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cineticameccanismo

Per gli enzimi:


Modello di Michaelis-Menten
(1913)
Reazione a singolo substrato (idrolisi del saccarosio)
Enzima
saccarosio+H20 glucosio+fruttosio

Osservazione: (Brown, 1902) ad altissime


concentrazioni di substrato, la velocit di reazione
non dipende pi da questa variabile (ordine 0).
Modello:

Ipotesi: reazione ESE+P irreversibile


(valida comunque allinizio della reazione, quando P non c)
Si possono ridurre le variabili
+ = []0 (Lenzima un catalizzatore)
+ + = []0

= []0 [] Possiamo eliminare [E] e [P]


= []0


= 0 [] +


= 0 +

Soluzione esatta trovata solo nel 2010!
Trucco di M&M: metodo delle velocit iniziali
Trucco di M&M: metodo delle velocit iniziali

Ricorda qualcosa?
Modello di M&M
Ipotesi: equilibrio kcat<<kf, kr

Ipotesi: se [S]o>>[E] o allora [S] [S]o


Modello di stato stazionario Ipotesi (meno stringente):
(Briggs & Haldane) allinizio della reazione c un periodo
di tempo per cui la velocit costante.
[ES]=costante.
Valida per [E]0<<[S]0 (realistica)

[P] cresce linearmente


v=cost.

Pre-SS
(ms) SS

= 0 +


= 0 +

[S] e [ES] variano alla stessa velocit?
Consideriamo le variazioni relative, per vedere se sono dello stesso ordine nellunit di tempo.
Dividiamo per la massima concentrazione possibile ([S]0 e [E]0, rispettivamente)

/ 0 1
= 0
0
/ 0 1
= 0 +
0
Ipotesi: eccesso di substrato (realistica) 0 0

/ 0 / 0


Nella fase pre-SS (pochi ms, prima delle nostre osservazioni),
[ES] cresce rapidamente, mentre [S][S]0.

Man mano che aumenta [ES], diminuisce la sua velocit di


variazione.

Rapidamente si raggiunge una condizione di stato stazionario,


in cui


= 0 0 + + 0 =0

0 0 0
= = 0
+ + +
0 + 0

0 0
= = 0 =
+ + 0
+ 0

0
=
+ 0
Costante di Michaelis
+
M= = +

la concentrazione di substrato per cui la velocit la met di Vmax.

Coincide con la costante di dissociazione se la reazione catalitica


limitante ( << )

Numero di turnover

= 0 = = numero di turnover
0

il numero di molecole di prodotto create al secondo per molecola di


enzima, a saturazione.
Quando S basso (<< ), lequazione di ordine 1 in S

0
= 0 = 0 0
+ 0

(costante di specificit) rappresenta lefficienza enzimatica.

Al massimo pu essere limitata dalla diffusione. In questo caso, se il substrato una
piccola molecola, ha un valore 108 -109 M-1s-1.

Quando S alto (>> ), lequazione di ordine 0 in S

0
= = 0
+ 0
0
Linearizzazioni =
+ 0
0
Linearizzazioni =
+ 0

0
= 1
+ 0

= =
+ 0 0

1
=
0
Lanidrasi carbonica (CA), localizzata negli
eritrociti, un enzima contenente zinco avente
il ruolo di catalizzare reversibilmente
lidratazione dellanidride carbonica:
CO2+ H2O H2CO3
La CA attiva anche come esterasi verso diversi
substrati, tra cui lacetato di p-nitrofenile (PNFA)

PNFA + OH- PNFO-+ CH3COOH

NO2 O COCH3 + OH- NO2 O- + CH3COOH

Ricorda qualcosa???

Stavolta lavoreremo a pH8, in modo da ridurre la velocit di reazione spontanea.


NO2 O COCH3 NO2 O-

- R (403 nm) =
R P 1 1
= 0 M cm
A

P (403 nm) =

= 18500 M 1cm 1
(Clin. Chem. 1980 26: 724)

(Eur. J. Biochem. 1974 41: 263)


Soluzioni: tampone TRIS 0.1 M a pH 8.0; soluzione
di CAB: 5.5 mg in 25 ml di TRIS (soluzione A);
soluzione di PNFA: 36 mg in 5 ml di CH3CN (
soluzione B ); seconda soluzione di PNFA: 5 mg in 5
ml di CH3CN ( soluzione C ); terza soluzione di
PNFA: 3 mg in 5 ml di CH3CN ( soluzione D ).
Le misure spettrofotometriche a 400 nm si
eseguono in celle di poli(metilmetacrilato) (PMMA);
la lettura a 280 nm si fa in cella di quarzo ottico.
Misura della concentrazione di CAB:
La concentrazione di CAB nella soluzione A si
misura leggendo lassorbanza della soluzione A a
280 nm in cella di quarzo da 1 cm (con TRIS nella
cella di riferimento). Per la CAB il valore del
coefficiente di estinzione molare a 280 nm
CAB,280= 54000 M-1cm-1.
Misure di v0 in stato stazionario:
In cella di PMMA da 1 cm si pongono 0.6 ml di soluzione A +
1.9 ml di TRIS. Si termostata a 25 C per 3 minuti. Si
iniettano x l di soluzione B, si agita e si segue lassorbanza a
400 nm per 60 secondi, campionando ogni 0.1 sec (con TRIS
nella cella di riferimento).
Eseguire i seguenti esperimenti cinetici:
x = 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 l.

Misure di v0 per sottrazione delleffetto di catalisi basica:


In cella di PMMA da 1 cm si pongono 2.5 ml di TRIS. Si
termostata a 25 C per 3 minuti. Si iniettano x l di soluzione
B, si agita e si segue lassorbanza a 400 nm per 120 secondi,
campionando ogni 0.1 sec (con TRIS nella cella di
riferimento).
Eseguire i seguenti esperimenti cinetici:
x = 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 l.
Si valuti lassorbanza nei primi 20 secondi di reazione.
Calcolare la velocit iniziale come

Calcolare la velocit iniziale per gli esperimenti eseguiti


in presenza di enzima, e per gli esperimenti eseguiti
con il solo tampone. Determinare quindi la velocit
iniziale della reazione catalizzata dalla CAB al netto
della catalisi basica:

Riportare in grafico v0 in funzione di [PNFA]0 (curva di


saturazione). Dal fit dei dati determinare kcat e KM