanto 
l’onda elettromagnetica (luce) che 
attraverso un oggetto opaco è 
costituita da due onde (incidente e 
diffratta) sfasate di mezza 
lunghezza d’onda. Per questo 
motivo le due onde interferiscono 
tra loro dando luogo ad un 
immagine meno luminosa 

In un mezzo trasparente ci sono 
sempre due onde, delle quali quella 
diffratta non è sufficientemente 
sfasata tale da modificare la 
lucentezza dell’immagine.
Nel microscopio a contrasto di fase, l’onda diffratta viene separata e 
modificata in modo che si propaghi sfasata con mezza lunghezza 
d’onda rispetto a quella incidente. Essa interferisce con l’onda 
incidente cosicché il campione trasparente viene evidenziato in tutti i 
suoi particolare come se fosse un oggetto opaco 

Diaframma circolare 
Disco ritarda­fase
 Disco ritarda­fase

Funzionamento del 
microscopio a contrasto di fase 

Diaframma circolare 
Microscopio a fluorescenza 

Il campione, illuminato con 
luce ultravioletta, viene 
trattato con opportune 
sostanze coloranti che 
emettono per fluorescenza 
nel campo del visibile 

Immagine al m. a fluorescenza
Microscopio polarizzatore 

Il campione è posto tra due nicol (funzionanti 
rispettivamente da polarizzatore e da 
analizzatore). 
Utilizzato soprattutto in mineralogia, 
nell’osservazione di strutture microcristalline, 
identificabile in base agli effetti cromatici 

Cristallo al microscopio polarizzatore
Microscopio invertito 

Il sistema di illuminazione ed il 
sistema ottico sono rovesciati 
rispetto a quelli di un normale m. 
ottico, il che permette di esaminare la 
parte inferiore del preparato (colture 
cellulari) 

Stereomicroscopio 
Stereomicroscopio 
Lo stereomicroscopio è uno 
strumento che vi permette di 
vedere in tre 
dimensioni gli oggetti 
osservando il campione da  E' un microscopio adatto 
due  all'entomologia, alla mineralogia, 
angoli leggermente diversi e  alla 
botanica, quindi è largamente 
ottenendo le due 
impiegato in numerosi campi di 
immagini necessarie per la 
ricerca,
visione stereoscopica. 
Microscopio elettronico 

Particolare tipo di microscopio 
in cui l’osservazione 
dell’oggetto è realizzata tramite 
un fascio di elettroni . Questo 
permette di ingrandire l’oggetto 
più di 100.000 volte ad un 
potere risolvente dell’ordine 
dell’angstrom