MICROBIOLOGIA CLINICA

1. DIAGNOSI DIRETTA E INDIRETTA

La diagnosi microbiologica si basa sull’identificazione diretta o indiretta dell’agente eziologico. La diagnosi
è essenziale sia per l’inquadramento diagnostico che per un’eventuale terapia.

Per diagnosi diretta si intende la visualizzazione del microrganismo in toto, di parti di esso o di prodotti
del suo metabolismo in campioni di materiale biologico del pz.
Per far ciò è necessario che il medico indichi il suo sospetto diagnostico, che fornisca indicazioni circa le
caratteristiche generali del paziente e disponga un corretto campione biologico.
Si possono sfruttare tecniche quali:
- microscopia diretta previa colorazione del campione,
- tecniche di amplificazione genica,
- ricerca di Ag specifici,
- immunofluorescenza,
- western blot.
Inoltre, l’indagine microscopica diretta è in grado di evidenziare la risposta dell’ospite e dare indicazioni
per l’esame colturale.
Con questo si arriva alla diagnosi di certezza del microrganismo e può essere sfruttata per eseguire un
antibiogramma, col quale impostare una terapia mirata.
La diagnosi indiretta sfrutta invece la traccia immunologica lasciata dai microrganismi e si esegue
ricercando Ig specifiche su siero.
A seconda della classe di Ig, si può determinare l’andamento temporale dell’infezione (IgM per infezione
acuta e IgG per infezione cronica/pregressa).
Oltre alla classe può anche essere dosato il titolo anticorpale, cioè la più alta diluizione con la quale si trova
ancora traccia di Ig.
Risulta fondamentale eseguire accuratamente la raccolta del campione biologico, perché ciò può influire
sull’indagine fino al 70%.
Altri aspetti fondamentali sono le tempistiche di invio in laboratorio e la scelta di adeguati terreni di
trasporto.

2. EMOCOLTURA
La batteriemia è definita come presenza transitoria nella circolazione di microrganismi.
Si distingue dalla sepsi, dove invece il microrganismo è presente nella circolazione in aggiunta a quadro
clinico di compromissione multiorgano.
Il metodo per determinare un’eventuale batteriemia è l’emocoltura, la quale trova indicazione in caso di
febbre >38°C a causa ignota.
È necessario prelevare almeno 3 campioni (ogni set è composto da 1 provetta per aerobi, 1 per anaerobi
ed eventualmente 1 per funghi) a distanza di 30-60 minuti l’uno dall’altro, da 3 accessi venosi diversi.
Questo è necessario per aumentare la sensibilità di isolamento più che di diagnosi eziologica, evitando
contaminazione da parte di microrganismi residenti (infatti S. epidermidis è l’organismo isolato più
frequentemente e se ne stabilisce la positività solo in caso di riscontro positivo in 2 campioni su 3), mentre
per microrganismi sicuramente patogeni basta la positività di un campione.
La risposta si ottiene dopo 5-6 giorni, in quanto la carica microbica nel sangue è bassa (al max 610 cell su
5 ml).
Bisogna inviare il campione immediatamente in laboratorio, e questo verrà inserito in degli incubatori che
controllano il flacone ogni 10 minuti per ogni eventuale crescita microbica, i campioni vengono inoltre agitati
per favorire l’emolisi di cellule fagocitarie e permettere una più favorevole crescita dei batteri. Un ritardo
nella consegna del campione favorisce lo sviluppo precoce di microrganismi che non verrà letto come
differenziale dalla macchina.
Gli organismi più frequentemente isolati sono:
- Stafilococchi Coagulasi Negativi,
- S.aureus,
- Enterococchi,
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 - Enterobacteriaceae,
- S.viridans,
- Pseudomonas spp,
- H.influenzae,
- B.fragilis,
- C.albicans.

3. ANTIBIOGRAMMA
E’ un saggio in vitro, eseguito su campioni colturali, dell’azione di farmaci antibiotici con lo scopo di valutare
l’eventuale sensibilità/resistenza di un determinato microrganismo.
Si può eseguire sia su campioni solidi che liquidi, ottenendo informazioni differenti:
- con le metodiche solide si ottengono gli aloni di inibizione testati con concentrazioni fisse di farmaco
(metodo Kirby-Bauer) da confrontare con standard di riferimento; mentre,
- con le metodiche liquide, si ottiene la MIC (concentrazione minima inibente) in quanto la
concentrazione del farmaco non è standard come nel caso dei terreni solidi, ma ho la possibilità di
usare varie concentrazioni.
In questo saggio, il farmaco trova quindi le condizioni ideali di interazione col bersaglio, a differenza
della situazione fisiologica, in cui potrebbe invece trovare interferenze farmacocinetiche e/o
farmacodinamiche.
I dati così ottenuti vengono poi confrontati ed interpretati alla luce dei Breakpoints Clinici, cioè:
- una combinazione tra parametri farmacodinamici e farmacocinetici (es. tossicità, assorbimento,
distribuzione, metabolismo, escrezione),
- distribuzione degli aloni di inibizione,
- distribuzione delle MIC,
- eventuali meccanismi di resistenza e valori soglia epidemiologici dei ceppi wild-type.
Ciò permette di definire il microrganismo testato come Sensibile o Resistente al dato farmaco.
I valori ottenuti quindi devono essere attentamente interpretati dall’infettivologo che sceglierà l’antibiotico
da usare non soltanto in base ai valori della MIC, ma considerando tutta una serie di parametri concomitanti
(condizioni cliniche, eventuali terapie concomitanti o pregresse ecc.).

4. DIAGNOSI INFEZIONI RESPIRATORIE

Polmoniti Comunitarie:
- Tipica: pneumococco (90%), haemophilus influenzae (al microsc coccobacillo gram-),
- atipiche (micoplasma, chlamydia, legionella)

Polmoniti Nosocomiali [dopo48h da ricovero]:

- legionella,
- staphilococcus aureus,
- pseudomonas e
- altri gram- (spesso farmacoresistenti).

Nell’immunocompromesso:
- pneumocistis jirovecii,
- CMV,
- aspergillus,
- candida,
- M tubercolosis.

DIAGNOSI: clinica + RX + esami di lab + microbiologia.

In base a questi valuto se ricoverare il pz o se impostare un terapia empirica a domicilio.

Esami microbiologici:
- Esame diretto e colturale dell’escreato (o su altri campioni in base alla clinica, ad es BAL,
broncoaspirato, liquido pleurico)
- Se febbre > 38 emocoltura (prima di iniziare la terapia).
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- Antibiogramma
- Ricerca Ag urinario per Legionella e Pneumococco.
- In alcuni casi PCR o sierologia IgM di Mycoplasma e Clamidophila pn
- Se si sospetta di Legionella è necessario usare terreni di coltura con L-cisteina e Sali di ferro.
- Se l’eziologia è fungina (es Aspergillus e Mucor) la diagnosi è difficile ed è basata sull’aspetto
microscopico e sull’isolamento colturale.

TBC
- esame microscopico diretto su escreato 3 campioni in giorni diversi (su liquor si fa un solo campione)
con colorazione di Ziehl Neelsen rapido, risposta in 2 ore.
Problema: necessaria un’elevata carica batterica.
- PCR o ibridazione in situ, aumentano la probabilità di trovare DNA del micobatterio anche con cariche
non elevate.
- Colturale + antibiogramma: in agar-uovo (4 sett x risposta), in brodo (10-14 gg)
- Se latente:
intradermoreazione di Mantoux (bassa Sn nell’immunocompromesso, bassa Sp in vaccinati)
Ppd della tubercolina, valutare a 48,72 ore.
Quantiferon,
Elispot test immunologico, IFNy prodotto da linfo T in risposta ad ag specifici.

5. DIAGNOSI INFEZIONE GENITO-URINARIE

La diagnosi di IVU si basa su:
 Esame chimico-fisico delle urine, se positivo (pH alcalino e nitriti) si effettua il sedimento urinario
(leucocituria, possibile macro/micro ematuria).
 Urinocoltura su campione estemporaneo: si raccoglie la prima minzione del mattino poiché
maggiormente concentrata, in un contenitore sterile, dopo adeguata igiene intima (sapone neutro per
minimizzare la contaminazione), avendo cura di raccogliere il mitto intermedio;
conservare il campione in frigo e consegnarlo al lab in tempi brevi per evitare un’eccessiva crescita
batterica.
I microrganismi più frequentemente riscontrati nell’urinocoltura sono:
- Escherichia coli,
- Proteus mirabils,
- Klebsiella,
- Enterobacter,
- Candida,
- Schistosoma haematobium (raccolta pomeridiana del campione).

Significatività urinocoltura:
- donna sintomatica 10^2 cfu,
- donna asintomatica 10^5 cfu,
- uomo 10^3 cfu.

IVU nei pz ospedalizzati determinate tipicamente da patogeni opportunisti in grado di produrre biofilm, e
che presentano Farmaco-Resistenza.
Sono generalmente causate dall’uso di cateteri vescicali e i principali agenti patogeni implicati sono:
- stafilo coag neg,
- candida,
- pseudomonas.

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 6. DIAGNOSI DI MENINGITE
A fronte di un quadro clinico compatibile con meningite, si procede con l’analisi di un campione di liquor.
Il prelievo di liquor è una procedura invasiva attuata tramite puntura lombare all’altezza di L4-L5, con
paziente in decubito laterale.
Si prelevano 3 cc di liquor, di cui 1cc sarà destinato all’esame chimico-fisico, 1 cc per l’analisi
microbiologica, 1 cc per la sierologia.
La prima valutazione macroscopica deve distinguere la limpidezza/torbidità del campione.
Se il liquor risulta torbido, una volta esclusa la diagnosi di ESA, si può sospettare un’eziologia batterica e
sarà fondamentale l’esame microscopico diretto con colorazione di Gram e con blu di metilene per
distinguere la forma dei batteri, il quale può già dare una diagnosi provvisoria:
- bacilli Gram Neg.  H. Influenzae,
- Diplococchi Gram Neg.  N. Meningitidis,
- Cocchi Gram Pos.  Pneumococco
Sarà poi l’esame colturale a dare la diagnosi definitiva.
All’esame chimico-fisico, in genere, si associa:
- aumento della protidorrachia (VN: 15-45 mg/dL),
- diminuzione della glicorrachia (VN: 60% glicemia plasmatica) e
- aumento marcato della cellularità, con prevalenza di PMN (VN: <5/mm3).

È importante valutare l’età del soggetto per indirizzarci verso un primo sospetto eziologico:
- nei bambini al di sotto dei 5 aa i microrganismi più coinvolti sono:
H. influenzae,
E. coli neonatale K1,
S. agalactie,
N. meningitidis,
Pneumococco.
Questi ultimi due agenti eziologici sono presenti in tutte le fasce d’età.

In caso di liquor limpido, si pone DD fra:

- Meningite Tubercolare, per la diagnosi si usa il reticolo di Mya
- Treponema pallidum,
- Fungina (criptococco neoformans, histoplasma capsulatum, coccidioides immitis)
Si usa l’ Inchiostro di china per Criptococco
- virale (enterovirus), di cui per fare diagnosi si valutano le alterazioni CF (glicorrachia normale e aumento
dei linfociti) + PCR.
Per le virali si può eseguire indagine sierologica a significato retrospettivo per interesse epidemiologico.

7. DIAGNOSI DI EPATITI
HCV:
- Acuta: HCV-RNA+, Ig anti-HCV +, ALT+
- Pregressa: HCV-RNA-, Ig anti-HCV+, ALT N
- Cronica: HCV-RNA+, Ig anti-HCV+, ALT N/+
HAV:
- Acuta: IgM anti-HAV+
- Pregressa: IgG anti-HAV+
HEV:
- Acuta: IgM anti-HEV+
- Pregressa: IgG anti-HEV+
HBV:
- Acuta: HBsAg+ (dalle 4 alle 24 settimane), IgM anti-HBc + (8-32 settimane), HBV-DNA (6-16 sett),
anti-HBc totali (da 8 settimane in poi), anti-HBs (da 32 in poi)
- Cronica: HBsAg+ (dalla 4 in poi), anti-HBc totali (da 8 in poi), IgM anti-HBc (da 8, picco a 16,
diminuzione ma non scomparsa), HBV-DNA (sempre).
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 Indicatori
- HBsAg = infezione
- HBeAg = replicazione
- HBV-DNA = replicazione (no di routine)
- IgM anti-HBc = malattia in atto
- Ig anti HBs = immunità
- Anti-HBc = esposizione

Di solito HbeAg è negativo nelle inf croniche, ma in alcuni casi può succedere che una mutazione del preC
ne determini la positività, in questo caso devo controllare HBV DNA, che dovrà essere basso.

Ab Anti-HBc positivo senza nient’altro indica una reazione crociata al test, oppure un periodo finestra in
cui non sono ancora in circolo gli anti HBs perché legati tutti agli HBsAg.

8. INFEZIONI DEL COMPLESSO TORCH (INFEZIONI DA RICERCARE IN GARVIDANZA)

E’ l’acronimo dell’insieme di microrganismi che si vanno a ricercare in una donna gravida:
- Toxoplasma Gondii,
- Virus della Rosolia (aborti, malformazioni cardiache, oculari e neurologiche – sindrome espansa da
rosolia congenita, vaccino pregravidanza, si controllano poi IgM e IgG),
- CMV (CMV congenito con epatomegalia, corioretinite),
- HSV.
Sono compresi nella “O” (others):
- T. pallidum (VDRL-TPHA),
- Coxsackie virus,
- VZV (aborto e malformazioni),
- HIV,
- HBV (entrambi danno patologia per trasmissione verticale),
- parvovirus B19.

In aggiunta, si possono ricercare patogeni con potenziale trasmissione nel canale del parto:
- S. agalactiae,
- Listeria.
Questi ultimi sono responsabili di meningite neonatale precoce (<1sett) o tardiva (>1mese).

La Listeria ha anche potenziale abortigeno.

Come prevenzione alla Listeria è necessario evitare latticini non pastorizzati.

Per la Toxoplasmosi è necessario mantenersi IgG negative per 9 mesi ed evitare di consumare:
salumi, carni crude e cambiare le lettiere di gatti.
In caso di donne IgG positive sarà necessario effettuare il test di avidità delle IgG, in quanto:
IgG avide saranno di vecchia data e sono quindi espressione di patologia pregressa.
Non si usano le IgM perché in questo caso durano eccezionalmente più di 6 mesi e non sono quindi
diagnostiche di patologia acuta.

9. DIAGNOSI HIV
Per effetturare diagnosi di HIV si utilizza il TEST ELISA, che consiste nella ricerca di Ab anti-HIV
(Sn e Sp 95%), questi compaiono dopo un periodo finestra di 4-6 settimane dal contagio e più nello
specifico si ricercano Ab contro le proteine dell’Envelope GP41 e GP120.
Si effettua un primo test a 1 mese/1 mese e mezzo dal comportamento a rischio, se questo risulta negativo
si ripete una seconda misurazione a 3 mesi per avere la sicurezza di aver oltrepassato il periodo finestra.

Se ELISA positivo si effettua come esame di 2° livello il Western Blot, che consiste nel riconoscimento da
parte degli Ab del pz di specifiche proteine virali, ad esempio p24, p31, gp41 e gp120/160.
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Questo esame può risultare indeterminato nel caso in cui la reattività sia solo per una o più proteine
codificate da un solo gene; mentre abbiamo la conferma della sieroconversione se gli Ab del pz reagiscono
a proteine codificate da geni diversi.

Monitoraggio di Malattia, si effettua tramite valutazione di:

- Conta CD4+ (<200/microlitro  AIDS) per valutare andamento dell’immunocompromissione;
- indagine molecolare HIV-RNA su plasma per valutare carica virale.

INFEZIONI SNC E SNP

Difficile penetrazione dei farmaci antiretrovirali (aumenta resistenze, possibile sviluppo patologia al SNC
anche in assenza di replicazione periferica)

- Toxoplasma può determinare lo sviluppo di lesioni occupanti spazio

(Diagnosi con: liquor pcrDNA/risposta terapia in base clinica + imaging),
- Criptococco (Diagnosi con microscopia + RICERCA Ag capsulare polisacc con ELISA + colturale
liquor),
- EBV può provocare Linfoma cerebrale primitivo (Diagnosi con: PCR EBV-DNA)
- Candida può causare Candidosi Orale o Esofagite da Candida
(Diagnosi è clinica e l’esame colturale solo per resistenza), è un microorganismo filamentoso se
commensale, lieviti forme patogeno
- Gastroenteriti si fa Diagnosi con microscopia su:
feci a fresco (microsporidi color. acetato/acid-fast) e
fissate in formalina.
Questo tipo d’infezioni possono essere causate da:
Batteri: si fa anche copro-coltura
Herpes o Microsporidi: per cui si esegue Microscopia su materiale bioptico preso con endoscopia
- Polmoniti possono essere causate da:
Pneumocistis Jirovecii  LDH aumentato + EE + Microsc su BAL, Espettorato, Broncoaspirato +
PCR-DNA

10. INFEZIONI NOSOCOMIALI

Sono tutte le nfezioni insorte nel corso del ricovero ospedaliero, non manifeste clinicamente né in
incubazione all’ammissione, oppure insorte dopo la dimissione se i microrganismi si ritengono acquisiti nel
corso del ricovero.

Fattori di Rischio:
- abuso/misuso Antibiotici,
- uso di presidi medici (catetere endovescicale, tubo endotracheale, inf nosocomiali infatti sono più
frequenti nei reparti di terapia intensiva, dove i pz permangono per lungo tempo cateterizzati e
intubati),
- interventi chirurgici,
- procedure iniettive,
- trasmissione pz/operatore.
Questi FdR sono alla base di uno dei problemi principali delle infezioni nosocomiali:
la MDR per cui agenti patogeni risultano resistenti a diversi antibiotici.

Le Sedi anatomiche più frequentemente colpite sono:

- Tratto urinario x abuso del catetere (+ frequenti, - gravate da mortalità),
più impo dal punto di vista della mortalità sono quelle di
- Apparato Respiratorio,
- Torrente circolatorio e
- Ferite chirurgiche.

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I patogeni più comunemente responsabili sono:
- Clostridium difficile, da diarrea x alterazione flora batterica spesso correlata a terapia antibiotica ad
ampio spettro.
Problemi in ambito ospedaliero: elevata trasmissibilità.
- Stafilococco aureus meticillino resistente, è uno Staf coag neg (patogenicità bassa ma 90%
MultiResistente).
- Enterobacteriaceae: Klebsiella pneumophila carbapenemasi produttrice (KPC) e
Enterobacteriaceae resistenti ai carbapenemici (CRE), hanno entrambe tendenza epidemica non
trascurabile.
- P. aeruginosa: gram – infezioni nosocomiali importanti.
- Lieviti: inf fungine disseminate (es. candida) sono quelle con > mortalità, siccome i segni e sintomi
non sono distinguibili da una batteriemia è importante tenere presente anamnesi e Fattori di Rischio
per valutare il rischio che pz sia esposto a infezioni fungine:
immunodepressi,
pazienti trattati con antibiotici ampio spettro o per tanti cicli, quindi disbiosi,
pz di chirurgia addominale, quindi microrganismi intestinali traslocano nel torrente circolatorio e nel
peritoneo).

Farmacoresistenza: in ambiente ospedaliero c’è una pressione selettiva degli antibiotici usati, ci sono
maggiori ceppi farmacoresistenti e un maggior scambio interumano degli stessi.
La diversità della farmacoresistenza riflette anche un abuso/uso scorretto (mancato rispetto tempi di
somministrazione, mancata adesione regime terapeutico) di una determinata classe di antibiotici in una
determinata nazione.

11. AGENTI INTRACELLULARI e MALARIA

L’utilizzo di Metodiche microscopiche di visualizzazione delle cellule sanguigne diventa necessario quando
siamo in presenza di un agente patogeno intracellulare ad es. :
- plasmodi e Bartonella (in emazie),
- Virus erpetici,
- Listeria Monocytogenes (in linfociti e monociti),
- Batteri (in Polimorfonucleati).
Nella diagnosi di malaria si fa lo striscio ematico, in momenti diversi e con vari prelievi, per poter vedere:
- il parassita endocellulare,
- la cellularità e
- il grado di parassitemia;
il vetrino può essere fatto:
- a goccia spessa, con deposito di cellule evidente, che ha il vantaggio di determinare una reale
Parassitemia.
- a goccia sottile, che ha il vantaggio di visualizzare il parassitismo cellulare.

Ci vuole un esperto che sappia leggere bene un vetrino, soprattutto nei casi in cui la parassitemia non sia
molto elevata, come nelle specie che non sono Falciparum.

Può essere utile la ricerca di due antigeni plasmodici:

è diagnostico soltanto l’antigene specifico del Falciparum che è la proteina Istidina, mentre
la lattato deidrogenasi è generica per tutti i tipi di plasmodi.

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