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000 GENI
CLONAGGIO
VETTORE: molecola di DNA che
permette lamplificazione della
sequenza dinteresse
VETTORI DI CLONAGGIO
- Plasmidi
- Cosmidi
- Fagi
- BAC (bacterial artificial chromosome)
- YAC (yeast artificial chromosome)
VETTORI DI CLONAGGIO
Plasmide
Molecola di DNA circolare (nella maggior parte dei casi)
Potrebbe essere considerato una forma di vita indipendente
(come i virus), poich capace di replicazione autonoma in un
ambiente opportuno (ospite batterico).
plasmide
DNA genomico
Simbiosi (non parassitismo): conferisce particolari caratteristiche
vantaggiose allospite come la resistenza ad un antibiotico.
Nella maggior parte dei casi sono molecole circolari superavvolte.
REPLICAZIONE
Plasmidi di piccole dimensioni
ori
Polylinker
ori: origine di replicazione
Amp: gene per la -lattamasi
Polylinker: sito multiplo di clonaggio
5-CGATTATCACTAGTCGAATTCAGCGGCCGCTCTGCAGGTCGAC-3
3-GCTATTAGTGATCAGCTTAAGTCGCCGGCGAGACGTCCAGCTG-5
SpeI
EcoRI
NotI
PstI
O
OP
O
P
O
O
BASE
zucchero
BASE
5 CH2
H
2
H
3
O-
1
H
OH
O
O- P
5 CH2
4
BASE
5 CH2
4
H
O
OP
O
H
3
H
2
OH
O-
BASE
O
H
3
H
2
OH
X
P
1
H
5 CH2
OO
P
O
O-
H
2
H
3
O-
1
H
pirofosfato
BASE
BASE
zucchero
CLONAGGIO
Vettore
Frammento
DNA
Taglio
(enzima di restrizione)
Cucito
(ligasi)
- Crescita batterica
- Selezione
- Estrazione costrutto
trasformazione
Vettore + inserto
Costrutto di DNA ricombinante
TRASFORMAZIONE
Replicazione batterica
Replicazione batterica
TRASFORMAZIONE
PARETE BATTERICA E MEMBRANA PLASMATICA
Metodo chimico
Elettroporazione
42 C
GHIACCIO
GHIACCIO
ELETTROPORAZIONE
Si creano pori transitori a livello della membrana plasmatica mediante lapplicazione di un campo elettrico
Tappo
Elettrodi
Contatti elettrici
Limpulso elettrico porta ad un aumento considerevole del potenziale di membrana.
Riarrangiamento della struttura molecolare della membrana.
Formazione di pori che si riempiono di molecole di acqua (pori idrofilici).
Aumento del trasporto transmembrana di ioni e molecole.
Pori idrofobici
Pori idrofilici
SELEZIONE
Plasmide con gene -lattamasi
Batteri
Batteri trasformati
trasformazione
TEST DI -COMPLEMENTAZIONE
Amp
ori
LacZ
(-GALATTOSIDASI)
Promotore delloperone Lac
Polylinker
5 X 106 2 X 107
109
ELETTROPORAZIONE
RAPPRESENTATIVITA
Una libreria rappresentativa contiene almeno una copia di tutte le possibili sequenze.
Almeno 10 cloni
A
B
D
I
A
trasformazione
E
H
G
I
C
B
E
G
ABCDEF GHIL
ABCDEF GHIL
10 CLONI
A
D
C
H
trasformazione
E
G
E
G
PRESENTI: A B C D E F G L
AAABCDEFGHIL
ASSENTI: H I
- Plasmidi
10 kb
- Cosmidi
20 kb
- Fagi
45 kb
- BAC
100 kb
- YAC
1000 kb
RAPPRESENTATIVITA
N=
ln (1-P)
ln (1-f)
N=
ln (1-0,99)
ln
(1-104/3x109)
= 1.400.000