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BIOLOGIA MOLECOLARE

1. Struttura e conformazione del DNA 1.01 rinci!ali "co!erte le#ate al DNA 1865: Mendel pubblica i risultati dei suoi esperimenti sui piselli, Esperimenti su piante ibride, gettando le basi del concetto di ereditariet e genetica. Ancora non si conoscevano gli acidi nucleici, le conoscen e arrivavano !ino alle proteine "alle #uali si attribu$ ini ialmente la !un ione di in!ormatori genetici% e alla presen a del nucleo. 186&: vengono scoperti gli acidi nucleici dal medico svi ero Miesc'er insieme a (l)er. Avevano studiato il materiale proveniente da gar e in!ette e spermato oi di trota* la componente cellulare di #uesto materiale viene separata tra nucleo e citoplasma, poi rompendo ed estraendo i componenti del primo, usando solu ioni saline, trovano c'e sono molto ricc'i in + e meno ricc'i di , ed - rispetto alle proteine. .i c'iama acidi nucleici. 18//: 0leming scopre i cromosomi. 1&1&: il medico inglese 2arrod !ormula l3ipotesi un gene 4 una proteina studiando pa ienti a!!etti da alcaptonuria, malattia ereditaria c'e colpisce il metabolismo dell3aa +'e "e 5)r% mancando gli a!!etti del gene per l3en ima omogentisato 1,67diossigenasi coinvolto nella degrada ione catabolica di #uesto aa. Mancano ancora per8 le conoscen e c'imic'e degli acidi nucleici. 1&11: Morgan scopre il parallelismo tra le modalit con le #uali venivano ereditati speci!ici geni e cromosomi sessuali e ottiene le prime con!erme sulla locali a ione dei geni sui cromosomi. 9 1.0$ rinci!io tra"formante 1&6871&:1: il microbiologo 0riederic' 2ri!!it' ipoti a il principio tras!ormante attraverso il suo !amoso esperimento: inietta nel topo 6 ceppi diversi di (treptococcus pneumoniae, un ceppo caratteri ato da capsula liscia "( ; (moot'% e l3altro privo di capsula e dall3aspetto ruvido "< ; <oug'%. =l tipo in!ettato con ( muore, ma vive se con il calore vengono uccisi i batteri. =l topo in!ettato con < vive. (e il topo viene in!ettato con < vive e con ( uccise con il calore, il topo muore. >uindi il ceppo non nocivo < era diventato patogeno se misc'iato al ceppo patogeno ( ucciso con il calore. =poti a #uindi la presen a di un principio tras!ormante c'e da ( si ? trasmesso ad < tras!ormandolo in nocivo. 9 1&@1: Aeadle e 5atum lavorano sulla -eurospora ,rassa e con!ermano sempre piB l3ipotesi un gene 4 un en ima di 2arrod dimostrando nettamente c'e certi geni codi!icano per proteine catalitic'e. 1&@@: Aver), Mc.eod e Mc,art) riescono a dimostrare c'e il principio tras!ormante ? il C-A. Estraggono dal topo morto il C-A degli ( vivi e con #uesto riescono a tras!ormare gli < in (, cosa c'e non si veri!icava se venivano usate ad esempio le proteine di (. =n!atti, #uando ( viene scaldato il calore rompe la sua membrana e il suo C-A, i cui !rammenti possono !uoriuscire* #uello con il gene per la patogenicit penetra in <, si integra nel suo genoma e viene espresso, tras!ormando < in (. 1&56: esperimento del !rullatore di Ders'e) e ,'ase dimostra c'e anc'e i geni virali sono acidi nucleici. Etili ano batterio!agi 56, nuclei vengono marcati con :6+, le proteine dell3involucro con :5 (. = batteri vengono !atti in!ettare da #uesto batterio!ago. Copo l3in!e ione !agica i batteri vengono piB volte centri!ugati.

= risultati !urono c'e nelle progenie del !ago vi era la maggior parte dell3acido nucleico parentale e nessuna traccia delle proteine. =noltre il batterio in!etto aveva C-A virale al suo interno mentre le proteine dell3involucro erano rimaste all3esterno, e se rimosse il batterio non perdeva la capacit di !ormare nuove particelle !agic'e. 0ine 3@17351: si conoscono le @ basi, i nucleotidi, l3esisten a del legame !os!odiestere :3753 ma ancora nulla sulla struttura del C-A. 1&@@: ,'arga!! studia la distribu ione delle @ basi "gi scoperte%. 0ormula la legge di ,'arga!!: AF2 ; 5F,, ossia A;5 E ,;2. .o scopre separando i componenti del C-A !ino ad avere una miscela di basi* poi usa la cromatogra!ia su carta. .a miscela viene assorbita dalla carta, man mano c'e il solvente viene assorbito viene separato determinandone i componenti in base alla #uantit. 1&5:: Gatson e ,ricH, utili ando le scoperte precedenti, scoprono la struttura corretta del C-A: una doppia elica complementare. Calla di!!ra ione ai raggi I si poteva osservare la struttura elicoidale, dalla regola di ,'arga!! essi determinarono la complementariet notando c'e A !orma 6 legami D con 5, e 2 ne !orma : con , e osservando inoltre c'e l3ingombro sterico di AF5 era pari a #uello di 2F,. 1&58: Art'ur Jornberg scopre la C-A polimerasi Meselson e (ta'l dimostrano la replica ione semiconservativa del C-A. Esperimento c'e utili a isotopi di - pesanti e leggeri, 6 cicli di irradia ione per dimostrare la semiconserva ione durante la replica ione. 1&61: ,ricH e Arenner dimostrano c'e l3in!orma ione della se#uen a nucleotidica va letta e tradotta a gruppi di : nucleotidi "tripletta e codoni% per ogni aa. (eguono molte nuove scoperte sull3m<-A, sul dogma centrale C-A 4 <-A 4 proteina, la nascita delle biotecnologie e delle tecnic'e del C-A ricombinante, oltre alla reali a ione del +rogetto 2enoma Emano avviato nel 1&&1 e terminato nel 6111 con la mappatura dell3intero genoma umano ad opera di ,raid Kenter e 0rancis ,ollins.

1.0% Ba"i e nucleotidi .e basi sono @, sono dette basi a otate perc'? contenenti -, libere sono basic'e, sono altamente coniugate "risonan a%, assorbono EK* il C-A assorbe a 661 nm. =n realt esistono piB di @ basi ma #ueste sono #uelle comunemente incluse nel C-A. Appartengono a 6 categorie diverse: A e 2 sono +E<=-E 5 e , sono +=<=M=C=-E +E<=-E: costituite da anello imida olico e da struttura pirimidinica. (ono #uasi planari. +=<=M=C=-E: totalmente planari.

+er ogni base ci sono 6 !orme tautomeric'e in e#uilibrio !ra loro e dipendenti dal pD. Es. ,=5L(=-A "anc'e ACE-=-A%: gruppi amminici, tautomeria ammino7immino.

AMM=-L +iB !re#uente

=MM=-L

Es. 2EA-=-A "anc'e 5=M=-A%: gruppi c'eto7enolici, tautomeria c'eto7enolica

,DE5L "!ra c'etone ed enolo% +iB !re#uente

E-L.L

.e basi si appaiono con complementariet purina 4 pirimidina nel seguente modo: A 4 5 "6 legami D% e , 4 2 ": legami D%.

= donatori e gli accettori di #uesti legami sono i seguenti: -.A.: donatore di legame D ? atomo di D legato ad altro atomo piB elettronegativo, accettore ? atomo di L o - elettronegativo.

,=5L(=-A72EA-=-A: 1. L di gruppo carbonilico su ,6 di 2 con D di gruppo amminico su ,@ di , 6. -: di , con D di -1 di 2 :. D di gruppo amminico di ,6 di 2 con L di gruppo carbonilico su ,6 di ,

ACE-=-A75=M=-A: 1. D di gruppo amminico esociclico su ,6 di A con L di gruppo carbonilico su ,@ di 5. 6. D di -: di 5 con -1 di A.

-.A. 0enomeno di rota ione della base: le basi possono protrudere dalla doppia elica. 0un ionale durante la ripara ione del C-A e per en imi di ricombina ione c'e scanneri ano l3elica ruotando in !uori le basi ad una ad una. = nucleotidi sono composti da una base a otata, uno ucc'ero a 5 atomi di , a cui ? legato almeno un !os!ato in posi ione 53. .o ucc'ero ? un <=AL(=L per i nucleotidi c'e vanno a comporre l3<-A o un 63CEL((=<=AL(=L per i deossinucleotidi, i monomeri del C-A. .a base piB lo ucc'ero "sen a gruppi !os!ato% !orma il -E,.EL(=CE "adenosina, guanosina, citidina, timidina%. -el termine nucleotide ? gi compreso invece il !os!ato o piB di un !os!ato* si parla #uindi di nucleoside mono!os!ato, nucleoside di!os!ato o nucleoside tri!os!ato. =l nucleoside 63deossitimidina non esiste come "ribo%timidina perc'? nell3<-A ? presente il suo corrispondente demetilato, l3E<A,=.E. = precursori usati nella sintesi del C-A sono i nucleosidi tri!os!ato.

1.0& Catene !olinucleotidic'e (ono i polimeri costituiti dalla successione di piB nucleotidi uniti tra loro da un ponte !os!odiestere, cio? da un !os!ato esteri!icato con l3LD ,7:3 di un nucleotide e con l3LD del ,753 di #uello successivo. >uesto sc'ema di legami delinea una polarit per ogni catena polinucleotidica: si c'iama estremit :3 #uella c'e termina con un LD7:3 libero "estremit a cui manca il nucleoside col gruppo !os!ato% ed estremit 53 #uella c'e termina con LD 53 di solito esteri!icato con !os!ato "talvolta libero%. =mportante ? c'e ogni molecola di C-A ? costituita da due catene polinucleotidic'e complementari avvolte a !ormare un3elica doppia e destrorsa a polarit opposta. >uest3ultima ? una conseguen a stereoc'imica dell3accoppiamento A75 e 27,. =noltre si crea un3impalcatura ucc'ero7!os!ato c'e ? costante in ogni catena polinucleotidica* #uello c'e varia ? la composi ione delle basi le #uasi sono disposte #uasi perpendicolarmente all3impalcatura ucc'ero7!os!ato. 1.0( Struttura del DNA 1. .3asse ? unico "diadico% ma le 6 elic'e non sono parallele e si vengono cos$ a !ormare un solco maggiore ed un solco minore. $. 1,:@ nm ; distan a tra le basi. %. circa 11,@ pb per ogni giro completo di C-A. &. circa :,@ nm ; lung'e a di un giro completo ; passo dell3elica "circa 11 M 1,:@%. (. 6,@ nm ; diametro dell3elica. ). .a parte interna del C-A ? idro!obica e costituita !ondamentalmente dalle basi delle due catene c'e si proiettano internamente e si appaiano in modo complementare con una speci!icit stabilita dai legami a D. .a struttura ? stabili ata anc'e dalle !or e di impilamento tra 6 basi sovrapposte. .a parte esterna, costituita dall3impalcatura ucc'ero7!os!ato, ? idro!ilica. .a parte esterna determina inoltre l3acidit della molecola per la presen a di caric'e negative dei gruppi !os!ato. *. .a doppia elica ? destrorsa* se la si guarda dal basso l3elica gira a destra verso l3alto. +. (ono antiparallele, 'anno cio? polarit opposta, e complementari. ,iascun paio di basi ? ruotato di 6N rispetto al precedente. -.A.: caratteristic'e 1. e ). sono le unic'e c'e rimangono invariate per ogni !orma di C-A, le altre sono caratteristic'e variabili.

1.0) Caratteri"tic'e del DNA B. =l C-A pu8 esistere in piB con!orma ioni. 2li studi di di!!ra ione ai raggi I 'anno rivelato la presen a di tre diverse strutture: il C-A A, il C-A O e il C-A A. =l C-A A ? il piB simile alla struttura !isiologica e si osserva in vitro in una solu ione altamente umida. .e caratteristic'e sono #uelle citate sopra. =noltre presenta un solco maggiore ampio e un solco minore piB c'iuso* il C-A ? in generale allungato e sottile. En3altra caratteristica c'e ? la con!orma ione del legame glicosidico c'e #ui ? anti. Ci!!erisce dalla !orma del C-A presente in natura in #uanto ? piB avvolto "in natura circa 11,@ pb per giro contro i circa 11 in solu ione% ed inoltre non ? per!ettamente regolare in #uanto la rota ione delle basi di una coppia attorno all3asse trasversale determina un3altera ione della posi ione delle basi c'e #uindi non giacciono sullo stesso piano. >uesto non ? costante ma !a comun#ue variare l3ampie a dei solc'i localmente.

1.0* Dimen"ioni delle di-er"e forme di DNA. .a !orma A di C-A 'a le seguenti caratteristic'e: ? piB corto e largo "circa 11 pb per giro%, il solco maggiore ? piB stretto e pro!ondo di #uello di A mentre #uello minore ? piB ampio e super!iciale, ? destrogiro e la con!orma ione del legame -7glicosidico ? anti. 7 1,6: nm ; distan a tra due coppie di basi 7 6,5 nm ; diametro elica 7 :,6 nm ; lung'e a del passo dell3elica 7 11 pb per giro 7 61N ; angolo tra due piani delle coppie di basi "per #uesto solco maggiore piB pro!ondo e stretto e il solco minore ? meno pro!ondo% C-A A ? una !orma disidratata e non naturale. .a ter a con!orma ione possibile ? la !orma O, la #uale ? stata osservata in natura. E3 levogira "sinistrorsa% e si ottiene se 'o un3alternan a di purine e pirimidine e se il legame -7 glicosidico ? anti sui residui pirimidinici "5 e ,% e sin su #uelli purinici "A e 2%. .a con!orma ione sin ? responsabile dell3avvolgimento sinistrorso e #uesta alternan a anti e sin determina la tipica con!orma ione a ig7 ag.

=l passaggio da anti a sin ? dato da una rota ione c'e cambia anc'e la posi ione del ribosio, mentre ,:3 e ,63 si scambiano di posi ione. >uesta !orma O va a costituirsi solo in presen a di molti ioni -aF o di altri ioni positivi c'e bloccano le caric'e negative dei !os!ati. 7 1,:8 nm ; distan a tra due coppie di basi 7 16 pb per giro 7 @,56 nm ; lung'e a passo dell3elica 7 solco maggiore piatto e sporgente dalla super!icie dell3elica 7 solco minore stretto e pro!ondo 71,8 nm ; diametro elica 7 &N ; angolo !ra i piani delle coppie di basi "per #uesto solco maggiore ? piatto% 1.0+ .i!i di le#ami e "olc'i nel DNA LEGAMI Legami nel nucleotide: si !ormano per condensa ione con perdita di D6L "covalenti%* #uello a piB alta energia ? #uello !os!oanidridico seguito da #uello estere. 7 .egame -7glicosidico, tra la base "-1 per le pirimidine e -& per le purine% e il gruppo LD sul ,1 del ribosio o del deossiribosio. +u8 essere nella con!orma ione anti "in C-A A e A, e sulle pirimidine del C-A O% oppure sin "purine del C-A O% 7 .egame estere, tra l3LD sul ,5 del ribosio o deossiribosio e il primo gruppo !os!ato 7 .egame anidridico "!os!oanidridico%, tra di piro!os!ato o tri!os!ato Legame covalente della catena: 7 .egami !os!odiesteri, tra ucc'ero di un nucleotide e #uello del successivo a !ormare impalcatura ucc'ero7!os!ato Interazioni deboli tra le basi: 7 .egami a D, tra le basi complementari A75 e ,72, sono !ondamentali per la stabilit termodinamica dell3elica ma anc'e per la speci!icit della coppia di basi. +er ogni legame D !ra le basi si rompe #uello c'e #uesto stabiliva con l3D6L #uindi teoricamente vi ? un aumento dell3entropia c'e stabili a appunto la doppia elica. .a speci!icit ? stabilita dal !atto c'e per motivi sterici ad esempio A e , si troverebbero di !ronte due accettori di legame D "-1 di A e -: di ,% c'e #uindi non possono !ormare un legame tra di loro ma nemmeno con una molecola di D6L perc'? #uesto non 'a spa io di interporsi tra i due accettori. Anc'e i due donatori -D6 al ,6 di A e ,@ di , dovrebbero stare di !ronte. 7 0or e di impilamento o intera ioni 4 , dovute alla struttura dell3D6L c'e con i suoi legami D spinge i gruppi idro!obici all3interno di una molecola. 0or e di tipo idro!obico c'e si stabiliscono tra basi sovrapposte* le basi, planari e idro!obic'e, si impilano perpendicolarmente all3asse longitudinale della doppia elica stabilendo intera ione tra le nuvole elettronic'e delle basi "sono aromatic'e e coniugate%. 0orniscono un grande contributo alla stabilit dell3elica. SOLCHI i !os!ati

(i !ormano per e!!etto della geometria della coppia di basi. .3angolo !ormato dalla protrusione degli ucc'eri dalle coppie di basi, cio? l3angolo !ormato dai legami -7glicosidici, ? di circa 161Nper l3angolo minore e 6@1N per #uello maggiore. >uindi #uando le basi si impilano una sopra l3altra la sovrapposi ione dell3angolo di 161N genera il solco minore, mentre #uello di 6@1N dall3altra parte genera il solco maggiore. .a sovrapposi ione degli angoli ? dovuta al !atto c'e le 6 elic'e sono antiparallele. Ca #uesti solc'i si a!!acciano i bordi delle basi. Solco maggiore = bordi delle basi c'e vi sporgono presentano un sistema di accettori e donatori dei legami a D caratteristico per ogni coppia A75 o 27, ma anc'e per 57A e ,72, c'e diventano #uindi distinguibili. Lgni coppia di basi ? identi!icata in modo speci!ico da determinati sc'emi dei solc'i* #uesto permette alle proteine di riconoscere in modo speci!ico e preciso la se#uen a di C-A sen a aprire l3elica. (pesso la proteina utili a un 7elica le cui catene laterali dei residui sporgono all3interno del solco minore. -.A. solco maggiore nel C-A A 'a alte a pari a 6,6 nm. C ; donatore legami D A ; accettore legami D M ; gruppo metilico D ; idrogeno non polare, legato ad un , an ic'? a - o L

+er il solco maggiore si delineano i seguenti sc'emi: AACD ; 27, DCAA ; ,72 ACAM ; A75 MACA ; 57A Solco minore Meno ricco di in!orma ioni, in!atti gli sc'emi sono uguali per le coppie 27, e ,72 e per A75 e 57A, c'e sono #uindi indistinguibili tra loro. -.A. nel C-A A pro!ondo 1,6 nm. ACA ; 27, ACA ; ,72 ADA ; A75

ADA ; 57A

1.0/ Se!arazione delle elic'e e tem!eratura di meltin# +er denatura ione s3intende la separa ione dei due !ilamenti della doppia elica per rottura dei legami deboli c'e li tengono uniti. >uesta rottura pu8 essere ottenuta mediante riscaldamento "circa 111N,% o ponendo il C-A in condi ioni di elevato pD "circa 16%. (e poi la temperatura o il pD vengono riabbassati a valori !isiologici so ottiene la rinatura ione. 5ale processo avviene in due stadi se i due !ilamenti sono completamente denaturati. .o stadio lento ? #uello in cui i due !ilamenti cercano la complementariet, #uello veloce ? #uello di riassocia ione. (e invece i due !ilamenti sono solo par ialmente denaturati si avr un unico stadio veloce di riassocia ione a cerniera. Curva di denaturazione Cescrive la varia ione di assorban a a 661 nm "EK% all3aumentare della temperatura a cui sottopongo il C-A. All3aumentare della temperatura aumenta anc'e l3assorban a. =n particolare si osserva un punto di !lesso prima del #uale non 'o cambiamenti e dopo il #uale l3assorban a aumenta del @1P. >uesto punto di !lesso ? la temperatura di melting "di !usione%, 5m, temperatura alla #uale 'o met della di!!eren a di assorban a tra la prima !ase a doppio !ilamento e la seconda a singolo !ilamento. A tal punto 'o anc'e met C-A ds "double strand% e met ss "single strand%. .3aumento di assorban a #uando il C-A ? a singolo !ilamento ? detto e!!etto ipercromico, la diminu ione di A #uando il C-A torna a doppio !ilamento ? detto e!!etto ipocromico. =noltre il netto aumento di A dopo 5m indica c'e la denatura ione e la rinatura ione sono processi altamente cooperativi. 5m ? caratteristica per ogni C-A: 7 +iB elevata ? la percentuale di 2 e ,, maggiore ? la 5m 7 +iB elevata ? la concentra ione salina della solu ione maggiore ? 5m. >uesto ? perc'? 2 e , !ormano : legami D e stabili ano maggiormente l3elica, inoltre le !or e di impilamento delle coppie 27, sono piB !avorite. =noltre le caric'e negative dei !os!ati dell3impalcatura ucc'ero7!os!ato aiutano la denatura ione per e!!etto repulsivo* se la concentra ione salina ? alta #ueste caric'e negative vengono sc'ermate e l3elica ? piB stabili ata.

1.10 DNA lineare0 circolare e "u!era--olto =l C-A pu8 essere lineare, come nei cromosomi eucariotici "una lunga molecola lineare di C-A per ogni cromosoma%. .a maggiore parte dei cromosomi batterici sono circolari, sono inoltre presenti elementi di C-A circolare c'e si replicano autonomamente, i plasmidi.

5L+L.L2=A del C-A =l C-A ? una molecola !lessibile e pu8 esistere in una !orma piatta o superavvolta* #uest3ultima !orma occupa meno spa io e si ottiene aumentando o diminuendo gli avvolgimenti del C-A. -elle molecole lineari le termina ioni sono libere #uindi per variare gli avvolgimenti basta ruotare i due !ilamenti in modo reciproco. -elle molecole circolari #uesto non ? possibile se non ci sono interru ioni nell3impalcatura ucc'ero7!os!ato. >uesti C-A circolari covalentemente c'iusi "cccC-A% non possono essere separati nei due !ilamenti a meno c'e non si inserisca un3interru ione "es. a ione della topoisomerasi% e si !accia passare l3altro !ilamento attraverso #uesta interru ione. =l linHing number ? il numero di volte in cui il !ilamento deve passare per #uesta interru ione a!!inc'? i due !ilamenti vengano separati de!initivamente, esso ? sempre un numero intero. L1 2 .3 4 5r Cove 5Q ; tQist, numero di volte c'e un !ilamento gira attorno all3altro !ilamento =n un cromosoma circolare piatto 5Q ; .J, e 5Q corrisponde al numero di volte in cui i due !ilamenti si incrociano su se stessi. Gr ; Qrit'e, numero degli incroci dell3asse longitudinale

-ormalmente per8 i cccC-A non sono piatti ma presentano torsioni c'e impongono all3asse longitudinale della doppia elica di incrociarsi su se stessa determinando cos$ una struttura tridimensionale e non piB planare. .3asse longitudinale pu8 avvolgersi su se stesso oppure attorno ad un cilindro immaginario !ormando una spirale. -.A. non variano le volte in cui si incontrano i 6 !ilamenti, per e!!etto della rota ione di uno sull3altro. >uello c'e varia ? l3avvolgimento dell3intera elica cio? il numero degli incroci dell3asse longitudinale. (e considero un C-A rilassato, il 5Q corrisponde a #uello di un C-A A, cio? 'o un incontro dei due !ilamenti ogni 11,5 basi. =l linHing number di #uesto ? de!inito .JN. L16 2 .3 2 n6 !7 8 100( Esso ? di segno positivo se avvolgimento destrorso. .a #uantit di superavvolgimenti di un cccC-A ? data dalla di!!eren a linHing. L1 2 L1 9 L16 (e .J ; 1 la molecola ? planare e rilassata "no avvolgimenti%, .J ; .JN

(e .J R 1 'o superavvolgimento negativo (e .J S 1 'o superavvolgimento positivo >uindi se .J R .JN 'o superavvolgimento negativo. .J ? sempre dato da 5Q F Gr #uindi diminuisce rispetto a .JN #uando 5Q diminuisce "e #uindi diminuisce il numero di pb per ogni giro d3elica% o #uando aumenta il numero di incroci dell3asse longitudinale della doppia elica "Gr%. Al contrario .J S .JN se aumenta il numero di pb per giro oppure diminuisce il numero di incroci dell3asse dell3elica. >uindi avr8 superavvolgimento positivo. (olitamente si 'anno superavvolgimenti negativi perc'? costituiscono un immaga inamento di energia libera a !avore di #uei processi c'e ric'iedono la separa ione dei due !ilamenti "trascri ione, ripara ione% tanto nei batteri "cccC-A% #uanto negli eucarioti "si creano lo stesso anc'e se lineari, la condensa ione comporta limiti topologici%. =n!atti, #uesti superavvolgimenti negativi tendono ad eliminare localmente la doppia elica e possono essere convertiti in tratti di C-A a singolo !ilamento. -.A. l3impacc'ettamento del C-A eucariotico su nucleosomi genera Qrit'e a spirale c'e si avvolge in modo sinistrorso, cio? l3impacc'ettamento del C-A sui nucleosomi introduce un superavvolgimento negativo. Superavvolgimento 1N avvolgimento ; i due !ilamenti avvolti attorno ad un asse 6N avvolgimento ; ripiegamento o torsione dell3asse su se stesso (uperavvolgimento ? mani!esta ione di una tensione strutturale, ? aspetto intrinseco della struttura ter iaria del C-A* se manca il secondo avvolgimento si 'a rilassamento. Cna ? rilassato nella !orma A, caratteri ato da determinato numero di giri: nN pbT11,5 Es. 8@ pb 8@T11,5 ; circa 8 giri

(e 'o una de!orma ione strutturale si avr8 superavvolgimento, soprattutto dovuto a disavvolgimento, ossia perdita di giri d3elica. Es. rimuovo uno degli 8 giri, #uindi 8@ pbT/ giri ; 16 pb per giro

Lttengo struttura termodinamicamente piB instabile della !orma A con 11,5 pb per giro, #uindi si andr a !ormare un superavvolgimento tramite avvolgimento dell3asse del C-A su se stesso. =n teoria si potrebbero anc'e separare i due !ilamenti di C-A per una lung'e a pari a circa 11 pb, le #uali sono le pb dell3ottavo giro perso, in modo tale c'e per il resto della molecola si stabiliscano giri !ormati da 11,5 pb. >uesto per8 ric'iede troppa energia per rompere i legami D tra i due !ilamenti. =n vivo il Cna disavvolto rende piB !acile la separa ione delle catene nei processi di trascri ione e replica ione e rappresenta una !orma di immaga inamento dell3energia. =n!atti disavvolgimento ; superavvolgimento negativo. 5L+L=(LME<A(= En imi c'e determinano l3aumento o la diminu ione dl grado di avvolgimento di C-A. Agiscono sul numero di legami ".J% 5=+L I "umana% A ione: taglio sul singolo !ilamento "nicH% Aumentano di F1 .JN (olitamente rilassano il C-A, rimuovono superavvolgimenti negativi 5=+L II "batterica% A ione: rottura doppio !ilamento Aumentano di F6 .JN =nducono superavvolgimenti negativi

-egli eucarioti esistono 6 topoisomerasi di tipo I "I e III% e due topoisomerasi di tipo II "II e II) le #uali non possono introdurre superavvolgimenti negativi come #uelle batteric'e "es. girasi, topoisomerasi di tipo II% ma possono indurre rilassamento del superavvolgimento sia negativo c'e positivo. .a compatte a del C-A ric'iede speciali !orme di compattamento: 7 superavvolgimento plectonemico: ampi avvolgimenti destrogiri "superavvolgimento negativo% rami!ica ioni catene avvolte in modo semplice e regolare 7 superavvolgimento a solenoide: assunto da C-A par ialmente disavvolto rota ioni levogire strette attorno ad un cilindro immaginario Entrambi superavvolgimenti negativi, solenoide non !orma compattamento adeguato in vivo. .e due !orme sono !acilmente interconvertibili ma la prima ? piB stabile in solu ione, la seconda ? !avorita dall3associa ione di proteine come avviene nella cromatina e rende maggiore la compatte a. =n!atti l3avvolgimento del C-A attorno ai nucleosomi ? un solenoide. .a prima !orma di compattamento ? comun#ue la !orma di disavvolgimento sia nei batteri, c'e poi n presentano !orme di compattamento con istoni, sia negli eucarioti, c'e presentano poi livelli ulteriori di impacc'ettamento.

$. Com!le""it: del DNA #enomico $.0$ Or#anizzazione #enica $.0% Genoma ;mano $.0& Se<uenze #enic'e e correlate ai #eni :,6 miliardi di basi, di cui il @1 P costituisce geni e se#uen e correlate ai geni "circa 1,6 miliardi di basi%. 5ra #uest3ultime, 1156 milioni di basi sono !rammenti genici, pseudogeni, introni ed altre se#uen e non tradotte "E<%, e solamente @8 milioni di basi sono costituite da se#uen e esonic'e. Ci conseguen a: @8T:611 ; 1,5P ; contenuto esonico del genoma. -el genoma umano circa 6611176@111 geni, di conseguen a la lung'e a media di un gene ? pari a: @8111111T6@111 ; 6111 pb. ,onsiderando c'e ogni aminoacido viene codi!icato da una tripletta di basi, in un gene medio si trovano 611T/11 aminoacidi "6111T:%. -.A. nel corpo umano circa 61781111 proteine ma 6676@111 geni. 2li introni sono 11761 volte piB numerosi degli esoni, sono circa 611117@1111. = 6 miliardi di pb restanti "C-A intergenico%: 7 se#uen e altamente ripetute ; 1@11 Mb ; .=-E "6@1 Mb% (=-E "@61 Mb% .5< "651 Mb% 5rasposoni "&1 Mb% 7 altre se#uen e intergenic'e ; 611 Mb ; se#uen e non ripetute "unic'e% ; 511 Mb se#uen e microsatelliti ; &1 Mb

(e#uen e ripetute ; 5:P del genoma, di cui: .=-E 61 P (=-E 1: P (e#uen e ripetute semplici 5 P Elementi retrovirus simili 8 P <esidui !ossili : P Cuplica ioni segmentali : P (e#uen e unic'e ; @1 P "introni :1 P% (e#uen e genic'e ; 1,5 P Eterocromatina ; 8P "ancora da se#uen iare% A #uesta va aggiunto il C-A mitocondriale c'e consta di 16561 pb. +oic'? in ogni cellula si trovano 811 mitocondri ed ognuno di essi contiene 11 copie di mitC-A, signi!ica c'e in ogni cellula troviamo 8111 copie di C-A mitocondriale. =n un tratto di 51 mila pb ci aspettiamo di trovare 1 o al massimo 6 geni. =l gene medio 'a circa una decina di esoni ed una decina di introni. $.0( Elementi ri!etuti inter#enici 1. .5< ; .L-2 5E<M=-A. <E+EA5 (ono se#uen e ripetute tipic'e dei retrovirus, di lung'e a pari a 611T811 pb. Cerivano dall3evolu ione, nell3uomo 'anno mantenuto l3aspetto virale ma 'anno perso la capacit in!ettiva. ,ostituiscono nel loro complesso circa l38 P del genoma umano. 6. .=-E ; elementi nucleari interspersi lung'i ,ostituiscono circa il 61 P del genoma umano. Es. se#uen a di 1611T8111 pb ripetuta 811T&11111 volte. :. (=-E ; elementi nucleari interspersi corti ,ostituiscono il 1: P del genoma umano. Es. se# EA-E di circa :11 pb, in vicinan a di geni. @. 5rasposoni a C-A 5. +seudogeni <elitti genomici, privi di introni e privi di !un ione. Cerivano dalla retrotrascri one dell3m<-A di un gene. Esso viene retrotrascritto a C-A, il #uale si integra in un punto diverso del genoma. Essendo privo di promotore ed essendo inserito in un punto casuale del genoma perde la sua !un ionalit. 6. 0rammenti genici Cerivano da altri geni, sono sparsi nel genoma. (e messi insiemi possono anc'e dare un gene. Es. K68 e K6&71 ,i sono poi punti scoperti in cui non ci sono se#uen e "se#uen e non ancora se#uen iate%, por ioni c'e non 'anno una !un ione apparente, C-A intergenico.

$.0) DNA "atellite E3 il C-A ripetuto in un cromosoma eucariotico, identi!icabile per l3insolita disposi ione nucleotidica. -on viene trascritto e non 'a !un ione nota. (i possono avere se#uen a K-5< "ripeti ioni in tandem a numero variabile, !ino a 65 pb%, se#uen e (5< "ripeti ioni in tandem semplici, 67@ nucleotidi%, se#uen e minisatellite e se#uen e microsatellite. .e se#uen e minisatellite e microsatellite, per la loro alta variabilit nella popola ione, costituiscono polimor!ismi molto utili nelle analisi di attribu ione della paternit, nei !ingerprinting e in medicina !orense. =l C-A minisatellite sono corte se#uen e di 1:761 pb o piB ripetute in tandem. (pesso a ripetersi ? un nucleotide come ,A, la #uale ? una ripeti ione molto comune. =l polimor!ismo risiede nel numero di ripeti ioni dell3unit ripetuta. .a loro locali a ione ? spesso nei telomeri "es. se#uen a 53 55A222 :3% o nei centromeri. =l C-A microsatellite ? costituito da se#uen e ripetute piB corte "anc'e 67@ pb% e ben distribuite nel genoma "in punti strategici%. (ono dovuti spesso ad errori durante la replica ione "es. slittamento di un !ilamento durante la replica ione, scambio di cromatidi !ratelli, crossing7over diseguale o duplica ione%. .e se#uen e satellite sono ricc'e in A75, #uesto ? !un ionale all3individua ione di bande satelliti. =n!atti, il C-A viene !rammentato con en imi di restri ione, viene poi messo in una provetta con una solu ione al 61 P di cloruro di cesio "sale molto pesante% e il tutto viene centri!ugato. =n tal modo viene a crearsi un gradiente di densit "C-A ? molto denso, 1,/6. (i ottiene una banda principale e poi bande piB piccole e meno dense, proprio per la presen a di se#uen e A75* sono #ueste le bande satelliti. .e bande satelliti vengono indicate con i numeri romani, il satellite = ? costituito da ripeti ioni di 1/T65 pb ed ? la componente piB ricca in A75 del genoma umano. Esso si locali a principalmente nei centromeri.

$.0* Com!le""it: #enomica 2iunti ad un certo livello evolutivo smette di esserci correla ione tra dimensione del genoma e complessit, il me o di con!ronto an ic'? le dimensioni diventa la DENSI.A= GENICA 2 n6 di #eni 8 lun#'ezza #enoma c'e esprime #uindi il poten iale codi!icante di un organismo. Maggiore ? la densit genica, minore ? la complessit* vi ? #uindi una rela ione inversamente propor ionale tra densit e complessit. .e maggiori densit si trovano, in!atti, nei virus "dove vi possono essere anc'e geni sovrapposti% e nei batteri "i #uali non 'anno introni%. 0ra eucarioti la densit genica diminuisce con l3aumento della complessit. .a diminu ione della densit genica ? dovuta a: 7 maggiori dimensioni di geni "aumento nel numero si se#uen e non codi!icanti nel gene% (E>EE-OE <E2L.A5<=,= "il concetto di gene comprende anc'e one regolatrici% =-5<L-= "se#uen e non codi!icanti intersperse tra le codi!icanti, costituiscono il &5P% 7 maggiore #uantit di C-A tra geni (E>EE-OE =-5E<2E-=,DE "por ione del C-A non associato con espressione di proteine

o <-A strutturali, costituisce il 61P del genoma, 6111 Mb% di #ueste: se#uen e unic'e ; 65 P "511 Mb% se#uen e ripetute ; C-A altam. ripetuto ; .=-E, (=-E, trasposoni "1@11 Mb% C-A microsatellite ; ripeti ione se# corte "&1 Mb% =n accordo con la minore complessit, gli eucarioti piB semplici 'anno maggiore densit genica, #uindi una minore #uantit di introni e di C-A intergenico. 5uttavia anc'e in genomi piB compatti, come in E. ,oli o (. ,erevisiae, vi sono microsatellite ed elementi trasponibili. =l C-A intergenico, apparentemente e momentaneamente privo di !un ione, deve comun#ue !ornire un vantaggio evolutivo. (e considero una regione di 65 Hb di C-A: E. ,oli ; 5/ geni (. ,erevisiae ; :1 geni diminuisce la densit genica Crosop'ila ; & geni Eomo ; 6 geni (e considero un singolo gene "es. gene per la subunit maggiore della <-A polim% E. ,oli ; meno di 5 Hb (. ,erevisiae ; circa 5 Hb aumenta la lung'e a di un gene Crosop'ila ; meno di 11 Hb Eomo ; circa :1 Hb $.0+ Dimen"ione #enomi di altri or#ani"mi -ei batteri la dimensione ? correlata al numero di geni. =n media &51 geniTMb. E. ,oli ; @,6 Mb M)coplasma genitalum ; 511 Hb

$.0/ Numero #eni in eucarioti .a grande a del genoma non ? strettamente correlata alla complessit dell3organismo* ci8 c'e determina la complessit ? la densit genica: minore ? la densit genica, maggiore sar la complessit dell3organismo. Esempi: 0ung'i: (. ,erevisiae 16 Mb, 5811 geni +roto oi: 5etra')mena t'ermop'ila 165 Mb, 6/111 geni =nvertebrati: C. Melanogaster 181 Mb, 1@/11 geni Kertebrati: D. (apiens :611 Mb, 61111 geni $.10 >ami#lie di #eni -ei batteri i geni sono praticamente distinti. 0ino alla mosca si riscontra una propor ionalit diretta !ra numero di geni e numero di !amiglie. -egli organismi piB evoluti aumenta il numero di geni mentre si appiattisce il numero di !amiglie* di conseguen e non aumenta il numero di !amiglia bens$ il numero di geni !acenti parte di ogni !amiglia.

$.11 Geni ed e-oluzione ,on l3aumento delle dimensione del genoma aumenta anc'e il numero dei geni, !ino all3Esc'eric'ia ,oli "@,6 Mb, @688 geni%. +oi si 'a un aumento notevole nelle dimensioni del genoma rispetto all3aumento in propor ione minore nel numero di geni. -egli eucarioti non vi ? piB correla ione tra numero di geni e dimensioni del genoma, importante ? invece la densit genica "nN geniTlung'e a del genoma in Mb%. =nvece per i batteri la dipenden a dimensioni genoma7geni ? lineare. .a perdita della propor ionalit tra dimensioni genoma e numero geni ? dovuta alla presen a di se#uen e ripetute, regioni intronic'e ed altre se#uen e regolatrici* aumenta #uindi la complessit del genoma ed ? possibile raggruppare i geni in !amiglie. 7 61 P del genoma ; simile tra eucarioti e procarioti "geni 'ouseHeeping, altamente conservati nel corso dell3evolu ione% 7 :1 P del genoma degli eucarioti ; si occupa del mantenimento della multicellularit. 7 6@ P del genoma dei vertebrati ; si occupa del sistema immunitario 7 66P del genoma dei vertebrati ; si occupa del sistema nervoso

%. Struttura del DNA nei cromo"omi E. ,oli: C-A di @,6 Mb, se viene svolto occupa 1,@ cm. Ma la cellula ? di 6 m M 1 mU =l problema sta nel !atto c'e #uando viene rotta una cellula si rompe anc'e il C-A, il #uale viene solitamente anali ato !rammentato. +er #uesto si ? cercato di rompere la cellula piB delicatamente e di utili are anc'e delle anti7 <-Aasi, ossia en imi c'e colpiscono #ueste proteasi. =l C-A batterico consiste in un3unica molecola integra e circolare* nell3eucariote #uesta integrit ? mantenuta a livello del cromosoma. %.01 DNA "u!era--olto =l C-A ? avvolto per lo piB negativamente sia nel C-A batterico c'e in #uello eucariotico. =l superavvolgimento negativo ? la prima !orma di compattamento presente. 5ale compattamento "c'e si esprime a tutti i livelli% ? necessario poic'? il C-A srotolato ? lungo circa 1,@ cm per E. ,oli e circa 1 m "corredo aploide% per il C-A umano, mentre esso deve poter stare in una cellula batterica "6M1 m% e nel nucleo di cellule eucariotic'e "diametro di 5711 m%. =n E. ,oli, oltre al superavvolgimento negativo, si !ormano circa una cin#uantina di anse contenenti ciascuna 517111111 pb. Lgni ansa parte e ritorna al punto di parten a sen a interru ioni. (ono state osservate in E. ,oli anc'e piccole proteine basic'e, Du. Lgni @ Du si !orma un tetramero su cui si avvolge il C-A. 5ali proteine Du sono simili agli istoni, tuttavia #ueste si associano e dissociano molto velocemente e non sono state osservate strutture stabili. %.0$ Nucleoide 7atterico =l nucleoide batterico ? la struttura nella #uale ? organi ata l3unica copia completa delTdei cromosomi batterici. 5ale copia ? una molecola di C-A integra e circolare ancorata alla super!icie interna della membrana plasmatica. %.0% Cromatina

(truttura !ormata dall3associa ione di C-A e proteine. -egli eucarioti: :5 P C-A 61 P proteine 5 P <-A 5ra le proteine, il 51 P sono proteine istonic'e, ossia proteine basic'e costituenti i nucleosomi il cui ruolo principale ? #uello di compattare il C-A* l3altro 51 P sono proteine non istonic'e, le #uali legano il C-A e regolano trascri ione, replica ione, ripara ione e ricombina ione. .a cromatina viene suddivisa in 7 E5E<L,<LMA5=-A ; rappresenta l38 P dell3intero genoma umano, ? piB compatta e priva di geni se non silen iati. <eplica nella !ase ( dopo l3eucromatina. 7 EE,<LMA5=-A ; ? piB aperta e accessibile, contiene i geni espressi. -elle !oto al microscopio presente colora ione piB tenue. %.0& roteine e #eni i"tonici 2li istoni sono proteine piccole e basic'e "1117611 aa, 11766 HCa%. .a basicit ? con!erita dagli aminoacidi caric'i positivamente .)s e Arg, c'e costituiscono piB del 61 P degli istoni, ed ? necessaria per l3associa ione al C-A acido "presen a di gruppi !os!ato%. .a loro massa totale ? simile a #uella del C-A poic'? sono necessari in abbondan a. (ono di 5 tipi: D1, D6A, D6A, D: e D@. =l primo ? detto istone linker, gli altri @ istoni del core del nucleosoma e !ormano il complesso proteico attorno il #uale il C-A si avvolge. =l linHer unisce invece 6 nucleosomi mediante una coda ed ? di dimensioni maggiori. =n accordo con la loro abbondan a i geni istonici sono ripetuti 111 volte e sono geni ancestrali e mantenuti nel corso dell3evolu ione. 5ali geni non presentano introni. .a conserva ione di una proteina si misura in termini di 1 muta ione M 111 aa M 111 anni* D: e D@ sono estremamente conservate, leggermente meno D1, D6A e D6A. (e sono cos$ conservate deve esser proprio perc'? la loro struttura ? tale da consentire un rapido e per!etto avvolgimento del C-A attorno al nucleosoma. +resentano, in!atti, una regione conservata c'iamata 'istone7!old, !ormata da tre regioni elica c'e media la !orma ione testa7coda di speci!ici eterodimeri. 6 "D:7D@% !ormano un tetramero 6D:76D@ e D6A e D6A !ormano due eterodimeri c'e non tetrameri ano. =l nucleosoma si !orma poi dall3associa ione ordinata di #uesti complessi proteici con il C-A.

Lgni istone del core possiede poi una coda -7terminale, la #uale non 'a una struttura ben de!inita e sporge all3esterno del nucleosoma rendendosi accessibile ad esempio per rea ioni di acetila ione o deacetila ione, !os!orila ione, metila ione, importanti per processi di rimodellamento della cromatina. -ell3ambito dell3espressione genica e della sua regola ione, #ueste modi!ica ioni cambiano la carica dell3istone ma anc'e !orma e propriet strutturali. (e con tripsina tratto il nucleosoma essa taglia le code ma il core resta associato saldamente al C-A.

=noltre anc'e i trascritti sono peculiari perc'? privi della poli7A, per #uesto sono detti <-A7meno7 poli7A. -.A. +ossiamo parlare di struttura secondaria del C-A per le diverse con!orma ioni del C-A, di struttura ter iaria per tutte le strutture c'e portano all3impacc'ettamento del C-A. %.0( Nucleo"oma =l C-A intimamente legato al nucleosoma ? detto C-A core "1@6 pb% e si avvolge in modo sinistrorso !ormando un solenoide "di !atto ? un Gr a solenoide%, ? avvolto 1,6576 volte. =l C-A tra i nucleosomi ? detto C-A linHer "61761 pb%. -el complesso, #uindi, C-A linHer F C-A core ; circa 611 pb. .e 1@6 pb del C-A core sono costanti in ogni cellula eucariotica* le dimensioni del C-A linHer variano invece di organismo in organismo. .a componente proteica del nucleosoma ? un ottamero istonico c'e presenta due assi di simmetria c'iamati diadi. =l tetramero D:7D@ "6D: e 6D@% interagisce ampiamente con il C-A ed ? il primo ad associarsi a #uesto. +oic'? esso interagisce con le 61 pb centrali del C-A con il suo 'istone !old e con le ultime 1: pb di ciascun terminale del C-A attraverso un elica della regione -7terminale di D:, provoca una curvatura c'e !acilita l3associa ione con i 6 dimeri D6A7D6A. >uesti ultimi legano ciascuno :1 pb da entrambi le parti delle 61 pb centrali associate ad D: e D@. D6A e D6A si associano piB lassamente al C-A e #uesto potrebbe !acilitare il rilascio al momento della replica ione. .3associa ione Cna7istoni ? mediata da circa 1@1 legami ad D per lo piB tra le proteine istonic'e basic'e e gli L negativi dei legami !os!odiesterici presenti vicino al solco minore del C-A. (olo i legami D sono con le basi attraverso il solco minore. Kiene coinvolto il solco minore perc'? non ? importante il riconoscimento di una particolare se#uen a. .3elevato numero di legami !ornisce l3energia necessaria per curvare il C-A* inoltre la basicit degli istoni c'e si associano al C-A masc'era la carica negativa dei !os!ati c'e impedirebbero, a causa della repulsione, la curvatura del C-A. .e code -7terminali stabili ano il C-A e lo costringono ad avvolgersi attorno al nucleosoma con andamento sinistrorso* #uesto perc'? le @ code degli istoni D: e D6A emergono !ra e dalle 6 elic'e tra 6 solc'i minori adiacenti "come i solc'i di una vite, emergono anc'e dalla posi ione diametralmente opposta dell3ottamero%, mentre le @ code di D@ e D6A emergono dalla parte superiore e in!eriore dell3ottamero istonico. =l C-A associato ai nucleosomi 'a 11 pbTgiro* #uesto compattamento introduce dei superavvolgimenti negativi. %.0) Struttura a filo di !erle <appresenta il ! livello di compattamento eucariotico . E3 la struttura C-A7nucleosoma e viene anc'e de!inita !ibra 11 nm. .a si pu8 osservare sottoponendo il C-A a concentra ioni saline elevate. =l C-A viene compattato di circa / volte. -.A.: la collana a !ilo di perle comprende come concetto anc'e il primo livello di compattamento del superavvolgimento negativo.

%.0* >i7ra %0 nm <appresenta il "! livello di compattamento eucariotico . Entra in gioco D1, istone linHer, il #uale interagisce con il C-A linHer costringendo il C-A ad una maggiore adesione con l3ottamero istonico. =n!atti, utili ando una nucleasi micrococcica c'e taglia il C-A tra 6 nucleosomi, ottengo, in assen a di D1, 1@/ pb* in presen a di D1 1@/F61 ; 16/ pb. D1 lega due regioni distinte del C-A dupleM !acenti parte della se#uen a associata al nucleosoma, tali regioni sono il C-A linHer e la parte mediana delle 1@/ pb legate all3ottamero* si aumenta in #uesto modo la lung'e a del C-A attorno all3ottamero. >uesto legame stabili a la struttura cromatinica di 6N livello "!ibra di :1 nm%, c'e presenta un grado di compattamento @1 volte superiore al C-A standard.

,i sono 6 modelli esplicativi della !ibra :1 nm: 7 (L.E-L=CE "A%: C-A e nucleosomi !ormano una superelica con 6 nucleosomi per giro. <ota ioni levogire del C-A attorno al nucleosoma, diametro !oro centrale 11 nm. 7 O=27OA2 ",%: nucleosomi disposti a ig7 ag con il C-A linHer c'e attraversa l3asse longitudinale della !ibra. Maggiore ? la lung'e a del C-A linHer piB ? !avorita #uesta struttura, in #uanto i sono disposti da una parte e dall3altra del C-A V importante notare c'e non tutta la !ibra da :1 presenta solo una delle due !orme.

nucleosomi linHer. nm

-ella !orma ione di #uesta !ibra intervengono anc'e le code -7terminali sen a le #uali non si pu8 !ormare #uesto grado di impaccamento* esse interagiscono mediante legami D con i nucleosomi adiacenti. .e code degli istoni sono inoltre importanti poic'? proprio in tale ambito avvengono modi!ica ioni associate al rimodellamento della compatta ione del C-A, talvolta impedendo la stessa !orma ione della !ibra :1 nm. .a !ibra :1 nm, inoltre, non si estende in ogni istante per l3intera lung'e a del cromosoma ma viene interrotta da regioni in attiva trascri ione. .e one c'e contengono geni in trascri ioni presentano, appunto, #uantit trascurabili di D1. %.0+ ?alori di im!accamento Ciametro ; 6,@ nm 11,5 pb per giro (pa io tra basi ; 1,:@ nm -umero di basi ; : miliardi "corredo aploide% 1,:@ nm M: miliardi ; 1 m per un corredo diploide ; 6 m 6 m M 6,@ nm ; ingombro :C

>uesta ? la lung'e a del C-A umano srotolato e deve essere compattato riducendo la lung'e a di circa 11111 volte per poter stare dentro un nucleo con diametro di 11715 nm.

1N livello: !ibra da 11 nm "!ilo di perle% C-A nucleosomico ; 611 pb (pa io tra basi ; 1,:@ nm Ciametro nucleosoma ; 11711 nm .ung'e a C-A nucleosomico: 611pb M 1,:@ nm ; 68 nm Kalore di impaccamento: 68 nmT11 nm "diametro nucleosoma% ; )0+ "circa /% 6Nlivello: !ibra da :1 nm Ciametro !ibra ; :1 nm Elica con 6 nucleosomi per giro C-A per ogni giro d3elica ; 611 pb M 6 nucleosomi ; 1611 pb .ung'e a C-A per ogni giro ; 1611 pb M 1,:@ nm ; @18 nm Kalore di impaccamento ; @18 nmT11 nm ; &00+ "circa @1% :N livello: anse ,alcolo approssimativo .ung'e a C-A per ogni ansa: 61781111 pb M 1,:@ nm ; 61111 nm Kalore impaccamento ; (00@1000 @N livello: impalcatura meta!asica Kalore di impaccamento ; +000@10000 %.0/ An"e <appresentano il #! livello di compattamento eucariotico . =l C-A della !ibra :1 nm !orma delle anse ciascuna di @17&1111 pb, #ueste sono bloccate alla loro base da una struttura proteica o matrice, detta (,A00L.C -E,.EA<E. >uest3ultimo ? !ormato da D1, topoisomerasi == e altre proteine come le (M, "dette condensine%. .a topoisomerasi == probabilmente !a parte del sistema di proteine c'e tiene bloccato il C-A alla base delle anse. .e proteine (M, "proteine del mantenimento della struttura del cromosoma% sono componenti c'iave dell3ulteriore condensa ione c'e avviene dopo la replica ione del C-A "C-A meta!asico%. +roteine della !amiglia (M, sono coinvolte nella !orma ione della coesina, c'e tiene uniti i cromatidi !ratelli, e della condensina, la #uale appunto lega le anse adiacenti aiutando l3impacc'ettamento del C-A. Lgni ansa ? detta anc'e replicone poic'? presenta un3unit replicativa per la replica ione. =noltre ogni ansa porta in genere un3unit genica "un gene%. .e anse possono avere comun#ue dimensioni diverse e !orse #uesto rispecc'ia l3espressione a #uel livello* vi ? in ogni caso continuit tra le anse. %.10 Im!alcatura metafa"ica <appresenta il $! livello di compattamento eucariotico . .e anse aperte in inter!ase vengono c'iuse e ripiegate sulla matrice stessa in meta!ase, #uando non vi ? piB espressione genica. Kiene a !ormarsi, anc'e mediante l3a ione delle condensine, la struttura altamente condensata del cromosoma meta!asico.

Anc'e nell3eterocromatina le anse sono strettamente impaccate, e #uesto indica silen iamento o assen a di geni. 5uttavia #uesta struttura ? presente anc'e in inter!ase.

%.11 Im!accamento del DNA ne#li "!ermatozoi .a cromatina dello spermato oo ? notevolmente addensata. >uesto notevole impaccamento ? reso possibile da un particolare tipo di istone, detto istone germinale o protammina, particolarmente ricco in Arginina piB c'e in .isina. .e protammine agenti nello spermato oo sono la (+E<M=-A e la (+E<M=C=-A, poliammine caric'e positivamente derivate dal punto di vista bioc'imico dalla metionina S ERMINA "(7adenosilmetionina% e dall3ornitina "la #uale a sua volta deriva dall3arginina nel ciclo dell3urea%. (ono proteine piB basic'e e di dimensioni in!eriori. =l C-A si condensa in toroidi di diametro pari a 51 nm c'e circondano il nucleo di protammine. <esta una S ERMIDINA piccola parte associata agli istoni. =l !ilamento da 51 nm si ripiega #uindi ancora in anse da @6111 pb legate alla matrice "sca!!old%. -.A. 2li eucarioti non possiedono en imi in grado di introdurre superavvolgimenti negativi "nei batteri lo !a la C-A girasi% ma nonostante #uesto, il C-A eucariotico ? disavvolto par ialmente "superavvolgimento negativo%. =l motivo ? il seguente: l3avvolgimento con rota ioni molto strette del C-A attorno al nucleosoma in !orma di solenoide ric'iede la rimo ione di un giro d3elica* #uesto disavvolgimento deve essere accompagnato ed e#uilibrato da un superavvolgimento positivo in un altro punto del C-A non legato ai nucleosomi. 5uttavia #uesto superavvolgimento positivo pu8 essere rimosso dalla topoisomerasi eucariotic'e ottenendo come risultato netto solamente un superavvolgimento negativo e #uindi C-A disavvolto "ridu ione netta di .JN%. .o stretto avvolgimento ric'iede anc'e una compressione della scanalatura minore nei punti di contatto* #uesto accade piB !acilmente per coppie A;5. V #uesto il motivo per cui i nucleosomi si associano al C-A in dipenden a della se#uen a* c'iaramente vengono pre!erite se#uen e in cui abbondano appaiamenti A;5.

&. Re!licazione del DNA &.01 I!ote"i di 5at"on e CricA Lltre a mettere a punto la struttura del C-A, Gatson e ,ricH misero a punto anc'e il modello di replica ione del C-A basandosi innan itutto sulla complementariet delle basi. .a loro teoria era c'e ciascun3elica contenesse l3in!orma ione necessaria a costruire l3elica complementare e #uesto suggeriva un sistema semplice ed e!!iciente per replicare il C-A: la separa ione delle due elic'e ognuna delle #uali sarebbe servita da stampo per il nuovo !ilamento. =l risultato sono due nuove elic'e ognuna contenente un vecc'io ed un nuovo !ilamento. Gatson e ,ricH proposero #uindi il modello di replicazione semiconservativa, dimostrata 5 anni dopo "358% essere #uella corretta a scapito della teoria dispersiva e conservativa.

.3esperimento di con!erma !u #uello di Meselson e (ta'l: Meselson e (ta'l !ecero crescere dei batteri in un terreno di coltura ricco dellWisotopo pesante 15-. >uesti microorganismi metaboli arono lW15- c'e #uindi venne ad essere introdotto in molte molecole biologic'e* tra #ueste molecole bisogna ricordare le basi a otate del C-A. =n #uesto modo il C-A presente nei batteri era un X%&A pesanteX, poic'Y inglobava atomi di a oto piB pesanti della norma. = due scien iati si assicurarono di mantenere i batteri in #uesto terreno di coltura per un tempo tale da garantire c'e tutto il C-A !osse e!!ettivamente pesante. Alcuni batteri !urono poi prelevati, lisati e, con opportune tecnic'e di laboratorio, venne estratto il loro C-A. >uestWultimo venne aggiunto ad una provetta contenente una solu ione concentrata di ,loruro di ,esio ",s,l 6M%. .a provetta !u poi centri!ugata. =n #ueste condi ioni nella provetta si !orma un gradiente di densit dal momento c'e il ,s,l tende a concentrarsi verso il !ondo della stessa. Ena volta c'e si ? !ormato il gradiente di densit, il C-A "ma in generale #ualun#ue molecola nella provetta% migra per !ermarsi nella regione della solu ione c'e 'a densit uguale alla sua. =l C-A pu8 essere messo in eviden a in seguito allWintrodu ione di particolari sostan e c'e si legano ad esso e divengono visibili se illuminate da luce ultravioletta. >uesta particolare tecnica prende il nome di centri!uga ione in gradiente di densit e in #uesto contesto, come si capir in seguito, serve a XpesareX il C-A estratto. ,i8 c'e si vide sperimentalmente !u una banda verso il !ondo della provetta. A #uesto punto alcuni batteri !urono tras!eriti dal primo terreno di coltura in un nuovo terreno XstandardX, in cui cio? era presente 1@an ic'Y 15-. = microorganismi metaboli arono lWa oto includendolo nelle basi a otate dei nucleotidi c'e andranno a !ormare "tra le altre cose% le nuove elic'e di C-A. 5rascorsi trenta minuti, ovvero il tempo necessario per la !orma ione di una nuova genera ione di batteri "ovvero replica ione del C-A%, alcuni batteri !urono prelevati dal terreno XstandardX, !urono lisati e venne estratto il C-A. =n seguito ad una centri!uga ione in gradiente di densit si ottenne unWunica banda posta in posi ione superiore rispetto a #uella del caso precedente: il C-A era #uindi pi' leggero. 5rascorso il tempo necessario per la successiva replica ione del C-A venne ripetuta la suddetta procedura. =n #uesto caso si ottennero due bande: la prima in posi ione nettamente superiore a #uelle ottenute nei casi precedenti, la seconda nella stessa posi ione di #uella dellWesperimento precedente. A #uesto punto possiamo identi!icare: un C-A pesante in cui per !or a erano presenti due !ilamenti 157 un C-A medio in cui per !or a era presente un !ilamento 15- e un !ilamento 1@7 un C-A leggero in cui per !or a erano presenti due !ilamenti 1@Alla luce di ci8, lWunico modello in grado di spiegare i XpesiX delle varie molecole di C-A era #uello di replica ione semiconservativa. -el caso di replica ione conservativa sarebbe sempre stata visibile la banda della doppia elica 15 - T 15- "situa ione non rispecc'iata dai risultati sperimentali%, mentre, nel caso della replica ione distributiva nelle genera ioni successive alla prima non sarebbe stata presente la banda del C-A 1@ - T 15-, cosa c'e invece i !atti escludono. 7

&.0$ Ori#ine di re!licazione in 7atteri ed eucarioti =l C-A batterico 'a una sola origine di replica ione detta replicatore c'e viene riconosciuta da un ini iatore, a #uesto livello si apre la doppia elica e si !orma la bolla di replicazione. =l C-A sinteti ato da un3unica origine ? detto replicone. =l replicatore ? l3intero set di se#uen e nucleotidic'e su!!icienti per dirigere l3ini io della replica ione. V un concetto diverso da origine di replica ione, la #uale ? invece considerata il sito in cui il C-A si separa ed ini ia la sintesi. Essa !a sempre parte del replicatore ma a volte ne costituisce solo una !ra ione di se#uen a. =l replicatore, oltre a contenere un sito di riconoscimento per l3ini iatore, ? spesso ricco in A;5, poic'? tale appaiamento ? piB !acile da aprire, anc'e se non spontaneamente. .3ini iatore ? una proteina c'e riconosce in modo speci!ico un elemento del replicatore e attiva l3ini io della sintesi. =l replicatore di E. ,oli !u il primo ad essere identi!icato, ? detto ori, ed ? costituito da 6@5 pb povere in 2, e ricc'e in A5. =n particolare, ? una se#uen a di & pb ripetuta 5 volte c'e rappresenta il sito di legame dell3ini iatore C-AA "una proteina costituita da :1 monomeri a !ormare un barilotto%* un3altra se#uen a di 1: pb ripetuta : volte rappresenta invece l3origine di replica ione, cio? il punto in cui si separa la doppia elica. .3associa ione all3ini iatore determina una curvatura della cromatina* in tal modo i monomeri di C-AA si legano anc'e alla se#uen a di 1: pb determinando l3apertura dell3elica. -egli eucarioti si trovano piB siti di replica ione, probabilmente situati nelle anse "appunto dette anc'e repliconi%.

.3ini iatore eucariotico ? L<, "complesso di riconoscimento dell3origine%, una proteina esamerica. -on sono ancora state individuate precise se#uen e consenso, ma tenden ialmente sono molto piB grandi rispetto a #uelle batteric'e. -on ? detto c'e tutte #ueste origini vengano aperte contemporaneamente, inoltre i cromosomi eucariotici devono essere replicati una sola volta durante il ciclo cellulare, precisamente in !ase (. &.0% Bolla re!licati-a &.0+ >orcella re!licati-a -ella cellula entrambi i !ilamenti vengono replicati contemporaneamente, ? necessario #uindi prima di tutto separare i due !ilamenti. =l punto c'e si trova !ra i due !ilamenti separati e la doppia elica c'e ancora non 'a subito il processo di separa ione ? detto (orcella replicativa, ed ? il punto dove attivamente vengono sinteti ate le nuove catene di C-A. Essa si sposta continuamente lasciandosi dietro due catene a singolo !ilamento su cui verranno sinteti ati i nuovi !ilamenti. .o spostamento avviene in dire ione del C-A dupleM* la separa ione del C-A dupleM e #uindi l3avan amento stesso della !orca replicativa avviene a spese di un en ima, la %&A elicasi. -ei procarioti nascono due !orcelle per l3unica origine di replica ione* tali !orcelle si muovono in dire ioni opposte !ino ad incontrarsi. >ueste due !orc'e !ormano una struttura c'iamata bolla di replicazione. .a struttura della bolla di replica ione viene a !ormarsi anc'e negli eucarioti: all3origine di replica ione viene a !ormarsi tale struttura, da l$ la sintesi ? bidire ionale e ogni met della bolla ? una !orca di replica ione. &.0& Reazione di !olimerizzazione del DNA .a sintesi di C-A ? una rea ione di polimeri a ione i cui substrati sono i #uattro deossinucleosidi tri!os!ato "dA5+, d25+, d,5+, d55+% e il complesso innesco7stampo, !ormato da C-A a singolo e doppio !ilamento. >uesto complesso ? !ondamentale perc'Y la C-A polimerasi non pu8 mai ini iare dal nulla la sintesi ma solo da un3estremit LD7:3 libera. >uesta estremit ? !ornita, appunto, dall3estremit :3 dell3innesco del complesso innesco7stampo. >uesto innesco ? molto piB corto del C-A stampo ma complementare ad esso. =l !ilamento stampo ? dupleM dove c3? l3innesco, ? a singolo !ilamento per il resto della lung'e a e dirige la sintesi del nuovo !ilamento. .a rea ione di polimeri a ione ? una rea ione (-6, in cui :37 LD ? il nucleo!ilo c'e attacca il !os!ato del deossinucleoside tri!os!ato c'e deve essere aggiunto. =l gruppo uscente ? ++i "+ e +% e il prodotto ? la !orma ione di un nuovo legame !os!odiestere. .a scelta del nucleotide in entrata ? dettata dal !ilamento stampo* l3idrolisi di ++i da parte della piro(os(atasi inorganica rilasci energia. =n totale si 'a la rottura di due legami anidridici !ra gruppi !os!ato e #uindi la rea ione di polimeri a ione ? !ortemente !avorita "Z2 RR 1, rea ione molto esoergonica%. &.0( .i!i di "tam!o@inne"co .3innesco pu8 essere sinteti ato da parte delle <-A polimerasi, le #uali sono in grado di sinteti are l3innesco de novo.

=n tal caso il primer ? ad <-A e viene sinteti ato dalla primasi, la #uale ? un <-A polimerasi speciali ata nella !orma ione di corti <-A primer "5711 nucleotidi%. .a C-A polimerasi ? poi in grado di ini iare la sintesi dall3estremit :3 4 LD dell3<-A primer. >uesto tipo di innesco7stampo genera #uindi un tratto di C-A7<-A eterodupleM. En altro tipo di innesco7stampo pu8 essere !ornito invece da un nick "rottura a singolo !ilamento% c'e espone anc'e in #uesto caso un :3 4 LD libero. =n #uesto caso l3innesco7stampo ? omodupleM e la regione a singolo !ilamento varia da uno a piB nucleotidi a seconda dell3entit dell3interru ione. >uesta situa ione si veri!ica, ad esempio, durante la ripara ione del C-A. 2li innesc'i sono uno per il leading strand, cio? il !ilamento replicato in modo continuo, e molteplici per il lagging strand, cio? uno per ogni (rammento di Okazaki) =noltre #uesti <-A primer devono essere rimpia ati da deossiribonucleotidi* #uesta a ione ? simile alla ripara ione nel processo di escissione di basi. .3en ima <-Aasi D "D ; D)brid% idroli a in modo speci!ico l3<-A appaiato a C-A, rimuovendo tutto il primer eccetto l3ultimo ribonucleotide, in #uanto pu8 idroli are solamente legami ribonucleotide7ribonucleotide e non legami tra ribonucleotidi e deossiribonucleotidi. >uest3ultimo ribonucleotide viene rimosso da un3esonucleasi c'e degrada da 53 "esonucleasi 53%* in un certo senso la +ol = batterica possiede la capacit di svolgere #uesta attivit. .a C-A polimerasi, in seguito, parte da :3 4 LD libero e riempie il gap lasciando per8 in nicH tra il :3 4 LD dell3ultimo deossiribonucleotide aggiunto e il 53 !os!ato del nuovo !ilamento gi sinteti ato. =l nicH viene riparato dalla C-A ligasi. &.0) A!!aiamento nucleotidi corretti e non corretti =l !ilamento stampo serve per inserire in modo corretto i deossinucleotidi sul !ilamento di nuova sintesi s!ruttando le regole di complementariet. 5uttavia la rea ione della C-A polimerasi pu8 talvolta inserire un nucleotide non corretto ogni 11 5 nucleotidi polimeri ati, il c'e ? dovuto spesso alla tautomeri a ione di una base in una !orma "imminica o enolica% sbagliata. >uesti errori devono essere corretti !ino a raggiungere una precisione dell3ordine di 1 errore ogni 1111 nucleotidi. >uesta maggior precisione ? data dall3attivit intrinseca della C-A polimerasi stessa conosciuta con il nome di esonucleasi correttore di bozze.

&.0* Atti-it: !olimerizzante e autocorretti-a della DNA !olimera"i .a C-A polimerasi contiene un solo sito attivo il #uale ? speci!ico nei con!ronti dei @ deossinucleotidi* essa ? speci!ica per l3ingombro sterico creato da una coppia appaiata correttamente ed ? in grado di discriminare tra deossi7 e ribonucleotidi. (olo #uando si !orma una coppia corretta, in!atti, i legami D c'e si !ormano dispongono il +[ in posi ione ottimale per ricevere l3attacco nucleo!ilo di :3 4 LD. (e l3appaiamento non ? corretto #uesto non avviene. .a velocit di incorpora ione di un nucleotide non corretto ? 11111 volte piB bassa, in #uesto modo viene permesso l3intervento dell3attivit autocorrettiva. = ribonucleotidi vengono incorporati ad una velocit 1111 volte piB bassa a causa dell3esclusione sterica nel sito attivo della C-A pol c'e non consente la presen a del 63 4 LD. =l concetto di selettivit cinetica ? !ondamentale per l3attivit autocorrettiva della C-A polimerasi.

.a C-A polimerasi assomiglia come struttura ad una mano destra par ialmente c'iusa. 7 =l palmo ? un !oglietto e contiene il sito catalitico* #uesto ospita due ioni bivalenti "Mg6F o On6F% c'e svolgono catalisi sottraendo D dal :3 4 LD e rendono :37 L7 un nucleo!ilo !orte, mentre l3altro ione masc'era le caric'e negative di + e + stabili ando il ++i. =l palmo controlla anc'e l3ingombro sterico dell3appaiamento delle basi. 7 .e dita possiedono residui c'e legano i d-5+ e #uando si !orma una coppia corretta d-5+ e stampo si c'iudono per trattenerla. +iegano poi di &1N il legame !os!odiesterico c'e si trova subito dopo il sito catalitico per esporre ad esso solo la prima base c'e si trova dopo l3innesco. 7 =l pollice mantiene in una corretta posi ione il complesso innesco7stampo e stabili a il complesso en ima7substrato. Attivit* polimerizzante 53 :3 "sito +, polimerasi% ,atali a la rea ione di polimeri a ione a partire da un :3 4 LD libero. =l numero medio di nucleotidi polimeri ati al secondo esprime il grado di processivit dell3en ima e varia da una C-A polimerasi ad un3altra "in generale la !orcella si muove ad una velocit di 1111 nucleotidi al secondo%. .a C-A polimerasi ? un en ima processivo, il c'e gli consente di rimanere legata e continuare a polimeri are. Attivit* autocorrettiva: esonucleasi correttore di bozze "sito E, esonucleasi% Attivit esonucleasica della C-A polimerasi in dire ione :3 53 c'e demolisce il C-A da un :3 LD nel momento in cui ? stato inserito un nucleotide errato. >uesta attivit ? !avorita dal rallentamento dell3attivit polimeri ante #uando vi ? un appaiamento scorretto e dal conseguente aumento di a!!init per il sito esonucleasico. 2ra ie a #uesta attivit il numero di errori si abbassa da 1 nucleotide errato ogni 11 5 a 1 ogni 11/* gra ie ad altri sistemi di ripara ione si arriva a 1 ogni 1111. =n vitro ? presente anc'e un3attivit esonucleasica 53:3 c'e ric'iede come ini io una rottura del singolo !ilamento con conseguente !orma ione di un complesso innesco7stampo. >uesta attivit in E. ,oli viene svolta dalla C-A polimerasi =. -.A. Endonucleasi: degradano dall3interno il C-A sulla base di se#uen e bersaglio Esonucleasi: degradano C-A all3esterno, a partire da un3estremit. &.0/ >ilamenti #uida e ritardato A livello della !orca replicativa, la sintesi procede in un3unica dire ione* #uesto crea dei problemi nella replica ione simultanea dei due !ilamenti poic'Y l3attivit polimeri ante procede esclusivamente in dire ione 533. >uindi sul !ilamento 53:3 avr8 una sintesi continua e pertanto #uesto !ilamento prende il nume di leading strand) (ul !ilamento :353 invece la sintesi avviene in modo discontinuo, mediante l3unione di !rammenti* il !ilamento prende il nome di lagging strand. &.10 Re!licazione filamento ritardato V necessario ritardare la sintesi a!!inc'Y la !orca scopra una lung'e a su!!iciente di C-A a singolo !ilamento "associato a ((A% per posi ionare il primer e sinteti are !ino al precedente tratto di C-A sinteti ato. >uesti !rammenti di nuova sintesi vengono c'iamati (rammenti di Okazaki, 'anno una lung'e a pari a 111176111 nucleotidi nei batteri, 1117@11 negli eucarioti.

Molto probabilmente il !ilamento lagging si curva in modo c'e il complesso di replica ione possa proseguire in un3unica dire ione sebbene stia sinteti ando in due dire ioni diverse per ogni !ilamento "la dire ione di avan amento della polimerasi ? la stessa, sono i !ilamenti stessi c'e 'anno polarit opposte%. (ul lagging strand ? necessario, #uindi, c'e la primasi si associ periodicamente per poter sinteti are un primer per ogni !rammento di LHa aHi. >uesti primer dovranno poi essere rimossi e sostituiti con C-A per creare un !ilamento continuo di C-A neosinteti ato. &.11 Re!li"oma 7atterico V il complesso di tutte le proteine c'e agiscono nella !orca replicativa. =l replisoma consente la sintesi contemporanea a livello della !orca replicativa di entrambi i !ilamenti. =n E. ,oli ? stato studiato nei dettagli, si ? visto c'e #uesta intera ione tra le componenti del replisoma ? !avorita dal legame !isico c'e le tiene unite. =n particolare #uelle c'e tengono unite le molte C-A polimerasi !ormano il complesso C-A pol III oloen ima. >uest3ultimo ? !ormato da due copie dell3en ima %&A polimerasi III core, una copia del complesso posi ionatore, !ormato da 5 proteine , il #uale si connette mediante due giun ioni !lessibili "proteina % ad ognuna delle C-A pol III core da un lato, mentre dalla parte opposta si lega alla sliding clamp, c'e appunto posi iona. .e proteine sliding non impediscono la dissocia ione della polimerasi bens$ ne !avoriscono la riassocia ione. =n particolare, man mano c'e l3elicasi, c'e si trova davanti a #uesto oloen ima interposto tra le 6 C-A pol III core, apre la doppia elica, il lagging strand si associa alle ((A e rimane a singolo !ilamento. (u #uest3ultimo la C-A primasi sinteti a a intervalli di tempo regolari un nuovo innesco. .a C-A pol c'e 'a terminato di sinteti are un !rammento di LHa aHi precedente si distacca. 5uttavia, rimanendo associata alla C-A pol del !ilamento leading, si porta avanti insieme a #uesta e riesce a trovare il nuovo innesco7stampo sul #uale il posi ionatore 'a sistemato una sliding clamp "pin a scorrevole%. A!!inc'Y tutto #uesto avvenga, il !ilamento ritardato si deve ripiegare all3indietro !ormando una struttura a laccio. .3associa ione elicasi7oloen ima aumenta l3attivit dell3elicasi. 0a parte del replisoma anc'e la C-A primasi, la #uale interagisce associandosi mediante intera ione debole all3elicasi e con le ((A 1 volta al secondo sinteti ando un nuovo primer. 5erminata la sintesi viene rilasciata. >uesta intera ione debole consente di creare !rammenti di LHa aHi piB lung'i "poic'? crea innesc'i meno !re#uenti%. =n de!initiva, in ogni replisoma si trovano: 7 7 7 7 6 5 6 : C-A polimerasi III proteine "complesso posi ionatore% proteine "giun ioni !lessibili% sliding clamp

C-A +L. III L.LE-O=MA

"1 sul lagging, 1 sul leading, 1 su posi ionatore% 7 ((A 7 C-A elicasi 7 C-A primasi +<=ML(LMA

-.A. =n realt, terminata la sintesi di un !rammento di LHa aHi, viene dissociata la C-A pol III e la sliding clamp, e il !ilamento ritardato con un nuovo primer posi ionato piB a valle entra nella pin a alla base del posi ionatore, il #uale riconosce il primer. V #uesto c'e determina la !orma ione del laccio. -egli eucarioti avviene la !orma ione di #uesti complessi multien imatici ma le polimerasi sono :: <-A pol Tprimasi "ini ia le nuove catene% C-A pol C-A pol allungano le catene, ognuna speci!ica per un !ilamento

&.1$ DNA !rima"i =n E. ,oli prende il nome di C-A2. V una <-A polimerasi speciali ata c'e permette la !orma ione di corti <-A primer ":711 nucleotidi% c'e !orniscono l3estremit :3 LD libera di cui necessita la C-A pol per ini iare la sentesi. A di!!eren a delle altre <-A polimerasi, #uesta non ? se#uen a speci!ica, ma la sua attivit ? regolata solo dall3intera ione "1 volta al secondo% con la C-A elicasi e le ((A, c'e la attivano. (ul !ilamento leading sinteti a solo un primer, mentre sul lagging ne sinteti a uno per ogni !ilamento di LHa aHi e la sua attiva ione ? regolata dall3intera ione "debole% con le proteine suddette. &.1% DNA elica"i V !ormata da 6 monomeri "C-AA in E. ,oli, complesso M,M nell3uomo% disposti a ciambella dentro i #uali scorre il C-A a singolo !ilamento. =l suo compito ? appunto #uello di separare i doppi !ilamenti di C-A per liberare gli stampi per la sintesi. (i muove idroli ando A5+ "attivit A5+asica% con la cui energia avan a separando i !ilamenti. ,onsuma 1 A5+ ogni 11 pb* ? un en ima processivo in #uanto avan a rimanendo legato al substrato. >uando si stacca dal substrato, la !orma ad anello si apre. .a dire ione di avan amento viene considerata 53:3, in realt la polarit pu8 anc'e essere :353 in #uanto dipende dal !ilamento cui l3en ima ? legato. =n ogni caso, in!atti, esso si deve muovere insieme al replisoma "si trova al davanti associata alla C-A pol === oloen ima e !orma il replisoma%. .a dire ione ? 53:3 se agisce sul leading.

Aprendo l3elica, l3elicasi comporta c'e a valle della !orca si vengano a !ormare dei superavvolgimenti positivi: #uesto perc'? se la molecola di C-A ? covalentemente c'iusa, man mano c'e si apre l3elica i legami topologici si accumulano nella parte di C-A ancora a doppio !ilamento. (e !osse libera ad un3estremit, man mano c'e l3elica si apre e si perde contatto tra i due !ilamenti "\ ogni 11,@ basi%, l3estremit ruoterebbe in modo tale da scaricare il legame perso srotolando #uesta estremit e riducendo cos$ il linHing number. Ma poic'? l3elica ? c'iusa, il linHing number resta invariato e si accumula sotto!orma di superavvolgimento "ripiegamento ad ansa o avvolgimento della doppia elica% permettendo cos$ di mantenere .J sen a modi!icare il tQist dell3elica. +er !are ci8, in!atti, dovrebbe diminuire il numero di basi per giro. >uesti superavvolgimenti devono essere rimossi cos$ da evitare un aggrovigliamento c'e impedirebbe il processo di replica ione.

&.1& DNA to!oi"omera"i I e II Cevono intervenire sia nei procarioti "C-A circolare e c'iuso% sia negli eucarioti, i #uali posseggono cromosomi troppo lung'i per poter ruotare attorno all3asse longitudinale disperdendo all3estremit i superavvolgimenti. >uesti en imi rimuovono un legame topologico ogni 11 pb denaturate, !ormando un perno nell3elica alla base della !orca. .o !anno introducendo una rottura temporanea del singolo e del doppio !ilamento. -e esistono 6 classi: 7 5opoisomerasi I "a%: introduce una singolo !ilamento attraverso cui passa il integro cambiando di una sola unit il legami topologici. -on ric'iedono A5+. rottura a !ilamento numero di

7 5opoisomerasi II "b%: introduce una rottura a doppio !ilamento permettendo ad un tratto di elica integra di passarvi attraverso cambiando di 6 unit il numero di legami topologici. V un en ima A5+7dipendente per le modi!ica ioni con!orma ionali dell3en ima. Ena particolare tipologia di topoisomerasi == batterica ? c'iamata %&A girasi e introduce superavvolgimenti negativi nei C-A batterici c'e !acilitano la separa ione dell3elica guadagnando in energia. Essa, in!atti, contrasta gli e!!etti di denatura ione c'e introdurrebbero superavvolgimenti positivi.

=n entrambi i casi, la rottura viene poi risaldata. =l meccanismo di taglio e saldatura non ric'iede A5+, in #uanto un residuo di 5)r del sito catalitico attacca il legame !os!odiestere con !orma ione di un legame covalente 5)r7gruppo !os!ato 53. >uesto legame conserva l3energia liberata dalla rottura del legame !os!odiestere. Al momento della saldatura del nicH, #uesta energia viene rilasciata dalla rea ione inversa con attacco del :3 LD. Al momento della rottura, la topoisomerasi = tiene saldamente legata l3estremit :3 LD del nicH e va incontro ad un cambiamento con!orma ionale c'e apre la rottura mentre l3en ima si allunga a ponte su di essa. A #uesto punto il !ilamento integro passa nell3interru ione legandosi ad un sito interno al ponte !ormato dall3en ima, poi ritorna la topoisomerasi torna alla con!orma ione precedente e si 'a la saldatura. >uesto modello ? applicabile anc'e alla topoisomerasi ==, la #uale necessita per8 di 6 subunit ciascuna con un sito attivo con 5)r* ric'iede inoltre l3idrolisi di A5+ per promuovere i cambiamenti con!orma ionali. .e topoisomerasi sono importanti anc'e per concatenare e deconcatenare molecole circolari di C-A. Molecole concatenate si generano alla !ine di ogni ciclo replicativo e devono essere separate per essere trasmesse alle cellule !iglie. En attorcigliamento si mani!esta anc'e alla !ine della replica ione del C-A eucariotico ed ? necessario separare i cromatidi* talvolta si possono anc'e !ormare dei nodi. >uesti processi sono mediati dalle topoisomerasi I e II, a patto c'e ci sia su un !ilamento un nicH o un gap " one a singolo !ilamento in una molecola a doppio !ilamento%. &.1( roteine SSB (ono proteine non en imatic'e c'e riconoscono il C-A a singolo !ilamento e si legano ad esso in modo cooperativo "single strand binding protein%. Esse in #uesto modo proteggono #uella parte a singolo !ilamento c'e si !orma a livello del !ilamento ritardato da attacc'i di C-Aasi o dalla possibilit di riappaiarsi con la nuova doppia elica complementare sull3altro !ilamento. 0anno assumere al singolo !ilamento una con!orma ione distesa. (i legano non con legami D ma in modo non speci!ico mediante intera ioni elettrostatic'e con i gruppi !os!ato e mediante intera ione di impilamento con le basi. &.1) inza "corre-ole e !o"izionatore .a pin a scorrevole ? una proteina con !orma ad anello aperto prima di avvolgere il C-A, in seguito si c'iude attorno ad esso. .a sua apertura e posi ionamento sono catali ati dal

posizionatore a spese di A5+, il #uale poi la rimuove al termine della sintesi o ogni volta c'e sul lagging strand la C-A polimerasi va incontro al precedente !rammento di LHa aHi. 0ra C-A a doppio !ilamento e l3anello rimane lo spa io per molecole di D6L c'e !avoriscono lo scorrimento. =l suo compito ? #uello di mantenere in posi ione la C-A polimerasi legandosi in coda ad essa. =l suo posi ionamento avviene ogni volta c'e ci sia una giun ione innesco7stampo. .a pin a scorrevole non impedisce la dissocia ione della C-A pol ma svolge il suo ruolo !avorendo la sua riassocia ione. 0a #uesto mantenendo la C-A pol in prossimit del C-A. .3e!!etto ? un aumento della processivit della polimerasi. .a pin a si dissocia ogni 617111 nucleotidi. -egli eucarioti la pin a scorrevole ? rappresentata dal complesso +,-A, il #uale rimane associato al C-A anc'e al termine della sintesi della polimerasi. =n #uesto modo attrae la ,A0 I c'e posi iona i tetrameri D6A7D6A per !ormare i nucleosomi sul nuovo !ilamento. .a !orma ione dei nucleosomi ? coadiuvata da proteine c'iamate trasportatori di istoni.

&.1* DNA li#a"i En ima !ondamentale per la ripara ione di nicH, i #uali sono tipici dei processi di ripara ione per escissione di basi o di nucleotidi, ma anc'e nei processi di elimina ione degli <-A primer. Attiva il 537gruppo !os!ato attaccando AM+ "derivante dall3idrolisi di A5+%, rendendolo cos$ piB predisposto all3attacco nucleo!ilo del :3 LD con successiva !orma ione del legame !os!odiestere. Agisce in : !asi: 1. .=2A(= F A5+ .=2A(=7AM+ "complesso E(% 6. .=2A(=7AM+ tras!erisce AM+ all3estremit 537gruppo !os!ato :. AM+ ora !avorisce l3attacco nucleo!ilo di :3 LD, la cui associa ione c'iude il nicH. &.1+ >rammenti di OAazaAi in !rocarioti ed eucarioti -ei procarioti: 111176111 nucleotidi. -egli eucarioti 1117@11 nucleotidi. &.1/ DNA !olimera"i !rocariotic'e =n E. ,oli sono presenti 5 C-A polimerasi procariotic'e: 7 ol III B : subunit, coinvolta nella replica ione del cromosoma, !a parte del %&A pol III oloenzima 7 ol I: 1 subunit, coinvolta nella rimo ione dell3innesco e nella ripara ione del C-A. +ossiede attivit polimeri ante ed un3attivit esonucleasica 53 3 oltre a #uella :35. >uesto gli permette di rimuovere l3<-A o il C-A "ripara ione% c'e si trova a monte del sito di sintesi. V poco processiva, permette la sintesi di 617111 nt. .3attivit esonucleasica 53:3 permette la rimo ione del legame <-A7C-A resistente alla <-Aasi D, rimuovendo i nucleotidi c'e si trovano Cavanti e contemporaneamente sinteti ando C-A "nicH traslation%. 7 ol II : 1 subunit, coinvolta nella ripara ione del C-A "es. ripara ione delle !orcelle

in stallo% 7 ol IV : coinvolta nella ripara ione del C-A e nella sintesi delle translesioni. 7 ol V : !ormata da 6 subunit, Enu, e EnuC, ? coinvolta nella ripara ione del C-A e soprattutto nella sintesi di translesioni. .e polimerasi IV e V !anno parte della !amiglia ]. 5utte possiedono 6 attivit: esonucleasica :353 e polimeri ante. .a C-A pol I possiede anc'e attivit esonucleasica 53:3.

&.$0 NicA tran"lation =l metodo di -icH translation ? una tecnica di laboratorio di biologia molecolare c'e serve per operare la marcatura del C-A ovvero a creare sonde radioattive c'e potranno servire in seguito per esperimenti #uali ad esempio il se#uen iamento di un tratto di acido nucleico. .a tecnica consiste nel creare interru ioni nella catena di acido nucleico con una C-Aasi =. (uccessivamente tale interru ione viene ripristinata con lWa ione della C-A polimerasi !acendo in modo c'e #uesta utili i nucleotidi tri!os!ato marcati radioattivamente. >uindi si ripete lWesperimento andando a scindere il legame !os!odiestere al :W del nucleotide inserito e cos$ via !ino a c'e non si abbia un intero tratto di C-A marcato "sonda%. &.$1 DNA !olimera"i eucariotic'e (ono in tutto 1:. 7 DNA !olimera"i : costituita da @ subunit, 6 primasi e 6 polimerasi* con le prime costituisce il primer, con le seconde inserisce i primi nucleotidi del nuovo !ilamento. -el suo complesso !un iona da primasi "sintesi dell3innesco%, in #uanto viene dalle polimerasi ed in un processo c'iamato s+itc,ing delle polimerasi) 7 DNA !olimera"i : coinvolta nella ripara ione del C-A, piB speci!icatamente nella ripara ione delle basi eliminate "processo di escissione di basi%. 7 DNA !olimera"i : coinvolta nella replica ione del C-A mitocondriale e nella <ipara ione. 7 DNA !olimera"i : coinvolta nella replica ione del C-A e nella ripara ione. 7 DNA !olimera"i : coinvolta nella replica ione del C-A e nella ripara ione. 7 DNA !olimera"i CetaD B coinvolta nella sintesi di translesioni. +olimerasi e non possiedono attivit esonucleasica :353. +olimerasi e possiedono attivit esonucleasica :353 e attivit polimeri ante. -essuna polimerasi eucariotica possiede attivit esonucleasica 53 :3. Altri en imi "endonucleasi 0.A+, en ima 0E-1% sollevano e degradano l3<-A primer mentre la C-A pol sinteti a* la ligasi poi salda i !rammenti.

&.$$ Atti-it: e"onuclea"ic'e a""ociate Kedi risposte @.61 e @.61. &.$% Re!licazione 7idirezionale V bidire ionale nel senso c'e da ogni origine di replica ione si dipartono due !orcelle di replica ione c'e si muovono in senso opposto creando la bolla di replica ione. Lgni !orca avr un leading e un lagging strand, in posi ioni invertite rispetto all3altra !orca. &.$& Re!licazione del DNA mitocondriale = due !ilamenti del C-A mitocondriale sono leggermente diversi in densit. >uello ricco in ,2 ? il !ilamento D "Deav) ; +esante%, #uello ricco in A5 ? #uello . ".ig't ; .eggero%. .a replica ione ini ia a livello del !ilamento D dove va a posi ionarsi il primer !ormato dalla <-A polimerasi mitocondriale* da #ui va a costituirsi la bolla C "C loop%, costituita da 5117611 basi, c'e comincia ad ingrandirsi. .a sintesi ? a carico della C-A polimerasi ^ "il cui gene ? nel nucleo% !ino a #uando #uesto replica il cerc'io D e trova poi l3origine del !ilamento . "a 6T: della circon!eren a%. A #uesto punto si !orma un primer in dire ione opposta "e piB corto% dal #uale ini ia la replica ione del !ilamento .. (i procede in entrambe le dire ioni. -.A.: trascrizione del %&A mitocondriale Entrambi i !ilamenti di C-A mitocondriale vengono trascritti alla stessa velocit da un singolo promotore presente su ciascun !ilamento* vengono prodotte due molecole giganti di <-A "trascri ione simmetrica%. (u un !ilamento avviene il taglio nucleasico per produrre i due r<-A, i t<-A e circa 11 <-A poli7A messaggeri. Cal secondo !ilamento si ottengono 8 t<-A e 1 m<-A poli7A "gli m<-A mitocondriali non contengono il cap 53%. &.$( .elomera"i (e la replica ione delle estremit terminali del leading strand non costituisce alcun problema, diversa ? la situa ione per il lagging strand. =n!atti anc'e se l3ultimo <-A primer venisse posi ionato con il suo 53 in corrisponden a dell3ultimo nucleotide dello stampo, l3elimina ione di #uesto <-A lascerebbe uno spa io c'e non pu8 essere riparato e rimane a singolo !ilamento. (i avrebbe in #uesto modo un continuo accorciamento delle estremit pari alla lung'e a del primer per ogni ciclo di divisione, con conseguente perdita di materiale genetico. >ueste estremit dei cromosomi sono c'iamate telomeri e sono !ormato da se#uen e ripetute la cui termina ione ? 53755A2227:3 "se#uen e minisatelliti%. >uesta caratteristica ? s!ruttata da un en ima in grado di risolvere il problema dell3accorciamento dei telomeri* #uesto en ima ? la telomerasi. >uesto ? un ribo ima "sebbene l3<-A non abbia attivit en imatica in #uesto caso% c'e !un iona come una trascrittasi inversa* allunga #uindi l3estremit :3 usando come stampo il proprio <-A costituito dalla se#uen a 537EAA,,,EAA7:3.

>uesta se#uen a contiene di !atto la se#uen a terminale telomerica con l3aggiunta di tre nucleotidi c'e non si appaiano e costituiscono una por ione a singolo !ilamento c'e rappresenta la giun ione innesco7stampo per l3attivit en imatica "componente proteica% telomerasica della trascrittasi inversa. .a sintesi prosegue !ino alla !ine dell3<-A e in seguito l3en ima scivola di alcuni nucleotidi in dire ione :3 ripetendo nuovamente il processo. >uesto scivolamento include un3attivit <-A7C-A elicasica. >uindi l3estremit :3 viene allungata aggiungendo diverse ripeti ioni della se#uen a della telomerasi. <imarr ancora in ogni caso una parte a singolo !ilamento per il problema intrinseco di replica ione del !ilamento ritardato, ma il telomero ? su!!icientemente lungo da evitare la perdita genica ad ogni ciclo di divisione. -on tutte e cellule esprimono la telomerasi* inoltre spesso vi sono proteine c'e si legano ai telomeri ed inibiscono la telomerasi. .3invecc'iamento e lo sviluppo dei tumori sembrano poter essere collegati il primo ad una ridotta attivit telomerasica con progressivo accorciamento dei telomeri, il secondo alla riattiva ione nell3espressione della telomerasi con conseguente crescita illimitata. &.$) Ciclo cellulare .a replica ione avviene esclusivamente in !ase ( e tutto il C-A deve essere replicato una sola volta. =l problema per gli eucarioti ? la presen a di origini di replica ioni multiple. Ci conseguen a molte di #ueste devono essere attivate, ma non tutte, e soprattutto #uelle non attivate non devono essere attivate una volta replicate. = 6 eventi di ini io sono la scelta del replicatore e l-attivazione dell-origine. 1. .a scelta del replicatore avviene in !ase 21 e prevede l3assemblaggio del complesso pre7 replicativo "pre7<,% c'e si !orma in #uesto modo: 7 l3ini iatore L<, riconosce il replicatore a livello della se#uen a conservata c'e ad esempio nel lievito ? l3elemento A e l3elemento A1. L<, lega ed idroli a A5+. 7 L<, recluta 6 posi ionatori dell3elicasi. 7 le : proteine attraggono l3elicasi. 6. .3attiva ione dell3origine avviene solo in !ase ( con l3attiva ione anc'e di pre7<, c'e avviene tramite !os!orila ione ad opera di due c'inasi attivate, appunto, solo in !ase (. Esse attivano anc'e le : C-A polimerasi eucariotic'e ed altri !attori. (olo una parte di #ueste proteine !aranno poi parte del replisoma* ad esempio i posi ionatori si dissociano. .e due c'inasi c'e attivano il complesso pre7<, sono c'inasi7ciclina dipendenti ",dH%. .a ciclina ? assente nella !ase 21, mentre nelle !asi (, 26 ed M ? presente a livelli elevati. +oic'? le ,dH attivano il complesso pre7<, !ormato in 21ma impediscono l3attiva ione di nuoci pre7<,, il genoma pu8 essere replicato una sola volta per ciclo.

(. Ri!arazione e ricom7inazione del DNA (.01 Alterazioni delle 7a"i 0ra le molteplici altera ioni riscontrabili a livello del C-A, troviamo le altera ioni delle basi. ,ontro tutti #uesti meccanismi entrano in gioco sistemi di ripara ione intrinseci della cellula al !ine di conservare e mantenere l3integrit del genoma. .e basi sono soggette a !enomeni #uali la deaminazione, l3alc,ilazione e l3ossidazione, c'e portano alla !orma ione di basi alterate, permettendo cos$ di distinguere #uelle danneggiate da #uelle integre. =n particolare ad essere nolto reattivi sono gli - delle basi: 7 -: di 2 e A 7 -/ di 2 e A alc,ilazione, aggiunta di gruppo alc'ilico "7,D:, 7,D6,D:% aggiunta gruppo 7,D: ; metila ione, distorce C-A

7 -5 di , e 5 "se , subisce metila ione e deamina ione diventa 5% 7 L6 di 2 ; alc,ilazione, porta a !orma ione di 1767metil2, il legame D non pu8 0ormarsi, il gruppo alc'ilico deve essere rimosso 7 perdita gruppo metilico di 5 7 ossida ione del doppio legame !ra -/ e ,8 di A e 2 Es. !orma ione /,87diidro7oMoguanina "LMo72%
O E

(i !orma per attacco di !orme reattive "L6<L( ; L6 <eactive LM)gen (pecies% generati da radia ioni ioni anti e dagli agenti c'imici c'e generano radicali liberi. LMo72 ? altamente mutageno perc'? si pu8 appaiare sia con A c'e con ,. (e alla replica ione si appaia con A porta ad una transversione "da purina a pirimidina% da 27, ad A75, muta ione molto !re#uente nei tumori. = gruppi amminici sono poi soggetti molto spesso a dea deamina ione, c'e porta alla !orma ione di basi alterate* anc'e le irradia ioni comportano l3altera ione delle basi. .e radiai oni EK "radia ioni non ioni anti% determinano la !orma ione di dimeri di purine "in particolare di 5%, mentre le radia ioni e _ "radia ioni ioni anti% sono particolarmente dannose perc'? rottura a doppio !ilamento nel C-A, rotture di!!icili da riparare.

(.0$ unti reatti-i "ul DNA

=l C-A ? una molecola molto reattiva. +unti particolarmente reattivi sono per le basi #uelli citati sopra* reattivi sono anc'e i gruppi !os!ato dello sc'eletro e i punti in cui sono presenti , metilate. Alcuni siti dei cromosomi sonoc'iamti punti caldi ",otspot% perc'? caratteri ati da una piB elevata !re#uen a di muta ione* sono #uesti ad esempio i microsatelliti ed il legame -7glicosidico. (.0% Danni "!ontanei .e muta ioni insorgono non solo a causa di errori di replica ione ma anc'e a causa di danni al C-A. Alcuni datti sono indotti, cio? causati da !attori ambientali come le radia ione o le sostan e mutageni. En3altra tipologia di danni sono #uelli spontanei, dovuti !ondamentalmente alle condi ioni stesse di pD, !or a ionica, temperatura a cui si trova la cellula. >uasi tutti i danni sono dovuti a danni idolitici* i due danni idrolitici piB !re#uenti sono la deamina ione e la depurina ione. (.0& De!urinazione V l3idrolisi spontanea del gruppo -7glicosidico c'e porta alla perdita della base c'e si stacca dal ribosio. =n #uesto modo vengono perse circa 11111 purine al giorno. (i viene cos$ a creare un sito A+, ossia apurinico "piB raramente apirimidinico, c'e si !orma per a ione della glicosilasi%, c'e deve essere riconosciuto e riparato. (.0( Deaminazione V il secondo tipo di danno idrolitico, anc'3esso molto presente, c'e consiste nell3idrolisi del gruppo aminico di ,, il c'e porta alla !orma ione di E.

>uesto tipo di deamina ione ? spontanea ed avviene con una !re#uen a di 1117611 al giorno.

Anc'e A e 2 vanno incontro a deamina ione:

D6L -D:
Iantina

E va ad appaiarsi con A e #uindi alla replica ione avr8 una A al posto di una 2 " transizione%. .3ipoMantina si appaia sia con , c'e con 5, #uindi se alla replica ione si appaia con , avr8 una transi ione. =n!ine la Mantina si appaia con , ancora ma mediante due legami D, non avr8 #uindi una muta ione. (ia la depurina ione c'e la deamina ione portano alla !orma ione di basi non naturali del C-A, compreso E, a di!!eren e di #uanto accade in conseguen a ad errori di replica ione. >uesto spiega anc'e perc'? il C-A utili a 5 an ic'? E, in #uanto la deamina ione da , ed E avviene molto !re#uentemente. (e il C-A utili asse E non potrebbe riconoscere e correggere l3errore* se #uesto ? tollerabile per l3<-A, non lo ? per il C-A. En problema in #uesto senso ? rappresentato proprio dalla presen a della 57metilcitosina, la #uale abbonda nei vertebrati a causa dell3a ione dell3en ima %&A metiltrans(erasi) .a 57metil, costituisce l31P delle basi e la sua deamina ione porta alla !orma ione di 5. >uesto errore non viene riconosciuto e durante la replica ione porta alla transi one da , a 5. .a metila ione della ,, in!ine, svolge un ruolo !ondamentale nel silen iamento genico. (.0) Errori re!licazione ,ome detto in preceden a, la C-A polimerasi commette 1 errore ogni 115 nucleotidi, ridotti a 1 ogni 11/ dalla sua attivit autocorrettiva. .a precisione deve per8 necessariamente arrivare a 1 errore ogni 1111 nucleotidi circa, e #uesto viene raggiunto tramite appositi macc'inari di ripara ione. 2li errori di replica ione comportano di !atto l3inserimento di nucleotidi errati* spesso #uesto ? dovuto alla tautomeri a ione delle basi. -el punto in cui ? stato inserito un nucleotide errato si avr un appaiamento scorretto con l3altro !ilamento "missmatc,, ce ne sono 16 possibili%. (e #uesto missmatc' non venisse riparato, il danno diventerebbe permanente poic'? in un secondo ciclo di replica ione il nucleotide scorretto !arebbe da stampo per il suo nucleotide complementare* il risultato sarebbe un cambiamento di se#uen a nel C-A ereditato dalle cellule !iglie. V il cambiamento di se#uen a ad essere la muta ione, la #uale #uindi scaturisce non dal danno in s?, ma dalla non7ripara ione del danno. =l danno per errore di replica ione "missmatc'% viene corretto dal sistema di ripara ione dei missmatc'.

(.0* Mutazioni +er de!ini ione una muta ione ? un cambiamento di se#uen a del C-A. .e muta ioni possono essere germinali o somatic,e, a seconda c'e interessino le cellule germinali o non. .e prime sono ereditarie, le seconde si esauriscono nell3individuo. =n base all3e!!etto prodotto possono poi essere letali "non si arriva all3et riproduttiva%, deletive "i !igli di a!!etti sono in numero minore%, vantaggiose "gli a!!etti 'anno un numero di !igli maggiore rispetto ai non a!!etti% oppure neutrali "non danno vantaggio n? danno%. (ono spesso il risultato di danni al C-A c'e non vengono riparati e c'e derivano o da errori di replica ione, o da danni spontanei, oppure da danni indotti. Ad esempio se il danno comporta la sostitu ione di una base con un3altra potr8 avere due tipi di muta ione: 7 5<A-(=O=L-E : sostitu ione di purina con purina o pirimidina con pirimidina

+u8 derivare ad esempio dalla deamina ione , E, con inserimento di A an ic'? di 2 nella replica ione 7 5<A-(KE<(=L-E : sostitu ione di purina con pirimidina e viceversa +u8 derivare dalla non ripara ione di miss matc', oppure dalla presen a di LMo72 se si appaia con A +ossono avvenire poi muta ioni per dele ione o inser ione di basi* ossia rimo ione o aggiunta di una o piB nucleotidi. (e la muta ione interessa un singolo nucleotide si parla di mutazione punti(orme. >uando una dele ione o un3inser ione di 1 o 6 nucleotidi colpisce un L<0 " open reading (rame% si avr una mutazione (ramesc,i(t, cosa c'e non accade se i nucleotidi sono :. Muta ioni piB macroscopic'e possono interessare intere regioni cromosomic'e portando a riarrangiamenti cromosomici piB drastici. = C-A microsatelliti sono molto mutabili. (pesso ci sono ,A altamente ripetuti di!!icili da replicare correttamente con conseguente aumento o diminu ione delle ripeti ioni ,A "la lung'e a della ripeti ione ,A ? in!atti altamente polimor!ica nella popola ione%. .a di!!icolt nella replica ione di se#uen e altamente ripetute sta nel !atto c'e #ueste se#uen e complementari si associano a !ormare !orcine: !orcine su !ilamento stampo portano a dele ioni, !orcine su !ilamento nuovo portano a inser ioni. .a !re#uen a di muta ione ? in media di 1176 T11711 per ciclo di replica ione. Ki sono poi siti ,ot spot piB mutabili "es. microsatelliti%. (.0+ Siti A (iti apurinici o apuridinici. (i !ormano sia per idrolisi spontanea della base sia per a ione della C-A glicosilasi. Kedi risposta 5.1@

(.0/ DNA #lico"ila"i ,irca 15 "uracile %&A glicosilasi ? una delle piB presenti e piB e!!icaci%, sono en imi in grado di riconoscere e rimuovere le basi danneggiate idroli ando il legame -7glicosidico* ne risulta un sito A+. (ono coinvolte nel processo di ripara ione per escissione di basi. >uesti en imi scorrono lungo il solco minore del C-A !inc'? non incontrano la lesione* per poter idroli are il legame la base viene ribaltata all3esterno e si siede sulla tasca en imatica. =l tutto avviene con costi energetici limitati gra ie alla !lessibilit del C-A "rota ione della base o base !lipping%. (e la base

danneggiata non viene rimossa, nel caso di LMo72 ? presente un ulteriore sistema di sicure a in #uanto la glicosilasi dedicata a #uesto problema riconosce l3appaimento LMo72:A ed elimina l3A, rimuovendo cos$ la base non danneggiata. V presente inoltre una glicosilasi in grado di riconoscere un miss matc' 5:2 derivante da deamina ione di 57metilcitosina. Anc'e se non sono presenti basi non naturali, #uesta glicosilasi ? in grado di assumere c'e il missmatc' ? dovuto a #uesta deamina ione e a rimuovere 5. (.10 Danni indotti (ono danni indotti da agenti mutageni di natura c'imica o !isica. 7A2E-5= ,D=M=,=: sostan e naturali o sintetic'e di vario genere come agenti alc'ilanti, addotti grossolani, analog'i delle basi, intercalanti. 7A2E-5= 0=(=,=: radia ioni ioni anti "raggi _ o ^% e raggi EK. (.11 A#enti alc'ilanti +rovocano alc'ila ioni delle basi "metila ioni, etila ioni...%* aggiungono gruppi alc'ilici ai siti reattivi delle basi e ai !os!ati. +ortano ad esempio alla !orma ione di L67metilguanina. 0ra gli agenti alc'ilanti comuni troviamo le nitrosammine "acido nitroso%.

(.1$ Cro"" linA Alcune sostan e !ormano dei ponti tra i 6 !ilamenti* se #uesti ponti sono stabili il C-A non pu8 piB aprirsi. (itua ione molto grave in #uanto viene impedita la replica ione. Es. .oralene, usato nella terapia contro la psoriasi. (.1% Addotti #ro""olani (ostan e c'e di per s? sarebbero insolubili e sen a punti reattivi. 5uttavia l3organismo deve eliminarli e gli epatociti "complesso +7:@1 nel !egato% li tras!ormano in componenti idrosolubili analog'i reattivi c'e possono danneggiare il C-A a livello degli - reattivi della basi. =l benzopirene !a parte di #uesta categoria. -.A. 0ra gli agenti c'imici ci sono anc'e gli analog'i delle basi c'e vanno a sostituire le basi normali* sono #uesti composta aromatici planari. Es. /0bromo0uracile V un analogo di 5 c'e pu8 appaiarsi mediante 6 legami D con A oppure mediante : legami D con 2. =n #uest3ultimo caso comporta una transi ione sul !ilamento neosinteti ato. (.1& A#enti intercalanti

,ome gli analog'i delle basi, sono composti aromatici planari c'e riescono ad inserirsi tra 6 doppietti creando una distorsione. 0ormano !or e di impilamento. (i associano ad eventi di dele ione o inser ione di una o piB coppie di basi. >uesto perc'? possono portare la C-A polimerasi ad inserire un nucleotide aggiuntivo giustapposto alla molecola c'e si ? intercalata, oppure a saltare un nucleotide. Es. etidio di bromuro ,atione !ormato da piB anelli aromatici. >uando si intercala causa al C-A uno srotolamento della doppia elica di 66N riducendo al normale rota ione delle coppie di basi da circa :6N a 11N. (.1( Radiazioni ;? <adia ioni non ioni anti con lung'e a d3onda pari a 661 nm c'e vengono assorbite dalle basi e provocano la !usione !otoc'imica di due pirimidine adiacenti nello stesso !ilamento. Molto !re#uente ? la !orma ione di un dimero di timina. >uest3ultimo ? un anello ciclobutanico generato dai legami !ra gli atomi di ,5 e ,6 di timidine adiacenti. V molto stabile e comporta l3impossibilit da parte delle timine di appaiarsi con le A. .a non rimo ione di #uesti dimeri a causa di un di!etto genetico degli en imi di ripara ione comporta lo I+ "Ieroderma +igmentoso%. (i possono !ormare anc'e dimeri ,;5 "!ra ,6 di 5 e ,@ di ,%.

(.1) Dimeri !irimidina Kedi risposta precedente. (.1* Radiazioni ionizzanti <aggi _ e in particolare. +ossono attaccare direttamente il deossiribosio ioni andolo, oppure indirettamente !ormando #uelle specie di L6 reattive. +rovocano rotture a doppio !ilamento di!!icili da riparare. (ono usate in terapie contro i tumori. (.1+ Meccani"mi di ri!arazione = meccanismi di ripara ione utili ati dalla cellula sono molteplici, speci!ici per il danno c'e deve essere riparato. -el caso di missmatc' entrer in gioco un meccanismo detto sistema di ripara ione del miss matc' "missmatc, repair%. -ei casi di danni di altra entit si avr una ripara ione per escissione di basi o per escissione di nucleotidi, i #uali sono i meccanismi piB comuni per la ripara ione delle basi danneggiate. -el caso di rotture a doppio !ilamento, la ripara ione si associa alla ricombina ione per recuperare il materiale andato perso dal cromosoma omologo. Altri meccanismi sono la sintesi translesione, coinvolta nella cosiddetta risposta (L(, e la (otoriattivazione nei batteri. (.1/ Geni di ri!arazione &1 geni coinvolti nella ripara ione.

(.$0 >otoriatti-azione (istema di ripara ione per il dimero di timina presente nei batteri e nelle piante. V mediato dall3en ima !otoriattivante %&A (otoliasi, il #uale agisce sul dimero ricavando energia dai !otoni. V un esempio di ripara ione diretta.

(.$1 E"ci""ione di 7a"i danne##iate (ono coinvolti due tipi di escissione: 1. E(,=((=L-E C= AA(= 7 .a glicosilasi idroli a il legame -7glicosidico e si crea un sito A+. .3escissione pu8 altrimenti partire da un sito A+ !ormatosi per idrolisi spontanea. 7 En endonucleasi "A1 endonucleasi F una !os!odiesterasi per rimuovere lo ucc'ero7!os!ato%taglia i legami !os!odiestere per eliminare lo ucc'ero apurinico o apirimidinico creando un nicH e liberando cos$ :37LD. .a giun ione innnesco7stampo attrae la C-A polimerasi la #uale inserisce il nucleotide. =n seguito la ligasi lo salda con il !os!ato753 del !ilamento. .a C-A pol c'e svolge #uesto ruolo ? la C-A pol ` nell3uomo, la pol I e II nei procarioti. 6. E(,=((=L-E -E,.EL5=C=,A -on essendo coinvolta la C-A glicosilasi, non viene riconosciuta nessuna lesione in particolare "non c3? speci!icit% ma #uesto sistema lavora riconoscendo delle distorsioni nella con!orma ione della doppia elica dovute alla presen a di dimeri di timina o di un grosso addotto c'imico "come un intercalante%. =l meccanismo s!rutta la rimo ione di un corto segmento a singolo !ilamento c'e include la lesione* in seguito la C-A polimerasi e la ligasi colmano la regione a singolo !ilamento cos$ !ormatasi. In E) Coli sono coinvolte @ proteine: EvrA, EvrA, Evr, e EvrC "!amiglia Evr%. >ueste !ormano un complesso c'e scorre lungo il C-A. EvrA riconosce la distorsione, staccandosi dal !ilamento una volta trovata. EvrA interviene in tale ambito !ondendo il C-A e denaturandolo a tale livello.

Evr,, c'iamata da EvrA, ? un endonucleasi c'e taglia 8 nucleotidi a monte della lesione e @75 nucleotidi a valle. EvrC ? una C-A elicasi e spa a via il !ilamento singolo compreso tra i due tagli. A #uesto punto la regione a singolo !ilamento di 1671: nucleotidi presenta un :3LD libero ed ? una giun ione innesco7stampo ideale per la C-A pol I. .a ligasi poi salda tutto. &egli eucarioti il meccanismo ? analogo ma coinvolge piB di 65 proteine. I+, ; EvrA I+A e I+C ; elicasi \ EvrA e EvrC <AA ; proteine ((A E<,,17I+0 e I+2 ; endonucleasi \ Evr, -el loro complesso sono c'iamate proteine I+ e sono #uindi importanti per la ripara ione dei danni da EK. .a muta ione di uno dei geni c'e codi!icano per #ueste proteine porta al mani!estarsi dello Ieroderma +igmentoso.

(.$$ Metiltran"fera"i En ima c'e rimuove il gruppo metilico dalla guanina #uando si !orma l3L67metilguanina, tras!erendolo su uno dei suoi residui di ,)s. V un esempio di ripara ione diretta del danno, ma ric'iede molta energia in #uanto #uesto en ima non ? catalitico e una volta accettato il gruppo metilico non pu8 piB !un ionare. V, in!atti, un en ima indotto dal danno stesso, c'e normalmente non viene prodotto.

(.$% A endonuclea"i En ima c'e taglia i legami !os!odiestere per eliminare lo ucc'ero apurinico. Kedi risposta 5.61. (.$& MutL e MutS (oni i due en imi procariotici "in E. ,oli% coinvolti nel sistema di ripara ione dei miss matc' dovuti ad errori di replica ioni* tali en imi aumentano di 6 o : !attori l3accurate a della replica ione "!ino a 11711%. >uesti missmatc' devono essere riconosciuti velocemente in #uanto gi alla seconda replica ione non si trover piB il miss matc' ma la muta ione e!!ettiva e non piB riconoscibile.

Mut( ? un dimero c'e anali a l3intero genoma e riconosce il miss matc' attraverso la distorsione c'e esso comporta. Esso si c'iude attorno all3elica ed induce una curvatura "!acilitata proprio dal missmatc'%* contemporaneamente subisce un cambiamento con!orma ionale. Mut( recluta Mut., la #uale attiva MutD. MutD produce un nicH in prossimit del miss matc', interviene poi una EvrC "elicasi% ed una delle : esonucleasi presenti. >uest3ultime sono di!!erenti a seconda c'e MutD tagli al 53 o al :3 del miss matc'. (e taglia al 53, agisce l3esonucleasi VII o <eca "dire ione 53 :3%* se taglia al :3, agisce l3esonucleasi I o esonucleasi I "dire ione :353%. EvrC solleva il singolo !ilamento mentre l3esonucleasi elimina i nucleotidi. (i creano cos$ il singolo !ilamento e la giun ione innesco7stampo. A #uesto punto possono agire la C-A polimerasi e la ligasi.

-.A. MutD taglia solo il !ilamento nuovo e non #uello vecc'io. >uesto ? importante per mantenere l3integrit di se#uen a, altrimenti nel 51P dei casi l3errore verrebbe !issato permanentemente nel C-A. .a #uestione ? in c'e modo riesca a distinguere il !ilamento vecc'io da #uello nuovo.

(.$( Metilazione e ri!arazione -ei batteri la distin ione tra !ilamento vecc'io e nuovo avviene mediante il !enomeno di emimetila ione, ossia solamente il !ilamento parentale viene metilato. .a %am metilasi metila i residui di A su entrambi i !ilamenti della se#uen a 5342A5,4:3, una se#uen a ampiamente rappresentata nel genoma "mediamente ogni 656 pb%. >uando per8 la !orca di replica ione vi passa sopra, le molecole !iglie a destra sono emimetilate, in #uanto ? metilato il !ilamento parentale, mentre #uello neosinteti ato non lo ? e rimane tale per alcuni minuti, !in #uando non interviene la C-A metilasi. -el !rattempo il sistema di ripara ione pu8 distinguere !ra nuovo e vecc'io attraverso #uesto sistema di memoria. -egli eucarioti le proteine omolog'e sono dette M(D "Mut( 'omologus% e M.D "Mut. 'omologus%. =l sistema di riconoscimento del vecc'io !ilamento non ? l3emimetila ione* viene s!ruttato il !atto c'e sul lagging strand c3? un nicH !ra i vari !rammenti di LHa aHi. (embrerebbe c'e M(D interagisca con il +,-A "pin a scorrevole negli eucarioti% e cos$ viene portato sul lagging strand a livello dei !rammenti. .o stesso potrebbe accadere per il leading strand, con M(D c'e viene trasportato da +,-A sull3estremit :3 crescente. (.$) Ri!arazione !o"t@re!licati-a +u8 includere la ripara ione accoppiata alla trascri ione c'e sblocca #uelle <-A polimerasi bloccate per la presen a di una lesione sul !ilamento stampo non precedentemente corretta. >uesto ric'iama le proteine dell3escissione nucleotidica.

.3<-A polimerasi agisce come un ulteriore en ima in grado di rilevare il danno* negli eucarioti #uesto avviene principalmente mediante 50IID, delle #uali I+A "EvrA% e I+C "EvrC% sono due subunit elicasic'e. .3attivit elicasica lavora sia se ? presente una lesione, sia nel processo di trascri ione. 2IS1OS3A SOS: Sintesi 3ranslesione >uando lesioni come siti A+ o dimeri di timina non vengono riparati la C-A polimerasi ? costretta a bloccarsi. >uando la cellula non riesce a riparare il danno interviene un sistema di sicure a, la sintesi translesione "<isposta (os% c'e introduce molte muta ioni ma limita il danno evitando la perdita dell3intero cromosoma. =n tale processo sono coinvolte delle speciali C-A pol c'e in E. ,oli sono Emu, "membro della !amiglia ] delle C-A pol% e EmuC3. .a loro caratteristica ? #uella di incorporare nucleotidi in modo indipendente dall3appaiamento delle basi ma dipendente in ogni caso dallo stampo.

=ntroducono molti errori in #uanto non leggono lo stampo* in!atti inseriscono nucleotidi a livello di un sito A+ o di un dimero di 5 c'e potrebbero anc'e essere errati "nell3uomo un membro di #uesta !amiglia ? in grado di inserire 6 A in corrisponden a di un dimero di 5%. +ossono comun#ue introdurre solo un numero limitato di basi e poi si dissociano "bassa processivit%. >ueste C-A pol sono indotte e i loro geni vengono espressi solo a seguito della risposta (os attraverso la proteolisi del loro repressore trascri ionale. A!!inc'? avvenga #uesto ? necessaria la presen a di copie di proteine <ecA. .a risposta (os, in!atti, nel suo complesso determina la !orma ione di un mutasoma, costituito dal complesso Emu3 e Emu, "o C-A pol V% e dalle proteine <ecA c'e legano il Cna ss. (.$* Ri!arazione e ricom7inazione .a ricombina ione, oltre ad avere lo scopo di o!!rire variabilit genetica, permette anc'e di recuperare dall3omologo se#uen e perse in seguito a danno al C-A e di !ar ripartire le !orc'e danneggiate o bloccate. -ella rottura a doppio !ilamento, la ripara ione s!rutta il sistema di riparazione delle rotture a doppio (ilamento "double strand breaH ; C(A% c'e recupera le in!orma ioni dal cromosoma !ratello. >uesto avviene !ormando la struttura tipica della ricombina ione omologa, il modello double strand breaH, il #uale ? un3estensione del modello di Doll)da). 5ale modello !un iona solo in presen a del cromosoma !ratello di #uello danneggiato. >uando per8 non si 'a a disposi ione il cromosoma !ratello "ad esempio se il cromosoma si ? rotto precocemente, prima della replica ione del !ratello%, interviene il sistema di sicure a giunzione delle estremit* non omolog,e "-DEa%, c'e unisce le due estremit del C-A rotto s!ruttando direttamente gli appaiamenti scorretti !ra i singoli !ilamenti c'e protrudono da #uesta estremit. .e proteine Ju "batteri e uomo% allineano #ueste estremit e le proteggono dalle nucleasi. >uesto sistema comporta dele ioni anc'e notevoli. (.$+ Modello di EollidaF e modello rotture a do!!io filamento =l termine ricombina ione indica la rottura e la riunione di due molecole di C-A. Essa pu8 essere: 7 2E-E<A.E o LML.L2A: coinvolge lo scambio di materiale genico !ra se#uen e di C-A omolog'e* pu8 portare a crossing7over ma ? coinvolto anc'e

nella ripara ione "es. ripristino delle !orcelle replicative%. Avviene !ra due molecole omolog'e, identic'e tranne c'e per muta ioni punti!ormi a livello degli alleli. 7 -L- LML.L2A o =..E2=55=MA 7 (=5L7(+E,=0=,A: avviene in corrisponden a di speci!ic'e se#uen e. 7 5<A(+L(=O=L-E .a ricombinazione omologa pu8 risolversi portando a ricombina ione reciproca, in cui le nuove molecole portano l3in!orma ione c'e deriva a entrambe le molecole parentali, oppure pu8 portare a conversione genica, in cui avviene un tras!erimento unidire ionale dell3in!orma ione genetica. +unti c'iave della replica ione omologa sono: 1. Allineamento di due molecole di C-A omolog'e, ossia identic'e per almeno 111 pb e di!!eribili per altre per altre regioni piB corte. 6. =ntrodu ione nel C-A di rotture a singolo !ilamento con !orma ione di un solo c'iasma "modello di Dollida)%, o a doppio !ilamento con !orma ione di due c'iasmi "modello double strand breaH%. :. Appaiamento di regioni a singolo !ilamento !ra le due molecole omolog'e: il !ilamento di una si appaia al suo complementare sull3altro !ilamento "invasione del (ilamento%. @. Migrazione del c,iasma, con !orma ione di nuovi appaiamenti e rottura di altri. 5. <isolu ione della giun ione di Dollida) o della giun ione delle rotture a doppio !ilamento. 2iun ione di Dollida): risolu ione .a risolu ione della giun ione di Dollida) da origine a prodotti patc,es o del non crossing7over, a one eterodupleM e a prodotti splice o del crossing over. -ella risolu ione sono coinvolte proteine della !amiglia <uv. =n particolare, in E. ,oli, <uv, risolve la giun ione incidendo 6 dei !ilamenti di C-A omologo "con la stessa polarit%. (i ottiene #uindi un3estremit !os!ato753 e una 4LD :3 c'e possono essere unite da una C-A ligasi. <uv, risolve solo #uando il c'iasma ? migrato dopo la seconda timina della se#uen a consenso* se cos$ non !osse non potrebbe esserci migra ione. .3avvenimento o meno di crossing7over ? visibile seguendo ori ontalmente la molecola di C-A. (e non ? avvenuta, trovo, in!atti, un !ilamento integro con la stessa se#uen a genica di alleli. -ell3altro !ilamento trovo un3inser ione di un !ilamento del C-A omologo c'e crea un missmatc' nella ona dell3allele ATb. >uesta ? detta regione eteroduple. e potr poi essere riparata. (e #uesti missmatc' vengono riconosciuti dagli en imi c'e riparano gli appaiamenti errati, #uesti inseriscono casualmente un nicH a singolo !ilamento. -e consegue c'e al termine della ripara ione entrambi i !ilamenti porteranno la stessa se#uen a. >uesto comporta una conversione genica, concetto diverso dalla ricombina ione omologa. =n #uest3ultimo avviene uno scambio vero e proprio, nel primo avviene la copia di un gene. (e invece avviene il crossing7over anc'e dopo la corre ione delle regioni eterodupleM otterr8 un riassortimento genico a livello degli alleli. 2iun ione del modello di ripara ione rottura doppi !ilamenti -on avviene la !orma ione di un nicH bens$ la rottura a doppio !ilamento.

Ena nucleasi degrada poi la molecola di C-A rotta producendo delle regioni a singolo !ilamento c'e terminano con un :37LD libero "code di %&A a doppio (ilamento%. (egue l3invasione da parte di #ueste code del C-A omologo e intatto* poic'? le code presentano un :3 LD libero possono servire come primer per la sintesi di #uel C-A degradato durante il processamento delle rotture a doppio !ilamento. (i vengono cos$ a creare 6 giun ioni di Dollida), 6 c'iasmi con due possibili risolu ioni. (e entrambi i c'iasmi vengono tagliati nello stesso modo "stesso sito% otterr8 i prodotti del non crossing7over. (e le giun ioni vengono tagliate in siti di!!erenti avr8 il crossing7over. >uando avviene il blocco della !orca replicativa "in #uanto ? presente una lesione%, #uesta pu8 essere processata in modi di!!erenti attraverso regressione della !orca oppure digestione nucleasica al !ine di creare un3estremit rotta c'e pu8 ini iare un evento di ricombina ione omologa. (i !ormano in tal caso due scambi, uno prima e l3altra dopo la lesione, in modo da andare a recuperare l3in!orma ione sull3altra molecola. =n caso di lesione avverr una regressione della !orca con appaiamento dei due !ilamenti di neosintesi c'e presentano un C(A alle estremit* #ueste possono dare origine e ricombina ione. (e invece troviamo un nicH, si avr il collasso della !orca a #uel livello. .a prematura termina ione della sintesi sul !ilamento rotto creer anc'e in #uesto caso un C(A. (.$/ roteine c'e inter-en#ono nella ricom7inazione =n E. ,oli il sistema di ripara ione dei C(C ? noto come sistema 2ec4C%, ed ? !ormato dal macc'inario proteico deputato alla ricombina ione. =n tale organismo non ? mai stata riconosciuta una proteina c'e introduce C(A, i #uali sono #uindi dovuti principalmente a danno o errori di replica ione. -egli eucarioti diploidi, invece, le C(A vengono introdotte appositamente da particolari proteine durante la meiosi, al !ine di !ormare la tetrade. .e proteine coinvolte nella ricombina ione sono "in ordine di appari ione%: 7 E.=,A(=T-E,.EA(= <ecA,C +rocessa le molecole di C-A rotte ed aiuta a caricare <ecA. V composta da : subunit "<ecA, <ec,, <ecC% e possiede attivit elicasica e nucleasica gra ie alle #uali svolge il C-A e crea il :3 protruding per l3invasione a livello dei C(A. Essa viene controllata dalla speci!ica se#uen a c,i5 costituita da 8 nucleotidi e presente in 111& siti, la #uale aumenta la !re#uen a di ricombina ione di un ordine di grande a e permette anc'e a <ecA,C di scegliere se integrare o no un C-A estraneo: se #uesta se#uen a ? presente il C-A viene integrato, altrimenti viene degradato. <ecA e <ecC sono elicasi c'e denaturano il C-A a partire da un C(A e spesso contemporaneamente la nucleasi taglia entrambi i !ilamenti. >uesto avviene !inc'? il complesso non incontra la se#uen a c,i* a #uesto punto viene persa l3attivit nucleasica :353 e aumenta la digestione nucleasica sul !ilamento 53 :3 rispetto all3altro. =l risultato ? la !orma ione di :3 protruding c'e termina con la se#uen a c'i. Lra <ecA pu8 coprire il :3 protruding a!!inc'? non venga coperto dalle proteine ((A. 7 <ecA Membro di una !amiglia di en imi c'iamata proteine c,e scambiano il (ilamento) -ella sua !orma attiva ? un !ilamento nucleoproteico enorme costituito da circa 111 subunit di <ecA e :11 nucleotidi di C-A. >uesto C-A avvolto dal !ilamento di <ecA non ? nella con!orma ione A* lo spa io !ra ogni base ?, in!atti, di 1,5 nm "an ic'? 1,:@%, e #uindi la sua lung'e a aumenta di 1,5 volte.

.e subunit di <ecA si legano pre!eren ialmente su un singolo !ilamento e si allungano in dire ione 53 :3, coprendo il :3 protruding. =l complesso <ecA7ssC-A va #uindi alla ricerca di una regione di omologia. <ecA possiede due siti di legame per il C-A: uno per la prima molecola di C-A, il secondo per una doppia elica di C-A c'e si lega in modo indipendente dalla se#uen a mediante un legame debole e transitorio. =n tal modo anali a se vi sono omologie* lo !a aprendo temporaneamente l3elica e cercando complementariet con il singolo !ilamento. +robabilmente avviene il base (lipping) (e vi sono 15 pb complementari c3? omologia e #uindi si attiva lo scambio dei !ilamenti con !orma ione della molecola giuntata5 ossia una struttura costituita da tre !ilamenti "il :3protruding e i due dell3elica integra% stabili ata da <ecA e c'e presenta una regione ibrida di circa 111 pb. <ecA stabili a #uesto complesso in #uanto ? complementare ai prodotti di C-A !ormati dopo lo scambio dei !ilamenti "stabili a ione dello stato di transi ione e !orma ione delllaTdelle giun ioni di Dollida)%. 7 <uvAA Aumenta la velocit di migra ione del c'iasma. <uvA, c'e contatta i @ !ilamenti, riconosce non la se#uen a ma la giun ione di Dollida) propria, vi si lega e recluta <uvA. >uesto esamero con attivit A5+asica simile ad <uvA !ornisce l3energia necessaria per lo degli appaiamenti !ra basi in modo da !ar il c'iasma. +er ogni c'iasma ? presente un <uvA "@ monomeri% e due <uvA "un esamero%.

vera e ? un un3elicasi. scambio avan are

7 <uv, V un endonucleasi in grado di risolvere il c'iasma. 0un iona insieme a <uvA e <uvA. >uando il c'iasma viene riconosciuto da <uv,, #uesto taglia due dei !ilamenti omolog'i con la stessa polarit* in base a #uali !ilamenti vengono tagliati posso ottenere due diversi prodotti "patc' o crossing over%. Anc'e se riconosce la struttura del c'iasma, taglia il C-A con una modesta speci!icit a livello della seconda 5 dei siti aventi una determinata se#uen a consenso. V #uesto il motivo per cui il c'iasma pu8 migrare* se non ci !osse la necessit di #uesta se#uen a <uv, attacc'erebbe la giun ione appena !ormata limitando lo scambio genico alla regione di scambio del !ilamento. -egli eucarioti la ricombina ione omologa svolge la !un ione aggiuntiva di mantenimento dell3integrit genomica durante la meiosi, in #uanto #uesta ? necessaria per la !orma ione della tetrade* genera inoltre, attraverso possibile crossing7over, variabilit genica trasmissibile alla prole. V stato individuato il !attore c'e introduce C(A: Spo , simile alla topoisomerasi, utili a un residuo di 5)r per attaccare il legame !os!odiestere e introdurre un nicH. Lperano in 6, uno per ogni !ilamento, tagliando il C-A a distan a di un nucleotide.

Altre proteine coinvolte nella ricombina ione eucariotica sono: M26 ; simile a <ecA,C %mc ; agisce in meiosi, simile a <ecA 2ad/ ; agisce in mitosi e in meiosi, simile a <ec1

>uando la !orcella si interrompe in presen a di un danno, due sono le possibilit: 1. .3in!orma ione per la se#uen a del segmento da riparare viene presa dal cromosoma omologo mediante ricombina ione 6. Sistema 3ranslesione: 7 EmuC viene ridotta a EmuC3 "piB piccolo% c'e si associa ad Emu, 7 <ecA "proteolisi dei repressori genici dei geni per le C-A pol della !amiglia ]% 7 C-A pol V e C-A pol IV "!amiglia ] delle C-A pol% 7 -ei mammi!eri C-A pol b e in parte ` <=,LMA=-AO=L-E 2E-E<A.E o LML.L2A (cambio di materiale genetico tra due molecole #ualsiasi di C-A c'e presentano una su!!iciente ona di omologia: 7 !ra cromosomi omolog'i "cellule diploidi% 7 !ra cromatidi !ratelli dopo la replica ione "dopo !ase (, prima della divisione% 7 !ra cromosoma e C-A estraneo con omologia 0un ione: &ei batteri: 7 processo di ripara ione del C-A danneggiato "soprattutto rotture a doppio !ilamento% e ricostru ione di una !orcella replicativa bloccata 7 pu8 avvenire durante in(ezione (agica o piB raramente durante Coniugazione 4atterica &egli eucarioti: 7 ripara ione del C-A danneggiato e recupero delle !orcelle bloccate 7 rende possibile il contatto !isico tra cromatidi !ratelli !ormando la tetrade a livello della prima segrega ione meiotica. >uesto contatto "mediante se#uen e omolog'e% assicura l3ordinata segrega ione dei cromatidi. 5ale contatto a livello della tetrade pu8 risolversi in un crossing7over contribuendo alla variabilit genetica della specie 0orcella in stallo, 6 casi: 1. 7 .a !orcella incontra una lesione non riparata. C-A pol III non pu8 ripararla. Avviene l3interru ione del nuovo !ilamento a livello della lesione sullo stampo. 7 <egressione della !orca* intervengono <ecA e altre proteine 7 =nterviene C-A pol I c'e sinteti a C-A a partire dall3estremit :3 interrotta, usando come stampo il !ilamento neosinteti ato. 7 .a !orca migra in dire ione opposta e 'o nuovamente l3ini io della replica ione detta &uova Origine della 2eplicazione Origine0%ipendente

6. 7 .a !orcella incontra un nicH sullo stampo c'e determina interru ione anc'e sul nuovo !ilamento* rottura a doppio !ilamento 7 (i !orma a tutti gli e!!etti il modello delle rotture del doppio !ilamento ma con una solo giun ione di Dollida) "presenti solo 6 estremit della rottura a doppio !ilamento% 7 =n tale ambito agiscono <ecA ed il complesso <ecA,C* il nicH sullo stampo viene riparato, la trascri ione pu8 continuare.

7 .a risolu ione della !orca viene poi svolta da <uvAA e <uv, 7 &uova Origine della 2eplicazione Origine0%ipendente -uova Lrigine della <eplica ione Lrigine7Cipendente comporta la riorgani a ione della !orcella c'e utili a proteine speci!ic'e a C-A pol II poi sostituita da C-A pol III. .a lesione pu8 poi essere riparato nuovamente mediante i comuni sistemi di ripara ione. -.A. .a giun ione di Dollida) viene a !ormarsi !ra cromatidi !ratelli, ci8 signi!ica c'e #uesto avviene durante o dopo la !ase ( sia in mitosi c'e in meiosi, ma soprattutto avviene anc'e nei batteri e negli organismi aploidi. .a ricombina ione omologa in meiosi degli eucarioti diploidi avviene anc'e !ra cromosomi omolog'i ed ? #uesto c'e pu8 portare a crossing7over. (.%0 La tra"!o"izione <icombina ione sito7speci!ica c'e avviene tra due elementi de!initi di C-A in #uanto il C-A c'e viene spostato "escisso oppure integrato% presenta speci!ic'e se#uen e dette siti di ricombinazione. (i tratta perlopiB di C-A virali. .a trasposi ione avviene tra se#uen e di C-A speci!ic'e e siti di C-A non speci!ici, e coinvolge elementi mobili, detti trasposoni) .o spostamento avviene mediante un evento di ricombina ione tra se#uen e di C-A poste all3estremit dell3elemento trasponibile ed una se#uen a presente sul C-A ospite scelta in genere con poca selettivit. .e trasposi ioni sono la principale !onte di muta ione per molti organismi, in #uanto possono inserirsi in un gene o in delle se#uen e regolatorie. (ono #uindi molto spesso dannosi, ma essen iali per l3evolu ione. (ono presenti in #uasi tutti i genomi "molto piB !re#uentemente nelle piante%* il 51P o piB del C-A ? costituito da elementi trasponibili. = meccanismi di ricombina ione sono molto simili a #uelli usati dai virus nell3integra ione del loro C-A, e anc'e a #uelli usati dalle cellule per alterare il pattern di espressione genica.

(.%1 Retrotra"!o"oni e retro-iru" Esistono : classi principali di trasposoni: 1. 5<A(+L(L-= A C-A 6. <E5<L5<A(+L(L-= (=M=.= A K=<E( "comprendono anc'e retrovirus% :. <E5<L5<A(+L(L-= +L.=7A "non virali% 1. 5rasposoni a C-A

+ortano se#uen e a C-A c'e servono come siti di ricombina ione nei geni c'e codi!icano per le proteine coinvolte. = siti di ricombina ione si trovano alle estremit: sono se#uen e ripetute e invertite di circa 657111 pb. Kengono riconosciute dalla trasposasi "o integrasi% la #uale viene codi!icata dall3elemento trasponibile stesso. Ai !ianc'i delle due estremit del trasposone si trovano due se#uen e brevi duplicate e dirette "non invertite% c'e si c'iamano duplicazione del sito bersaglio. (i !ormano durante la stessa ricombina ione. >uesta struttura ? tipica dei trasposoni autonomi, mentre #uelli non autonomi possiedono esclusivamente le estremit ripetute ed invertite sen a il gene per la trasposasi. (i ricombinano mediante una trasposi ione tagliaTincolla con l3escissione del trasposone e successiva integra ione in un nuovo sito.

6. <etrotrasposoni simili a virus +ossiedono all3estremit siti di inser ione ripetuti ed invertiti immerse all3interno di se#uen e ripetute piB lung'e c'e si trovano all3estremit dell3elemento in un3organi a ione ripetuta e diretta. (ono de!inite Lung,e Se7uenze 3erminali 2ipetute, o L32. (ono presenti 6 geni per 6 proteine: l3integrasi e la trascrittasi inversa "<5% o %&A pol 2&A dipendente, c'e utili ano <-A come stampo per sinteti are C-A. >uesto perc'? nel loro processo di trasposi ione ? previsto un intermedio a <-A. (ono !ianc'eggiati anc'e #uesti da se#uen e duplicate e dirette. .a di!!eren a tra retrovirus e retrotrasposoni simili a virus ? c'e i primi sono impacc'ettati in una particella virale c'e s!ugge da una cellula per in!ettarne una nuova, mentre i secondi si possono spostare solo all3interno della cellula stessa. Ena <-A pol cellulare trascrive il retrotrasposone o il retrovirus partendo da un promotore di una .5<. .3<-A viene poi retrotrascritto da <5 !ormando un cC-A a doppio !ilamento. >uesto cC-A ? riconosciuto dall3integrasi c'e elimina alcuni nucleotidi dalle estremit :3 e catali a poi l3inserimento nel C-A ospite "sito bersaglio non speci!ico in se#uen a%. >uesto processo ? c'iamato duplica ione dell3elemento trasponibile. -.A. = siti bersaglio sono s!alsati, di conseguen a, dopo l3integra ione, l3interru ione viene riparato e avr8 la duplica ione del sito bersaglio. .3<-A virale si trova impacc'ettato nella particelle virali insieme con un t<-A cellulare c'e agisce come primer "t<-A primer% per la sintesi del primo !ilamento del cC-A.

>uesto t<-A si appaia vicino a E5 e < nel sito di legame del primer e cos$ la trascrittasi inversa copia E5 ed <. >uesto C-A E57< viene rilasciato come singolo !ilamento #uando l3attivit <-AasiD di < idroli a l3<-A E5 e < ibridato al C-A E57<. A #uesto punto il C-A E57< ss va ad appaiarsi con la sua < alla seconda < dell3m<-A dell3estremit opposta e la 5< "possiede sia attivit C-A polimeri ante c'e <-AasiD, la #uale degrada l3<-A appaiato al C-A% pu8 allora copiare il resto dell3<-A. =nterviene ancora l3<-AasiD c'e degrada l3<-A stampo lasciando per8 un !rammento legato alla se#uen a sul C-A nota come tratto polipurinico 113, c'e si trova dopo E:. >uesto <-A ? primer per la copia a C-A delle se#uen e E:7<7E5 dell3altro !ilamento a C-A e viene copiato anc'e +A( dallo stampo del t<-A. Eliminando #uesto, i +A( :3 possono appaiarsi con !orma ione di un intermedio circolare. .e due estremit :3 vengono allungate, viene a !ormarsi un cC-A completo delle due intere .5<. :. <etrotrasposoni poli7A -on presentano le ripeti ioni terminali invertite presenti in tutti gli altri tipi di trasposoni. =nvece le due estremit presentano se#uen e diverse: 53.5< "regione non tradotta% e l3altra :3.5< seguita da una serie di pb A75 detta se7uenza poli0A. Anc'e #uesti sono !ianc'eggiati da duplica ioni del sito bersaglio. +ortano 6 geni: L<01, c'e codi!ica per proteina c'e lega il C-A, e L<06, c'e codi!ica per !attore con attivit sia di trascrittasi inversa c'e endonucleasica. Etili ano nel processo un intermedio ad <-A ma il meccanismo ? di!!erente da #uelli virus7simili e viene c'iamato trascrizione inversa innescata dal sito bersaglio : 7 <-A pol cellulare codi!ica l3m<-A poli7A 7 5rasporto al citoplasma con tradu ione e produ ione di L<01 e L<06 c'e rimangono associati al trascritto "cos$ non possono essere utili ati da altri elementi% 7 <itorna al nucleo e avviene la ricombina ione con taglio del C-A cromosomico e integra ione "!avorita da L<06%. 5aglio a livello di se#uen e ricc'e di 5 c'e si associano al poli7A dell3<-A 7 .3estremit :3LD c'e si ? creata sul !ilamento di C-A rotto diventa il primer per la retrotrascri ione "L<06% dallo stampo a <-A 7 (intesi del secondo !ilamento e ripara ione della rottura. Molti di #uesti trasposoni presenti nel genoma 'anno perso la capacit di trasporsi poic'? 'anno perso la se#uen a dei geni o del promotore -.A. .a duplica ione del trasposone avviene in 6 e in :, non in 1. (.%$ .ra"!o"izione elementi LINE Elementi -ucleari .ung'i Cispersi, !acenti parte dei retrotrasposoni poli7A autonomi, rappresentano circa il 61 P del genoma umano. .1 "8111 pb% ? uno degli elementi .=-E piB conosciuti. >ueste .=-E !orniscono anc'e le proteine necessarie per retrotrascrivere ed integrare se#uen e simili ma piB corte, le (=-E "s'ort% c'e sono retrotrasposoni poli7A non autonomi. .a loro se#uen a ricorda un gene semplice. =n teoria, poic'? la trascri ione porta ala !orma ione di m<-A maturi con la coda poli7A, pu8 accadere c'e L<01 e L<06 promuovano la trasposi ione anc'e di #uesto m<-A. V molto raro ma il risultato ? un pseudogene processato c'e presenta assen a di promotore, introni e se#uen e !ianc'eggianti ripetute. =n genere non vengono espressi. V raro in #uanto L<01 e L<06 tendono a legarsi subito all3<-A c'e le 'a codi!icate.

). .ra"crizione nei !rocarioti ).01 Reazione di !olimerizzazione RNA .3espressione di un gene prevede c'e l3in!orma ione contenuta sotto!orma di C-A venga prima trascritta in <-A e poi tradotta in proteina, #uindi in aminoacidi. .3espressione include anc'e il concetto di regola ione. .a trascri ione prevede la sintesi di <-A, la #uale ? c'imicamente ed en imaticamente molto simile alla replica ione del C-A. .a catena di <-A ? per8 un polimero non di deossiribonucleotidi ma di ribonucleotidi, ed ? a singolo !ilamento, complementare ad uno solo dei due !ilamenti di C-A. -on avviene mai la trascri ione contemporanea di entrambi i !ilamenti. Anc'e la sintesi di <-A ? una rea ione di polimeri a ione catali ata da un en ima, la 2&A polimerasi, la #uale possiede attivit polimeri ante 53 :3. -e risulta #uindi c'e, al termine della tradu ione, al :3 dell3<-A corrisponde il ,7terminale della proteina !inale, e al 53 dell3<-A corrisponde l3-7terminale. .3<-A ? anc'e meno stabile del C-A "ma l3<-A dupleM ? piB stabile del C-A dupleM%, contiene E al posto di 5 "5 ? di per s? un 57metil7uracile%, ed in!ine porta in 53 un tri!os!ato. +u8 ripiegarsi con regioni complementari interne al suo singolo !ilamento !ormando strutture ter iarie.

.e di!!eren e principali !ra trascri ione <-A e replica ione C-A sono: 7 +resen a di ribonucleotidi an ic'? deossirobonucleotidi 7 .3<-A polimerasi non necessita di primer 7 .a sintesi ? processiva sempre, mentre sul C-A lo ? solo a livello del leading strand 7 -on esiste un3attivit esonucleasica accessoria di corre ione nella <-A pol* #uesto perc'? un errore sorto in replica ione pu8 provocare un danno permanente nel genoma, mentre in trascri ione l3errore rimane limitato al trascritto e al suo prodotto di sintesi e si esaurisce con la distru ione del trascritto stesso sen a risc'io di trasmissione alla prole <-A pol ; 1 errore ogni 11 mila nucleotidi C-A pol F sistemi di ripara ione ; 1 errore ogni 11 milioni di nucleotidi 7 In entrambe vengono coinvolte topoisomerasi 7 -ella trascri ione non ? ric'iesta la presen a di elicasi in #uanto l3<-A pol stessa apre il C-A "attivit elicasica% 7 .a velocit ? di 1111 nucleotidi al secondo per replica ione, 51 nucleotidi al secondo per la trascri ione* C-A pol 61 volte piB veloce dell3<-A pol 7 .3<-A prodotto !orma una breve ona ibrida con il C-A a solo poc'i nucleotidi di distan a dall3aggiunta dei nuovi ribonucleotidi. (i stacca e #uesto permette in seguito la tradu ione dell3<-A, ma rende possibile anc'e la trascri ione contemporanea dello stesso gene da parte di diverse <-A pol.

7 .a trascri ione copia selettivamente, e anc'e molteplicemente, solo alcune por ioni del genoma. (ono presenti se#uen e speci!ic'e c'e dirigono l3ini io della trascri ione, altre il termine* piB geni possono essere trascritti contemporaneamente in una cellula. 7 .3<-A pol batterica, a di!!eren a della C-A pol, compie tutte le a ioni necessarie alla trascri ione: 7 apre il C-A "attivit elicasica% 7 trascrive il C-A "attivit polimeri ante% 7 ini ia la sintesi di <-A 7 termina la sintesi di <-A ).0$ >a"i di tra"crizione .3<-A polimerasi procede in : !asi: 1. =-=O=L =l promotore, ossia una speci!ica se#uen a di C-A, viene riconosciuto dalla <-A pol* #uesta si lega al sito insieme ad altri !attori d3ini io. =ntorno a #uesto punto il C-A si svolge e viene a !ormarsi la bolla di trascrizione "circa 65 nucleotidi%. +oic'? l3<-A pol si lega al promotore con un orientamento pre!issato, la scelta del promotore implica #uale dei due !ilamenti verr trascritto, in #uanto l3en ima procede solo in dire ione 53 :3. Callo stesso promotore viene sempre trascritto lo stesso !ilamento. V #uesto il passaggio maggiormente sottoposto a regola ione. 6. A..E-2AME-5L -ella prima !ase dell3ini io l3<-A pol si lega al promotore e !orma il complesso c,iuso, complesso in cui il C-A ? ancora a doppio !ilamento. =n seguito vi ? la transi ione "cambiamento con!orma ionale% al complesso aperto con !orma ione della bolla di trascri ione e #uindi apertura della doppia elica. = primi ribonucleotidi vengono portati sul sito attivo legati ed allineati sullo stampo. .3<-A pol ini ia a scorrere sullo stampo aprendo l3elica davanti a s? e ric'iudendola dietro di s? e sinteti ando diverse prove di circa 11 nucleotidi c'e poi vengono rilasciate. >uando vengono sinteti ati segmenti con dimensioni maggiori di 11 nucleotidi si dice c'e l3<-A pol ? evaso dal promotore e viene a !ormarsi un complesso ternario stabile 2&A0%&A0enzima* #uesta ? la transi ione verso la !ase di allungamento. Curante la !ase di polimeri a ione l3<-A pol apre il C-A, lo riavvolge dentro di s?, stacca l3<-A dallo stampo e !un iona da correttore di bozze. =n particolare le !un ioni di corre ione sono: 7 editing piro!os!olitico: nel sito attivo avviene la rea ione inversa all3inserimento di un nucleotide #uando #uesto ? scorretto tramite reincorpora ione di ++i 7 editing idrolitico: la polimerasi torna indietro di uno o piB nucleotidi e taglia la se#uen a c'e porta errori* viene stimolato da !attori 2<E, i #uali sono anc'e !attori stimolanti dell3allungamento :. 5E<M=-AO=L-E =n corrisponden a di una se#uen a speci!ica la polimerasi si !erma e rilascia l3<-A prodotto. ).0% >ilamenti DNA codificante e "tam!o .a scelta del promotore, come detto, comporta anc'e la scelta del !ilamento c'e verr utili ato come stampo. >uesto ?, appunto, detto (ilamento stampo, mentre l3altro ? detto (ilamento

codi(icante) Ca notare c'e l3<-A prodotto sar uguale al !ilamento codi!icante ma complementare a #uello stampo. Kiene detto codi!icante proprio perc'? ? del tutto uguale al C-A, ad ecce ione di E al posto di 5. -on avviene mai la trascri ione contemporanea di entrambi i !ilamenti altrimenti si otterrebbero due proteine diverse dallo stesso gene. .a proteina corrisponde invece all3<-A e #uindi al !ilamento codi!icante. ).0& romotori e terminatori +er de!ini ione i promotori sono le se#uen e di C-A cui si lega l3<-A pol. .a scelta del promotore, come gi detto, condi iona la scelta del !ilamento stampo, e l3<-A pol si lega ad esso in modo prede!inito. =l punto d-inizio ? il punto preciso in cui ini ia la trascri ione ed ? detto F1* divide cos$ la parte a monte "c% e #uella a valle del gene "F%. =l promotore si trova a monte. = terminatori, invece, sono se#uen e di C-A c'e segnalano all3<-A pol di staccarsi dal C-A e di rilasciare l3<-A sinteti ato, portandolo cos$ dalla !ase di allungamento a #uella di termina ione. -ei batteri sono di due tipi: 2,o0dipendenti e 2,o0indipendenti. ).0( Bolla di tra"crizione V il sito in cui avviene la sintesi dell3<-A. (i !orma nella !ase di ini io, nel momento in cui il C-A comincia a denaturarsi e l3<-A pol passa dalla !orma c'iusa a #uella aperta. .a bolla ? circondata dalla <-A pol, trattenuta nel sito attivo. Kedi anc'e risposte precedenti. ).0) RNA !olimera"i 7atterica = batteri presentano un solo tipo di <-A pol, gli eucarioti :. .a polimerasi batterica ? composta da subunit multiple* l-enzima core dell3<-A pol ? da sola in grado di sinteti are l3<-A ed ? composto da due subunit [ "@1 HCa%, una subunit `, una `3 ed una d. ` e `3 presentano le dimensione maggiori "1517161 HCa% e sono omolog'e alle subunit maggiori eucariotic'e dell3<-A pol II <+A1 e <+A6* le subunit [ sono invece omolog'e a <+A: ed <+A11, la subunit d a <+A6. =n generale la !orma ? #uella di una c'ela di granc'io in cui le 6 pin e sono costituite principalmente dalle subunit maggiori ` e `3. .e subunit [ sono responsabili del riconoscimento del promotore. =l sito attivo ? costituito da alcune regioni di ` e `3 e si trova alla base delle pin e all3interno di una regione c'iamata solco centrale attivo. =l sito attivo pu8 legare Mg6F in accordo con il meccanismo catalitico a cationi bivalenti per l3aggiunta di nucleotidi, meccanismo comune a tutti i tipi di polimerasi. +resenta una struttura detta timone, la #uale apre l3ibrido <-A7C-A mentre l3en ima si muove liberando il trascritto, ed un3altra struttura c'iamata porta c'e provoca la curvatura del C-A.

Ki sono poi diversi canali c'e consentono il passaggio di C-A, <-A e ribonucleotidi. >uesti canali sono 5: 1. ,anale di ingresso &310uptake per l3ingresso di ribonucleotidi verso il sito attivo 6. ,anale di uscita 2&A0e.it per !ar uscire l3<-A sinteti ato :. ,anale %&A do+nstream per il C-A a valle "ancora a doppia elica%: si trova tra le ganasce ` e `3 "ancora a doppia elica% @. ,anale di uscita dal solco centrale attivo &30non template per il !ilamento codi!icante: il C-A si denatura presso F: e da #ui esce il !ilamento codi!icante 5. ,anale di uscita 30template per il !ilamento stampo* lo stampo esce dopo un cammino lungo il solco centrale attivo. +resso 711 la doppio elica si rinatura. .3en ima trattiene a valle 11 nucleotidi, &711* la bolla di trascri ione ? costituita da circa @@ nucleotidi. .3ibrido C-A7<-A ? costituito da circa & #ueste subiscono !lipping !uori dall3elica per appaiarsi con l3<-A. ).0* Sito atti-o RNA !olimera"i Kedi risposta precedente. ).0+ >attore Si#ma CGD =l core dell3<-A pol ? in grado, in linea di principio, di ini iare la trascri ione in #ualsiasi punto del C-A* nelle cellule ini ia solo in corrisponden a dei promotori. >uesto ? dovuto all3aggiunta del (attore di inizio 8 "(attore 8% c'e converte l3en ima core nella !orma in grado di ini iare la trascri ione solo in corrisponden a dei promotori. <-A pol F !attore e ; oloen ima =n E. ,oli il !attore e predominante ? G*0, il #uale pu8 essere suddiviso in @ regioni: e1, e6, e: e e@. e6 si lega al core della <-A pol e al C-A a livello dell3elemento 711 del promotore. =n corrisponden a di #uesto elemento avviene l3ini io della separa ione del C-A durante la transi ione da complesso c'iuso ad aperto. +er #uesto motivo e6, c'e 'a una struttura a doppia elica, contiene diversi residui aromatici c'e interagendo con le basi del !ilamento non stampo stabili ano il C-A aperto "? a #uesto livello c'e avviene la !usione del C-A dupleM%. e@ si lega al core della polimerasi a livello dell3elemento 7:5 del promotore. Cue elic'e all3interno della regione @ !ormano un dominio di legame al C-A elica0giro0elica* un3elica si inserisca del solco maggiore ed interagisce con le basi dell3elemento 7:5, l3altra interagisce con l3ossatura del C-A. e: riconosce l3elemento 711 esteso del promotore #uando #uesto ? presente. >uando #uesto oloen ima spostandosi giunge su F1 ini ia la sintesi ed il !attore e si dissocia. -ell3oloen ima esso si colloca in modo da poter riconoscere diversi promotori. .a sua regione di legame al C-A ? rivolto dalla parte opposta rispetto al corpo dell3en ima. =noltre le regioni e6 e e@ sono separate da circa &5 f, distan a circa pari a #uella !ra l3elemento 711 e 7:5 nel promotore tipico di e/1. 0ra #ueste due regioni si inserisce e:. a monte #uindi pb* di C-A

.a transi ione da complesso c'iuso ad aperto comporta cambiamenti con!orma ionali e l3apertura "melting% della doppia elica: nei batteri con e/1, #uesta transi ione ? detta isomeri a ione, processo irreversibile c'e non ric'iede idrolisi di A5+. >uando #uesto avviene si 'a l3ini io della trascri ione. -el complesso c'iuso, invece, l3<-A pol pu8 ancora dissociarsi dal C-A "processo reversibile%. >uando avviene l3isomeri a ione, l3en ima va incontro a due cambiamenti con!orma ionali: 7 .e pin e anteriori si c'iudono !ermamente sul C-A a valle 7 (postamento dell3-7terminale di e "e1.1%: la regione #uando non ? ancora avvenuto il legame al C-A si trova all3interno del solco centrale attivo bloccando il cammino c'e il !ilamento stampo percorre #uando il complesso ? aperto. >uando si lega il dna, la transi ione a complesso aperto comporta lo spostamento di e1.1 !uori dall3oloen ima lasciando libero l3accesso. ,ome il C-A #uesta regione contiene molte caric'e negative, mentre il solco centrale attivo presenta caric'e positive. =noltre #uando si aggiunge e all3<-A pol l3oloen ima si estende da 751 a F61 sul C-A, coprendo circa /1781 pb. All3isomeri a ione vengono coperte circa 61 pb. >uando e si stacca dall3<-A pol #uesta riduce nuovamente le sue dimensioni, coprendo da 7:5T@1 a F11, ossia circa @1751 pb. >uesta situa ione si veri!ica #uando viene a !ormarsi il complesso de!initivo della !ase di allungamento. (i ritiene c'e alcune regioni di e siano !ondamentali per la capacit dell3<-A pol di sinteti are <-A eM novo sen a primer. .3<-A pol ini ia la maggior parte dei trascritti con A c'e !orma due soli legami con 5. .3en ima tiene A nell3orientamento corretto per permettere l3attacco c'imico con l3-5+ successivo* !a #uesto mediante intera ioni speci!ic'e per A, !avorendo cos$ l3ini io e!!iciente solo di catene c'e ini iano con A. >ueste intera ioni sembrano essere rese possibili da regioni e. =noltre la regione e :.6 !un iona da imitatore molecolare di <-A. Essa si trova all3interno del canale 2&A0e.it #uando l3en ima ? nella con!igura ione aperta e #uindi sembra essere responsabile dell3ini io abortivo* in!atti, per poter sinteti are piB di 11 nucleotidi #uesta regione e deve essere spostata da #uesta posi ione e #uesto processo pu8 ric'iedere piB tentativi. .3espulsione di e :.6 pu8 giusti!icare la molto piB ridotta associa ione di e con <-A pol in !ase di allungamento, tanto c'e molte volte si dissocia completamente. ).0/ Ciclo di G =l !attore e !orma l3oloen ima #uando si lega all3<-A pol mediandone l3attacco al promotore. >uando poi avviene la transi ione alla !ase di allungamento spesso e si dissocia dal complesso "durante la transi ione tra complesso c'iuso e aperto ? legato, #uando avviene l3allungamento si dissocia%. =n !ase di allungamento il C-A a doppia elica entra tra le pin e attraverso il canale del %&A a valle. All3interno del solco centrale attivo le catene di C-A si separano presso la posi ione F: ed i due !ilamenti, stampo e codi!icante, si separano entrando nei rispettivi canali. (i riassociano in doppia elica dietro alla polimerasi. .3ibrido C-A7<-A ? lungo solo 87& nucleotidi. >uesto ciclo avviene perc'? i !attori e sono meno numerosi delle <-A polimerasi e di conseguen a devono essere riciclati. ).10 romotore 7atterico = promotori riconosciuti dal !attore e/1 di E. ,oli 'anno le seguenti caratteristic'e: sono 6 se#uen e conservate ciascuna costituita da 6 nucleotidi, sono separate da una se#uen a non speci!ica di 1/7 1& nucleotidi.

.e se#uen e conservate si trovano a circa 11 e :5 paia di basi rispettivamente a monte del punto d3ini io. >ueste se#uen e si calcolano a met della se#uen a di 6 pb e sono c'iamate regioni o elementi 7:5 "minus :5% e 711 "minus 11%, considerando F1 il punto d3ini io. >uesti elementi vengono riconosciuti rispettivamente da e@ e da e6. ,i sono tre tipi di promotori procariotici: 7 elementi 711 e 7:5, distan iati da 1/71& pb. 7 pu8 esserci l3elemento 91 "Epstream +romoter, tra 7@1 e 761%: promotore !orte c'e spesso dirigono l3espressione di geni per gli <-A ribosomiali. Kiene riconosciuto da [,5C, il dominio ,7 terminale della subunit [ dell3<-A pol. 7 +u8 essere assente l3elemento 7:5 ed essere presente l3elemento 0 : esteso, il #uale oltre all3elemento 711 contiene una piccola regione appena a monte rispetto ad essa. V riconosciuto dalla regione :. ).11 Se<uenze con"er-ate 2li elementi 7:5 e 711 sono se#uen e conservate molto simili in procarioti diversi. ,on!rontandole ? possibile derivare delle se#uen e consenso, ossia una versione della se#uen a in cui ogni posi ione ? occupata dal nucleotide c'e si trova in tale sito piB !re#uentemente. Esse sono: 711 ; 5A5AA5 "5A5A boM, anc'e negli eucarioti% 7 :5 ; 552A,A = promotori piB vicini alle se#uen e consenso sono generalmente piB !orti, cio? danno origine ad un numero maggiore di trascritti. >uesto dipende da #uanto il promotore leg'i l3<-A pol, con #uale e!!icien a supporti l3isomeri a ione e da #uanto prontamente la polimerasi pu8 evadere dal promotore stesso. ).1$ Contatto RNA !ol8DNA Kedi anc'e risposte precedenti. .3<-A contatta una !accia del C-A, in!atti la maggior parte dei punti di contatto si trova sul !ilamento codi!icante. Muta ioni a livello degli elementi 711 e 7:5 aboliscono e riducono l3attivit del promotore. -.A. A valle si avranno dei superavvolgimenti positivi con piB di 11 pb per giro. +er !ar s$ c'e la trascri ione non venga bloccata intervengono le topoisomerasi II "girasi% c'e introducono superavvolgimenti negativi. A monte, invece, per ogni giro d3elica svolto si !orma un superavvolgimento negativo "meno di 11 pb per giro% e #uindi interviene la topoisomerasi I c'e rilascia i superavvolgimenti negativi. A valle vengono, #uindi, introdotti superavvolgimenti positivi per compensare la diminu ione del tQist "piB di 11 pb% mantenendo cos$ costante il .inHing number. ).1% .erminazione in !rocarioti Avviene in corrisponden a di se#uen e speci!ic'e c'iamata terminatori. Esistono due tipi di terminatori procariotici: <'o7dipendenti ed <'o7indipendenti. ).1& R'o@di!endente ed R'o@indi!endente 1. 5erminatori <'o7indipendenti Cetti anc'e terminatori intrinseci5 sono costituiti da elementi: una se#uen a invertita "palindroma, 6

simmetria diadica% di circa 61 nucleotidi e ricca in ,2, seguita da un piccolo segmento di circa 8 coppie di basi A75 "poli75 sul !ilamento codi!icante, poli7A su #uello stampo%. >uando vengono trascritti in <-A, #uesto pu8 !ormare una struttura a !orcina gra ie all3appaiamento intramolecolare delle basi della se#uen a palindroma. >uesto provoca la rottura del complesso di allungamento per due ragioni possibili: o la !orcina spinge la polimerasi oltre il !ilamento, oppure determina un cambiamento con!orma ionale della polimerasi. >uesta termina ione ? e!!iciente solo se ? presente il segmento poli7E nell3<-A, il #uale si accoppia con le A dello stampo diventando l3unica struttura c'e mantiene l3<-A sullo stampo nel sito attivo. A7E ? debole e #uindi !acile da scindere. 6. 5erminatori <'o7dipendenti >uesti terminatori 'anno elementi di <-A meno caratteri ati, #uindi ? necessaria la presen a del (attore 2,o) >uesto ? costituito da 6 subunit uguali c'e !ormano un complesso a !orma di semicerc'io, il #uale si lega all3<-A #uando esce dalla polimerasi. =n particolare il !attore si lega all3estremit 53, scorre sull3m<-A verso :3 la <-A pol !ino a c'e #uesta si !erma a livello del terminatore. <'o possiede attivit A5+asica c'e !avorisce il rilascio dell3<-A dal C-A e dalla polimerasi. <'o riconosce inoltre il sito <'o7utili ation "<ut%, costituito da circa @1 nucleotidi ricc'i di , c'e rimangono a singola elica sull3<-A. +oic'? nei batteri trascri ione e tradu ione avvengono contemporaneamente, <'o si lega a trascritti legati a ribosomi e #uindi termina #uei trascritti c'e si stanno allungando oltre un gene o un operone. <'o o spinge la polimerasi oltre il !ilamento, o porta via l3<-A dalla polimerasi, oppure determina un cambiamento con!orma ionale nella polimerasi. ).1( Antiterminazione .a se#uen a di antitermina ione non possiede simmetria diadica e #uindi rilascia il primo <-A ma l3<-A pol prosegue oltre al sito di termina ione per continuare la replica ione "non si ? !ormata la !orcina%. >uesto permette di trascrivere due regioni continue se #ueste sono separate da una se#uen a di antitermina ione. >uando l3<-A pol arriva su tale se#uen a si associa ad essa una proteina antiterminazione c'e rende l3<-A pol in grado di passare oltre il terminatore e continuare a trascrivere la regione a valle.

*. .ra"crizione ne#li eucarioti *.01 Controllo della tra"crizione ne#li eucarioti .e di!!eren e principali tra la trascri ione nei procarioti e negli eucarioti sono: 7 : di!!erenti tipi <-A polimerasi 7 -ecessit di numerosi !attori di trascri ione 7 +romotori molto piB complessi e tipici per ogni <-A pol "spesso se#uen e attivatrici si trovano molto distanti nello stesso gene e #uesto ric'iede l3intervento di altri complessi% 7 Ci!!icolt ad accedere al gene in #uanto il C-A eucaristico ? incorporato nei nucleosomi. +er #uesto il gene prima deve essere reso accessibile dal rimodellamento della cromatina, il c'e ric'iede altri !attori oltre a #uelli generali di trascri ione. 5utte le tappe della trascri ione e tradu ione sono !inemente regolate. .3espressione del gene comprende la !orma ione di un primo prodotto, il trascritto primario "<-A eterologo nucleare%, c'e deve essere sottoposto a splicing "matura ione%, e deve poi uscire attraverso i pori nucleari per essere tradotto. .a proteina dovr poi subire il (olding e modi!ica ioni post7tradu ionali. >uindi la regola ione avviene a #uesti livelli: trascri ione, elabora ione dell3<-A, trasporto dell3<-A !uori dal nucleo, tradu ione, degrada ione dell3<-A e modi!ica ione post7tradu ionale. *.0$ RNA !olimera"i eucariotic'e Esistono : diverse polimerasi eucariotic'e: 1. <-A polimerasi I: trascrive i geni per i precursori dei grandi <-A ribosomi ali "68(, 18( e 5.8(%. V priva della coda ,5C. 6. <-A polimerasi II: trascrive la maggior parte dei geni c'e codi!icano per +roteine. 5rascrive inoltre 'n<-A "c'e matura a m<-A% e sn<-A. :. <-A polimerasi III: trascrive i geni per i t<-A, alcuni sn<-A "sn<-A E2%, gli r<-A 5( ed i sno<-A "<-A /(. e <-A /(J%.

(ono !ormate da subunit di #ueste dimensioni: 7 611 HC: correlata alla 3 batterica "<+A1 per l3<-A pol II% subunit maggiori 7 111 HC: correlata alla batterica "<+A6 per l3<-A pol II% 7 51 HC: correlata alla batterica "sono 6 sia nei batteri c'e negli eucarioti e corrispondono a <+A: e <+A11 dell3<-A pol II%. A #ueste si aggiungono altre subunit tipic'e eucariotic'e "& in piB per la I, / per la II e 11 per la III%. .a pol II ? ad esempio costituita da 16 subunit, da <+A1 a <+A16. .a subunit d batterica ? correlata a <+A6 nelle <-A polimerasi eucariotic'e. .a polimerasi II ? strutturalmente del tutto simile a #uella procariotica. Kedi domanda su polimerasi eucariotica. *.0% Geni tra"critti Kedi risposta /.16

*.0& RNA !olimera"i II Kedi polimerasi batterica per la struttura. .e di!!eren e sono nel meccanismo di trascri ione, in #uanto necessita dei !attori generali di trascri ione, e per la presen a del compattamento del C-A nei nucleosomi. *.0( Se<uenze con"en"o nel !romotore RNA !olimera"i II =l termine promotore base eucariotico indica il numero minimo di se#uen e necessarie per un ini io accurato di trascri ione da parte dell3<-A polimerasi II. =n media sono lungo circa 611 pb, di cui @1 pb sono gli elementi minimi, con posi ione !issa posta nelle immediate vicinan e di F1* si trovano poi elementi dispersi. V costituito da @ elementi di 8711 nucleotidi con se#uen e conservate spa iate da distan e conservate "non come se#uen a%* di !ato un promotore contiene solo 6 o : di #uesti @ elementi. Lgnuno di #uesti legato un determinato !attore di trascri ione. >uesti, da monte a valle, sono: 7 se7uenza a monte "7111T611% 7 42E "50IIA recognition element%, riconosciuto da 50IIA "7:5% 7 3A3A "5A5A boM%, riconosciuta da 5A+ "5A5A boM binding% "76&7:1% 7 Iniziatore "=-<%, riconosciuto da 50IIC "a cavallo di F1, dove ini ia l3apertura dell3elica% 7 %1E "doQnstream promoter element%, c'e in alcuni casi sostituisce 5A5A boM, viene riconosciuta da 50==C. -on ? necessaria la presen a di tutti #uesti elementi per la trascri ione. .e se#uen e consenso di #uesti elementi sono: 7 A<E : ricca in ,2 7 5A5A boM : ricca in A5 7 =-< : conservata su , e 5 7 C+E : ricca in ,2 Lltre a #uesti sono presenti altri elementi essen iali per la trascri ione in vivo* #ueste sono le se7uenze regolatrici, le #uali includono: 7 en,ancer: ampli!icatori lung'i circa 111 pb c'e si trovano a monte anc'e molto distanti dal promotore. (en a #uesti elementi la trascri ione non pu8 aver luogo in #uanto legano i regolatori responsabili dell3attiva ione di un gene. 7 silencer "silen iatori% 7 elementi di con(ine 7 insulator "isolatori% 7 9AS "upstream activating se#uence% -ei procarioti le se#uen e regolatrici sono situate in prossimit del promotore, mentre #uesto non si veri!ica negli eucarioti. -el corso dell3evolu ione si ? giunti ad una sempre maggiore complessit del promotore. *.0) >attori di tra"crizione = !attori generali di trascri ione svolgono nel loro complesso la stessa !un ione di e nei batteri, cio? aiutano la polimerasi a legarsi al promotore, a separare il C-A e ad evadere dal promotore per entrare nella !ase di allungamento.

(i c'iama complesso di pre7ini io il gruppo completo dei !attori generali di trascri ione e della polimerasi legati assieme al promotore e pronti per l3ini io. .a !orma ione di #uesto complesso ini ia con il riconoscimento della 5A5A boM da parte di 50 IIC attraverso una delle sue subunit c'iamata 5A+. .e altre subunit di 50 IIC sono c'iamate 5A0 "5A+ associated !actors%. =l legame 5A+7C-A distorce la se#uen a 5A5A in modo molto marcato. 5A+ presenta, in!atti, una caratteristica struttura a sella c'e presenta sia por ioni ad 7elica sia a !oglietto `. =n #uesto caso per8 non ? l37elica c'e riconosce il C-A inserendosi nel solco maggiore come avviene solitamente* ? il !oglietto ` c'e riconosce la 5A5A boM a livello del solco minore. >uesto avviene in #uanto la necessit ? #uella di piegare la struttura locale del C-A di circa 81N e per !are #uesto 5A+ allarga il solco minore !ino a !argli assumere una con!orma ione #uasi piatta "il C-A ? superavvolto negativamente e la piega lo denatura%. (i instaurano poc'i legami D tra solco minore e !oglietto `* la speci!icit ? data principalmente da due coppie di +'e c'e si intercalano !ra le basi dei terminali della se#uen a 5A5A imponendo il ripiegamento. >uesto ? !avorito se si tratta appunto di una 5A5A boM in #uanto #uesta ? ricca in A:5 c'e vengono distorti piB !acilmente. >uesta !acilit di associa ione alla 5A5A boM ? la discriminante di riconoscimento da parte di 5A+. >uesto complesso 5A+TC-A ? la piatta!orma su cui vengono reclutati gli altri !attori "prima era presente 50IIC%: 1. 50IIA, 50IIA 6. 50II0, portandosi dietro la <-A pol II con la sua coda con il dominio ,7terminale ",5C% :. 50IIE, 50IID, c'e presentano attivit elicasica "A5+asica%

=n dettaglio: 7 .A> "5A0 F 5A+ ; 50IIC%: circa 11 e si associano a 5A+, lega all3ini iatore "=nr%, uno all3elemento C+E, uno sembra regolare l3attacco di 5A+ al C-A, e altri sembra possano essere coinvolti in legami al C-A simili a #uelli delle proteine istonic'e* presentano in!atti con #ueste molte analogie.

sono uno si

7 .>IIB B ? responsabile della unidire ionalit della trascri ione. Ena sola subunit entra appena dopo 5A+ ed ? in contatto sia con #uesto, sia con A<E, sia con il C-A a valle della 5A5A boM. V inoltre in contatto con la <-A pol II: di conseguen e rappresenta un ponte tra 5A+ e polimerasi. (embrerebbe c'e il suo dominio -7terminale si inserisca nel canale di uscita dell3<-A della pol II in modo analogo alla regione e :.6 dei batteri. 7 .>II>B costituita da due subunit, si associa alla pol II con la #uale viene reclutata sul promotore. V necessaria la sua associa ione prima di 50IIE e 50IID. 7 .>IIEB costituita da due subunit, recluta e controlla 50IID. 7 .>IIEB costituita da & subunit. Ci #ueste 6 possiedono attivit elicasica c'e attraverso l3idrolisi di A5+ stimola l3apertura del C-A del promotore "a di!!eren a dei procarioti%. >ueste subunit sono le I+A e I+C, elicasi coinvolte anc'e nel MM<. Ena subunit possiede invece attivit c'inasica* !os!orila i siti di !os!orila ione di ,5C della pol II consentendo a #uesta di evadere dal promotore lasciandosi indietro tutti i !attori di trascri ione e procedendo nella !ase di allungamento. =l dominio ,7terminale ,5C contiene 56 ripeti ioni della se#uen a eptapeptidica 3;r0Ser01ro03,r0Ser01ro0Ser. (erina, tirosina e treonina sono siti di !os!orila ione. -el complesso di pre7ini io la coda non ? !os!orilata. Anc'e i passaggi successivi #uali la matura ione dell3<-A sono regolati dallo stato di !os!orila ione di ,5C. +rima della !os!orila ione. +rima della !os!orila ione e della conseguente evasione avviene anc'e #ui un ini io abortivo. *.0* Com!le""o di inizio *.0+ Le#ame .B 8DNA Kedi risposta /.16 *.0/ Com!le""o atti-atore8mediatore +er la replica ione in vivo ? necessaria la presen a di complesso mediatore, proteine trascrizionali regolatrici e complesso modellatore "per modi!ica ione nucleosomi%. =l complesso mediatore interviene nel contatto tra le proteine trascri ionali regolatrici, dette attivatori, e il complesso di pre7ini io. =l complesso mediatore ? costituito da 61 subunit c'e si associano alla coda ,5C* deve poter riconoscere le varie proteine attivatrici ed il complesso trascri ionale. V anc'e in grado di !avorire l3ini io e l3allungamento tramite regola ione della ,5C c'inasi di 50IID. 2li attivatori sono molteplici ed interagiscono con diverse subunit del mediatore. (i legano ad en'ancer appropriati da una parte, mentre dall3altra si legano al mediatore. >uesto posi iona sul gene gli altri !attori del complesso di pre7ini io. <eclutano inoltre il complesso modellatore. =l complesso modellatore ? responsabile del rimodellamento della cromatina ? pu8 possedere attivit acetiltrans!erasica, come le HA3 "istone acetiltrans!erasi%, oppure di rimodellamento dei nucleosomi, come S<I=S&> A310dipendente "(Qitc'T(ucrose -on 0ermentable, destabili a intera ioni istoni7C-A in modo A5+7dipendente%.

.3aggiunta di un gruppo acetilico !avorisce il legame del complesso trascri ionale creando speci!ici siti di legame per proteine c'e possiedono il bromodominio "50IIC ne possiede uno%. *.10 Se<uenze en'ancer (ono se#uen e regolatrici ampli!icatrici, ossia attivano il gene in un determinato momento e in una data cellula. En'ancer di!!erenti legano di!!erenti attivatori* tuttavia integrando i segnali dei vari regolatori ed interagendo poi con il mediatore essi controllano lo stesso gene. +ossono essere posi ionati anc'e molto distanti dal gene "sia a valle c'e a monte% e #uindi per poter attivare il gene deve !ormarsi una struttura a laccio "ad ansa% nel C-A, il #uale si piega per e!!etto delle intera ioni stesse !ra attivatori, complesso mediatore e macc'inario replicativo. Kiene #uindi a !ormarsi il complesso dell3enanc,eosoma c'e presenta le proteine arc'itetturali DM2I, c'e tengono insieme le altre proteine del complesso, tra le #uali troviamo proteine c'e !anno parte della via di trasdu ione del segnale e #uindi implicate nelle modi!ica ioni a livello della trascri ione. *.11 Re#ioni di controllo RNA !ol I .3<-A pol I ? correlata alla polimerasi II tuttavia la trascri ione ini ia da promotori distinti. .e due polimerasi condividono comun#ue la presen a di 5A+. V necessaria per l3espressione di un solo gene il #uale ? il precursore degli r<-A, ad ecce ione di 5(. (ono presenti molte copie di #uesto gene, e i suoi elevati livelli di espressione comportano la presen a di #uella parte del nucleo c'iamata nucleolo. =n particolare #uesti geni si trovano sui bracci p dei cromosomi acrocentrici 1:, 1@, 15, 61, 66. Ci conseguen e la regione del nucleolo presenta tali cromosomi !usi e sovraespressi a cui sono associati sno<-+ e proteine ribosomiali* il tutto ? !un ionale all3assemblaggio dei ribosomi. =l promotore ? costituito da: 7 core o elemento base, a cavallo di F1 7 E,< "upstream control element, regione di controllo a monte%, 1117151 pb a monte. .a sua met a valle costituisce il sito A, #uella a monte il sito A. Al primo si lega (.1, !ormato da 5A0 e : 5A0. (i lega solo in presen a di uno speci!ico !attore di trascri ione, EA0, c'e si lega al sito A. EA0 recluta, in!atti, (.1 e la polimerasi I. *.1$ Re#ioni di controllo RNA !ol III +resenta promotori di!!erenti rispetto alla pol I, mentre 5A+ ? universale. V coinvolta nell3espressione del gene per l3r<-A 5( e per t<-A, sn<-A e sno<-A. = suoi promotori esistono in !orme di!!erenti ma tutte sono posi ionate a valle di F1. 7 >uelli dei geni per i t<-A presentano le regioni AoM A e AoM A 7 >uelli dei geni per r<-A 5( presentano le regioni AoM A e AoM , =n alcuni casi presente anc'e 5A5A boM. .a pol === necessita dei !attori 50IIIA e 50III, per i t<-A, a #uesti si aggiunge per la trascri ione del gene per l3r<-A 5( anc'e 50IIIA "oltre a 5A+%. =l promotore per il gene dei t<-A per esempio presenta 50III, c'e si lega al promotore "AoM A e AoM A%, #uesto recluta 50IIIA a monte del F1. 50===A contiene 5A+ e recluta la pol III sul F1. A #uesto punto la pol III deve scal are 50III, c'e si trova a valle. *.1% Allun#amento e terminazione

Copo l3evasione dal promotore avviene uno scambio tra i !attori d3ini io e #uelli necessari all3allungamento e alla matura ione dell3<-A. >uesti vengono reclutati dalla ,5C nella !orma !os!orilata "presso (er in posi ione 6, 5 e / delle ripeti ioni%. =l ,5C si trova proprio adiacente al canale d3uscita dell3<-A. 5ra #uesti !attori di allungamento troviamo ad esempio +75E0b, una c'inasi c'e gli attivatori reclutano sulla pol == ed una volta legata !os!orila la (er in posi ione 6 delle ripeti ioni di ,5C ed altri !attori di allungamento !ra cui D(+55, il #uale recluta il macc'inario del capping. En altro !attore di allungamento ? 50II( "simile ai !attori 2re batterici%* esso svolge di!!erenti !un ioni: 7 limita il tempo di !ermata della polimerasi sulle se#uen e c'e tenderebbero a rallentarla "la polimerasi in!atti non trascrive tutte le se#uen e alla stessa velocit% 7 contribuisce alla corre ione da parte delle polimerasi "editing piro!os!olitico della pol% 7 stimola un3attivit ribonucleasica intrinseca non !acente parte del sito attivo di pol ==, la #uale possiede una limitata attivit degradativa locale dell3<-A simile all3editing idrolitico batterico stimolato dai !attori 2re. Lltre a #uesti !attori di allungamento vengono caricati anc'e i componenti di matura ione dell3<-A. +er matura ione dell3<-A s3intende: 7 aggiunta di un ,A+ al 53 7 splicing 7 poliadenila ione all3estremit :3 "coda poli7A% Molte proteine coinvolte nell3allungamento reclutano le proteine necessarie per la matura ione "ad esempio #uelle necessarie per il capping%, al !ine di assicurare una giusta coordina ione delle due attivit. =l capping prevede l3aggiunta di una 2 modi!icata al 53 dell3<-A. >uesta 2 viene metilata e aggiunta al 53 con un insolito legame 53753 c'e coinvolge tre gruppi !os!ato. >uesto processo avviene nel momento in cui l3<-A possiede una lung'e a di circa 617@1 nucleotidi "transi ione tra !ase d3ini io e di allungamento%. Copo il capping, la (er in 5 viene de!os!orilata e la seguente !os!orila ione di (er in 6 recluta il macc'inario di splicing. 5ale reclutamento avviene ancora a carico del ,5C. >uando al pol == raggiunge la !ine di un gene incontra delle speci!ic'e se#uen e "se#. consenso AAEAAA% responsabili della termina ione della trascri ione e dell3attiva ione delle proteine per l3aggiunta della coda poli7A. >uesti siti di taglio provocano appunto il taglio dell3m<-A, la poliadenila ione al :3 e la termina ione della trascri ione. = segnali di poliadenila ione "siti di taglio% provocano a seguito della loro trascri ione il tras!erimento di due !attori dalla coda di pol == all3<-A* tali !attori sono il ,+(0 "!attore di clivaggio e poliadenila ione speci!ico% e ,st0 "!attore stimolatore del clivaggio%. Ena volta tras!eriti reclutano le proteine c'e, di !atto, portano al taglio e alla poliadenila ione. =l taglio, ad opera di una endonucleasi, avviene a circa 117:1 nucleotidi a valle delle se#uen e di taglio* viene a !ormarsi un :3 c'e viene poliadenili ato ad opera di una particolare <-A polimerasi, la poli7A polimerasi "+A+%. >uesta aggiunge circa 611 A al :3 dell3<-A utili ando come !onte di adenina l3A5+ e sen a l3utili o di uno stampo. Ci !atto per8 la pol == non si !erma dopo il taglio e l3adenila ione dell3<-A bens$ scorre sul C-A producendo un secondo trascritto lungo anc'e 611 pb e poi si dissocia. =l secondo <-A viene degradato. .a pol == !orse si dissocia a causa dell3assen a del cap 53 su #uesto secondo <-A, il c'e segnala all3<-A pol di !ermarsi.

Lppure il tras!erimento degli en imi coinvolti nella poliadenila ione dalla coda all3<-A provoca un cambiamento con!orma ionale nella pol == c'e ne riduce l3attivit en imatica portandola alla dissocia ione. .3aggiunta del cap 53 e della coda poli7A in :3 'a il !ine di proteggere il trascritto ed inoltre essendo una situa ione tipica solo dell3m<-A permette il riconoscimento di #uest3ultimo tra gli altri <-A. =l riconoscimento ? particolarmente nella trasloca ione nel citosol del trascritto* la presen a di cap 53 e coda di poli7A segnala l3avvenuta matura ione. -.A. .3<-A pol I ad esempio non possiede la coda con il ,5C, di conseguen a i suoi trascritti "r<-A% mancano di cap e di coda. *.1& >attori di !oliadenilazione e di ta#lio Kedi risposta /.1: *.1( Rimodellamento della cromatina Kedi !orma ione del complesso modellatore. 2li istoni sono proteine basic'e e #uindi se le loro code vengono acetilate si caricano di carica negativa* poic'? anc'e il C-A possiede carica negativa la repulsione stacca #ueste code dal C-A e cos$ la cromatina "!ibra :1 nm% respira. *.1) Ini7itori della "inte"i di DNA 5ra i piB comuni troviamo gli antibiotici actinomicina, acridina e ri!ampicina* l37amantina, prodotta dal !ungo velenoso Amanta +'alloides blocca l3<-A pol == e ===. +. Maturazione dell=RNA +.01 ?ari ti!i di RNA Esistono diversi tipi di <-A. .e classi principali sono: m<-A, <-A codi!icante trascritto da geni c'e codi!icano per proteine, t<-A, <-A non codi!icante ma coinvolto nei processi di tradu ione da m<-A a proteine,il suo ruolo speci!ico ? #uello di accoppiare ad ogni tripletta di m<-A l3aminoacido corrispondente, gli r<-A, <-A c'e insieme ad un complesso proteico vanno a costituire le due subunit maggiori e minori dei ribosomi, macc'inario sul #uale avviene la tradu ione. Esistono poi classi minori di <-A come gli sn<-A "small nuclear <-A%, coinvolti ad esempio nello splicing dell3m<-A, gli sno<-A "piccoli <-A nucleolari%, dei #uali !anno parte gli <-A guida c'e dirigono il taglio dell3<-A precursore degli r<-A. 5roviamo inoltre gli si<-A, i mi<-A, i tnc<-A, e gli 'n<-A "<-A coinvolti nella regola ione genica%. =n particolare gli si<-A derivano in genere da <-A c'e entrano dall3esterno della cellula oppure sono creati da trasposoni da virus, in ogni caso, essendo estranei alla cellula, devono essere eliminati in #uanto minacciano la stabilit del genoma. = mi<-A sono, invece, codi!icati da geni c'e si trovano nel genoma. 5utti gli <-A sono a singolo !ilamento, tuttavia regioni intramolecolari complementari possono appaiarsi e dare luogo a strutture ter iarie. Kedi anc'e risposta 6.11.

+.0$ Contenuto RNA nella cellula Cell3<-A totale presente nella cellula solo il 67@P ? codi!icante "m<-A%, il restante &5P ? non7 codi!icante. Ci #uesto &5P una piccolissima parte ? costituita da sn<-A e sno<-A ed altre <-A di piccole dimensioni "nei batteri anc'e tm<-A ed sc<-A%, l381P ? costituito da r<-A, il 11761P da t<-A. 2li r<-A sono #uindi in assoluto la componente piB signi!icativa del contenuto di <-A nella cellula, di conseguen a la maggior parte di #uesto svolge un ruolo piB catalitico e strutturale c'e codi!icante. +.0% RNA !recur"ore e ti!i di maturazione .e modi!ica ioni post7trascri ionali non sono limitate agli m<-A. 2li r<-A delle cellule batteric'e ed eucariotic'e vengono prodotti a partire da precursori di maggiori dimensioni c'iamati <-A pre7ribosomiali o pre7r<-A. -ei batteri gli r<-A 16(, 6:( e 5( ed alcuni t<-A derivano da un unico precursore, l3<-A :1(, dal #uale verr rimosso <-A da entrambe le estremit e tra gli r<-A. = geni per gli r<-A sono presenti in molte copie, / per E. ,oli, 611 per l3uomo, ed in #uest3ultimo sono distribuiti su 5 cromosomi. >uesti sono il 1:, 1@, 15, 61 e 66, sono acrocentrici e possiedono e geni sul braccio p. =n E. ,oli tutti i / geni presentano regioni codi!icanti per gli r<-A praticamente uguali ma di!!eriscono per il materiale genetico interposto: tra l3r<-A 16( e 6:( si trovano 6 o : regioni codi!icanti per t<-A* pre7<-A di!!erenti presentano regioni per t<-A di!!erenti. -egli eucarioti l3<-A pre7ribosomiale ? il @5( e la sua modi!ica ione per dare origine agli r<-A 18(, 68( e 5.8( avviene nel nucleolo. .3<-A 5( invece viene prodotto da un trascritto distinto dall3<-A pol =* evidentemente #uesto si ? aggiunto nel corso dell3evolu ione. .a matura ione de!initiva avviene in #uesto modo: 7 nei batteri: <-A :1( viene metilato "circa 111 metila ioni presso le basi di nucleotidi speci!ici% e sottoposto a circa 111 isomeri a ioni di E a pseudouridina* #ueste modi!ica ioni aiuterebbero il ripiegamento e l3assemblaggio degli r<-A !inali. .a posi ione speci!ica sulla #uale devono avvenire metila ione e scissione viene speci!icata da <-A guida, membri di una classi di <-A c'iamata piccoli <-A nucleolari "sno<-A%. .a scissione in punti precisi del :1( avviene ad opera degli en imi <-Aasi ===, <-Aasi+ "ribo ima c'e taglia a livello del t<-A compreso tra il 16( ed il 6:(% e <-AasiE "taglia a livello del 5( procariote%. 2li intermedi c'e ne derivano vengono tras!ormati nei prodotti !inali da esonucleasi c'e rimuovono nucleotidi dalle estremit LD7:3. 7 negli eucarioti: <-A @5( subisce circa 111 metila ioni all3LD763 degli ucc'eri dei suoi 16111 nucleotidi* tali metila ioni rimangono nei prodotti !inali per !avorire i tagli en imatici. +er #uanto riguarda i restanti t<-A ogni cellula possiede circa @1751 t<-A di!!erenti* negli eucarioti vi ? inoltre un numero piB elevato di geni c'e codi!icano per i t<-A. >uest3ultimi derivano da precursori piB lung'i codi!icati da geni organi ati in cluster e devono subire una progressiva ridu ione en imatica alle estremit. =n un unico trascritto primario possono esserci piB t<-A e devono in tal caso essere separati ad opera di una endonucleasi detta <-Aasi+ "ubi#uitaria% c'e rimuove <-A dall3estremit 53. >uesto ? un ribo ima costituito da proteine e da un <-A di :// nucleotidi c'e possiede attivit catalitica. Kengono cos$ prodotte estremit :3 degradate poi da esonucleasi* tra #ueste la <-AasiC c'e rimuove nucleotidi dal :3 !ino ad incontrare una se#uen a ,,A "#uesto avviene #uasi sempre%. -egli eucarioti possono introni c'e devono essere rimossi mediante splicing c'e coinvolge un endonucleasi ed una t<-A7ligasi in un meccanismo di taglia e cuci. = precursori dei t<-A devono subire ulteriori modi!ica ioni post7tradu ionali.

=n alcuni precursori ? assente la tripletta ,,A all3estremit :3* #uesta ? necessaria e caratteristica per ogni t<-A essendo il sito cui si lega l3aminoacido speci!ico. Ceve essere #uindi aggiunto per a ione dell3en ima t<-A nucleotidil trans!erasi. =n!ine alcune basi possono subire modi!ica ioni #uali deamina ione di A "per dare =% e metila ioni. = t<-A presentano in!atti basi modi!icate: 7 +seudouridina =l ribosio si lega al ,5 an ic'? a -1 V #uindi un legame 17glicosidico. 7 Ciidrouridina <idu ione del doppio legame tra ,5 e ,6. 5roviamo inoltre l3ipoMantina e la metilguanina. >ueste basi modi!icate dovrebbero migliorare la !un ione dei t<-A.

+.0& Maturazione nei 7atteri Kedi risposta 8.1: +.0( RNA tran"fer = t<-A agiscono da adattatori tra i codoni dell3m<-A e gli aminoacidi c'e essi individuano durante la tradu ione. (ono in numero di @1751, molti di piB rispetto al numero di aminoacidi ma in!eriori al numero di codoni "6@%. (ono costituiti dai /5 ai &5 nucleotidi* posseggono un3estremit :3 c'e termina con la tripletta 537,,A7:3 e rappresenta il sito c'e si associa ad uno speci!ico aminoacido. ,ome struttura i t<-A mostrano una tipica alternan a di regioni di autocomplementariet, le #uali si appaiano !ormando regioni a doppia elica alternate ad altre a singola elica: viene #uindi a !ormarsi una struttura secondaria a #uadri!oglio. 5 sono le strutture peculiari della struttura secondaria del t<-A: 7 stelo accettore, cui si lega l3aminoacido "estremit :3% 7 ansa %, c'e contiene diidrouridine "C% 7 ansa ?9, c'e contiene pseudouridina 7 ansa variabile, costituita da :761 basi 7 ansa dell-anticodone, contiene lganticodone, elemento decodi!icante costituito da : nucleotidi e delimitata da una base purinica al :3 e da un E al 53. (i appaia al codone dell3m<-A. >uesta struttura secondaria possiede ulteriori regioni di autocomplementariet, in modo tale c'e nello spa io si viene a creare una struttura ter iaria ad ..

Anc'e in #uesta struttura ter iaria l3estremit :3 dello stelo accettore "c'e porta l3aminoacido% si trova al capo opposto della . rispetto all3anticodone "stelo accettore sul braccio corto della ., anticodone sul braccio lungo%. =n #uesta struttura tridimensionale ansa hE e stelo accettore !ormano un3elica allargata, cos$ come vanno a !ormare una struttura analoga lo stelo dell3anticodone e l3ansa C. >ueste due elic'e si posi ionano perpendicolarmente l3una all3altra. .a struttura ter iaria viene stabili ata da legami D, intera ioni tra basi e impalcatura, impilamento delle basi. +.0) RNA ri7o"omiale +er matura ione vedi risposta 8.1:. .3r<-A ? la componente ad <-A dei ribosomi, il macc'inario c'e dirige la sintesi proteica. -ei procarioti ne esistono di : tipi: 5(, 16( e 6:(. -egli eucarioti ne esistono @ tipi: 5.8(, 5(, 18( e 68(. ( sta per (vedberg, l3unit di misura della sedimenta ione: piB alto ? il numero maggiore ? la velocit di sedimenta ione. >uesto r<-A vanno a costituire lo sc'eletro su cui si associano le proteine* portano #uindi principalmente un3in!orma ione strutturale, tuttavia ultime scoperte dimostrano una rilevan a anc'e catalitica. -ei ribosomi procariotici, in!atti, il sito + "peptidil trans!erasico% ? composto interamente da r<-A 6:(, inoltre l3r<-A 16( svolge un ruolo !ondamentale essendo contattato sia dagli anticodoni dei t<-A sia dai codoni dell3m<-A. Elteriori dettagli nella tradu ione "capitolo 11%. +.0* Ri7o"omi !rocariotici ed eucariotici (ia i ribosomi procariotici c'e eucariotici sono composti da due subunit, una maggiore e l3altra minore. >ueste vengono assemblate solo al momento della sintesi proteica nel seguente ordine: la subunit minore si lega all3m<-A "del #uale porta il sito di legame% ed in seguito giunge la subunit maggiore c'e porta i tre siti di legame A, + ed E per i t<-A, siti necessari per ogni ciclo di tradu ione e trattati al 11.1/. .a continua associa ione e dissocia ione delle subunit ? detta ciclo ribosomiale. ,iascuna subunit ? composta da una speci!ica composi ione in r<-A e proteine di!!erenti tra procarioti ed eucarioti.

2li r<-A vanno a costituire circa la met della massa totale dei ribosomi. .a sedimenta ione non ? una misura della massa in #uanto dipende anc'e dalla !orma* di conseguen a le velocit di sedimenta ione del ribosoma non ? la somma delle sedimenta ioni delle due subunit, n? ( di #ueste ? la somma delle ( dei vari componenti. =l ribosoma ? un ribo ima, ossia ? composto da proteine ed r<-A con ruolo catalitico. .a !orma ione del legame peptidico ? catali ata, in!atti, dall3r<-A 6:( della subunit maggiore "vedi 11.1/%, ed anc'e 16( svolge come gi detto un ruolo catalitico. 2li r<-A 5( e 6:( !ormano il nucleo della subunit maggiore dei procarioti. -el sito attivo di 18 f in cui avviene la !orma ione del legame peptidico non si trova nessuna proteina, solamente r<-A 6:(. = ribosomi mitocondriali son piB piccoli ma simili. En3ulteriore distin ione ? da !are tra i ribosomi liberi e #uelli associati al <E<. +.0+ roduzione di ri7o"omi nel nucleo -egli eucarioti la trascri ione e matura ione degli r<-A e la loro associa ione con le appropriate proteine per !ormare le due subunit dei ribosomi avvengono in una struttura ben caratteri ata del nucleo, il nucleolo. >uesto non ? un compartimento, in #uanto non ? circondato da una membrana* ? un aggregato macromolecolare c'e comprende i geni stessi per gli r<-A "c'r 1:, 1@, 15, 61, 66%, pre7r<-A, sno<-+ "proteine F sno<-A ; <-A guida% e proteine ribosomiali. A livello del nucleolo si trova una cromatina ipersensibile con poc'i nucleosomi, in accordo con gli elevati livelli di espressione. .3espressione coinvolge geni posti sulla punta di speci!ici cromosomi* dopo la mitosi "#uando il nucleolo scompare% le punte di #uesti 11 cromosomi "5 coppie% si !ondono ri!ormando il nucleolo. =l processo ? mediato da <-A pol I.

Maggiori sono le dimensioni del nucleolo, maggiore ? il numero di ribosomi prodotti e maggiore ? l3attivit della cellula. -el nucleolo sono prodotti anc'e altri <-A "tutti non trascri ionali% ed assemblati in complessi <-A7proteine. Kengono costituite sn<-+ "sn<-A F proteine%, coinvolte nello splicing, le telomerasi "ribo ima% ed avvengono inoltre modi!ica ione a livello dei t<-A. .e subunit dei ribosomi devono #uindi essere trasportate al citosol* il percorso inverso lo percorrono le proteine ribosomiali c'e vengono importate dal citosol. +.0/ Maturazione RNA ne#li eucarioti 2li m<-A eucariotici sono monocistronici, ossia codi!icano per una sola proteina, a di!!eren a di #uelli procariotici c'e sono policistronici. +er cistrone s3intende, in!atti, il gene inteso come unit !un ionale c'e codi!ica la se#uen a di aminoacidi per un polipeptide. A di!!eren e di #uello batterico la matura ione dell3m<-A eucariotico prevede : tappe: 7 aggiunta di un cap 53 "rea ione di capping% 7 splicing 7 aggiunta di coda di poli7A "poliadenila ione (ono processi c'e avvengono #uasi contemporaneamente e strettamente associati alla trascri ione stessa. .o scopo del cap e della coda di poli7A, come gi detto, ? il riconoscimento dell3m<-A stesso e la sua prote ione, lo scopo dello splicing ? la rimo ione degli introni. +.10 Ca!!in# V il primo evento di matura ione dell3m<-A. Avviene appena l3<-A pol II 'a prodotto un m<-A di 617@1 nucleotidi e consiste nell3aggiunta di una 2 metilata al 53 del trascritto mediante la !orma ione di un legame insolito 53753 c'e coinvolge tre gruppi !os!ato. ,ome gi detto, in!atti, il 53 dell3<-A, a di!!eren e del C-A, termina sempre con un tri!os!ato. -el processo sono coinvolti : en imi: 7 !os!atasi: rimuove un gruppo !os!ato dal tri!os!ato al 53 7 guanil trans!erasi: aggiunge un 2M+ in legame 53753 "an ic'? :3753%. Ci !atto, #uindi, nell3m<-A troviamo un3estremit :3 della coda di poli7A e un3estremit :3 del 25+ 7 metil trans!erasi: aggiunge un metile a 2 in -/. =l donatore del gruppo metile ? la SAMe. +u8 essere tras!erito in posi ione 63 del primo o del secondo ribosio* #uindi : sono i siti di metila ione: 1. capping di tipo :, metila ione della guanina 6. capping di tipo , metila ione anc'e del 63 del ribosio di 2 :. capping di tipo ", metila ione anc'e del 63 del ribosio del penultimo nucleotide. =l capping di tipo 1 ? presente in tutti i trascritti eucariotici, #uello di tipo 1 in #uelli degli eucarioti multicellulari, #uello di tipo 6 pu8 esserci o meno "solitamente negli eucarioti superiori%. Copo il capping, la de!os!orila ione della (er in 5 nelle ripeti ioni della coda ,5C della pol II provoca la dissocia ione del macc'inario per il capping. .a !os!orila ione di un3altra (er in 6 recluta e carica il macc'inario di splicing. =l cap 53, oltre a proteggere l3m<-A in matura ione, recluta anc'e i ribosomi una volta c'e l3m<-A ? giunto nel citosol. =l cap 53, la coda di poli7A e gli stessi siti di splicing vengono riconosciuti dal complesso dei pori nucleari* #uesto assicura c'e solo un m<-A maturo con le 6 estremit caratteristic'e e c'e 'a subito splicing possa passare al citosol per essere tradotto.

-.A. =l cap 53 ? presente in tutti i trascritti della polimerasi II, #uindi anc'e in alcuni sn<-A. +.11 oliadenilazione Kedi anc'e risposta /.1:. = trascritti dei geni istonici sono privi della coda poli. >uesto suggerisce c'e nel corso dell3evolu ione #uesto meccanismo sia comparso piB tardivamente. A #ueste code di poli7A si associano proteine speci!ic'e "+A+, poli7A binding protein% c'e, oltre a stabili are l3<-A, vengono riconosciute dalle proteine dei pori nucleari. .e !un ioni della coda di poli7A sono: 7 terminazione della trascrizione 7 inizio della traduzione 7 stabilizzazione dell-m2&A .a testa e la coda dell3m<-A si associano circolari ando cos$ l3m<-A* a #uesta struttura si associano tanti ribosomi "polisoma% Alcuni virus agiscono proprio a livello di #ueste strutture. Ad esempio il picornavirus "virus del ra!!reddore% degrada il cap binding compleM, di conseguen a l3m<-A torna nella !orma non circolare. =l rotavirus "patologie gastrointestinali nei bambini% produce la proteina -(+: c'e va a sostituire le poli7A binding protein. >uesta proteina per8 !a circolari are i suoi m<-A. 2li m<-A dei virus si distinguono dal momento c'e posseggono siti interni per i ribosomi "<-A internal ribosome entr) site in 53%, in #uesto modo non ? necessario il cap 53. +.1$ Gene intronico 2li introni sono se#uen e non codi!icanti disperse all3interno di se#uen e codi!icanti, esoni, all3interno di un gene. .a presen a de #ueste se#uen e e della rea ione di splicing per rimuoverli dal trascritto primario di m<-A venne scoperto gra ie a studi sugli adenovirus. >uesto virus utili a, in!atti, un meccanismo di splicing alternativo per generare m<-A maturi diverso a partire da un unico precursore di m<-A. +rendendo un m<-A eucariotico e !acendolo ibridi are col suo C-A codi!icante "!ilamento stampo% posso osservare la !orma ione di piB anse nel !ilamento di C-A, come se #ueste anse contenessero regioni di C-A c'e non sono presenti nell3m<-A maturo. >ueste anse sono, in!atti, gli introni c'e sono stati rimossi nell3m<-A maturo. (i possono anc'e individuare le se#uen e retrotrascrivendo l3m<-A e con!rontando la se#uen a con il C-A originale. 2li introni possono avere dimensioni molto variabili, da 11 a 111111 nucleotidi. Ad esempio i geni della globina possiedono tutti la stessa struttura, #uello c'e cambia ? la lung'e a degli introni. =n media, per8, gli introni sono se#uen e di 1117611 pb interposte !ra introni di 15111761111 pb, con dimensioni sempre piB variabili nel corso dell3evolu ione della specie. Ci tutto il genoma umano, gli esoni costituiscono circa l31.5P. .a presen a di introni ric'iede molta energia in #uanto vengono sinteti ati !rammenti c'e devono poi essere eliminati* tuttavia la presen a di introni rappresenta un guadagno evolutivo, piB i geni sono !rammentati, piB la specie ? evoluta "solitamente nN introni ; nN esoni 71%. -.A.

2li istoni vengono codi!icati da @ geni ripetuti 111 volte c'e non possiedono introni "e i loro m<-A non possiedono la coda di poli7A%. >uindi i geni primitivi codi!icavano ognuno per piccole proteine c'e venivano assemblate. Ca un punto di vista evolutivo ? risultato piB vantaggioso usare tutti #uesti geni separati da se#uen e non codi!icanti, cos$ c'e i primi sono diventati gli esoni e i secondi gli introni. .e piccole proteine diventano cos$ domini !un ionali di un3unica proteina.

+.1% .i!i di introni Esistono di!!erenti tipi di introni c'e possono essere suddivisi in gruppi: 7 =ntroni del gruppo I: introni di proto oi e organelli #uali mitocondri e cloroplasti "in pre7r<-A e pre7t<-A%. Essi subiscono un meccanismo diverso da #uello eucariotico comune. (i tratta di 6 rea ioni di transesteri!ica ione, ossia di spostamento di un legame estere. (ono introni sel!7splicing "come #uelli del gruppo II%, ossia l3introne stesso assume un ripiegamento speci!ico e catali a la c'imica del suo stesso rilascio. -on sono dei veri e propri en imi in #uanto mediano solo un ciclo di matura ione dell3<-A. 2li introni del gruppo I utili ano una 2 libera "nucleotide o nucleoside% legato all3<-A c'e presenta un :371D libero c'e agisce da nucleo!ilo attaccando il sito di splicing in 53. A #uesto punto si libera l3estremit :37LD dell3esone c'e agisce a sua volta da nucleo!ilo attaccando il sito di splicing :3, con conseguente unione dei sue esoni e rilascio dell3introne in !orma lineare. >uesti introni sono costituiti da circa @1171111 nucleotidi, dimensioni piB ridotte rispetto agli esoni del secondo gruppo. +ossiedono una tasca in grado di legare nucleotidi o nucleosidi purc'? non sia con il ribosio. A di!!eren a degli introni eucariotici la loro se#uen a ? importante in #uanto deve ripiegarsi in una struttura precisa per poter catali are lo splicing. >uesti introni presentano #uindi una struttura comune caratteri ata da & gruppi di se#uen a appaiate. 7 =ntroni del gruppo II: introni presenti in organelli "di !ung'i e piante% e in alcuni procarioti. (ono anc'3essi introni sel!7splicing ma il loro meccanismo ? del tutto simile a #uello catali ato dallo spliceosoma eucariotico* #uesto suggerisce un3origine evolutiva comune. .a struttura catalitica di #uesti introni c'e esegue la prima rea ione di transesteri!ica ione ? molto simile sia negli introni del gruppo == c'e nel complesso pre7m<-ATsn<-+. .3introne utili a un residuo interno di A posto nel punto di rami!ica ione per attaccare con il 637LD di A il legame !os!odiesterico al con!ine tra la sua estremit 53 e #uella :3 dell3esone, cio? al sito di splicing 53. (i 'a cos$ la !orma ione di un cappio intronico ".A<=A5% a cui segue una seconda rea ione in cui il :37LD dell3esone attacca il sito di splicing :3 unendo cos$ i due esoni e rilasciando l3introne sotto!orma di cappio. =n vivo vi ? anc'e la presen a di proteine dette maturasi c'e masc'erano le caric'e negative dell3impalcatura a!!inc'? le se#uen e possano interagire nella struttura tridimensionale catalitica.

7 =ntroni 2E7A2 o AE7A,: sono gli introni eucariotici presenti nei pre7m<-A nucleari. Essi ric'iedono un macc'inario riboproteico nel complesso de!inito spliceosoma, il #uale catali a una rea ione uguale a #uella c'e avviene a livello degli introni del secondo gruppo* #uesto indica un3evolu ione dal == gruppo. 7 =ntroni del gruppo III: <-A degli organelli. (imili a #uelli del secondo gruppo ma di dimensioni minori e con struttura caratteristica. 7 =ntroni dei pre7t<-A: nei precursori dei t<-A possono essere presenti degli introni* ? #uindi necessario un meccanismo di splicing. >uesto meccanismo ? insolito: una sorta di processo taglia e cuci c'e utili a un3endonucleasi c'e spe a l3introne ed una t<-A ligasi c'e unisce gli esoni. -ella struttura tridimensionale a . le giun ioni esoni7introni sono vicine. 7 5Qintroni: <-A degli organelli. (i tratta di introni del gruppo == e === inseriti l3uno nell3altro. -.A. -egli arc'eabatteri gli introni vengono rimossi da ribonucleasi speci!ic'e. +.1& Rimozione de#li introni +.1( Reazione di "!licin# 2li introni presenti nei lung'i pre7m<-A devono essere rimossi mediante il processo di splicing. >uesto ? una rea ione di transesteri!ica ione, in cui alcuni legami !os!odiesterici vengono rimossi ed altri vengono !ormati in ugual numero. Essendo nel suo complesso uno scambio di legami non ? necessario !ornire ulteriore energia per la rea ione in s?. Abbiamo gi trattato lo splicing degli introni sel! dei gruppi primo e secondo. 2li introni devono presentare delle se#uen e conservate ai con!ini con gli esoni* #ueste devono essere riconosciute dal macc'inario di splicing. =l limite all3estremit 53 dell3introne ? marcato da una se#uen a detta sito di splicing 53 "2ETAE% e #uella al :3 ? detta sito di splicing :3 "A2TA,%. V necessaria anc'e una ter a se#uen a, il punto di rami!ica ione, c'e si trova internamente all3introne ed ? costituita principalmente da un segmento di polipirimidine vicino all3estremit :. 5utte #ueste se#uen e sono altamente conservate* le piB conservate sono le se#uen e 2E al sito di splicing 53, A2 al sito di splicing :3 e la A al punto di rami!ica ione "2E e A2 sono presenti al 111P%. 5ipi piB rari di introni presentano AE "53% ed A, ":3%. >ueste sono le tipic'e se#uen e consenso dello splicing. "+.1) Se<uenze con"en"o% .a prima rea ione di splicing ? un attacco nucleo!ilo da parte del 637LD di A "punto di rami!ica ione% al gruppo !os!ato della 2 conservata al sito di splicing 53 "meccanismo (-6 con intermedio !os!ato prevalente%. (i rompe il legame !os!odiesterico alla giun ione introne7esone e l3estremit 53 libera dell3introne viene unita ad A. A si trova #uindi legata attraverso il :3 e il suo 53 all3impalcatura ucc'ero7!os!ato e attraverso il suo 63 all3estremit 53 libera del suo introne mediante un ter o legame !os!odiesterico. >uesta rea ione 'a liberato il :37LD dell3esone 53 il #uale attacca il gruppo !os!ato al sito di splicing :3 agendo da nucleo!ilo "seconda rea ione, (-6%. Avviene #uindi l3unione dell3esone 537:3 e la libera ione dell3introne "gruppo uscente% sotto!orma di cappio ".A<=A5%. .a rapida degrada ione dell3introne "c'e ? uno dei due prodotti insieme all3m<-A privato dell3introne% e l3aumento di entropia "in #uanto ottengo due molecola da una sola di parten a% sposta l3e#uilibrio verso la !orma ione dei prodotti.

+.1) Se<uenze con"en"o Kedi risposta 8.15 +.1* Monta##io de#li e"oni =l meccanismo di splicing sopra descritto sembra suggerire l3unione di due esoni successivi. >uesto non ? sempre vero in #uanto uno o piB esoni possono essere saltati nello splicing alternativo. =n altri casi si possono unire due esoni provenienti da due <-A distinti tramite lo splicing in trans. >uesto meccanismo comporta l3unione di un singolo esone, mediante splicing al 53, a molti trascritti diversi di <-A. .3esone al 53, #uindi, rimane sempre lo stesso, ci8 c'e cambia ? l3esone al :3. >uesto avviene soprattutto nei tripanosomi e nei nematodi. +.1+ roteine "nRN +.1/ S!liceo"oma .e proteine sn<-+ sono composte da sn<-A "circa 1117:11 nucleotidi% e da una componente proteica. >ueste sn<-+ !ormano il nucleo dello spliceosoma, il complesso c'e esegue lo splicing del pre7m<-A eucariotico. .o spliceosoma comprende anc'e altre tipologie di proteine di!!erenti alle sn<-+. >uesti sn<-A coinvolti nello splicing sono 5 "E1, E6, E@, E5 e E6% e si appaiano con il pre7m<-A riconoscendone i siti di splicing e il punto di rami!ica ione. +ossiedono anc'e attivit catalitica. Lltre all3intera ione <-A7<-A sono importanti anc'e #uelle <-A7proteine e proteine7proteine. 0ra #ueste importanti intera ioni troviamo l3accoppiamento sn<-A E1 con il sito di splicing in 53, il #uale poi si accoppia anc'e con sn<-A E8, e l3intera ione tra sn<-A E6 e E6 con il punto di rami!ica ione. 0ra le proteine complessate con <-A ricordiamo: E6A0 "!attore ausiliario di E6% c'e riconosce il segmento polipirimidinico e il sito di splicing :3, e !avorisce il legame di AA+ "branc'7point binding protein% al punto di rami!ica ione "spia ato poi da sn<-A E6% =l percorso dello splicing ? il seguente: 1. formazione del complesso E (early) sn<-+ E1 riconosce il sito di splicing 53, E6A0 si lega al segmento pirimidinico e al sito di splicing :3 e recluta AA+ al punto di rami!ica ione $. formazione complesso A sn<-+ si associa, !avorita da E6A0, e spia a AA+ dal punto di rami!ica ione. .3appaiamento m<-A7sn<-A E6 spinge !uori l3A dal punto di rami!ica ione della doppia elica di <-A e #uindi #uesta protrude rendendola disponibile per la prima rea ione (-6. %. formazione complesso B (i aggiunge la struttura sn<-+ E@TE6FE5, in cui E@ e E6 sono appaiate per complementariet <-A7<-A mentre E5 ? legata meno !ortemente mediante intera ione proteina7proteina. A #uesto punto il complesso ? costituito da #uesta tripla, da E6 e da E1, mentre esce E6A0. Kengono avvicinati i tre siti di splicing. =n seguito E1 lascia il complesso con precedente rottura dei suoi appaiamenti con il sito di splicing 53, processo c'e ric'iede energia. E1 viene rimpia ato da sn<-+ E6. &. formazione complesso C, innesco della catalisi E@ lascia il complesso cos$ c'e E6 possa interagire con E6 al punto di rami!ica ione

mediante intera ione <-A7<-A. =l complesso , ? #uindi composto da E6, E5 ed E6, c'e vanno a costituire il sito attivo. >uesto ? costituito principalmente da regioni di E6 ed E6 complementari e unite da intera ioni <-A7<-A. = siti di splicing sono !ra loro in prossimit e pu8 avvenire la prima transesteri!ica ione. .a seconda transesteri!ica ione ? supportata invece da E5 c'e !avorisce l3avvicinamento dei due esoni. =n!ine le sn<-+ rimaste lasciano l3m<-A con l3introne a cappio ".A<=A5% ma vengono poi riciclate #uando #uesto viene degradato. +u8 accadere c'e si veri!ic'ino degli errori nel riconoscimento dei siti di splicing* l3accurate a pu8 essere aumentata in due modi: 7 l3<-A pol == mentre trascrive il gene trasporta molte proteine necessarie alla matura ione dell3<-A. 0ra #ueste alcune sono tras!erite dalla coda ,7terminale della pol == ai siti di splicing 53 appena #uesti vengono trascritti e aspettano di interagire con le proteine c'e si legano al sito di splicing 53 subito successivo. >uesto riduce la possibilit si salto dell3esone. 7 presen a di proteine (r "serin ric'% c'e si legano a se#uen e interne all3introne dette en'ancer di splicing esonico e reclutano E6A0 e sn<-+ E1 "c'e marcano i siti di splicing%. >uesto meccanismo garantisce c'e vengano riconosciuti pre!eren ialmente i siti di splicing piB vicini agli esoni. Esiste uno spliceosoma alternativo per alcuni tipi di introni "anc'e nei mammi!eri%. >uesti introni sono i piB rari AE7A,. .o spliceosoma presenta E11 e E16, simili a E1 e E6 ma in grado di riconoscere i siti di splicing AE e A,. V presente E5, E6 "A57A,% e E@ "A57A,%. +.$0 S!licin# alternati-o Molti geni codi!icano per m<-A c'e possono essere tagliati in modi di!!erenti mediante splicing alternativo dando origine a prodotti proteici di!!erenti a partire dallo stesso m<-A. .o splicing alternativo pu8 essere costitutivo o regolato. -el primo caso ? presente un3ambiguit di se#uen a intronica, ossia sono presenti 6 o piB accoppiamenti alternativi di siti di splicing 53 e :3 c'e vengono scelti a caso dallo spliceosoma. -el secondo caso, invece, vi sono proteine c'e regolano lo splicing. >ueste proteine si legano a dei siti speci!ici c'iamati en'ancer di splicing esonici o intronici o silen iatori di splicing esonici e intronici* i primi sono attivatori, i secondi repressori. Agli en'ancer di splicing esonici si legano le (<, proteine c'e contengono un dominio (<, ricco in (er e Arg, al ,7terminale e interagisce con il macc'inario dello spliceosoma e lo recluta al sito di splicing vicino. Esistono inoltre le proteine ,A+(, simili alle (< e associate al ,5C della <-A pol == in modo tale da connettere lo spliceosoma al complesso do trascri ione "trascri ione e splicing sono simultanei%.

= silen iatori, invece, sono riconosciuti dalle 'n<-+, costituito da 'n<-A "<-A eterogeneo nucleare% e da proteine ad esso associate. (i associano pre!eribilmente agli introni aiutando a distinguerli dagli esoni. (i legano all3<-A ma non possiedono il dominio (< e #uindi non reclutano il macc'inario dello spliceosoma e impediscono l3utili o dei siti di splicing. En esempio di #uesto ? l3'n<-+1, c'e si lega alla regione polipirimidinica e blocca il macc'inario. En altro meccanismo ? l3esclusione di un certo esone dall3m<-A maturo mediante il legame a one !ianc'eggianti l3esone stesso in modo tale da !ormare un cappio c'e viene escluso dallo spliceosoma. .e proteine di!!erenti c'e originano tramite splicing alternativo dallo stesso gene sono dette iso!orme e possono avere !un ioni uguali, simili o distinte.

(i pu8 avere lo splicing alternativo anc'e solo per accendere o spegnere il gene sen a la produ ione di di!!erenti proteine, ma solo di !orme attive o inattive della proteina stessa. >uesto accade se l3esone incorporato dallo splicing contiene uno stop prematuro con conseguente produ ione di una proteina tronca o non !un ionale. (e lo splicing alternativo esclude l3esone, il gene viene espresso e si ottiene una proteina completa e !un ionale. >uesto pu8 anc'e avvenire per il mantenimento di un introne, ad esempio per impedire all3m<-A l3esporta ione dal nucleo e #uindi la sua tradu ione. Alcuni esempi di splicing alternativo sono: 7 sesso in Crosop'ila: splicing alternativo del trascritto del gene double7seM 7 gene della tropomiosina: splicing di!!erenti portano a proteine speci!ic'e per muscolo liscio, sc'eletrico e per sistema nervoso 7 gene degli anticorpi: in base allo splicing si ottiene l3anticorpo secreto oppure ancorato alla membrana. >uest3ultimo possiede un tratto idro!obico in piB. 7 gene per la calcitonina: da un trascritto primario comune per splicing alternativo ottengo calcitonina "ormone% nella tiroide oppure ,2<+ "neuropepetide trascritto solo nelle cellule nervose% nell3ipotalamo. 7 splicing alternativo dell3D=K: presenta promotori classici 5A5A boM e proteine -0-A e (+1. -ev, <ev e 5at "stabili a complesso c'e !os!orila la pol == c'e ? cos$ in grado di trascrivere genoma D=K molto lungo% sono trascritti in m<-A completamente spliced. <ev si accumula e si lega poi nel nucleo alla se#uen a <<E "<ev responsive element% dei trascritti non spliced i #uali codi!icano per gag e pol. +.$1 atolo#ie le#ate ad errori di "!licin# (e avviene una muta ione a livello della giun ione introne7esone il sistema di splicing cerc'er il sito di splicing piB vicino alla muta ione* tuttavia #uesto sito pu8 trovarsi oltre un esone, oppure anc'e al suo interno e la proteina risultante sar alterata e mal !un ionante. .a stessa situa ione si veri!ica se la muta ione crea un nuovo sito di splicing. En esempio a riguardo ? la talassemia : la muta ione di una 2 in A crea A2 in posi ione 111, ossia viene a !ormarsi un nuovo sito di splicing. (i trova #uindi un pe o in piB nell3esone 6. Essendosi venuto a creare un nuovo sito di splicing verr prodotta sia la proteina "catena % sana sia #uella malata. +u8 avvenire anc'e una muta ione piB grave, cio? la transi ione da , a E, c'e porta ad una nuova termina ione "codone di stop%. Kiene prodotta una proteina corta ed ine!!icace.

/. Codice #enetico /.01 Caratteri"tic'e #enerali En codice viene de!inito come un sistema di simboli e segnali c'e trasmettono l3in!orma ione tra una !onte e una destina ione. -el codice genetico la !onte ? la se#uen a nucleotidica e la destina ione ? #uella aminoacidica. Ci conseguen a #uesto codice deve !ornire su!!icienti simboli per esprimere 61 aminoacidi diversi a partire da @ nucleotidi diversi.

=l numero minimo di permuta ione c'e riescono ad esprimere i 61 aminoacidi coinvolge : nucleotidi "codone%: @: ; 6@, il primo numero su!!iciente ma molto in eccesso rispetto al numero di aminoacidi. Ca #uesto e da altri aspetti derivano le : caratteristic'e principali del codice genetico: 7 ? universale 7 ? degenerato "piB t<-A c'e aa% 7 ? ridondante "piB codoni c'e aa% .a rela ione !ra se#uen e di aminoacidi e nucleotidi ? colineare, cio? gruppi successivi di nucleotidi codi!icano per aminoacidi contigui nei peptidi. /.0$ I!ote"i adattatore =l passaggio di in!orma ioni da nucleotidi a aminoacidi comporta la presen a di una molecola adattatrice in grado di appaiare al codone il corretto aminoacido "non c3? complementariet strutturale tra acidi nucleici ed aa%. >uesta molecola ? il t<-A il #uale viene caricato a livello del suo stelo accettore del suo speci!ico aminoacido ad opera dell3en ima aminoacil7t<-A sintetasi. .3insieme dei determinanti c'e consentono a #uesto en ima di riconoscere il t<-A in modo speci!ico e di caricarlo dell3aminoacido corretto ? molto complesso e viene de!inito secondo codice genetico. 5uttavia una volta c'e avviene il caricamento dell3aminoacido non vi sono ulteriori controlli, di conseguen a se ? avvenuto un errore a #uesto livello #uesto viene mantenuto nella se#uen a aminoacidica. .a mancan a di ulteriori controlli ? dovuta all3incorpora ione nel corso del processo di caricamento di un3Ala al posto di una ,)s. Al capo opposto dello stelo accettore si trova l3anticodone in grado di appaiarsi con polarit opposta "antiparallelo% al codice dell3m<-A a lui complementare. ,i sono piB t<-A rispetto ai 61 aminoacidi, #uesto ? responsabile della degenera ione del codice. /.0% Decifrazione del codice .3esperimento c'iave c'e 'a permesso la deci!ra ione del codice genetico ? stato #uello condotto da -irenberg e .eder. +rima di #uesto, attraverso l3esperimento di -iremberg e Matt'ei "1&61%, era gi stato possibile individuare alcuni codoni. =l metodo utili ato in #uesto esperimento !u #uesto: vennero sinteti ati <-A contenenti solo A, E, , e 2 "poli7A, poli7E ecc% utili ando in vitro l3en ima !os!orilasi polinucleotidica c'e normalmente degrada l3<-A. Ad alte concentra ioni di nucleotidi di!os!ato ? possibile invertire il senso della rea ione a !avore della !orma ione di legami !os!odiesterici. 2li <-A poli7A, poli7, ecc vengono #uindi sinteti ati in #uesto modo !ornendo solamente A, ,, 2 o E. =n vitro ? stato possibile !ar legare i ribosomi a #uesti polimeri sintetici cos$ c'e #uesti !un ionino da stampo per se#uen e aminoacidic'e* gli aminoacidi vengono marcati radioattivamente. =l poli7E ? stato il primo ad essere usato e venne osservato c'e esso sele ionava esclusivamente l3aa +'e, creando catene di poli7+'e. Ci conseguen a il codone EEE codi!ica per +'e. Allo stesso modo AAA codi!ica per .)s, ,,, per +ro, mentre non !u possibile individuare 222 in #uanto #uesto determinava la !orma ione di una tripla elica c'e non lega i ribosomi* 222 codi!ica per 2l). Allo stesso modo !urono sinteti ati polimeri misti !ornendo due o piB di!os!ati di!!erenti e regolandone anc'e il rapporto e con!rontandolo con #uello degli aa incorporati.

>uesto tipo di deci!ra ione, tuttavia, non pu8 essere precisa. .a svolta decisiva !u data appunto dall3esperimento di -irenberg e .eder "1&6@%. 5ale esperimento consiste nella prepara ione di supporti !orati ciascuno contenente un codone speci!ico. Kengono !atti !iltrare ribosomi e tutti i 5rna con i rispettivi aa. +oic'? i ribosomi non possono passare dai !ori, si andranno a costituire solamente complessi codone7ribosoma7t<-A complementari al codone. 2li aminoacidi !urono marcati radioattivamente. Mediante #uesto esperimento !u possibile deci!rare 51 dei 6@ codoni. 0urono poi gli esperimenti di Dar 2obind J'orana a con!ermare e completare la deci!ra ione del codice genetico. /.0& Codoni !er aminoacidi =l numero di codoni ? molto maggiore rispetto a #uello degli aminoacidi. >uesto perc'? alcuni codoni di!!erenti codi!icano per lo stesso aminoacido "ridondan a%. Lsservando il codice si pu8 percepire un certo ordine: 7 codoni con pirimidine ", e E% in seconda posi ione codi!icano per aminoacidi idro!obici 7 codoni con purine "A e 2% in seconda posi ione codi!icano per aminoacidi polari -e consegue c'e, dato c'e le transi ioni "da purina a purina e pirimidina a pirimidina% sono il tipo piB comune di muta ioni, se viene sostituita la seconda posi ione si otterr comun#ue un aa con caratteristic'e simili. =l codice ? #uindi ottimi ato per ridurre le altera ioni.

Altre caratteristic'e: 7 una transi ione o transversione in ter a posi ione raramente 'a e!!etto 7 se le prime due posi ioni 'anno entrambe 2 o ,, #ualsiasi sia il ter o nucleotide sar speci!icato lo stesso aminoacido "22M ; 2l), ,,M ; +ro% 7 se le prime due posi ioni sono entrambe occupate da A o E, il ter o nucleotide determina una di!!eren a: AAM ; Asn "Ee ,% .)s "A e 2% EEM ; +'e "E e ,% .eu "A e 2% >uesto perc'? 27, !ormano un appaiamento piB !orte rispetto ad A7E, di conseguen a se i primi 6 appaiamenti sono !orti sul ter o pu8 essere tollerata la di!!eren a anc'e per il !enomeno di Qobbling. /.0( Se#nali di "to! = tre codoni di stop inducono la termina ione della tradu ione. -on possiedono un t<-A corrispondente. Essi sono: 7 EA2 "amber%, il primo scoperto 7 EAA "oc're% 7 E2A "opale% (ono tutti riconosciuti dai !attoti di rilascio: <01 e <06 nei batteri, E<01 negli eucarioti. =l codone di ini io ? invece AE2 "Met% /.0) A!!aimento codone@anticodone

Appaiamento antiparallelo: codone 53:3, anticodone :353. Kedi risposte precedenti. /.0* Huadri di lettura a!erti COR>0 o!en readin# frameD .a regione o le regioni c'e codi!icano per la proteina in ciascun m<-A sono costituite da una !ila di codoni contigui c'e non si sovrappongono, sono c'iamate L<0, open reading !rame. =l primo e l3ultimo codone sono sempre il codone d3ini io ed uno dei tre codoni di stop. =l codone d3ini io "537AE27:3% svolge due !un ioni: codi!ica per l3aminoacido metionina e de!inisce il reading !rame dei codoni successivi, in #uanto ogni L<0 avrebbe tre possibili #uadri di lettura "sono 6 nel C-A, : per ogni elica%. Ena volta ini iata la tradu ione nessun codone si sovrappone e #uindi la lettura va di : in :. .e muta ioni di inser ione o dele ione possono alterare il reading !rame se coinvolgono 1 o 6 nucleotidi "non :%, in tal caso si parla di muta ioni !rames'i!t. 2li m<-A eucariotici contengono solitamente una sola se#uen a codi!icante "L<0% per una sola proteina "m<-A monocistronici%, #uelli procariotici piB di una "m<-A policistronici. ,ome individuare se una se#uen a ? codi!icante, ossia possiede un L<0i (appiamo c'e : codoni su 6@ sono di stop, #uindi 61 sono #uelli codi!icanti. =n media ogni 61 codoni si trover un codone di stop "61T:%. Ci conseguen a se dopo aver individuato un codone d3ini io AE2 conto in dire ione 53:3 e trovo uno stop prima di 61 codoni il #uadro di lettura ? c'iuso e #uindi non ? un L<0. (e invece lo incontro dopo 61 o piB codoni ? un L<0, una se#uen a codi!icante. .3unica ecce ione ? il gene per la sintesi del tripto!ano c'e ? lungo 1: codoni ma ? un L<0. /.0+ Ridondanza del codice .a ridondan a del codice ? dovuta al !atto c'e se#uen e nucleotidic'e di!!erenti codi!icano per la stessa se#uen a aminoacidica. Ecco perc'? dalla se#uen a aminoacidica di una proteina non posso ricavare in modo certo la se#uen a nucleotidica da cui deriva. =noltre gli aminoacidi piB !re#uenti sono proprio #uelli codi!icati da piB codoni* ad esempio .eu ed Arg sono codi!icate da 6 codoni, 2l) da @. 5utti gli aminoacidi, ad ecce ione di 5rp e Met, sono codi!icate da piB di un codone. = codoni codi!icanti per lo stesso aa sono detti sinonimi. /.0/ De#enerazione del codice =l codice genetico ? degenerato in #uanto lo stesso aa viene codi!icato da piB codoni. .a degenera ione ? dovuta, oltre c'e alla ridondan a del codice, anc'e a motivi legati ai t<-A. ,i sono molti piB t<-A rispetto agli aminoacidi "@8 eucariotici, :1 procariotici%* il numero di t<-A ? comun#ue in!eriore rispetto al numero di codoni. Ci conseguen a alcuni aa possiedono piB di un t<-A associato ad essi, ma poic'? i t<-A sono meno numerosi dei codoni alcuni t<-A devono potersi legare ad almeno due codoni di!!erenti. >uesto ? reso possibile dal !enomeno di Qobbling o vacillamento della ter a base. /.10 o"izione -acillante = diversi codoni c'e codi!icano per lo stesso aa spesso di!!eriscono proprio per il ter o nucleotide, mentre le prime due posi ioni determinano la speci!icit "nucleotidi stringenti%. Ci conseguen a lo stesso t<-A portante l3aminoacido codi!icato da #uesti codoni pu8 legarsi a ciascuno di #uesti riconoscendo solo i primi due nucleotidi.

.3appaiamento vacillante della ter a base ? dovuto al !atto c'e la prima base dell3anticodone pu8 s'i!tare, in #uanto si trova par ialmente spostata sulla curva dell3ansa e #uindi non subisce restri ioni spa iali come le prime due. =l vacillamento permette la !orma ione di legami D !ra basi normalmente non appaiabili. (pesso una base dell3anticodone ? l3inosina, la #uale pu8 appaiarsi sia con A, sia con E, sia con , "negli eucarioti solo E e ,%. >uindi #uando E occupa la prima posi ione dell3anticodone possono essere riconosciuti : codoni diversi c'e di!!eriscono per la ter a base, la #uale deve essere A o E o ,. Cei @8 t<-A umani, 16 usano il !enomeno di Qobbling. -.A. .a prima posi ione ? #uella al 53 sia per il t<-A c'e per l3m<-A, #uindi il vacillamento della ter a base si ri!erisce alla ter a del codone e alla prima dell3anticodone.

/.11 ;ni-er"alit: =l codice genetico ? universale in #uanto ? lo stesso praticamente per tutti gli organismi. V sorprendente invece come le unic'e devia ioni dal codice genetico standard siano state riscontrate in organelli sub7cellulari come i mitocondri. /.1$ Codice mitocondriale =l C-A mitocondriale ? costituito da 1656& pb, :/ geni. Ci!!eren e tra codice genetico standard e mitocondriale: 7 E2A non ? codone di stop bens$ codi!ica per 5rp (ia E2A c'e E22 codi!icano per 5<+* #uesto non sorprende perc'? per il !enomeno di Qobbling E2A ? un codone alternativa ad E22. 7 (ia AE2 c'e AEA codi!icano per la Met interna 7 @ sono i codoni di stop: EAA, EA2 "stop anc'e nello standard%, A2A e A22 "Arg% 7 -ei mitocondri di mammi!ero son inoltre presenti solo 66 t<-A, mentre ne sono necessari almeno :6. =n!atti, #uesti t<-A mitocondriali possiedono tutti in posi ione 1 al 53 una E c'e si pu8 appaiare con tutti i @ nucleotidi in posi ione : sul codone 7 =l mitocondrio ini ia la sintesi con una -7!ormil metionina, come nei batteri >ueste modi!ica ioni rispetto al codice standard sono possibili in #uanto il mitocondrio ? un sistema c'iuso c'e sinteti a poc'e proteine speci!ic'e "c'e contengono anc'e aminoacidi tipici come la !ormil7metionina e la selenocisteina%.

10. Sinte"i roteica C.raduzioneD 10.01 Caratteri"tic'e #enerali e "!ecificit: V il processo c'e dal trascritto di m<-A porta alla de!initiva tradu ione in aminoacidi dell3in!orma ione portata dai nucleotidi. <ic'iede molta energia, in!atti la sintesi di una sola proteina ric'iede la coordina ione dell3a ione di 111 proteine e <-A.

<ispetto alla trascri ione e alla replica ione vi ? un cambiamento nel linguaggio usato per il prodotto !inale* poic'? gli aminoacidi possiedono una3a!!init pressoc'? nulla per le basi ? necessario, come abbiamo gi visto, l3intervento di un adattatore in grado di appaiarsi con l3m<-A e di dirigere l3aminoacido corretto nella corretta posi ione. >uesto adattatore ? il t<-A. = 6 elementi c'e intervengono sono: 7 m<-A 7 aminoacidi 7 t<-A 7 aminoacil7t<-A sintetasi 7 ribosomi "sono 617@1111 per cellula% 7 !attori di tradu ione

10.0$ Differenze !rocarioti ed eucarioti +rocarioti 7 Assen a di introni 7 -on c3? solu ione di continuit in #uanto non esistono compartimenti interni* sintesi proteica e tradu ione sono associate e contemporanee 7 m<-A policistronico* deve essere comun#ue lungo #uanto un L<0. ,iascun cistrone pu8 essere tradotto in modo indipendente. =noltre prima del codone d3ini io ? presente una se#uen a "57& pb a distan a dall3ini io% detta <ibosome binding site "<A(% o se#uen a di ('ine7Calgarno* #uesta se#uen a recluta il ribosoma essendo complementare ad una regione prossima al :3 dell3r<-A 16( del ribosoma. >uesto determina anc'e l3allineamento corretto del codone AE2 a livello di #uello c'e in seguito sar il sito + del ribosoma completamento assemblato determinando anc'e il #uadro di lettura. +iB il 16( e <A( sono complementari, piB alta sar la !re#uen a di tradu ione. -on tutti i cistroni 'anno il loro <A( ed in #uesto caso il loro AE2 si andr a sovrapporre in parte al :3 dell3L<0 precedente "537AE2A7:3, c'e contiene sia AE2 sia E2A% cos$ c'e il ribosoma c'e 'a appena tradotto #uest3ultimo si trovi gi in posi ione corretta per la tradu ione del secondo cistrone anc'e in assen a di <A( "accoppiamento della tradu ione%. Eucarioti 7 +resen a di introni 7 m<-A deve essere trasportato !uori dal nucleo* trascri ione nel nucleo, tradu ione nel citosol. 7 m<-A monocistronico, con cap al 53 e coda di poli7A al :3. (ul C-A codi!icante "uguale all3m<-A% di un L<0 eucariotico si riconosce inoltre un sito di splicing "A2T25 solitamente% con un A in me o al presunto introne. =l ribosoma degli eucarioti ? reclutato dal cap 53 ed una volta legato scorre in dire ione 53:3 !ino ad incontrare il codone AE2 "scanning dell3m<-A%. =n alcuni m<-A ? presente una purina subito a monte di AE2 e una 2 subito a valle "se#uen a di Jo aH%: #uesta aumenta la !re#uen a di tradu ione interagendo con il t<-A ini iatore "non con l3r<-A%. .a coda di poli7A al :3 permette la !orma ione della c'iocciola, ossia la circolari a ione dell3m<-A, gra ie all3associa ione !ra le proteine c'e legano poli7A e i !attori di ini io c'e riconoscono il cap 53.

>uesti meccanismi aumentano la !re#uen a e l3e!!icien a della tradu ione in #uanto permettono ad un ribosoma giunto al 53 di saltare di nuovo alla regione :3 e permettono il riciclaggio dello stesso c'e pu8 tradurre il tutto una seconda volta. 10.0% Struttura tRNA 10.0& Re#ioni del tRNA Kedi risposta 8.15

10.0( Aminoacil@tRNA "inteta"i (ono gli en imi deputati al caricamento dell3aminoacido corretto sul t<-A. (ono 61 en imi di!!erenti, uno per ogni aminoacido* tuttavia, poic'? piB codoni codi!icano per lo stesso aa, una sintetasi pu8 riconoscere piB t<-A "piB anticodoni%. >uesti t<-A sono detti isoaccettori e sono, in!atti, in numero molto maggiore rispetto sia agli aa c'e alle sintetasi "piB di @1%. +oc'i aminoacidi sono codi!icati da un unico codone e #uindi un solo t<-A* #uesti sono metionina e tripto!ano. +er ogni aminoacido ? presente comun#ue una sola aminoacil7t<-A sintetasi c'e pu8 riconoscere e caricare tutti i vari t<-A isoaccettori. Alcuni batteri mancano per8 dell3aminoacil7t<-A sintetasi per 2ln e cos$ caricano 2lu anc'e sul t<-A2ln ed un secondo en ima converte poi 2lu in 2ln. Ena volta c'e avviene il caricamento "trattato al 11.16%, l3aminoacido si lascia trasportare passivamente sul ribosoma sen a subire ulteriori controlli. =l t<-A andr #uindi a riconoscere il suo codone complementare sull3m<-A con conseguente inserimento dell3aminoacido nella catena polipeptidica nascente. Ci conseguen a il ribosoma non ? in grado di riconoscere tra t<-A caricati correttamente e t<-A errati. 5utta la responsabilit del caricamento corretto ?, #uindi, addossato alle aminoacil7t<-A sintetasi. Esse devono riconoscere tutti i t<-A isoaccettori e caricare su di essi lo stesso aminoacido. = determinanti della speci!icit sul t<-A c'e permettono all3en ima di riconoscere i propri t<-A si trovano a livello dello stelo accettore e dell3ansa dell3anticodone. .o stelo accettore ? particolarmente importante, !orse piB dell3anticodone, in #uanto presenta una coppia discriminatrice c'e con!erisce speci!icit. .3ansa dell3anticodone non sempre viene utili ato come discriminante in #uanto lo stesso aa pu8 essere codi!icato da piB anticodoni. .3insieme di #uesti determinanti costituisce il secondo codice genetico. =l riconoscimento e la successiva rea ione di caricamento devono avvenire in modo molto preciso: la !re#uen a di errore ? di 1 t<-A caricato scorrettamente su 1111 t<-A "11 7:%. .3en ima deve scegliere e riconoscere l3aminoacido corretto e lo !a mediante la sua catena laterale c'e presenta speci!ic'e caratteristic'e "carica, ingombro sterico ecc%. =noltre per aumentare la precisione del processo essi utili ano un sito correttore c'e si trova in prossimit del sito catalitico per l3adenila ione* ? presente un pro!ondo solco c'e controlla il prodotto dell3adenila ione. ,os$ ad esempio una valina attivata dalla isoleucil7t<-A sintetasi entra come AM+7valina in #uesto solco e viene in seguito rilasciato per idrolisi come valina e AM+ liberi. =nvece l3isoleucil7AM+ non riesce ad entrare in #uanto troppo grande e cos$ non viene idroli ata. >uesta capacit di corre ione porta la !re#uen a di errore a 117@.

10.0) Atti-azione de#li aminoacidi .3attiva ione degli aminoacidi da parte della aminoacil7t<-A sintetasi avviene in due passaggi: 1. Attiva ione dell3aminoacido tramite adenila ione "tras!erimento di AM+% . Kiene a !ormarsi un3anidride mista !ra AM+ e aa in seguito all3attaccamento nucleo!ilo del gruppo carbonilico dell3aminoacido al gruppo !os!ato in dell3A5+ con conseguente libera ione di piro!os!ato inorganico "idroli ato a 6 +i dalla piro!os!atasi inorganica%. =l legame anidridico ? ad alta energia e #uesto attiva l3aminoacido c'e si trova #uindi nella !orma di aminoacido adenilato "aa7AM+%. 6. ,aricamento del t<-A. .3aminoacido adenilato rimane strettamente associato alla sintetasi e il :3LD o il 63LD dell3A all3estremit :3 del t<-A agisce da nucleo!ilo e attacca il , carbonilico dell3aminoacido impegnato nel legame anidridico con l3AM+* ne consegue la libera ione di AM+. (intetasi di classe I sono monomeric'e e legano l3aminoacido al 63LD del t<-A (intetasi di classi II sono dimeric'e o trimeric'e e legano l3aminoacido al :3LD del t<-A. 10.0* Struttura ri7o"omi eucariotici e !rocariotici Kedi risposta 8.1/ -.A. +esi molecolari: eucariotici @,6 MCa, procariotici 6,5 MCa. 10.0+ >a"i della traduzione .e !asi della tradu ione sono, come #uelle della trascri ione, :: 1. ini io 6. allungamento :. termina ione 5ali !asi sono tipic'e sia dei procarioti c'e degli eucarioti. Ci!!eren e e dettagli sono trattati nelle risposte successive. 10.0/ Siti di le#ame e centri atti-i nel ri7o"oma = ribosomi procariotici sono composti da due subunit: la minore, :1(, presenta una !essura ricca di <-A ed una piatta!orma, e si incastra con la subunit maggiore 51( attraverso un incavo presente su #uest3ultima. +resenta inoltra una protuberan a centrale ed un peduncolo laterale. >ueste subunit non sono sempre assemblate* seguono il ciclo ribosomiale: 1. la subunit minore si lega all3m<-A e carica il t<-A ini iatore !ormando il complesso ternario 6. viene reclutata la subunit maggiore creando i siti di legame A+E del ribosoma. =l t<-A ini iatore si trova al sito +, viene poi reclutato un secondo t<-A al sito A. :. #uando si presenta un codone di stop avviene il rilascio del peptide e la dissocia ione delle due subunit pronte per un altro ciclo. ,iascun ribosoma sinteti a un solo peptide per volta* nei procarioti ciascun m<-A pu8 essere tradotto da piB ribosomi contemporaneamente andando a !ormare un polisoma o poliribosoma. =n tal caso la distan a tra due ribosomi ? di 81 nucleotidi.

Lgni ribosoma contata circa :5 basi dell3m<-A* #uesto spiega la limitata #uantit di m<-A nella cellula rispetto a #uella dell3r<-A. =l ribosoma assemblato presenta dei siti attivi con attivit en imatica peptidil trans!erasica e siti di legame per l3m<-A e per i t<-A. >uesti contatti strutturali e catalitici non sono mediati solo da proteine ma anc'e ed an i soprattutto dagli r<-A, i #uali non solo svolgono ruoli strutturali ma anc'e catalitici. .a subunit minore ? responsabile in prima istan a del riconoscimento dell33m<-A "? complementare a se#uen a di ('ine7Calgarno% e del posi ionamento corretto del codone d3ini io. >uando si assembla l3intero ribosoma si !ormano i : siti di legame A+E per i t<-A cos$ c'e a livello della subunit minore avvenga a grandi linee il riconoscimento codone7anticodone e a livello di #uella maggiore la !orma ione del legame peptidico. V in!atti a livello di #uest3ultima c'e il ribosoma presenta attivit peptidil trans!erasica. .a peptidil trans!erasi ? #uindi un ribo ima* ? di antic'issima origine e coinvolge l3r<-A 6:(. >uesto sito peptidil trans!erasico ? esclusivamente a <-A mentre le proteine ribosomiali si dispongono principalmente ai margini del ribosoma. En ulteriore centro attivo ? detto sito del !attore 2 ed attiva le attivit 25+asic'e dei diversi !attori. = siti di legame al t<-A sono invece c'iamati siti A+E e si !ormano dall3inter!accia tra la subunit maggiore e minore: 7 sito A, aminoacil7t<-A, vi si lega il t<-A aminoacetilato 7 sito +, peptidil trans!erasi, vi si lega il peptidil7t<-A 7 sito E, eMit, uscita del t<-A dopo aver tras!erito l3aminoacido alla catena peptidica nascente =l t<-A si alluna dal sito peptidil trans!erasico a livello delle subunit maggiore a #uello di riconoscimento anticodone7codone a livello della subunit minore* #uindi le estremit :3 dei t<-A si trovano a livello della subunit maggiore e le anse degli anticodoni a livello di #uella minore. ,i sono inoltre due piccoli canali nella subunit minore per l3entrata e l3uscita dell3<-A* le loro dimensioni sono tali da !ar passare l3<-A in !orma lineare e #uesto ? importante per evitare la !orma ione di !orcine porti ad errori nel #uadro di lettura. 5ra i due canali ? presente una regione cui possono accedere i t<-A in cui codoni adiacenti dell3m<-A possono legare il peptidil7t<-A e l3aminoacil7t<-A nei siti + ed A. .3m<-A tra i due codoni dei siti + ed A ? !or ato ad una curvatura c'e !avorisce il mantenimento del corretto reading !rame. -ella subunit minore ? presente un ulteriore canale !un ionale all3uscita della catena polipeptidica nascente* le sue dimensioni consentono il passaggio e #uindi la !orma ione di un 7 elica ma non di altre strutture secondarie o ter iarie. .a super!icie interna di #uesto canale ? !ormata soprattutto da r<-A 6:( c'e crea poc'e intera ione con polipeptide, cos$ c'e #uesto non venga rallentato nell3uscita. 10.10 Sinte"i !roteica nei !rocarioti .e principali di!!eren e con gli eucarioti sono gi state trattate. = dettagli sono presenti nelle risposte successive.

10.11 Codone d=inizio 10.1$ >ormilazione

=l codone AE2 ? sia il codone d3ini io sia il codone codi!icante per Met. (e esso si trova all3ini io di una L<0 recluta un t<-A detto t<-A ini iatore, c'e nel caso dei batteri ? caricato !ormilata della metionina "-7!ormilmetionina%. .a !ormila ione avviene dopo il una Met standard. =l t<-A ini iatore prende #uindi il nome di !Met7t<-Ai !Met* #uesto si posi iona al sito +. -on tutte le proteine procariotic'e ini iano con una -7!Met al -7terminale "53% in #uanto l3en ima de!ormilasi gruppo !ormile oppure la stessa metionina viene rimossa da un aminopeptidasi insieme ad altri all3estremit -7terminale.

caratteristico con la !orma caricamento di

rimuove il aminoacidi

10.1% >attori d=inizio 10.1& Com!le""o di !re@inizio .3ini io della tradu ione procariotica 'a origine a della subunit minore e ric'iede i : !attori d3ini io =06, e =0:. Essi entrano nel seguente ordine: =0:, =06 "F25+%, =01, ini iale e m<-A* in seguito esce =0: e viene a legarsi al subunit maggiore con conseguente !uoriuscita anc'e ed =06. = ruoli c'e essi svolgono sono: 7 =0:: si lega alla subunit minore e 'a l3importante di impedire l3associa ione con la subunit maggiore esso si trova legato* impedisce anc'e il legame con caric'i. V essen iali nel ciclo ribosomiale in #uanto si alla subunit minore al termine di un ciclo provocando dissocia ione della subunit /1(. (i lega al sito E e all3m<-A* permette la !orma ione complesso ternario stabile "composto da subunit minore, t<-A ini iatore ed m<-A% prima c'e si associ subunit maggiore. 7 =06: ? una 25+asi c'e interagisce con la subunit minore, con =01 e con il t<-A ini iatore carico evitando c'e altri t<-A si associno al sito + 7 =01: occupa #uel sito della subunit minore c'e a costituire il sito A. livello =01, t<-A di =01 ruolo !inc'? t<-A lega la del la

andr

=n #uesto modo, tra i tre !uturi siti della subunit minore, solo il sito + pu8 legare un t<-A, e #uesto avviene !ino a #uando tutti i !attori d3ini io sono legati. A #uesto punto la subunit minore !orma il complesso ternario legandosi al t<-Ai e all3m<-A. .3ordine di associa ione a t<-A ed m<-A nei procarioti

avviene in modo del tutto casuale, mentre negli eucarioti viene sempre a !ormarsi prima di tutto il complesso subunit minore7t<-Ai. .3m<-A deve essere posi ionato in modo corretto* a #uesto !ine avviene l3accoppiamento di basi !ra il <A( "se#. ('ine7Calgarno, 537A22A22E7:3% e l3r<-A 16(. +oic'? <A( si trova a monte rispetto all3AE2 di un L<0 e distan iato da #uesto di :7& basi, #uesto riconoscimento permette l3allineamento corretto del codone d3ini io nel sito + nel momento in cui #uesto si !ormer per associa ione con la subunit maggiore. -ei procarioti, inoltre, il legame dell3!Met7t<-Ai!Met alla subunit minore ? !acilitata dalla sua intera ione con =06. .3ultimo processo della !ase d3ini io ? il reclutamento della subunit maggiore a seguito di un cambiamento con!orma ionale della subunit minore dopo la !orma ione del complesso ternario. >uesto cambiamento con!orma ionale rilascia =0: e viene ad associarsi la subunit maggiore costituendo il complesso d3ini io /1(. Lra il 25+ legato a =06 viene idroli ato a 2C+, =06 e =01 riducono la loro a!!init per il ribosoma e per il t<-Ai e si dissociano. >uesti !attori vengono #uindi riciclati nel ciclo dei !attori. A #uesto punto troviamo: ribosoma /1( F m<-A F t<-Ai al sito +. =ni ia la !ase di allungamento. 10.1( Se<uenza di S'ine@Dal#arno Kedi sopra e risposta 11.16. 10.1) .ra"locazione Curante la !ase di allungamento la !orma ione di legami peptidici e la !orma ione del peptide !inale ric'iedono c'e dopo ogni rea ione peptidil trans!erasica il peptidil7t<-A del sito A e il t<-A scarico del sito + vengano traslocati rispettivamente al sito + ed al sito E in modo tale da liberare il sito A per il successivo aminoacil7t<-A. ,ontemporaneamente il t<-A del sito E deve uscire dal ribosoma. .3allungamento prevede #uindi la rea ione di !orma ione del legame peptidico e la trasloca ione per poter procedere con una successiva aggiunta di u aminoacido e la !orma ione di un altro legame peptidico. V il ribosoma c'e si muove, non l3m<-A* in particolare per prima si muove di un codone la subunit 51(, seguita dalla subunit :1(. 10.1* e!tidil tran"fera"i V la sola attivit en imatica presente e catali a la !orma ione del legame peptidico. .a catena nascente ? strettamente associata al t<-A. = due substrati della rea ione sono il peptidil7t<-A nel sito + e l3aminoacil7t<-A nel sito A* il primo ? la catena nascente, il secondo il nuovo aminoacido c'e deve essere aggiunto. Entrambi sono legati al :37LD del t<-A tramite legame estere. .a rea ione prevede l3attacco nucleo!ilo da parte del gruppo amminico -D 6 dell3aminoacil7t<-A al , carbonilico della catena polipeptidica determinando la rottura del legame estere del peptide e conseguente rilascio di t<-A scarico al sito + e !orma ione del legame peptidico sul sito A. =l peptidil t<-A con un aminoacido in piB ? ora nel sito A.

.a successiva trasloca ione ricreer un sito A libero, un sito + occupato dal nuovo peptidil7t<-A ed un sito E con il vecc'io peptidil7t<-A scarico "'a donato il peptide al t<-A in A%. -e consegue c'e al 53 dell3m<-A corrisponde l3-7terminale della catena polipeptidica. =n #uesto meccanismo non ? ric'iesta energia sotto!orma di nucleosidi tri!os!ato in #uanto l3energia necessaria ? conservata nella !orma ione del legame estere e viene liberata #uando il legame tra t<-A e catena polipeptidica viene rotto. =l sito peptidil trans!erasico ? composto da <-A e s!rutta una base "probabilmente una A% per catturare un DF da -D6 rendendolo piB nucleo!ilo per l3attacco al , carbonilico. >uesto DF catturato dalla base viene ridonato poi per !ormare il :37LD del t<-A. .3r<-A ? il 6:( della subunit maggiore* alcune basi di #uesto <-A si accoppiano con l3estremit 537,,A7:3 dei t<-A nei siti A e + posi ionandoli nel modo corretto per la rea ione. 10.1+ Allun#amento .a !ase di allungamento utili a due proteine 25+asic'e c'iamate !attori di allungamento: 7 E>@.u: scorta l3aminoacil7t<-A sul ribosoma e poi si lega all3estremit :3 del t<-A masc'erando l3aminoacido associato c'e, #uindi, non pu8 !ormare il legame peptidico !inc'? il !attore ? associato. E075u si associa all3aminoacil7t<-A #uando lega 25+* #uesto 25+ viene poi idroli ato a 2C+ #uando il t<-A viene caricato sul sito A in modo corretto. A #uesto punto E075u pu8 interagire con il centro di legame di !attore della subunit maggiore c'e attiva l3attivit 25+asica "!aceva lo stesso con =06%. E075u72C+ 'a scarsa a!!init e rilascia l3aminoacil7t<-A* avviene ora la rea ione peptidil trans!erasica. 7 E>@G: ? il !attore di completamento della trasloca ione. >uesta comprende lo spostamento del t<-A dal sito + a E e dal sito A a + ed uno scivolamento di : nucleotidi sull3m<-A. Copo la rea ione peptidil trans!erasica, il :3 del t<-A in A "c'e porta i peptide% si sposta nel sito + a livello della subunit maggiore, mentre l3anticodone rimane nel sito A* lo stesso avviene per il t<-A in +. >uindi la trasloca ione nella subunit maggiore precede #uella nella subunit minore e i t<-A si trovano in una condi ione ibrida. E072 va a legarsi in una regione c'e viene a crearsi nel sito A dopo la trasloca ione* si lega a tale regione nella !orma legata a 25+. =l contatto con il centro di legame del !attore della subunit maggiore determina l3idrolisi del 25+ a 2C+* #uesto permette a E072 di insinuarsi meglio nella subunit minore e di completare la trasloca ione del t<-A dal sito A a +. Anc'e l3m<-A deve s'i!tare di : nucleotidi per poter esporre il nuovo codone al sito A. >uesto avviene in #uanto il t<-A7peptidil in A mantiene l3associa ione con il suo codone anc'e dopo la trasloca ione e #uindi trascina con s? l3m<-A spostandolo di : nt. A #uesto punto il ribosoma possiede scarsa a!!init per E07272C+ e #uesto viene rilasciato. .a trasloca ione viene #uindi propagata ad e!!etto domino al sito E e +. E072 simula #uindi un t<-A legato a una proteina pur essendo un semplice peptide* ? un esempio di mimetismo molecolare. E072 scambia poi il 2C+ con 25+ mentre E075u necessita per #uesto scambio la proteina E075s, un !attore di scambio per il 25+. =n conclusione la !orma ione del legame peptidico ric'iede 1 A5+ "rea ione dell3aminoacil7t<-A sintetasi% e : 25+ "6 per i !attori ed 1 per ini iare la tradu ione%. 10.1/ .erminazione e rila"cio 10.$0 >attori di rila"cio

>uando si presenta una delle tre triplette di stop, #ueste non vengono riconosciute da nessun t<-A ma vengono riconosciute da proteine dette !attori di rilascio "<0% c'e attivano l3idrolisi del peptide dal peptidil7t<-A. Esistono due classi di #uesti !attori: 0 (attori di classe I : riconoscono i codoni di stop e innescano l3idrolisi nel sito +. =n particolare sono <01, c'e riconosce EA2 e EAA, e <06, c'e riconosce E2A e EAA. =l riconoscimento di tali se#uen e ? mediato da una regione di : aminoacidi, mentre il rilascio del polipeptide ? mediato da un3altra se#uen a di : aminoacidi nei pressi del centro peptidil trans!erasico. 0 (attori di classe II : stimolano la dissocia ione dei !attori di classe I in seguito al rilascio della catena polipeptidica dal ribosoma. =n particolare troviamo <0:, una 25+asi. <0: legata a 2C+ si lega al ribosoma in presen a di <01 o <06* dopo l3idrolisi del peptide, una varia ione con!orma ionale scambia 2C+ con 25+. <0:725+ si lega con maggiore a!!init al ribosoma provocando il rilascio di <01 o <06. A #uesto punto, il centro del legame del !attore della subunit maggiore idroli a 25+ a 2C+ e, in assen a dei !attori <01 o <06, <0:72C+ si dissocia dal ribosoma. -elle cellule procariotic'e esiste il !attore di riciclaggio del ribosoma, <<0, c'e consente, appunto il riciclaggio del ribosoma agendo insieme a E072 e =0:. <<0 si lega al sito A vuoto, recluta E072, il #uale stimola non la trasloca ione ma il rilascio dei t<-A scaric'i ancora presenti in + e E. Anc'e =0: pu8 partecipare al rilascio di m<-A, ma ? assolutamente necessario per la dissocia ione delle due subunit. +oic'? <<0 e E072 poi si dissociano, il risultato !inale sar una subunit minore legata a =0: ed una subunit maggiore libera. 10.$1 oliri7o"omi Kedi risposta 11.1/.

10.$$ Sinte"i !roteica ne#li eucarioti Ci!!eren e con i procarioti gi trattate. +er dettagli vedi risposte successive. 10.$% >attori d=inizio eucariotici 10.$& Com!le""o di !re@inizio A livello dell3ini io di un cistrone non avviene il riconoscimento tra <A( e se#uen a di ('ine7 Calgarno, bens$ il ribosoma viene reclutato dal cap 53 e dalle proteine ad esso associate. Al momento del reclutamento al subunit minore ? associata al t<-A ini iatore e scorre sull3m<-A in dire ione 53:3 !ino ad incontrare il primo 537AE27:3. V importante ricordare c'e in alcuni m<-A eucariotici ? presente una base purinica a monte di AE2 e una 2 subito a valle* #uesta ? la se#uen a di Jo aH c'e rende piB e!!iciente la tradu ione. +iB di :1 proteine sono coinvolte nella !ase d3ini io. .3associa ione t<-A7subunit minore precede sempre il legame all3m<-A.

>uando, dopo ogni ciclo, il ribosoma si dissocia nelle subunit maggiore e minore per a ione di e=0: "analogo di =0:, sito E% e e=01A "analogo di =01, sito A%, due 25+asi intervengono: e=06 ed e=05A reclutano il t<-A ini iatore. >uest3ultimo negli eucarioti ? il Met7t<-AiMet, caricato con Met non !ormilata. .3analogo eucariotico di =06725+ non ? e=06 ma e=05A725+, il #uale si lega alla subunit minore in modo e=01A7dipendente e recluta poi il complesso e=06725+7t<-Ai. (volge #uindi il ruolo di mediatore tra e=01A, c'e si trova nel sito A, e il t<-Ai c'e deve essere posi ionato al sito + cos$ come =06 nei procarioti contattava t<-Ai, m<-A e =01. Kiene #uindi a !ormarsi il complesso di pre7ini io @1( costituito da subunit minore, e=01A al sito A, e=0: al sito E, ed e=052725+ c'e media !ra e=01A e t<-AiMet F e=06725+. >uesto complesso deve essere reclutato dal cap 53, il #uale viene riconosciuto dalla proteina e=0@0. >uesta ? costituita da : subunit: 7 A si lega in modo aspeci!ico al <-A 7 E si lega direttamente al cap 53 7 2 si lega in modo aspeci!ico all3<-A .3intera ione di E ma anc'e del resto della proteina con e=0: associata alla subunit maggiore recluta al complesso di pre7ini io a livello dell3estremit 53. V importante notare c'e e=0@0 viene legata prima da e=0@A, la #uale attiva un3elicasi di 0 per assicurare c'e il 53 dell3m<-A sia lineare e privo di strutture secondarie. V sempre gra ie a #uesta elicasi A5+7dipendente c'e avviene lo scorrimento del complesso di pre7 ini io sull3m<-A in dire ione 533. =l primo AE2 viene riconosciuto gra ie all3accoppiamento con l3anticodone del t<-Ai "ecco perc'? deve legarsi per primo% e #uesto promuove il rilascio di e=06 ed e=0:. =l rilascio permette l3associa ione della subunit maggiore con conseguente stimola ione dell3idrolisi del 25+ a 2C+ di =05A e rilascio degli altri !attori. (i !orma il complesso d3ini io 81( con il Met7t<-Ai nel sito + e il sito A libero per accettare un t<-A carico. E=0@0 e le sue relative subunit interagiscono con la proteina c'e si lega al poli7A, la #uale riveste la coda poli7A "interagisce principalmente la subunit 2%. Ci conseguen a, #uesta intera ione, c'e si mantiene costante ad ogni ciclo di tradu ione, !a s$ c'e l3m<-A venga mantenuto in una con!igura ione circolare "a c'iocciola% mediante #uesto ponte proteico 537:3. ,os$ #uando il ribosoma arriva all3estremit :3 e viene rilasciato si trova subito nella posi ione ideale per ricominciare la tradu ione dello stesso m<-A. 10.$( .u e com!le""o ternario E075u procariotico corrisponde ad eE01 eucariotico, E072 corrisponde ad eE06. Kedi #uindi risposta 11.18. .a !re#uen a di errore e 117:T117@* inoltre ? importante sottolineare tre meccanismi c'e evitano al ribosoma di sele ionare aminoacil7t<-A errati: 1. (olo #uando l3appaiamento codone7anticodone ? corretto si !ormano due legami D addi ionali tra due residui di A dell3r<-A 16( e il solco minore della coppia codone anticodone. 6. (elettivit cinetica: solo un appaiamento corretto codone7anticodone aumenta l3attivit 25+asica di E075u con il conseguente rilascio dal t<-A. :. Copo il rilascio di E075u ? necessario accomodare il t<-A carico del sito A ruotandolo in modo da avvicinare la sua estremit :3 al sito + . =n #uesto passaggio, t<-A non accoppiati correttamente spesso si dissociano. >uesto meccanismo ? simile ad un3attivit di proo!7reading

10.$) Siti del ri7o"oma Kedi risposte precedenti. 10.$* Allun#amento e terminazione 10.$+ >attori di terminazione .a !ase di allungamento ? del tutto simile a #uella dei procarioti. +er #uanto riguarda i !attori di rilascio ? presente un !attore di classe I, e<01, c'e riconosce tutti e tre i codoni di stop, ed uno di classe II, e<0:, c'e possiede attivit 25+asica. .a !ase di termina ione 'a ini io con il riconoscimento del codone di stop* avviene #uindi il legame con D6O con dissocia ione della molecola in DF e LD7, un nucleo!ilo !orte. >uesto attacca il carbonio carbonilico del legame anidridico con :37LD del peptidil7t<-A "idrolisi%. .3D F perso precedentemente viene riac#uisito da ,LL7 per dare ,LLD. 10.$/ Ener#ia nece""aria !er formazione del le#ame !e!tidico (ono necessarie 1 A5+ e : 25+ "1 per l3ini io e 6 nell3attiva ione dell3aminoacido% .3energia !ornita ? conservata nella !orma ione di un legame estere.

10.%0 Ini7itore della "inte"i !roteica .a puromicina ? del tutto simile all3aminoacil7t<-A ed ? un antibiotico in grado di entrare nel sito A* #ui il suo gruppo amminico ? coinvolto in una rea ione di attacco nucleo!ilo al , carbonilico della catena nascente con conseguente !orma ione di un peptidil7puromicina. Avviene #uindi il blocco della sintesi, sia in eucarioti c'e in procarioti. .a tetraciclina si lega al sito A a livello della subunit :1( procariotica* inibisce il legame dell3aminoacil7t<-A. Eritromicina blocca il canale d3uscita per il peptide della subunit 51( procariotica. 5ossina di!terica inibisce eE01 eucariotica.

11. Re#olazione dell=e"!re""ione #enica nei !rocarioti 11.01 unti di controllo dell=e"!re""ione .a regola ione dell3espressione genica comprende tutti #uei meccanismi c'e aumentano o diminuiscono l3espressione di uno speci!ico gene una volta c'e viene a cambiare la ric'iesta del suo prodotto. -ei batteri il punto di controllo piB controllo ? l3ini io della trascri ione* vi sono poi successivi controlli a livello della termina ione, dell3allungamento, del processamento dell3<-A e della tradu ione. 11.0$ Caratteri"tic'e #enerali RNA !rocariotici ed eucariotici 11.0% .ra"critto !olici"tronico

Kedi tratta ioni precedenti. =n generale #uelli eucariotici sono monocistronici e presentano una sola L<0, mentre gli m<-A procariotici sono policistronici e presentano molteplici L<0. Ci conseguen a in #uest3ultimi vengono attivati piB geni. =noltre nei procarioti trascri ione e tradu ione sono strettamente associate. -.A. ,istrone ; gene inteso come unit !un ionale, codi!ica la se#uen a aminoacidica per un polipeptide. 11.0& Concetto di o!erone0 !romotore e o!eratore .3operone, presente solo nei procarioti, ? un aggregato di geni "trascritto policistronico% con !un ioni interconnesse* ? di per s? un3unit trascri ionale. =l promotore ? un sito speci!ico del C-A riconosciuto dall3<-A polimerasi c'e indica il punto in cui ini ia la trascri ione e #uale !ilamento deve essere utili ato come stampo* non viene trascritto. .3operatore pu8 essere sovrapposto al promotore o interposto !ra #uesto ed i geni* in generale ? il sito di legame per i !attori di controllo. Agisce, appunto, come interruttore trascri ionale dal momento c'e vi si legano proteine regolatrici, per lo piB repressori c'e impediscono il legame dell3<-A pol sul promotore. .a tipica se#uen a di un promotore procariotico riconosciuto dal !attore /1 contiene gli elementi 7:5 e 711, se#uen e altamente conservate "vedi anc'e risposte precedenti%. .a !or a del promotore ? tanto maggiore #uanto piB la sua se#uen a ? vicina a #uella consenso. =l legame di !attori ? particolarmente importante in speci!ic'e condi ioni, #uali lo s'ocH termico. =n tal caso interviene il !attore :6 c'e possiede speci!icit per tipi di promotori di!!erenti c'e possono indurre la sintesi di particolari proteine necessarie alla nuova condi ione "en imi di ripara ione, c'aperonine ecc%. En ulteriore !attore c'e pu8 intervenire ? il 5@, il #uale si associa ad una piccola !ra ione di polimerasi c'e esprimono geni coinvolti nel metabolismo dell3-. =n assen a di attivatori e di repressori, l3<-A polimerasi si lega occasionalmente e spontaneamente al promotore ed ini ia a trascrivere ad un livello di espressione costitutiva detta livello basale. +er impedire #uesta espressione un repressore si lega all3operatore, il #uale, essendo una se#uen a sovrapposta al promotore, impedisce l3attacco su di #uesta della polimerasi. +er attivare, invece, l3espressione a livelli maggiori, un attivatore si lega ad una se#uen a speci!ica, c'e spesso si trova a monte del promotore, ed aiuta l3<-A pol a legarsi su #uesta. >uindi l3attivatore, con una sua super!icie di legame, lega la se#uen a e con l3altra lega e porta sul promotore l3<-A pol. >uesto processo di reclutamento ? un esempio di legame cooperativo. (e il passaggio limitante non ? tanto il legame al promotore dell3<-A polimerasi #uanto la transi ione da complesso c'iuso ad aperto, gli attivatori possono anc'e agire attraverso un meccanismo allosterico !avorendo #uesto passaggio con!orma ionale. 11.0( O!erone latto"io

.3operone lac contiene geni implicati nel metabolismo del lattosio "disaccaride costituito da glucosio e galattosio% da parte di E. ,oli. = geni sono :: 1. .ac O: codi!ica per l3en ima 7galattosidasi c'e scinde il lattosio nei monosaccaridi glucosio e galattosio 6. .ac ]: codi!ica per la permeasi, proteina integrale di membrana c'e permette al lattosio di entrare nella cellula :. .ac A: codi!ica per tiogalattoside transacetilasi, c'e libera la cellula dai tiogalattosidi basici c'e entrano dalle permeasi.

=l promotore si trova subito a monte presso il 53 del gene .ac O. .3operone lac ? espresso solo #uando nell3ambiente esterno ? presente esclusivamente lattosio come !onte di energia, #uindi in assen a di glucosio. >uesto perc'? ? piB !avorevole per la cellula utili are il monosaccaride glucosio an ic'? ottenerlo per scissione dal lattosio. 7 =n assen a di lattosio avviene un tipo di regola ione negativa mediata da un soppressore attivo. =l repressore determina un blocco trascri ionale* il suo gene si trova in prossimit degli altri geni dell3operone lac ma possiede un promotore speci!ico costitutivamente espresso. 7 =n presen a di lattosio, esso stesso sotto!orma di allolattosio inattiva il repressore lac determinando l3ini io della trascri ione. .3allolattosio viene prodotto dalla stessa 7galattosidasi. 7 =n presen a di glucosio avviene una regola ione positiva con attivatore ,A+ ",atabolite Activator +rotein% inattivo. =l gene per ,A+ si trova su un altro gene del cromosoma batterico. 7 =n assen a di glucosio viene attivata la proteina ,A+ e di conseguen a viene attivata la stessa trascri ione dell3operone lac. -e consegue c'e il repressore lac segnala la presen a di lattosio #uando viene inattivato, l3attivatore ,A+ segnala l3assen a di glucosio #uando viene attivato: in #uesta condi ione avviene la trascri ione dell3operone. (i tratta #uindi di un controllo combinatorio ed i geni lac !orniscono un esempio di integra ione del segnale, in #uanto la loro espressione ? controllata da due segnali. <iassumendo: 7 +resen a glucosio, presen a lattosio ; ,A+ inattiva, repressore lac inattivo, bassi livelli di trascri ione 7 +resen a glucosio, assen a lattosio ; ,A+ inattiva, repressore lac attivo, assen a di trascri ione 7 Assen a glucosio, presen a lattosio ; ,A+ attiva, repressore lac inattivo, alti livelli di trascri ione =l repressore lac si lega alla se#uen a del promotore detta operatore lac "61 pb% sovrapposto al promotore stesso cos$ c'e il repressore legato impedisce !isicamente al legame dell3<-A polimerasi. (i lega come tetramero ma ogni operatore lac ? contattato da solo 6 di #ueste subunit, mentre le altre due interagiscono con uno degli altri due operatori lac a valle e a monte di #uello principale "il C-A !ra essi compresi !orma un loop%.

=l promotore lac contiene una se#uen a a 7:5 ottimale per il legame con l3oloen ima "<-A polimerasi F /1%* ecco perc'? anc'e in presen a sia di glucosio c'e di lattosio, e #uindi in assen a sia di ,A+ c'e del repressore lac, ci sono bassi livelli di trascri ione. Lltre all3elemento 7:5, non ? presente l3elemento E+, come tipico per i promotori controllati da attivatori. -.A. ,ome gi detto, l3allolattosio inattiva la regione lac* tuttavia la conversione del lattosio in allolattosio ? catali ata dalla 7galattosidasi codi!icata dal gene lac O. ,om3? possibilei Avviene gra ie alla bassa e preventiva trascri ione7tradu ione costitu ionale dell33operone lac. .3allolattosio si lega al repressore lac e ne induce un cambiamento con!orma ionale c'e non gli consente di legare il C-A* in tal modo viene rimossa la repressione !isica. 11.0) cAM e !roteina CA ,ome detto in preceden a, la proteina ,A+ si lega come dimero a un sito di lung'e a simile a #uella dell3operatore lac "61 pb% a circa 61 pb a monte di F1. Essa possiede super!ici separate per il legame al C-A e per l3intera ione e reclutamento dell3<-A polimerasi sul promotore. >uest3ultima ? c'iamata regione attivatrice ed interagisce con ,5C dell3<-A pol, la #uale solitamente interagisce con l3elemento E+ del promotore, #uando #uesto ? presente* essendo assente nell3operone lac, si lega direttamente alla proteina ,A+. ,5C ? inoltre collegato da una giun ione !lessibile all3-5C della subunit c'e si trova all3interno dell3en ima. ,A+ introduce inoltre un3importante curvatura nel C-A, il #uale si avvolge in parte attorno alla proteina. ,A+ ? attivata in assen a di glucosio per il seguente meccanismo: l3assen a di glucosio !a aumentare jcAM+k, il #uale ? l3e!!ettore allosterico di ,A+. (olo #uando ,A+ ? attivata dal cAM+ pu8 legare il C-A. -.A. <epressore lac e ,A+, cos$ come molti altri attivatori e repressori, utili ano un dominio strutturale comune per legare il C-A* #uesto ? il dominio elica7giro7elica, costituita da 6 7elic'e, #uella di riconoscimento si insinua nel solco maggiore, mentre l3altra contatta lo sc'eletro di C-A. 11.0* O!erone tri!tofano =l tripto!ano ? un aminoacido molto raro nelle proteine e, insieme alla metionina, ? l3unico ad essere codi!icato da un unico codone "E22%. .3operone trp comprende 5 geni c'e codi!icano per en imi necessari alla biosintesi del trp stesso* #uesti vengono espressi #uando tale aminoacido scarseggia nell3organismo. =n presen a di trp avviene una regola ione negativa con repressore attivato dal legame con il trp stesso* il tripto!ano ?, #uindi, un corepressore.

=n assen a di trp, o comun#ue a basse concentra ioni dell3aminoacido, avviene una regola ione negativa con repressore inattivato dalla dissocia ione del corepressore* pu8 #uindi avvenire la trascri ione. 5uttavia a #uesto punto interviene un secondo meccanismo regolativo: l3attenua ione. Essa consiste in una prematura termina ione c'e porta alla !orma ione di un trascritto bloccato prima c'e venga incluso il gene 5rp E, con!ermando invece c'e davvero nella cellula non ? presente tripto!ano. >uesto !enomeno ? tipico dei procarioti in #uanto si basa sulla stretta associa ione tra trascri ione e tradu ione e sulla capacit dell3<-A di !ormare appaiamenti intramolecolari. >uesto meccanismo negativo, in!atti, agisce a livello della se#uen a terminatore <'o7 indipendente "se#uen e palindrome%. 0ra il promotore e il primo codone del gene 5rp E ? presente una se#uen a di 161 nucleotidi detta se#uen a leader* verso la sua estremit :3 e prima dell3ini io di 5rp E presenta una se#uen a terminatrice presso le regioni : e @ c'e, una volta trascritte, danno origine ad una struttura ad ansa e !orcina di termina ione. >uesta regione ? l3attenuatore. >uando #uesta !orcina :7@ "!orcina di termina ione% si !orma avviene il blocco della tradu ione e la sintesi di un m<-A leader lungo 1:& nucleotidi. >uesto, per8, avviene solo se la concentra ione di tripto!ano ? bassa ma comun#ue non pari a 1. (e invece esiste ancora una concentra ione di trp residua, troppo bassa per mantenere il primo blocco del repressore, ma abbastan a elevata da superare il secondo controllo, si innesca un meccanismo in grado di portare alla trascri ione e tradu ione dell3intero operone: 1. -ell3m<-A leader sono, in!atti, presenti altre due regioni dette 1 e 6, le #uali possono !ormare una !orcina 176* tuttavia la regione 6 pu8 anc'e andare a !ormare con : una !orcina 67:, impedendo in #uesto caso la !orma ione della !orcina :7@ di termina ione7 6. .e caratteristic'e suddette, accoppiate alla contemporanea tradu ione di un peptide leader di 1@ aa da un L<0 contenuto nell3m<-A leader, consentono di e!!ettuare il secondo controllo sui livelli di j5rpk. >uesto perc'? il peptide leader contiene due codoni adiacenti per il 5rp. >uindi, se durante la sintesi di #uesto peptide leader il trp scarseggia, il ribosoma si blocca sui codoni per il 5rp in #uanto non sono presenti su!!icienti t<-A caricati con 5rp. =l ribosoma bloccato nasconde la regione 1 e, mentre la restante parte dell3m<-A leader viene trascritta, la regione 6 non pu8 accoppiarsi con la 1 ma pu8 !arlo con la :, andando a !ormare la !orcina 67:. >uesto impedisce la !orma ione della !orcina di termina ione :7@.

(e invece il 5rp ? presente, il ribosoma non si blocca e, mentre sinteti a, blocca la regione 6 cos$ c'e la trascri ione va a !ormarsi la !orcina di termina ione :7@. Anc'e in assen a di sintesi proteica, non avvenendo il legame con il ribosoma, si !ormano le !orcine 176 e :7@ con conseguente termina ione. .a combina ione della repressione e dell3attiva ione consente un tipo di controllo delle3espressione dell3operone 5rp molto piB !ine. -.A. .3attenua ione non ric'iede una proteina regolatrice.

11.0+ O!erone #alatto"io ed ara7ino"io .3operone galattosio consta di : geni: 2al E codi!ica per un3epimerasi, 2al 5 per un3uridil trans!erasi e 2al J per una galattoc'inasi "per ingresso nel metabolismo%. =l meccanismo ed il tipo di regola ione ? uguale a #uelli dell3operone lac. .a di!!eren a sta nel !atto c'e il repressore 2al non si lega ad un sito c'e si sovrappone al promotore e #uindi non blocca il legame con l3<-A pol* piuttosto interagisce con essa impedendogli la transi ione da complesso c'iuso ad aperto. =l gene per il repressore non !a parte dell3operone gal. .3operone arabinosio contiene i geni ara, c'e codi!ica per la proteina Ara, "repressoreTattivatore%, araA, araA e araC c'e vengono trascritti in dire ioni opposte rispetto ad ara,. Ci conseguen a viene a !ormarsi un trascritto ara, ed un trascritto araAAC trascritti in dire ioni opposte. -ella trascri ione dell3operone sono coinvolte le ,A+ e l3attivatore Ara,. =l promotore dell3arabinosio ? molto !orte, per #uesto viene usato nei vettori di espressione. .3operone viene trascritto in assen a di glucosio ed in presen a di arabinosio. =n presen a di arabinosio, Ara, si lega come dimero al C-A, piB precisamente a livello delle due met adiacenti dei siti araI1 e araI6. =n assen a di arabinosio, Ara, assume una con!orma ione diversa c'e lega il C-A in maniera di!!erente: un monomero va a legarsi ad araI1 mentre l3altro si lega ad araI6, il #uale si trova a 1@& pb di distan a. =l C-A compreso !orma un loop* in #uesto modo araI6 non ? associato a nessun monomero e, poic'? ? il sito associato all3attiva ione, non avviene l3attiva ione. Ci conseguen a la stessa proteina ? attivatore in presen a di arabinosio e repressore in sua assen a. (ubito a monte dei siti araI1 e araI6 ? presente un sito per ,A+ c'e si lega solo in assen a di glucosio !avorendo l3attiva ione. ,A+ indica sempre se ? presente glucosio. (e non ? presente viene sbloccata l3espressione di un determinato gene in rela ione al ucc'ero di cui necessita l3organismo. 11.0/ Re#olazione !o"iti-a e ne#ati-a .a regola ione pu8 essere: 7 negativa, se coinvolge la presen a di un repressore 7 positiva, se coinvolge la presen a di un attivatore. A loro volta, i repressori e gli attivatori possono essere inattivi e devono essere attivati da segnali speci!ici, oppure essere attivi e subire una disattiva ione da parte di determinati segnali. .a combina ione di due o piB attivatori eTo repressori c'e interagiscono tra di loro e con il C-A costituisce una regola ione piB !ine in rela ione alle necessit cellulari. >uesto aumenta la sensibilit nei con!ronti delle condi ioni ambientali. ,onsiderando gli esempi di operoni trattati:

7 regola ione positiva: operone lac tramite ,A+ 7 regola ione negativa: operone lac tramite repressore lac operone gal tramite repressore gal operone trp

11.10 Meccani"mo di atti-azione e re!re""ione Kedi risposta 11.1/. 11.11 Re#olazione !roteina !%$ V una proteina c'e lega il C-A a singolo !ilamento. (e viene prodotta in eccesso oppure se non ? piB disponibile C-A a singolo !ilamento a cui associarsi, essa si lega al suo stesso trascritto di m<-A codi!icante in un regione ricca di A5* ne consegue il blocco della tradu ione. 11.1$ O!eroni ri7o"omiali <egolano ed includono i geni per gli r<-A e per le proteine ribosomiali* sono organi ati in operoni, ciascuno contenente !ino a 11 geni. =n #uesti operoni sono inclusi anc'e i geni per le subunit , e dell3<-A polimerasi, in accordo con il !atto c'e la sintesi di #uesti prodotti aumenta con l3aumentare della velocit di crescita cellulare. =l principale controllo avviene a livello della tradu ione e non della trascri ione. =n!atti, le proteine ribosomiali !ungono da repressori della loro stessa tradu ione, legando l3m<-A a livello della se#uen a d3ini io di uno dei due geni dell3operone ed impedendo il legame dei ribosomi e #uindi la tradu ione. V su!!iciente c'e una sola proteina sia in eccesso perc'? venga repressa la tradu ione di tutti i geni dell3operone. >uesto permette di sinteti are i componenti ribosomiali solo in #uantit correlate alle reali necessit della cellula. 11.1% Controlli !o"t@tra"crizionali =l meccanismo sopra descritto ? un esempio di controllo a livello della tradu ione. 11.1& Atti-atori e re!re""ori .e loro caratteristic'e sono gi state descritte. Alcuni esempi: 7 attivatori ; ,A+ -tr,, controlla l3espressione di geni per il metabolismo di Mer<, attiva gene codi!icante per resisten a al mercurio -tr, e Mer, sono attivatori allosterici, ossia inducono la transi ione della pol a complesso aperto. 7 repressori ; lac, gal

11.1( Ri"!o"ta "trin#ente .a risposta stringente si attiva in seguito ad una caren a di aminoacidi. = ribosomi in stallo legano t<-A scaric'i e #uesto attiva la proteina <E.A "p65%, legata alla subunit 51(. >uesta catali a la !orma ione di ppp2pp a partire da 25+ F ++i "c'e proviene da A5+%. =l ppp2pp viene idroli ato a pp2++, il cui ruolo ? d attivare l3espressione dei geni per t<-A, r<-A ed altri operoni a !avore dell3attiva ione degli operoni biosintetici e catabolici. =n!atti, pp2pp si lega all3<-A pol, la #uale a sua volta riconosce #uesti operoni. >uesto promuove la sintesi degli aminoacidi e il loro ri!ornimento dalla dieta. (ono detti promotori stringenti #uelli il cui riconoscimento ? alterato da pp2pp. A stringen a negativa sono #uelli degli r<-A e dei t<-A, a stringen a positiva #uelli per la sintesi di aminoacidi.

11.1) RNA anti"en"o V un <-A a singolo !ilamento complementare a #uello c'e voglio regolare. .3utili o di tali <-A !a s$ c'e per appaiamento si !ormi un <-A a doppia elica c'e non permette la tradu ione "impedisce, ad esempio, il legame del ribosoma%. =l meccanismo ? lo stesso c'e coinvolge si<-A e mi<-A.

1$. Re#olazione dell=e"!re""ione #enica ne#li eucarioti 1$.01 Li-elli di e"!re""ione -on tutti i geni sono espressi allo stesso livello. = geni c'e sono sempre espressi sono i cosiddetti geni 'ouseHeeping* altri geni, #uali #uelli ribosomiali e dei !attori di allungamento, sono invece mantenuti #uasi sempre ad un elevato livello di espressione* altri geni ancora sono espressi molto raramente "es. en imi per la ripara ione% oppure solo in speci!ici tessuti, andando a determinare il di!!eren iamento cellulare.

1$.0$ unti di controllo

= punti di controllo dell3espressione genica eucariotica sono molteplici. Civersi sono, in!atti, i passaggi c'e portano dalla trascri ione del C-A alla proteina. = punti di controllo principali sono 6: 1. ,ontrollo trascri ionale "prima ancora anc'e regola ione dell3accesso al C-A% 6. ,ontrollo della matura ione del pre7m<-A :. ,ontrollo del trasporto e della locali a ione dell3m<-A @. ,ontrollo tradu ionale 5. ,ontrollo della degrada ione dell3m<-A 6. ,ontrollo dell3attivit della proteina .a di!!eren a rispetto ai procarioti sta nel !atto c'e #ui ci sono molte se#uen e regolatrici e spesso #ueste sono posi ionate in punti molto distanti dal promotore, mentre nei procarioti tali se#uen e erano subito a monte o a valle del promotore. 5utte #ueste se#uen e devono poter interagire con il promotore e con l3<-A pol legata ad esso: #uesta intera ione ? mediata da proteine in grado di legare da una parte il C-A "attraverso domini conservati% e dall3altra le proteine coinvolte nell3espressione. 1$.0% roteine c'e "i le#ano al DNA (ono proteine in grado di riconoscere e legarsi alle se#uen e regolatrici sen a c'e la doppia elica venga aperta. =l riconoscimento delle se#uen e avviene a livello del solco maggiore dove sono presenti sc'emi caratteristici per ogni coppia di basi. 0ormano poi legami D con #ueste basi. = domini di #ueste proteine attraverso i #uali vengono riconosciute le se#uen e sono altamente conservati: elica7giro7elica, elica7ansa7elica, dita di inco e cerniera di leucine. 1$.0& Elica@#iro@elica V un motivo comune alle proteine procariotic'e c'e legano il C-A. V costituito da 6 7elic'e legate da un tratto aminoacidico non strutturato. En 7elica ? di riconoscimento e si inserisce nel solco maggiore riconoscendo speci!ic'e se#uen e e !ormano legami D, l3altra 7elica contatta lo sc'eletro di ucc'eri7!os!ato del C-A, aiutando il posi ionamento corretto dell37elica di riconoscimento ed aumentando le !or e di legame. 5ale motivo ? riscontrabile nelle proteine omeotic'e c'e contengono un omodominio costituito da : 7elic'e: 6 di #ueste !ormano il motivo elica7giro7elica, la ter a si inserisce nel solco maggiore. (ono proteine altamente conservate coinvolte nello sviluppo dell3organismo.

1$.0( Elica@an"a@elica ,ostituito da due 7elic'e, una piB lunga ed una piB corta, separate da un3ansa !lessibile c'e permette a #ueste due elic'e di compattarsi l3una con l3altra. .37elica piB lunga ? coinvolta sia nel riconoscimento del C-A sia nella dimeri a ione con l3 7 elica piB corta. Ci conseguen e proteine c'e contengono tale dominio !ormano dimeri attraverso l3intera ione dell37elica corta e di parte di #uella lunga.

5alvolta l3eterodimeri a ione, an ic'? aumentare il numero di siti riconoscibili, masc'era il dominio di legame e rappresenta un meccanismo repressivo.

1$.0) Dita di zinco .3atomo di On interagisce con i residui di Dis* spesso, in!atti, due residui di Dis sono a livello di un37elica, #uella di riconoscimento, mentre due ,)s sono all3interno di un !oglietto "oppure @ ,)s%. .3intera ione dell3atomo di O- con #uesti stabili a e mantiene nella posi ione l3intera struttura. Alcune proteine contengono piB domini di tipo collegati l3uno all3altro con un legame coda* maggiore ? la lung'e a del legame riconosciuto, maggiore ? la speci!icit. #uesto dominio il !attore di trascri ione per l3espressione dell3r<-A 5(. ,)s ed presenti presenti residui corretta #uesto testa7 +ossiede 50IIIA

1$.0* Cerniera di Leucine .a leucina ? un aminoacido idro!obico c'e tende a dimeri are, la sua parte basica interagisce con il C-A. >uesto motivo ? responsabile, appunto, della dimeri a ione delle proteine c'e lo contengono. ,iascun monomero ? un37elica, cos$ c'e il dimero ? composto da due lung'e 7elic'e c'e !ormano una pin a attorno al C-A.

Lgni elica si inserisce in modo diametralmente opposto nel solco maggiore della doppia elica. .a dimeri a ione, invece, ? mediata da un altro sito del dominio ricco in .eucine e altri residui idro!obici opportunamente disposti l3uno rispetto all3altro. =n modo vengono a stabilirsi intera ioni idro!obic'e tra due domini leucine ipper e #uindi vengono a !ormarsi brevi tratti a coiled7coil !ra le due elic'e.

+roteine contenenti #uesti @ domini possono !ormare sia omodimeri c'e eterodimeri, con il vantaggio di poter riconoscere un numero maggiore di siti nel momento in cui ogni monomero riconosce siti diversi. >ueste proteine in grado di legare il C-A non presentano, invece, domini di attiva ione cos$ conservati e de!initi. = domini c'e presentano #ueste proteine attivatrici sono: 7 domini di legame al C-A 7 dominio attivatore 7 domini di connessione "ad esempio si lega ad un coattivatore, il #uale !un iona solo se legato all3attivatore connesso al C-A% = primi due sono sempre presenti. 1$.0+ Le#ame coo!erati-o Molti attivatori lavorano insieme in modo sinergico, ossia il loro e!!etto ? molto maggiore rispetto alla somma degli e!!etti dei !attori presi singolarmente. >uesto avviene ad esempio se 6 attivatori reclutano un singolo complesso contattandolo in due punti* oppure due attivatori possono necessitare di un mutuo aiuto, cio? si legano in un punto solo gra ie al legame dell3altro. >uesta cooperativit si mani!esta anc'e se un attivatore recluta una molecola essen iale per il legame di un secondo attivatore. =l legame cooperativo classico consiste nel reclutamento, da parte di un attivatore, di un modi!icatore c'e !acilita il legame di un secondo attivatore. .a sinergia ? invece essen iale per l3integra ione del segnale da parte di piB attivatori. (i pu8 ottenere un controllo combinatorio mediante la regola ione dell3espressione attraverso la combina ione di diverse proteine regolatrici. =l concetto ? lo stesso della regola ione dell3operone lac c'e coinvolge ,ap e repressore lac. 1$.0/ .A.A 7oI 7indin# !rotein Kedi risposte /.16 e /.18.

1$.10 Struttura dei !romotori eucariotici Kedi risposta /.15. <icorda regione di controllo dei geni, l3intero complesso di C-A coinvolto nella regola ione e nella trascri ione "promotore F se#uen e regolatrici%. 1$.11 En'ancer e Silencer En en'ancer, o ampli!icatore, aumenta l3attivit del gene. +u8 essere distante anc'e molte migliaia di pb dal promotore, a monte, a valle e talvolta all3interno degli introni. +ossono essere presenti molteplici en'ancer* in tal caso verranno a !ormarsi diverse anse. En silencer ? una se#uen a a cui si associano repressori trascri ionali. 2li insulator, invece, sono se#uen e c'e si interpongono tra gli en'ancer ed il promotore* #uesto perc'? tra l3en'ancer ed il gene regolata possono essere interposti altri geni c'e non devono essere espressi. >ueste se#uen e isolatrici, o elementi di con!ine, interagiscono con apposite proteine di riconoscimento, le #uali, interagendo esse stesse con le proteine attivatrici legate agli en'ancers, impediscono c'e #uesti attivino il promotore dei geni c'e non devono essere trascritti. +ossono anc'e svolgere un ruolo opposto sc'ermando i geni dall3espansione dell3eterocromatina ed evitando, #uindi, c'e #uesti non vengano trascritti. 2li isolatori si trovano spesso nelle anse, in particolare alla base di esse, cos$ c'e le anse prima e dopo di tali elementi vengano compattate in eterocromatina, mentre l3ansa compresa !ra l3isolatore viene saltato nel processo di eterocromati a ione. =n #uesto modo vengono de!initi dei domini di espressione genica indipendenti. Ad esempio .,< associato ad un isolatore c'e !a in modo c'e venga in!luen ato solo il gene per le globine. 1$.1% Re#olazione dei #eni durante lo "-ilu!!o .e strategie utili ate per istruire le cellule ad esprimere un determinato set di geni e #uindi a di!!eren iarsi sono :: 1. locali a ione dell3m<-A 6. contatto cellula7cellula :. segnala ione mediante molecola secreta 1. 2li m<-A codi!icanti per un attivatore o un repressore sono locali ati in maniera asimmetrica, in modo tale da creare un gradiente diverso di #uesti prodotti genici nella cellula. >uesto ? molto evidente, ad esempio, nello sviluppo della Crosop'ila Melanogaster* lo igote di tale organismo va incontro a / divisioni cellulari sen a citodieresi con !orma ione di un sinci io a 168 nuclei. 6.7 :. -el contatto cellula7cellula le molecole segnale rimangono associate alla membrana plasmatica e #uindi in!luen ano solo #uelle cellule c'e sono in contatto !isico con esse. (e invece la molecola viene secreta nella matrice eMtracellulare, esse possono agire a distan a e molto spesso sono responsabili delle in!orma ioni posi ionali. >ueste molecole, in!atti, si possono distribuire in modo da !ormare un gradiente eMtracellulare, cos$ c'e le cellule dell3embrione vicine alla sorgente di #ueste molecole segnale ricevano una concentra ione maggiore della molecola, con conseguente sviluppo in una determinata dire ione.

>uelle piB distanti ricevono, invece, concentra ioni progressivamente minori e di conseguen a prendono una dire ione di sviluppo di!!erente. >uesto consente uno sviluppo ed un di!!eren iamento diverso a seconda della posi ione delle cellule embrionali. .e molecole segnale c'e controllano l3in!orma ione posi ionale sono talvolta c'iamate mor!ogeni. >ueste sono molecole segnalatrici a lungo raggio c'e di!!ondono creando un gradiente di concentra ione c'e spinge la cellula al di!!eren iamento in base alla posi ione. .e molecole segnalatrici, sia c'e siano secrete sia c'e siano associate alla membrana, sono riconosciute da un recettore speci!ico della cellula ricevente, il #uale attiva varie vie mediante il processo di trasdu ione del segnale. Ena stessa cellula ? di norma sottoposta a regola ione da parte di combina ioni di!!erenti di piB proteine regolatrici, mediante il gi citato controllo combinatorio. >uindi piB proteine regolano un gene, ma una proteina regolatrice pu8 anc'e regolare piB geni. 1$.1$ .ra"crizione in !re"enza di cromatina 1$.1& Acetilazione della cromatina =l compattamento in cromatina del C-A eucariotico rappresenta un problema all3accesso del macc'inario regolatorio e trascri ionale ai geni bersaglio. =ntervengono #uindi dei processi di rimodellamento della cromatina. .e principali proteine c'e sono coinvolte nel rilassamento della !ibra 11T:1 nm sono le istone acetiltrans!erasi DA5% e le istone deacetilasi "DCA,%* le prime introducono un gruppo acetile alle code istonic'e, le seconde le rimuovono. +oic'? il gruppo acetilico ? carico negativamente, esso attrae caric'e positive degli istoni basici c'e normalmente si associano alle caric'e negative del C-A. =n #uesto modo la !ibra si rilassa, la cromatina respira e i promotori diventano piB accessibili. .3a ione delle DA5 e delle DCA, ? indiri ata da speci!ici attivatori o inibitori c'e indicano anc'e in #uali posi ioni tali en imi devono agire* gli attivatori portano ad iperacetila ione, gli inibitori a deacetila ione. Lltre a rendere il C-A piB o meno accessibile, l3acetila ione crea degli sc'emi di acetila ione c'e si associano con le proteine c'e attivano i geni* ad esempio uno di #uesti sc'emi viene riconosciuto da due bromodomini del 50IIC. >uesti bromodomini sono distan iati di /5 f e !ormano delle tasc'e di 161 aa c'e accolgono le code acetilate. -el processo di rimodellamento intervengono poi altri complessi proteici: vengono a !ormarsi, #uindi, complessi di modi!ica ione costituiti da proteine di indiri o, acetilasiTdeacetilasi e altre proteine di rimodellamento della cromatina. Copo aver rilassato la cromatina e aver reso accessibile il promotore, i nucleosomi presenti devono essere in #ualc'e modo spostati, in #uanto solo per l3ingresso dell3<-A pol devono essere rimossi un paio di nucleosomi "<-A pol ; 511 HCa, nucleosoma ; 661 HCa%. =ntervengono allora le proteine c'e rimodellano la cromatina (G=T(-0 A5+7dipendente* #uesti sono !attori di rimo ione degli istoni c'e s!ruttano l3idrolisi di A5+. >uesti possono agire mediante due meccanismi: 7 scivolamento del nucleosoma con libera ione del C-A di interesse "solitamente non avviene% 7 distacco del nucleosoma a cui conseguono due situa ioni possibili. 2li istoni del nucleosoma c'e si distaccano a valle, in!atti, vanno a riassociarsi a monte* due sono i modi in cui #uesto pu8 avvenire: 1. l3ottamero si dissocia cos$ com3? e poi va a riassociarsi al C-A piB a monte 6. gli istoni si dissociano, lasciano passare l3<-A pol ed in seguito si riassociano.

(tudi con isotopi radioattivi per marcare gli istoni 'anno dimostrato la seconda ipotesi, in #uanto #uando l3ottamero si riassembla ingloba istoni casualmente !ra #uelli radioattivi. <iassumendo: Acetila ione delle code istonic'e ; attiva ione Metila ione code istonic'e ; repressione 0os!orila ione coda di D: ; associata alla cromatina supercondensata mitotica. .a !os!orila ione aumenta le caric'e negative c'e, attratte dalle caric'e positive, aumentano la compatta ione. 1$.1( Controllo della metilazione del DNA .a trascri ione pu8 essere negativamente regolata dall3a ione di en imi come la C-A metilasi, c'e inducono la metila ione del C-A a livello della citosina, con !orma ione di 57Metilcistosina in una se#uen a detta ,p2. =l gruppo metile sporge ed impedisce il legame di proteine regolatrici a livello del solco maggiore. >uesto processo ? tipico dei vertebrati. .a metila ione ? solo la conseguen a della decisione di silen iare un gene "ad esempio #uando ? assente la proteina regolatrice%* la metila ione c'e ne consegue viene riconosciuta da proteine c'e reclutano le DCA, e le istone metilasi, le #uali modi!icano al cromatina in !avore di un maggior compattamento. >uando poi avviene una replica ione, il silen iamento di un gene per metila ione viene mantenuto anc'e sulla nuova elica gra ie all3a ione di una metilasi di mantenimento. V un processo reversibile ed epigenetico correlato all3imprinting* esso ra!!or a il silen iamento di un gene ma se le necessit cellulari si modi!icano tale gene pu8 essere demetilato con conseguente espressione del gene stesso. Eno dei due cromosomi I ? completamento metilato e #uindi inattivo "corpo di Aarr% 1$.1) I"ole C!G =l gruppo metile legato al ,5 della citosina altera la struttura della base c'e cos$ sporge nel solco maggiore. =l problema sta nel !atto c'e , tende a deamina ione spontanea* se #uesto avviene a livello della 57Metil, non si andr a costituire uracile, c'e viene riconosciuto e riparato, bens$ timina, una base legittima del C-A c'e se non viene riparata porta a transi ione. +er #uesto motivo la se#uen a ,p2 ? molto meno !re#uente nel genoma rispetto alla !re#uen a di 1T16 c'e ci si aspetterebbe. Ki sono invece delle one del genoma dove la !re#uen a di ,p2 ? molto piB elevata: vengono #ueste c'iamate isole ,p2 e corrispondono a #uelle one sempre attive e contenenti i cosiddetti geni 'ouseHeeping in #uanto corrispondono a se#uen e mai metilate "ad esempio A+<5, adenina !os!oribosil trans!erasi, gene 'ouseHeeping con ,p2 elevata%. (+71 ? un !attore di trascri ione c'e si lega al doppietto ,p2 e #uindi spesso ? coinvolto nella trascri ione di geni 'ouseHeeping. =l C-A con se#uen e ,p2 ? u adiuvante per la risposta immunitaria: un C-A c'e presenta molte se#uen e di #uesto tipo viene riconosciuto come estraneo e #uindi stimola la risposta immunitaria.

1$.1* Siti i!er"en"i7ili alle DNAa"i .e C-Aasi non riescono ad agire nelle regioni di silen iamento genico dove il C-A ? altamente compattato. .e regioni ipersensibili alle C-Aasi sono invece attive e #uindi il C-A ? aperto "poc'i nucleosomi%.

5rattando cellule diverse con C-Aasi si osservano siti con diversa sensibilit, il c'e ri!lette la di!!erente espressione genica ed il diverso grado di silen iamento. =l sito piB sensibile alle C-Aasi del gene per le globine ? la .,< "sito di regola ione%. 1$.1/ Re#olazione dei clu"ter #lo7inici (ul cromosoma 11 l3organi a ione dei geni per le globine segue l3ordine temporale in cui #ueste vengono espresse: globina , globina , globina e . =l sito piB sensibile del gene per la globina ? la regione .,< "locus control region%, ossia la regione di regola ione* essa attiva il primo gene adiacente "globina %, poi #uesta si inattiva e .,< passa ad attivare #uello seguente "globina %, e cos$ procede per tutte lo globine. (ubito dopo la !econda ione avviene la demetila ione a livello dei geni delle globine !etali, mentre nell3embrione i geni per le globine adulte sono metilate. Alla nascita vengono demetilate #uest3ultime e soppresse #uelle !etali. -elle cellule non eritroidi i geni globinici restano sempre metilati.

1$.$0 Atti-azione delle !roteine .3attiva ione delle proteine pu8 avvenire per !os!orila ione, de!os!orila ione, proteolisi, rimo ione di un inibitore, controllo dell3emivita di una proteina e pu8 essere mediata da segnali eMtracellulari #uali #uelli ormonali c'e scatenano una trasdu ione del segnale. 1$.$1 .ra"duzione del "e#nale ,oinvolge ormoni, citoc'ine, !attori di crescita c'e coinvolgono recettori associati a laH "lanus Hinases% c'e dimeri ano e si !os!orilano a vicenda. =n particolare la trasdu ione pu8 coinvolgere (5A5 "segnale di trasdu ione e attivatore della trascri ione% c'e si lega a laH e viene da esso !os!orilato* un dimero di (5A5 entra #uindi nel nucleo ed attiva gene bersaglio. =n alternativa, la !os!orila ione per attivit c'inasica dei recettori crea nuovi siti di legame per altre proteine "ad esempio recettori associati a proteine 2%. En3importante proteina coinvolta nella regola ione trascri ionale ? -07JA "!attore nucleare JA%* #uesto regola geni coinvolti nella risposta in!iammatoria e immunitaria legandosi alla se#uen a consenso JA del promotore. V inoltre coinvolto nella proli!era ione e nell3apoptosi. 5ra i membri di tale !amiglia troviamo p51Tp115 e pT56Tp111 " nei batteri <elA p65, risposta stringente%. -07JA viene inibito da =JA c'e lo trattiene nel citoplasma* ? attivo nella !orma acetilata, nella !orma deacetilata dal nucleo torna al citosol e si lega ad =JA. Kiene degradato da esposi ione a citoc'ine, EK, radicali dell3ossigeno e tossine. 1$.$$ S!licin# alternati-o Kedi risposta 8.61.

1$.$% Re#olazione !o"t@tra"crizionale Ci!!erenti sono le situa ioni di regola ioni post7trascri ionali. .a regola ione del trasporto attraverso il complesso dei pori nucleari ? il primo punto di controllo post7trascri ionale. .3m<-A maturo deve essere trasportato dal nucleo al citosol attraverso il complesso dei pori nucleari "-+,%, il #uale permette il trasporto attivo dell3m<-A. >uest3ultimo viene riconosciuto come integro e maturo gra ie alla presen a del cap 53, della coda poli7A e delle proteine (<* la presen a di 'n<-+ pu8 invece signi!icare la presen a di introni e #uindi determinare il trattenimento dell3m<-A nel nucleo. 0inc'? l3m<-A ? nel nucleo non pu8 avvenire la tradu ione. En secondo punto di controllo ? la locali a ione dell3m<-A. >uesto, in!atti, pu8 essere gi posi ionato nel punto in cui avviene la tradu ione* ? ci8 c'e accade per l3m<-A c'e codi!ica per l3actina, il #uale viene gi posi ionato nel punto in cui la proteina polimeri a.

=n!ine l3editing dell3m<-A ? un ulteriore punto di controllo post7trascri ionale. 5ale processo pu8 modi!icare la se#uen a dell3m<-A dopo c'e #uesto ? gi stato trascritto* ? un !enomeno di regola ione al !ine di ottenere prodotti di!!erenti da uno stesso trascritto. Cue sono i meccanismi principali: 1. deamina ione sito7speci!ica: 7 da , a E, avviene in modo tessuto7speci!ico e regolato. Ad esempio l3m<-A per l3apolipopotreina A subisce una deamina ione da ,AA ad EAA, #uesto avviene per8 solo nelle cellule intestinali. 7 da A ad =, catali ato da ACA<, adenosina deamminasi speci!ica per <-A 6. inser ione o dele ione di uridine diretta da <-A guida: osservata nei mitocondri del tripanosoma, ? una muta ione !rames'i!t "se : aggiunte allora +'e%. Eridine vengono inserite da <-A guida "g<-A% costituiti da @1781 nucleotidi. >uesti possiedono un3estremit 53, c'e ancora una ona centrale c'e rappresenta il punto in cui verranno inserite le E, ed un3estremit :3 con coda di poli7E. .3ancora riconosce una se#uen a sull3m<-A a valle della regione dove avviene l3aggiunta di E. (i !orma un <-A dupleM con un missmatc' per protrusione dell3<-A guida a livello del punto di inserimento di E sull3m<-A. A #uesto punto il sistema di ripara ione introduce una rottura sull3m<-A ed il nicH viene colmato con E, il #uale usa come stampo le A del g<-A c'e in preceden a aveva !ormato l3ansa protrudente. =n base a dove e a #uante A ci sono nel g<-A, vengono inserite le E sell3m<-A* un3<-A ligasi salda i nicH. 1$.$& Re#olazione mediante !roteoli"i .e proteine 2A2 entrano a !ar parte della matrice di un retrovirus solo dopo proteolisi* se non avviene proteolisi, non ? presente il core esposto responsabile dell3in!e ione. =l gene 2A2 codi!ica per matrice virale, proteine del capside e nucleoproteina. .a proteolisi libera da #uesto unico precursore i singoli componenti. 1$.$( RNA interference

V un !enomeno di silen iamento genico post7trascri ionale c'e s!rutta l3intera ione <-A7<-A mediata da una classe di piccoli <-A non codi!icanti: si<-A, mi<-A, tnc<-A e sn<-A. 5utti #uesti svolgono una !un ione di regola ione genica. 1. "iRNA, small inter!erence <-A, piccoli <-A a doppio !ilamento di 61766 nucleotidi c'e provengono solitamente dall3esterno "ad esempio per in!e ione virale%. (i generano da <-A ds piB lung'i e devono essere eliminati in #uanto mediano il silen iamento genico o il blocco trascri ionale. =l silen iamento avviene in #uanto si<-A ? complementare ad una determinata se#uen a* il suo appaiamento determina la degrada ione dell3<-A. >uesto pu8 essere s!ruttato per creare <-A ds arti!iciali complementari ad un m<-A c'e si vuole silen iare. 6. miRNA, micro<-A, piccoli <-A lung'i 1&765 pb, codi!icati dal genoma stesso talvolta solo in determinati periodi dello sviluppo. (ono trascritti prima come precursori, pre7mi<-A* #uesti 'anno una lung'e a di circa /1 pb con se#uen a interne complementari c'e vanno a !ormare !orcine. Kengono #uindi trasportati nel citoplasma dove un3endonucleasi, solitamente la C=,E< "<-A F <-Aasi%, taglia l3<-A per produrre corti dupleM da 61765 nucleotidi, i mi<-A. = mi<-A si legano al complesso proteico <=(, "<-A induced silencing compleM% il #uale lo guida all3m<-A target associandosi al :3 E5< di #uesto mediante complementariet imper!etta* la !orma ione di un dupleM causa il blocco trascri ionale ma non la degrada ione. >uesto ri!lette il diverso ruolo regolativo di si<-A e mi<-A. 2li si<-A 'anno origine dal processamento da parte di C=,E< di un <-A estraneo* #uesti sono per!ettamente complementari all3<-A della cellula ospite cui si appaiano provocando l3inibi ione della tradu ione e la degrada ione. = mi<-A non sono estranei bens$ vengono codi!icati dal genoma stesso* ne sono stati scoperti 511 nell3uomo. Essi svolgono un ruolo di regola ione post7trascri ionale ma non inducono la degrada ione come gli si<-A. (pesso vengono espressi temporaneamente in periodi dello sviluppo ed in modo tessuto7speci!ico. (ono inoltre coinvolti nelle neoplasie umane: bassi livelli di un mi<-A portano alla sovraespressione dell3m<-A target. Ad esempio una dele ione del mi<-A 15 e 16 porta a leucemia lin!atica cronica. :. tncRNA, tin) non coding <-A, scoperti di recente, 'anno una lung'e a di 61766 nucleotidi. Molti sono generati da processamento da C=,E<. -on posseggono !orte complementarit* non se ne conosce esattamente la !un ione. @. "mRNA, small modulator) <-A, gli ultimi ad essere scoperti, 'anno una lung'e a di circa 61 nucleotidi. (ono complementari a se#uen e genomic'e dette silencer neurone7speci!ici. =l silen iamento mediati da <-A inter!erence svolge #uindi un ruolo importante tanto per la di!esa verso <-A virali o verso elementi trasponibili c'e utili ano un intermedio a <-A, #uanto nella regola ione dell3espressione genica. =l processo di inter!eren a una volta innescato si propaga con ampli!ica ione dell3attivit di inter!eren a stessa* #uesto perc'? l3<-A ds c'e l3'a innescato viene rigenerato cos3 c'e il processo continui anc'e #uando tutto l3<-A di parten a ? stato degradato. 1$.$) Re#olazione dell=emi-ita delle !roteine .3ubi#uitina marca le proteine c'e devono essere degradate dal proteasoma Ci!!erente ? l3emivita delle proteine:

7 proteine del cristallino durano per tutta la vita 7 emoglobina 'a emivita di circa : mesi 7 recettori ormonali 'anno emivita molto breve 1$.$* Re#olazione del #ene della tu7ulina V una proteina simile alla p:6 batterica* ? una costituente dei microtubuli. >uando ? presente in eccesso si lega al proprio m<-A e !a in modo c'e #uesto venga degradato. 1$.$+ Ormoni #lucocorticoidi (ono ormoni steroidei, di!!ondono nella membrana, si legano ai loro recettori speci!ici. >uesti sono inattivi in assen a dell3ormone in #uanto legati a c'aperoni "'sp&1%* il legame dell3ormone libera ed attiva il recettore c'e migra nel nucleo. En esempio ? la regola ione dei corepressori (M<5 "silencing mediators%. >uesti sono corepressori legati al C-A c'e reclutano le deacetilasi* #uando il ligando si lega al recettore dell3ormone steroideo, (M<5 si distacca permettendo l3attiva ione del gene. 2li ormoni glucocorticoidi vengono rilasciati in condi ioni di digiuno e di intensa attivit !isica. Essi stimolano nel !egato l3espressione di geni per en imi metabolici al !ine di aumentare la produ ione di glucosio dagli aminoacidi. >uesti geni possiedono ungespressione massima solo dopo l3attacco del recettore7ormone al sito regolatore.

1%. E-oluzione molecolare 1%.01 RNA come enzima Aig Aang ; 1: miliardi di anni !a 0orma ione sistema solare ; 5 miliardi di anni !a Mondo a <-A ; circa @ miliardi di anni !a +rime cellule a C-A ; circa : miliardi di anni !a +rimi mammi!eri ; 6:1 milioni di anni !a Eomo ; 611 mila anni !a = ribonucleotidi compaiono molto prima rispetto a proteine e a C-A. .3<-A da solo ? stato in grado di costituire il !lusso in!orma ionale "C-A e proteine%. +rima si ? !ormato il primo polimero di <-A sen a l3ausilio di proteine, e #uesto 'a ric'iesto un tempo enorme. .a catalisi ? avvenuta attraverso il coinvolgimento di ribonucleotidi semplici. >uando poi due di #uesti polimeri primordiali si sono associati ? venuto a !ormarsi l3<-A a doppia elica, ora praticamente scomparsa. Ca un <-A a doppia elica si ? riusciti ad avere una polimeri a ione spontanea cos$ da ottenere piB copie. ,om3? avvenuto il passaggio da <-A a C-Ai V avvenuta mediante una ridu ione, ossia perdita di LD in posi ione 6 del ribosio, con conseguente !orma ione di deossiribonucleotidi. =n seguito vi ? stata anc'e l3a ione di primordiali trascrittasi inverse, ancora presenti nei retrovirus. Mediante #ueste prima si ? !ormato un C-A complementare all3<-A e poi C-A a doppia elica. -el nostro genoma troviamo le .5<, derivanti da se#uen e retrovirali. =n seguito l3<-A 'a dato origine alle proteine. +ensando ai diversi sistemi in cui l3<-A dimostra attivit catalitica otteniamo con!erma della teoria evolutiva: considerando lo splicing del gruppo I e II, perc'? negli eucarioti superiori si ?

arrivati al complesso dello spliceosomai >uesto avviene in correla ione all3aumento della complessit del genoma, in #uanto il riconoscimento delle se#uen e di splicing ? piB di!!icile essendo le se#uen e meno conservate. 1%.0$ Ri7ozimi (ono molecole ad <-A in grado di !un ionare come en imi, esempi tipici sono le telomerasi e la peptidil trans!erasi. = viroidi sono gli organismi piB piccoli a livello delle specie molecolari* sono virus ad <-A c'e possiedono anc'e solo 6117811 nucleotidi di <-A in grado di trasmettersi e replicarsi "nelle piante%. =l meccanismo di replica ione ? cos$ antico da non necessitare di proteine* nel momento in cui vogliono maturarsi le molecole di <-A assumono la con!orma ione a testa di martello costituito da : bracci di basi accoppiate ed una cavit conservata. >uest3ultima ? costituita da nucleotidi altamente conservati ed ? in #uesto sito c'e ? presente l3attivit catalitica. A livello del sito catalitico avviene il taglio attraverso un atomo di Mg c'e cattura un protone dalla citidina rompendo il legame !os!odiestere* di conseguen a avviene un autotaglio. V possibile riprodurre tale meccanismo* posso ri!ormare #uesta struttura con le se#uen e corrette conservate, usando un !ilamento en imatico ed uno c'e !inge da substrato "ad esempio un m<-A virale c'e voglio eliminare%. =brido #uindi il !ilamento substrato con un oligonucleotide in modo c'e venga a crearsi una struttura simile a #uella del viroide* a #uesto punto avviene il taglio. >uesta tecnica viene utili ata per costruire in vitro dei ribo imi in grado di riconoscere un determinato target da iniettare ed usare a scopo terapeutico. 1%.0% Rime"colamento e"onico .3uomo condivide molti domini proteici con altri organismi ma ? in grado di utili arli in riarrangiamenti molto piB complessi gra ie anc'e al rimescolamento esonico. En esempio di #uesto ? il gene per il recettore delle .C.. >uesto ? !ormato da una por ione c'e andr a costituire l3esterno della proteina "glicosilata% ed una por ione transmembrana. Ena di #ueste por ioni si trova pari pari nel gene per il complemento ,& mentre un3altra nel gene per il precursore di E20. 7 dominio E20 F #uello della c'imotripsina ; !attore =I 7 dominio di uroc'inasi F #uello di c'imotripsina ; plasminogeno 7 dominio di uroc'inasi F dominio di c'imotripsina F dominio di E20 ; uroc'inasi .e cellule primordiali 'anno subito crescita improvvisa con scambio genico poco selettivo* poic'? sono poi andati a costituirsi regni e specie, lo scambio ? attualmente selettivo e relativamente raro. .3albero !ilogenetico ? lo strumento base della genomica comparativa e descrive le divergen e tra organismi con!rontando se#uen e genic'e e proteic'e.

1%.0+ DNA mitocondriale

,ostituito da 1656& pb, viene espresso nella sua totalit, cio? sono pressoc'? assenti gli introni "ecce ione nel lievito ad esempio%. ,odi!ica per 66 t<-A, 6 r<-A "16( e 16(% e 1: proteine di : tipologie: citocromo ossidasi, -ACD deidrogenasi e A5+asi. .a trascri ione ? simmetrica, coinvolge entrambi i !ilamenti e determina la !orma ione di 6 <-A giganti: su uno avviene il taglio per ottenere 11 <-A con coda poli7A codi!icanti per 6 r<-A e alcuni t<-A* l3altro codi!ica per 8 t<-A ed 1 m<-A con coda poli7A. .3m<-A mitocondriale non possiede il cap 53 ma la poli7A polimerasi mitocondriali aggiunge post7 trascri ionalemente una coda di poli7A. .o splicing avviene solo nei rari casi in cui siano presenti degli introni. =l genoma mitocondriale ? molto compatto: 11 mtC-A per ogni mitocondrio, 811 mitocondri per cellula* va a costituire l31P del C-A totale. =l codice genetico ? particolare, e #uesto probabilmente 'a impedito il completamento del tras!erimento del genoma mitocondriale nel nucleo. .e dimensioni di mtC-A variano da !ung'i, protisti e animali* tuttavia il numero dei geni rimane simile: nell3uomo 16 Hb e :/ geni, nei vegetali 1867:66 Hb e circa 61 geni. =l C-A mitocondriale del lievito ? invece costituito da 8@111 pb ed il numero di geni ? vicino a #uello degli animali, possiede #ualc'e introne. 1%.0/ Ori#ine mitocondri .a teoria endosimbiontica a!!erma c'e i mitocondri deriverebbero da ancestrali batteri, dotati di metabolismo ossidativo, c'e sarebbero stati inglobati dalle cellule eucariote con conseguente mutuo bene!icio. (uccessivamente i batteri avrebbero tras!erito gran parte del loro materiale genetico a #uello cellulare, divenendo cos$ mitocondri. Lltre alla presen a di C-A mitocondriale, vi sono altre indica ioni c'e sostengono la teoria endosimbiontica: 7 =l cromosoma mitocondriale ? circolare, esattamente come il cromosoma batterico. 7 =l mitocondrio 'a un sistema di membrane "esterna ed interna% c'e ricorda molto il sistema membrana7parete c'e 'anno i batteri. 7 = mitocondri sono dotati, sulla loro membrana esterna, di porine, proteine tipic'e dei batteri. 7 Eucarioti e procarioti traducono in maniera leggermente diversa alcune delle triplette di cui ? composto il codice genetico. Ad esempio ci sono alcune triplette c'e nel batterio sono codoni di (5L+, mentre negli eucarioti codi!icano per un aminoacido, e viceversa. =l codice genetico dei mitocondri risulta essere piB simile a #uello batterico c'e non a #uello eucariote. 7 Analisi !ilogenetic'e 'anno dimostrato c'e i geni mitocondriali sono piB a!!ini ai geni dei batteri. 7 = mitocondri sono in grado di replicarsi in maniera indipendente, con un meccanismo c'e ricorda la replica ione batterica. 1%.10 Genomi cloro!la"tici = cloropoplasti 'anno avuto un3origine piB tarda rispetto ai mitocondri* derivano, in!atti, dall3endocitosi di un batterio !otosintetico c'e produceva ossigeno. =l genoma cloroplastico ? di dimensioni maggiori e possiede piB geni rispetto a #uello mitocondriale. +ossiede 115711: geni: :17:6 per t<-A @ per r<-A "16(, 6:(, @,5(, 5(% 61 per proteine ribosomiali : per <-A polimerasi :1 per tilacoidi 11 per -ACD deidrogenasi

7 V un genoma circolare e a doppia elica "1617161111 pb% 7 +ossiede una !orte somiglian a con i genomi batterici 7 +u8 presentare introni 7 +resenta geni c'e codi!icano per proteine preposte alla produ ione di lipidi, mentre i mitocondri li devono importare Ena dimostra ione di #uesta teoria ? la presen a di un introne di tipo I nel t<-A per la leucina sia nei cianobatteri "batteri !otosintetici% c'e nei cloroplasti.

1&. DNA ricom7inante 1&.01 Concetto di DNA ricom7inante V una se#uen a di C-A ottenuta dalla combina ione di materiale genetico proveniente da origini di!!erenti. =n particolare un !rammento di C-A estraneo viene integrato in un genoma in grado di riceverlo* #uello c'e si ottiene ? un C-A ricombinante, contenente anc'e il C-A estraneo. =n natura #uesto !enomeno avviene in ambito batterico mediante i processi di coniuga ione, trasdu ione e tras!orma ione. 1&.0$ .ra"formazione 7atterica .a tras!orma ione ? un evento naturale in diverse specie batteric'e "(. +neumoniae, D. =n!luen ae%* in tale processo intervengono una esonucleasi associata al recettore c'e idroli a uno dei due !ilamenti di C-A estraneo, e delle proteine di ricombina ione "<ecA% c'e consentono l3inserimento del !ilamento di C-A nel cromosoma. >uando la specie batterica in coltura "per esempio di streptococcus% diventa competente, libera delle proteine dette !attori di competen a, le #uali si legano a speci!ici recettori della cellula produttrice o adiacente e innescano una serie di modi!ica ioni a livello intracellulare, a partire dai #uali si 'a la derepressione "attiva ione% di alcuni geni c'e producono delle proteine. 5ra #ueste proteine vi ? unWautolisina c'e digerisce una por ione della parete cellulare batterica e #ui si legano una C-A7binding protein in grado di legare il C-A e una esonucleasi c'e digerisce uno di #uesti !ilamenti di C-A. =l !ilamento esogeno si combina col cromosoma batterico e, in seguito alla !orma ione di ponti a idrogeno con le basi omolog'e, si origina una struttura ibrida o eterodupleM.

1&.0% Coniu#azione 7atterica En batterio donatore pu8 tras!erire C-A "in !ase di replica ione% ad un batterio ricevente mediante la !orma ione di un pilus sessuale* attraverso il pilus passa il C-A. =l contatto ed il tras!erimento di C-A sono promossi da un plasmide speciali ato presente nella cellula donatrice* in particolare tale plasmide contiene il !attore 0, il #uale contiene un operone 5<A c'e codi!ica per le proteine del pilus sessuale. =l plasmide 0 ? una molecola di C-A circolare a doppio !ilamento di 111 Hb.

,irca il ::P dei geni del plasmide consiste di geni c'e controllano il tras!erimento del plasmide* la maggiore parte di #uesti geni codi!ica, come gi detto, per polipeptidi coinvolti nella costru ione del pilus. =l pilo, c'e 'a lung'e a di circa 1 m, aderisce alla cellula 07, ossia #uella non portatrice del plasmide 0 "0F%. Ena volta aderito alla cellula 07, il pilo si contrae avvicinando le due cellule* una stretta via di contatto si stabilisce attraverso le membrane delle cellule 0 F ed 07 adiacenti. =l completamento della connessione segnala ad un3endonucleasi codi!icata dal plasmide 0 di tagliare un !ilamento del C-A plasmidico in un segmento speci!ico "origine del tras!erimento%. .a cellula 0F estrude il !ilamento tagliato, attraverso la via di passaggio, nella cellula 07* una volta ricevuto, la cellula 07 sinteti a il !ilamento complementare, cosicc'? ora la cellula possiede il plasmide 0 "07 diventa 0F%. -el !rattempo, nella cellula 0F, un !ilamento neo7sinteti ato rimpia a #uello c'e ? stato tras!erito. 1&.0& Infezione fa#ica En batterio!ago o !ago ? un virus c'e parassita un determinato batterio. = batterio!agi piB complessi, come #uelli della serie 5, 'anno una !orma a spillo. .a testa contiene lWacido nucleico, sotto a #uesta si trova un collare, seguito da una coda c'e si s!rangia allWestremit libera in 5 o 6 !ibre. =l batterio!ago attacca il batterio !issando le !ibre su un punto preciso della super!icie del batterio. ,on un meccanismo di contra ione inietta il suo acido nucleico, mentre lWinvolucro proteico rimane allWesterno. Ena volta iniettato, il genoma !agico pu8 seguire due vie: 7 -el ciclo litico "tipico dei batterio!agi 5%, il !ago, dopo essersi legato speci!icatamente ad un batterio ospite, inietta nella cellula il proprio C-A. =l C-A della cellula ospite viene #uindi digerito: #uesto viene utili ato per la !orma ione di un nuovo C-A !agico. .a cellula ospite trascrive e traduce il C-A !agico producendo anc'e le proteine !agic'e. Ena volta completata la costru ione delle nuove particelle !agic'e, un en ima codi!icato dal C-A !agico causa la lisi della cellula ospite: le particelle !agic'e liberate possono ora dare ini io ad un altro ciclo. 7 -el ciclo lisogeno invece, il genoma !agico si integra in un punto speci!ico del cromosoma batterico. =n #uesto stato integrato, il !ago viene c'iamato pro!ago ed ? non in!ettivo. Lgni #ual volta il cromosoma batterico si replica, anc'e il pro!ago integrato viene replicato. En batterio c'e contiene un pro!ago ? detto XlisogenoX. .o stato di pro!ago ? mantenuto da una speci!ica proteina prodotta dal !ago stesso. =n rari casi, il pro!ago pu8 separarsi dal cromosoma stesso: lWallontanamento di #uesto repressore induce il ciclo litico.

1&.0( Clona##io (erie di tecnic'e ricombinanti con le #uali ? possibile ottenere piB copie identic'e di una certa molecola di C-A, c'e #uindi viene ampli!icata. >uesto termine pu8 comprendere anc'e il concetto di isolamento di un particolare tratto di C-A dal resto del C-A cellulare, poic'? l3isolamento ? !acilitato di molto dall3ampli!ica ione del C-A di interesse. Cue sono le principali tecnic'e di clonaggio: 7 .ibrerie di C-A, create utili ando vettori plasmidici, virali o arti!iciali "AA, o ]A,%. +ossono essere genomic'e o di cC-A. 7 +,<, permette di ottenere cloni genomici o di cC-A.

1&.0) Enzimi di re"trizione (coperti agli ini i degli anni 3/1, sono nucleasi, cio? en imi in grado di tagliare il C-A a livello di speci!ic'e se#uen e dette siti di restri ione. >uest3ultime sono se#uen e palindrome costituite da @78 nucleotidi. .a maggior degli en imi di restri ione riconosce siti di 6 nucleotidi, riscontrabili con una !re#uen a di 1T@6 "1 ogni 8111% in un C-A batterico lungo milioni di basi. .e se#uen e palindrome sono le seguenti per gli en imi di restri ione piB importanti: 7 E,L<1 ; 5342AA55,7:3 7 D+A1 ; 537255AA,7:3 7 D=-C III ; 537AA2,557:3 7 -L51 ; 5372,22,,2,7:3, 8 nucleotidi, !re#uen a del sito 1T@8 Ena volta riconosciute #ueste se#uen e, il taglio pu8 avvenire in modo s!alsato, con!orma ione di due code protrudenti tra loro complementari, estremit coesive o sticH) ends* oppure possono crearsi due estremit piatte o blunt ends. .a !un ione di #uesti en imi ? #uella di tagliare il C-A estraneo a livello di #uesti siti* ? #uindi una !un ione di di!esa. =l C-A batterico ?, in!atti, protetto da #uesti en imi in #uanto essi stessi metilano la propria se#uen a bersaglio a livello di A e ,. .3utili o delle tecnologie del C-A ricombinante ? notevole. =l taglio di due C-A con lo stesso en ima di restri ione crea estremit coesive in grado di appaiarsi e permettere l3integra ione di un !rammento estraneo "ad esempio un vettore plasmidico%. +er legare due estremit tagliata con la stessa nucleasi di restri ione ? necessaria l3a ione di C-A ligasi ed A5+. (e il punto di parten a sono due estremit coesive, #ueste si appaiano per complementariet con l3aiuto di C-A ligasi ed A5+. (e il punto si parten a sono due estremit piatte, ? necessaria l3a ione della ligasi del !ago 5@ e A5+. (e in parten a 'o un3estremit coesiva ed una piatta, ? necessaria l3a ione di una polimerasi e la presen a di d-5+ al !ine di creare un3estremit piatta su #uella coesiva. =n seguito l3a ione della ligasi del !ago 5@ e l3energia da A5+ saldano l3estremit piatta originale con la nuova estremit piatta. 5rattare C-A con nucleasi di restri ione permette inoltre di ottenere !rammenti divisibili ed individuabili attraverso elettro!oresi su gel, la #uale separa i !rammenti in base alla dimensione* a #uesto punto si possono anc'e applicare tecnic'e come il sout'ern o nort'ern blot. .a mappatura !isica del C-A 'a permesso anc'e di individuare una mappa dei siti di restri ione cos$ c'e si pu8 risalire ai siti di un cromosoma in cui possono avvenire i tagli. 1&.0* ?ettori !la"midici e -irali +er vettore s3intende un elemento genetico c'e si autoreplica, dentro il #uale viene inserito un particolare !rammento di C-A estraneo c'e si vuole clonare. >uesto vettore ? solitamente plasmidico o virale. =n!atti, dopo l3in!e ione in una cellula batterica da parte di plasmide o !ago portanti il C-A ricombinante, le capacit autoreplicative e la rapidit di divisione portano ad una rapida e notevole ampli!ica ione del !ilamento d3interesse "clonaggio%. = plasmidi sono elementi eMtracromosomici di C-A circolare, utili ati per la clona ione molecolare di !rammenti di C-A. Ena particolare tipologia di plasmidi sono gli episomi, ossia !ilamenti di C-A circolare ds mantenuti in !orma non integrata nel genoma. Esso pu8 essere di origine virale oppure pu8 derivare dalla non integra ione di un vettore plasmidico in seguito a tecnic'e di ricombina ione. 2li episomi possono presentare speci!ici geni, ad esempio geni per la resisten a ad antibiotici.

=n tal caso l3integra ione di tale episoma in un altro C-A batterico pu8 determinare la trasmissione della resisten a ad un antibiotico. 1&.0+ Sonde (ono molecole di C-A a singolo !ilamento utili ate per rilevare se#uen e complementari ad esse. +ortano marcatori radioattivi o c'imici per !acilitare la loro rileva ione. +ossono essere lung'i dai 15 ai 1111 nucleotidi, solitamente la lung'e a minima ? di 61 nucleotidi. >ueste sonde possono andare ad ibridarsi sia con C-A c'e con <-A* in #uest3ultimo caso si pu8 mettere in eviden a se uno speci!ico gene viene espresso in una cellula. >uesta tecnica viene anc'e utili ata per determinare la posi ione dei con!ini esoniTintroni: vengono se#uen iate le se#uen e di cC-A c'e rappresentano gli m<-A espressi in una cellula, con!ronto #uesta se#uen a con #uella dell3intero gene mediante ibrida ione. .e one del gene intero c'e non vengono ibridate con il cC-A "o m<-A maturato% sono gli introni. .e sonde possono essere utili ate per sout'ern e nort'ern blot, oltre c'e per le ibrida ioni in situ "0=(D%, o per individuare il !rammento di interesse in una libreria genomica o di cC-A.

1&.0/ Nort'ern0 Sout'ern e 5e"tern 7lottin# 1. (out'ern blotting .a (out'ern Alot ? una tecnica usata per rivelare la presen a di speci!ic'e se#uen e di C-A in una miscela complessa. +rende il nome dal suo inventore, EdQin Mellor (out'ern. +rocedura: 7 En campione eterogeneo di C-A genomico viene trattato con en imi di restri ione e successivamente sottoposto ad elettro!oresi su gel dWagarosio o di poliacrilammide. -el gel sar possibile osservare uno smear, ossia una striscia continua* non si vedranno bande nette perc'Y il C-A genomico digerito con lWen ima di restri ione 'a tantissimi punti di taglio, #uindi sul gel si troveranno tantissimi !rammenti c'e migreranno con velocit diverse in base al diverso peso molecolare.

7 =l gel viene immerso in una solu ione alcalina per denaturare il C-A* solitamente si tratta di una solu ione molto diluita di -aLD per un tempo pari a 15 minuti. 7 =l gel viene coperto da un !oglio di nitrocellulosa e sopra di #uesto viene posta una pila di !ogli assorbenti. +er capillarit la solu ione tender ad attraversare il gel, il !oglio di nitrocellulosa e risalir nei !ogli assorbenti. = sali trascinano i segmenti di C-A per!ettamente in verticale, depositandoli sullo strato di nitrocellulosa con il #uale i segmenti instaurano legami elettrostatici. Ca notare c'e in #uesto passaggio il C-A non sale gra ie a una !or a elettrica come nella prima elettro!oresi ma solo per capillarit. 7 =l !oglio di nitrocellulosa viene separato dal gel e immerso in una solu ione contenente una sonda marcata in vario modo "!luorescen a, radioattivit, ecc..% c'e ibridi a con se#uen e di C-A complementari presenti sul !oglio, identi!icandole. .a sonda viene creata con tecnic'e di ampli!ica ione del C-A. .Wibridi a ione della sonda con il C-A pu8 avvenire con diversi gradi di Xstringen aX a seconda delle !inalit dellWesperimento, consentendo una ibridi a ione con speci!icit anc'e in!eriore al 111P. 7 A seguito di lavaggio della nitrocellulosa per eliminare le sonde non ibridate, si !a una lastra !otogra!ica c'e metta in eviden a dove la sonda 'a legato il C-A genomico. 6. -ort'ern blotting =l -ort'ern blotting ? una tecnica c'e permette di visuali are ed identi!icare lW<-A puri!icato da un campione, in particolare per studiare lWespressione genica. 5ecnicamente, ? simile al (out'ern Alotting, con la di!!eren a sostan iale c'e lW<-A tende a !ormare strutture secondarie stabili in solu ione* per !are in modo c'e la mobilit elettro!oretica sia solo dipendente dalla lung'e a del !rammento, lW<-A deve essere preventivamente denaturato "solitamente esponendolo ad alte temperature%. =noltre, la corsa elettro!oretica deve essere eseguita in presen a di agenti denaturanti, solitamente !ormaldeide e !ormammide. +rocedura: 7 .W<-A viene riscaldato a circa /1 N, per :75 minuti, poi viene ra!!reddato rapidamente in un bagno di g'iaccio !ondente. Ena piccola #uantit di un agente denaturante viene aggiunta "solitamente !ormammide% per mantenere lW<-A privo di strutture secondarie. 7 .Welettro!oresi permette di !ra ionare lW<-A in base al peso molecolare, e #uindi in base alla lung'e a. Cato c'e lW<-A in solu ione a temperatura ambiente tende a !ormare strutture secondarie c'e ne alterano la mobilit elettro!oretica, un agente denaturante "ad esempio: !ormaldeide% ? aggiunto al gel. 2eneralmente, la corsa elettro!oretica avviene su gel di agarosio, a concentra ione variabile dallo 1.6P al 67:P, a seconda della lung'e a dellW<-A da identi!icare. +er visuali are lW<-A durante lWelettro!oresi, si pu8 utili are lWetidio bromuro, c'e si lega debolmente allW<-A ed emette luce !luorescente #uando esposto a luce ultravioletta. 7 .W<-A pu8 essere tras!erito su una membrana di n)lon utili ando il !enomeno della capillarit. =l gel viene preparato e incubato in una solu ione salina. .a membrana viene poggiata al di sopra del gel ed una pila di carta assorbente viene posta al di sopra della membrana. =l movimento dellWac#ua e degli ioni causa il tras!erimento dellW<-A dal gel alla membrana, alla #uale si lega mediante legami deboli. 7 +er identi!icare lW<-A in oggetto di studio si possono utili are diverse metodologie, ma la piB di!!usa prevede lWutili o di una sonda di C-A, cio? una se#uen a di C-A complementare allW<-A da identi!icare "da cui la de!ini ione di ibridi a ione o ibrida ione%. .a sonda ? spesso marcata con un isotopo radioattivo "ad esempio :6+% oppure con una molecola !acilmente individuabile con altre tecnic'e, ad esempio la digossigenina. 7 -el caso di un isotopo radioattivo, ? possibile rilevare la posi ione dellW<-A "legato adesso alla sonda marcata% esponendo la membrana ad una lastra !otogra!ica .

:. Gestern blotting =l Qestern blot o immuno!issa ione permette di identi!icare una determinata proteina in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi speci!ici* in generale, per !acilitare il riconoscimento, la miscela di proteine viene prima separata in base alle loro dimensioni "o peso molecolare% utili ando un gel di poliacrilammide "ma esistono varia ioni #uali il dot blot o slot blot, in cui la miscela proteica non viene separata in base alle dimensioni, ma ci si a!!ida alla selettivit antigeneTanticorpo%* successivamente le proteine vengono tras!erite su di un supporto, c'e comunemente ? una membrana di nitrocellulosa, e #uindi si procede al riconoscimento vero e proprio della proteina mediante lWutili o di un anticorpo speci!ico. <ecentemente sono state messe a punto tecnic'e c'e permettono il riconoscimento antigeneTanticorpo direttamente nella matrice del gel, evitando #uindi il tras!erimento su membrana. >uesta tecnica si usa #uando il campione corso ? composto da una miscela di moltissime proteine tali c'e con una colora ione standard "blu coomassie o nitrato di argento% non si riuscirebbe a distinguerle lWuna dallWaltra, oppure #uando, pur avendo bande ben distinte "discrete%, la proteina di interesse ? in #uantit troppo basse per essere visuali ata con altre tecnic'e. =n!atti il Qestern possiede tre passaggi in cui avviene lWampli!ica ione del segnale, ci8 rende visibili anc'e decimi di picomole "11711mol% di proteina.

1&.10 Cromo"omi artificiali di lie-ito ]A,, )eld arti!icial c'romosome, ? un cromosoma arti!iciale di lievito "(. ,erevisiae% c'e pu8 accogliere !rammenti molto grandi di C-A. En tipico ]A, ? cos$ composto: 7 6 5E. : se#uen e telomeric'e, assicurano la completa replica ione del C-A !ino all3estremit del cromosoma 7 ,E- : se#uen a centromerica, per la corretta segrega ione 7 L<= : origine di replica ione +resenta dei siti di restri ione, A e A, cio? geni per marcatori c'e !acilitano l3isolamento delle cellule di lievito c'e l3'anno assunto con successo. >uesti sono gli elementi necessari per il corretto !un ionamento del cromosoma arti!iciale come vettore. .3espressione del gene di interesse ricombinato in ]A, in una cellula eucariotica come #uella del lievito consente di esprimere geni eucariotici sen a le accorte e necessarie per l3espressione nei batteri "presen a di introni, modi!ica ioni del prodotto ecc%. =noltre consente di clonare !rammenti di C-A !ino a 116 pb. (ono uno strumento utilissimo per ottenere contigui "contig% di una regione cromosomica e costruire mappe !isic'e. = AA, "bacterial arti!icial c'romosome% sono attualmente il vettore pre!erito per costruire librerie di C-A di organismi complessi "anc'e l3uomo, sono stati utili ati per se#uen iamento genoma umano%. Kengono prodotti arti!icialmente sulla base del plasmide 0 di E. ,oli, in grado di clonare !rammenti di dimensioni dalle :11 alle 1111 Hb.

>uesto plasmide 0 "responsabile della !orma ione del pilus sessuale% e AA, sono presenti solo in 1 o 6 copie per cellula di E. ,oli e #uesto garantisce la capacit di conservare stabilmente grosse se#uen e di C-A clonato in #uanto sono meno probabili eventi di ricombina ione con se#uen e presenti su altre copie del plasmide. -el processo di coniuga ione il plasmide 0 pu8 integrarsi nel cromosoma batterico portando con s? parte del cromosoma batterico e tras!erendo anc'e #uest3ultimo. >uindi esistono due tipi di tras!erimento a seconda c'e il plasmide 0 sia indipendente o integrato nel cromosoma batterico. -el primo caso si duplica solo il plasmide ed una delle due copie passa attraverso il ponte citoplasmatico in !orma lineare integrandosi nel C-A della cellula ricevente. -el secondo caso, ini ia la duplica ione ed il punto di origine della replica ione ? anc'e l3ini io del C-A tras!erito. .a coniuga ione dura &1 min ed ? possibile bloccarla ed osservare le varie !asi di tras!erimento e mappare il materiale genetico. 1&.11 Li7rerie #enomic'e Ena libreria genomica ? composta da un set di se#uen e genomic'e c'e, prese insieme, rappresentano tutte le regioni del genoma dellWorganismo in #uestione. =l numero di cloni c'e costituisce una libreria genomica dipende da: 7 la grande a del genoma in #uestione* 7 la grande a dellWinserimento tollerata dal vettore di clona ione utili ato. Ena libreria genomica reali ata con vettori plasmidici "c'e possono contenere solo poc'e migliaia di paia di basi% sar ad esempio molto piB grande di una composta da vettori piB capienti "come ad esempio i AA,, c'e possono raggiungere le trecentomila bps%. Ena libreria genomica, #uindi, contiene cloni casuali di tutto il C-A, ? uguale per tutte le cellule di un organismo "salvo rare ecce ioni% ed ogni se#uen a presenta anc'e introni e por ioni regolatrici dei geni. 1&.1$ I"olamento di mRNA eucariotico Ci tutto l3<-A estraibile da una cellula, solo circa il @P ? m<-A codi!icante portante la caratteristica coda poli7A* #uesta caratteristica pu8 essere s!ruttata per isolare l3m<-A. .a tecnica s!rutta una colonna cromatogra!ica la cui matrice solida lega speci!icatamente la poli7A dell3m<-A, essendo costituita da un oligonucleotide 5. Call3<-A totale !atto percolare, viene trattenuto l3m<-A, mentre gli altri <-A passano attraverso al colonna. >uesto sistema viene utili ato per costituire le librerie cC-A c'e sono tipic'e per ogni tessuto e rappresentano tutto il corredo di geni espresso in un tessuto. 1&.1% Li7rerie di cDNA = cC-A sono C-A copia ottenuti dagli m<-A isolati in un determinato tessuto mediante l3a ione dell3en ima trascrittasi inversa* a di!!eren a del C-A originale i cC-A sono privi di introni e delle se#uen e necessarie per l3espressione del gene c'e non vengono trascritte. .a trascrittasi inversa utili a l3m<-A come stampo per !ormare ini ialmente un ibrido C-A7<-A* mediante l3attivit di <-Aasi D, la polimerasi degrada l3<-A lasciando alcuni !rammenti di <-A c'e vengono utili ati dalla C-A polimerasi come innesco nella sintesi del secondo !ilamento. Kiene #uindi a !ormarsi il cC-A.

Cai cC-A ? possibili ottenere una libreria di cC-A in #uesto modo: ogni cC-A viene inserito in un unico vettore plasmidico o virale inserito a sua volta in un3unica cellula batterica c'e viene !atta dividere. .a colonia di #uesto batterio rappresenta la clona ione del cC-A. .3insieme delle colonie, ciascuna contenente uno dei cC-A derivati dal contenuto totale di m<-A, va a costituire una libreria di cC-A. A!!inc'? il cC-A venga integrato nel vettore ? utile aggiungere alle sue estremit piatte dei linHers portanti siti di restri ione c'e vanno a !ormare sticH) ends dopo taglio nucleasico. Ena libreria di cC-A si distingue da una libreria genomica in #uanto: 7 cC-A contengono solo le regioni del genoma c'e vengono trascritte in m<-A 7 cC-A sono diversi da tessuto a tessuto perc'? dipendono dai pattern di espressione c'e sono tessuto7speci!ici. 7 cC-A contengono la se#uen a codi!icante non interrotta di un gene "sen a introni% >uesto ? molto importante se voglio risalire alla se#uen a di aa oppure se voglio !ar esprimere la proteina in lievito o batterio, in #uanto #uest3ultimi non riescono a !are splicing.

1(. .ecnolo#ie del DNA ricom7inante 1(.01 Anali"i di "e<uenze (ono tutte #uelle tecnic'e c'e permettono di studiare e determinare le se#uen e del C-A. (ono state ideate diverse strategie per ottenere la se#uen a nucleotidica del C-A. = primi metodi, tra cui #uello ideato da Allan MaMam e Galter 2ilbert nel 1&/: erano piuttosto complicati* una svolta si ebbe nel 1&/5 con la prima pubblica ione di una strategia en imatica tuttora di!!usissima, sviluppata da 0redericH (anger e collaboratori "il cosiddetto metodo dei terminatori di catena, c'ain termination met'od o metodo (anger, dal nome del suo scopritore%, c'e ricevette per #uesto il suo secondo premio -obel. EnWaltra strategia ini ialmente molto popolare ed utili ata !u sviluppata dagli stessi MaMam e 2ilbert nel 1&// ed ? conosciuta sotto il nome di metodo di MaMam e 2ilbert. +iB recentemente sono stati sviluppati nuovi metodi caratteri ati dalla capacit di se#uen iare molti !rammenti di C-A contemporaneamente "anc'e se con e!!icien a minore in termini di numero di basi se#uen iate per !rammento% aprendo una nuova era del se#uen iamento. >ueste metodic'e vanno sotto il nome di se#uen iamento ad elevato parallelismo. 1(.0$ Se<uenziamento c'imico V una tecnica ormai in disuso, una delle tecnic'e tradi ionali insieme al metodo en imatico ideato da (anger. >uesto due tecnic'e 'anno in comune la genera ione di una scaletta di !rammenta ione di C-A a singolo !ilamento, ciascuno piB lungo di un nucleotide rispetto al precedente* #uesti vengono separati con elettro!oresi su gel di poliacrilammide an ic'? di agarosio per permettere di separare !rammenti c'e appunro di!!eriscono di un solo nucleotide. =l se#uen iamento c'imico di MaMam72ilbert ? poco utili ato in #uanto non adatto al se#uen iamento automatico e per l3utili o di composti c'imici dannosi. >uest3ultimi tagliano il C-A a livello di basi speci!ic'e "nucleotidi singoli%.

Cal C-A si ottengono ini ialmente !rammenti per digestione en imatica* poi i !rammenti a doppio !ilamento devono essere convertiti a !ilamenti ss e marcati terminalmente al 53 o al :3 del doppio !ilamento con :6+, in seguito avviene la denatura ione. = campioni di C-A ss vengono divisi in @* ogni campione reagisce con un reagente c'imico diverso. Lgni reagente demolisce una o due delle #uattro basi "2, 2FA, ,F5, ,%. (tatisticamente tutte le possibili basi saranno degradate ottenendo cos$ !rammenti la cui lung'e a ? pari alla distan a tra l3estremit marata ed il sito di taglio. A #uesto punto utili o l3elettro!oresi parallela dei @ campioni* viene #uindi visuali ata la corsa elettro!oretica per autoradiogra!ia. .a banda piB piccola, e #uindi #uella piB vicina al polo positivo, ? al 53 e so determino #uale nucleotide ? al 53 in base al campione cui appartiene. (econdo #uesto principio proseguo lungo il gel e leggo la se#uen a.

1(.0% Se<uenziamento enzimatico =l metodo (anger ? un metodo cosiddetto en imatico, poic'Y ric'iede lWutili o di un en ima* il principio della tecnica sviluppata da 0red (anger si basa sullWutili o di nucleotidi modi!icati "dideossitri!os!ato, dd-5+s% per interrompere la rea ione di sintesi in posi ioni speci!ic'e. = nucleotidi dideossitri!os!ato sono molecole arti!iciali corrispondenti ai nucleotidi naturali, ma si di!!eren iano per lWassen a del gruppo idrossilico sul carbonio 6W e :W della molecola. = dideossinucleotidi, a causa della loro con!orma ione, impediscono c'e un altro nucleotide si leg'i ad essi, in #uanto non si possono !ormare legami !os!odiesterici. =l protocollo classico ric'iede un templato di C-A a singolo !ilamento, un primer per ini iare la rea ione di polimeri a ione, una C-A polimerasi, nucleotidi deossi e nucleotidi dideossi per terminare la rea ione di polimeri a ione. L un nucleotide normale o #uelli modi!icati o il primer devono essere marcati "radioattivamente o per !luorescen a% in modo da poter visuali are le bande dei !rammenti di C-A neosinteti ato dopo aver e!!ettuato lWelettro!oresi. =l campione di C-A da se#uen iare viene diviso in #uattro rea ioni separate, ognuna delle #uali contiene la C-A polimerasi e tutti e @ i deossiribonucleotidi "dA5+, d,5+, d25+, d55+%. Ad ognuna di #ueste rea ioni viene poi aggiunto solo uno dei #uattro nucleotidi dideossi "ddA5+, dd,5+, dd25+, dd55+% in #uantit stec'iometricamente in!eriore per permettere un3elonga ione del !ilamento su!!iciente per lWanalisi. .Wincorpora ione di un dideossinucleotide lungo il !ilamento di C-A in estensione ne causa la termina ione prima del raggiungimento della !ine della se#uen a di C-A stampo* #uesto d origine ad una serie di !rammenti di C-A di lung'e a diversa interrotti in corrisponden a dellWincorpora ione del nucleotide dideossi. = !rammenti generati da #ueste rea ioni vengono poi !atti correre su gel di poliacrilammide7urea c'e permette la separa ione dei vari !rammenti con una risolu ione di un nucleotide. Lgnuna delle @ rea ioni ? corsa su po etti vicini, dopodic'Y le bande sono visuali ate su lastra autoradiogra!ica o sotto luce EK, e la se#uen a viene letta direttamente sulla lastra o sul gel, a seconda del tipo di marcatura dei nucleotidi di deossi. 1(.0& Se<uenziamento con fluorocromi

An ic'? marcare i nuovi !ilamenti al 53 con :6+, utili o @ diversi !luorocromi, uno per ogni dd-5+, e an ic'? eseguire @ corse elettro!oretic'e in parallelo ne eseguo una sola lungo un tubo di gel di poliacrilammide. Man mano c'e scorrono i !rammenti, un laser ne rileva il colore* in #uesto modo si risale ai dd-5+. Kiene #uindi prodotto un cromatogramma con picc'i c'e vengono in seguito letti da un +, il #uale !ornisce la se#uen a nucleotidica. =l vantaggio ? c'e il processo consiste in un3unica rea ione ed inoltre viene eliminati il problema della variabilit intrinseca di ognuna delle #uattro corse c'e pu8 portare ad imprecisioni* in!ine il l3utili o di #uesto processo 'a permesso di automi are il se#uen iamento.

1(.0( CR .a +,<, rea ione a catena della polimerasi, ? un metodo di ampli!ica ione diretta di !rammenti di C-A* necessita, tuttavia, della conoscen a a priori della se#uen a di C-A. .a +,< non solo ampli!ica di 116 volte un !rammento ma ? anc'e in grado di puri!icare la regione sele ionata dal resto del genoma. V necessario c'e due oligonucleotidi vengano sinteti ati per !ianc'eggiare la se#uen a desiderata* #uesti devono !un ionare da primer per ognuno dei due !ilamenti "per #uesto ? necessario conoscere la se#uen a%. Avviene la ripeti ione molte volte di un ciclo composto da : !asi: 1. Cenatura ione a &@N, per :1761 s* ottengo due !ilamenti singoli c'e agiscono da stampo 6. Annealing a 51761N, per :1761 s* ibrida ione dei primer sinteti ati, uno per ogni !ilamento :. Estensione a /6N, per 17: min* sintesi di C-A ad opera della C-A pol termoresistente, "5A> polimerasi% estratta da un arc'eabatterio termo!ilo, c'e non viene denaturata ad alte temperature. = prodotti di ogni ciclo diventano i reagenti del ciclo successivo* di conseguen a viene ampli!icato il C-A in modo esponen iale. .e molecole di C-A prodotte per ogni ciclo sono 6m. ,i8 c'e ? importante nel metodo +,< ? anc'e la capacit di puri!icare il !rammento di interesse: dopo parecc'i cicli "617:1%, in!atti, la molecola di C-A predominante ? una singola specie di !rammento di C-A la cui lung'e a corrisponde alla distan a !ra i due primer originali. .a +,< rende possibile la clona ione molecolare sen a cellule di un !rammento di C-A in poc'e ore. 5racce di <-A possono essere sottoposte a +,< dopo trascri ione in C-A mediante a ione della trascrittasi inversa.

1(.0) Cloni #enomici e di cDNA mediante CR ,loni genomici: 1. +uri!ica ione C-A cromosomico 6. +,< con primer c'e !ianc'eggiano il tratto di C-A da clonare :. Copo molti cicli ottengo il C-A !ra i primer ampli!icato c'e corrisponde alla por ione di C-A c'e si voleva ampli!icare. (i ottengono cos$ cloni genomici ,loni di cC-A: 1. +uri!ica ione dell3m<-A dalla cellula 6. =l primo primer si associa all3m<-A e viene utili ata la trascrittasi inversa, poi permette all3<-Aasi di rimuovere <-A dall3eterodupleM. :. Aggiungo il secondo primer e dopo molti cicli di +,< ottengo cloni di cC-A. =n entrambi i casi deve conoscere in anticipo la se#uen a nucleotidica di almeno una parte della regione da clonare. 1(.0* Se<uenziamento del #enoma umanoB metodi "'ot#un e conti# Approccio ('otgun: approccio ideato da Kenter, utili ato dall3istituto ,E.E<A nell3ambito del +rogetto 2enoma. .3idea ? di sparare sul C-A al !ine di ottenere piccoli !rammenti casuali c'e vengono poi clonati e se#uen iati mediante l3utili o di so!tQare. =l so!tQare stesso ? in grado di riconoscere le sovrapposi ioni "overslap% e di ricostruire l3intera se#uen a correttamente. >uesto metodo ? molto piB rapido del metodo tradi ionale ma secondo molti ? meno preciso. =n!atti, per genomi complessi vi ? la possibilit di commettere errori come la perdita di !rammenti specialmente in caso di ripeti ioni c'e possono venir sovrapposte determinando la perdita del materiale tra loro interposto* inoltre non vengono distinte le parti codi!icanti e non. +er evitare #uesti errori e se#uen iare correttamente il genoma utili ando #uesto metodo rapido ? necessario conoscere gi la mappatura !ornita dal metodo tradi ionale, piB lento ma piB preciso. Metodo contig "metodo clone per clone%: Metodo usato dal ,onsor io +ubblico nell3ambito del +rogetto 2enoma Emano.

.a strategia s!rutta il taglio del C-A attraverso en imi di restri ione, ottenendo !rammenti di 1117 611111 pb. >uesti !rammenti presenteranno delle one di sovrapposi ione, one in cui i !rammenti combaciano. Mediante la mappa dei siti di restri ione ? possibile ottenere un unico !rammento costituito dalle due estremit c'e combaciano e dalla se#uen a interposta tra le due. 5ali !rammenti vengono #uindi clonati in librerie AA,. Lgnuno di #uesti !rammenti combacia con #uello successivo ed ognuno di essi ? un contig, cio? un !rammento contiguo. (i se#uen ia #uindi ogni contig, e contig per contig si riesce a risalire alla se#uen a originale.

+er de!ini ione ('otgun ? il metodo di rottura in !ilamenti casuali di C-A. ,ontig sono !rammenti c'e si sa essere contigui perc'? ottenuti dalla sovrapposi ione di !rammenti ottenuti da taglio con en imi di restri ione i cui siti bersaglio sono mappati nel C-A "in!orma ione c'e devo avere a priori%. = due metodi usato dal gruppo privato ,E.E<A e dal ,onsor io +ubblico utili ano entrambi gli approcci ma in modi di!!erenti. ,E.E<A utili a il metodo ('otgun su tutto il genoma e poi cerca contig tramite un so!tQare. =l ,onsor io +ubblico prima ottiene i contig, li clona poi in librerie AA, e poi applica il metodo ('otgun per ognuno dei contig. (ono #uesti metodi di!!erenti di ricostru ione dell3intera se#uen a genomica, non tanto di se#uen iamento* i veri metodi di se#uen iamento di !rammenti sono #uelli c'imici ed en imatici. %e(inizione di CO&3IG da Lenn; (erie di segmenti contigui del genoma* ad esempio in una libreria genomica si possono ordinare i singoli cloni identi!icando le se#uen e sovrapponibili. @C,romosome +alkingA: s!rutto se#uen e conosciute e mappate sul genoma come marcatori e costruisco sonde complementari a #ueste. ,erco dove si ibridano nella libreria e utili ando diversi marcatori ? possibile riordinare contig per contig tutti i cloni della libreria. 5ali se#uen e conosciute e mappate sono dette (5( "se#uence tagged site%, sito a se#uen e etic'ettata. =l ,onsor io +ubblico "-ational =nstitute o! Dealt'% 'a usato proprio #uesto metodo per risalire all3ordine esatto e ogni contig ? stato poi sottoposto a s'otgun e se#uen iato: 7 Cettagliata mappa del genoma umano con cloni per ogni cromosoma organi ati in contig. Ci ogni contig si conosceva la (5( di con!ine ad una distan a di 111111 pb o meno. 7 .e tecnic'e di se#uen iamento di allora permettevano il se#uen iamento !ino a /11 pb cos$ i contig di 111111 pb !urono sottoposti a s'otgun e ogni pe o venne se#uen iato* ogni contig venne ricostruito per overloop dal sistema computeri ato. (e#uen iamento completo nel 611:. ,elera ,orporation elimina la !ase di ricostru ione della mappa del genoma e sottopone l3intero genoma a s'otgun e poi lo ricostruisce tramite sistema computeri ato c'e anali a gli overloop. 5uttavia 'a anc'e utili ato #ualc'e ri!erimento alla mappatura del ,onsor io +ubblico, in #uanto nel genoma sono presenti punti troppo delicati "ad esempio ripeti ioni% c'e portano ad errori nella sovrapposi ione. 1(.0+ Genomi "e<uenziati (ono stati se#uen iati genomi da @/1 !ino a @1111 geni, mediante tecnic'e di se#uen iamento del C-A. (ono inoltre stati se#uen iati cloroplasti, mitocondri, molti batteri, tra cui il M;coplasma genitalum c'e ? anc'e stato il primo organismo ad essere stato sinteti ato arti!icialmente

"M;coplasma laboratoriumB da parte di ,raig Kenter. >uest3ultimo 'a individuato come letali e indispensabili alla vita dell3organismo solo :11 dei suoi @/1 geni. Altri batteri riprodotti arti!icialmente sono l3Esc,eric,ia Coli "@,6 Mb, @688 geni, 1811 loci letali% e l3Hemop,ilus In(luenzae) >uest3ultimo causa in!e ioni e meningiti ed ? stato il primo organismo di cui si ? completata la se#uen a "1,8 Mb%. +oi sono stati se#uen iati i lieviti Sacc,arom;ces Cerevisiae "1:,5 Mb%, il verme nematode Caenor,abditis Elegans "&,/ Mb, 18111 geni%, il moscerino %rosop,ila Melanogaster "165 Mb, 1:111 geni% ed in!ine, gra ie al progetto 2enoma Emano anc'e il corredo aploide umano ":,6 Mb, :1111 geni%. =n realt Kenter 'a da poco se#uen iato il corredo diploide scoprendo una varia ione tra geni paterni e materni almeno del @@P "alta di!!eren a%. =l se#uen iamento di patogeni "virus, batteri di gonorrea, si!ilide e colera% 'a permesso vari progressi nel campo sia diagnostico c'e curativo. 1(.0/ ?ettori di e"!re""ione (ono vettori di clonaggio contenenti segnali di trascri ione e tradu ione necessari all3espressione di un gene clonato. +ermettono di produrre grandi #uantit di una proteina d3interesse, #ualun#ue essa sia. (ono plasmidi progettati per produrre una grande #uantit di m<-A stabile c'e viene poi tradotto e!!icientemente dalle cellule trans!ettate con #uesto plasmide "batteric'e, lievito, di insetto, di mammi!ero%. .a proteina verr poi puri!icata dal resto delle altre proteine cellulari mediante cromatogra!ia. >uesti vettori di espressione sono ingegneri ati per ottimi are la resa in base al tipo di cellula in cui la proteina deve essere prodotta. 2eneralmente viene inserito nel plasmide un promotore !orte prima del gene da esprimere "ad esempio #uello dell3arabinosio di E. ,oli%* posso anc'e scegliere promotori attivi solo in determinate condi ioni c'e possono essere regolate. En3ulteriore strategia pu8 essere #uella di aggiungere un3etic'etta molecolare "marcatore% alla proteina espressa per !acilitarne la puri!ica ione. >uando invece si conosce la proteina ma non il genei (i costruisce una libreria di cC-A* sulle colonie viene disposto un !iltro di nitrocellulosa dopo c'e ? stata indotta la lisi delle cellule. A #uesto punto le proteine si attaccano al !iltro. =ncubo #uest3ultimo con un primo anticorpo diretto contro la proteina d3interesse* in seguito incubo con un secondo anticorpo radioattivo diretto contro il primo anticorpo. Mediante autoradiogra!ia individuo le colonie c'e esprimono la proteina d3interesse e cos$ si pu8 risalire alla loro posi ione originale e #uindi isolare il gene. 5rovato il gene di tale proteina pu8 avvenire il se#uen iamento. 1(.10 In"ulina ricom7inante .3insulina ? un ormone proteico prodotto dalle cellule del pancreas. V composto da due catene polipeptidic'e A e A unite da ponti disol!uro. Kiene sinteti ata come pre7proinsulina, !orma inattiva prima di ponti disol!uro, c'e ? costituita da : catene "A, A e ,% ed una se#uen a leader -7terminale c'e la indiri a al 2olgi. =l processo di matura ione avviene per proteolisi mediante due tagli: il primo per eliminare la se#uen a leader, ottenendo proinsulina "A e A legato, , interposta%, il secondo taglio avviene per

eliminare la catena , ed ottenere #uindi l3insulina matura !ormata dalla catene A e A c'e si legano mediante ponti disol!uro. (e viene isolato il solo gene umano o il cC-A e viene introdotto in un plasmide batterico di espressione c'e possiede almeno una resisten a ad un antibiotico, posso !ar esprimere il gene ma non otterr8 insulina matura, in #uanto i batteri mancano della peptidasi speci!ica. Allora ? necessario costruire in vitro due C-A sintetici, privi di introni, c'e codi!icano uno per la catena A ed uno per la catena A. Kengono poi inseriti in vettori d3espressione e #uindi in batteri* si otterr una colonia A ed una colonia A, ognuna sinteti ante le catene rispettive c'e vengono poi puri!icate. +er avere i ponti disol!uro si !aranno reagire le catene con agenti ossidanti. .3insulina ottenuta mediante tale procedimento ? stato il primo !armaco ottenuto gra ie all3ingegneria genetica. .3espressione in eucarioti permette l3espressione di proteine eucariotic'e c'e necessitano di modi!ica ioni non possibili in cellule batteric'e. =l problema consiste nel come !ar entrare il vettore, c'e non contiene la resisten a agli antibiotici in #uanto la cellula ? non batterica. (i pu8 utili are una tras!e ione: un cosmide da lievito viene inserito in liposomi c'e riconoscono piB !acilmente la membrana cellulare e lo tratto con lipopectine. En cosmide ? un vettore c'e usa speci!ici geni lambda, ? un vettore plasmidico in cui sono state inserite le estremit coesive del !ago . +u8 clonare grossi !rammenti di C-A, !ino a 51111 pb. +er rendere permeabile la membrana la si pu8 trattare con sali di ,a6F ed uso corrente elettrica "elettropora ione% En ulteriore metodo ? l3uso di vettori virali, ossia se#uen e retrovirali con sito di clonaggio, cio? apribile con en ima di restri ione. .e cellule eucariotic'e vengono poi in!ettate, i virus si moltiplicano attraverso ciclo litico ma ogni virione contiene anc'e il gene clonato in !orma di <-A. Ena volta clonato, l3<-A pu8 esprimere le proteine ricombinanti. 1(.11 ?accino ricom7inante del -iru" dell=e!atite B =l virus alberga bel !egato ma produce molti antigeni c'e si trovano anc'e nel siero. .3antigene dell3epatite A "DA( Ag% ? detto antigene Australia, in #uanto individuato per la prima volta nel siero degli Australiani. +er ottenere il vaccino ? stato clonato l3intero genoma del virus dell3epatite, si ? poi isolato il gene per la proteina del core e #uesta ? stata messa in un vettore di lievito "eucariote%, in #uanto deve subire modi!ica ioni non possibili nei batteri.

1). Modificazione e tra"!orto delle !roteine

1).01 Ri!ie#amento funzionale della catena !roteica Curante il processo di tradu ione, la catena polipeptidica nascente esce come se#uen a lineare salvo per #ualc'e brave tratto ad 7elica, struttura concessa in #uanto ? in grado di passare attraverso il canale di uscita della catena peptidica presente nel ribosoma. A tradu ione avvenuta, la catena polipeptidica deve per8 andare incontro al !olding, cio? ad un corretto ripiegamento c'e porti alla sua !orma nativa, ossia alla !orma !un ionale attiva. 5ale ripiegamento prevede, #uindi, l3arrivo a una struttura ter iaria tridimensionale !avorita da un aumento di eutropia nell3ambiente circostante. .e istru ioni per un corretto ripiegamento sono per lo piB contenute nella se#uen a aminoacidica stessa. =n realt, non appena un dominio proteico emerge dal ribosoma !orma una struttura secondaria locale gi allineata nel modo corretto* #uesta struttura !ormata dai domini proteici ? detta globulo !uso e a #uesto seguiranno altri processi piB lenti di intera ione !ra domini diversi, !ino a raggiungere la struttura ter iaria !inale "#uesta !ase avviene principalmente #uando il peptide ? uscito dal ribosoma%. >uesto processo prevede, dal punto di vista energetico, un andamento ad imbuto in cui la por ione aperta rappresenta le molteplici con!orma ioni energeticamente possibili* l3imbuto va poi a restringersi sele ionando la con!orma ione con l3energia libera piB bassa e #uindi la piB stabile. >uesta ? la con!orma ione nativa. (ebbene il !olding sia un processo dettato in prima istan a dalla se#uen a aminoacidica stessa "vedi processo di rinatura ione%, #uesto processo pu8 talvolta necessitare di proteine ausiliarie c'e !acilitano il ripiegamento oppure di proteine c'e degradano peptidi c'e non riescono ad associarsi nella loro !orma nativa. 1).0$ C'a!eronine '"!)0 1).0% C'a!eronine '"!*0 2li c'aperoni molecolari sono una classe di proteine il cui compito ? #uello di rendere piB e!!iciente il ripiegamento di molte proteine e di prevenire ripiegamenti non corretti sia in condi ioni !isiologic'e c'e in condi ioni di stress. (ono state identi!icate per la prima volta in mutanti di E. ,oli. 2li c'aperoni !anno parte dell3insieme di proteine c'e vengono sovraeespresse in condi ioni di stress come l3aumento di temperatura, e #ueste sono dette 'eat s'ocH protein, 'sp. .3aumento di temperatura !avorisce la denatura ione della proteina e #uesto, a sua volta, aumenta la sintesi delle proteine c'aperone. =n totale le !amiglie 'sp sono 6, distinti in base al peso molecolare espresso in HCa. Esse si trovano in diversi compartimenti cellulari e sono: 1. '"!100: scoperte per la prima volta nei batteri come sistema proteasico a due subunit detto ,lp. .a !un ione principale delle Dsp111 ? #uella di promuovere la rimo ione di aggregati proteici !ormatisi in condi ioni di stress in una modalit A5+7dipendente: la ,lpA !avorisce il de!olding dell3aggregato c'e pu8 andare incontro ad un processo di re!olding o essere idroli ato dalla subunit ,lp+. 6. '"!/0: sono proteine dimeric'e con un sito di dimeri a ione locali ato nella regione ,7terminale. -ella regione -7terminale contengono invece un sito di legame per l3A5+. .e Dsp&1 contengono due siti c'aperone, c'e contribuiscono indipendentemente alla sua attivit di c'aperone molecolare. = due siti, inoltre, mostrano speci!icit diversa per il substrato e

dipenden a o meno dall3A5+. =l sito -7terminale interagisce con proteine e peptidi non ripiegati, in modo A5+7dipendente, mentre il sito ,7terminale sembra agire come uno c'aperone generale, in modo A5+7indipendente. .e Dsp&1 sembrano essere coinvolte nella trasdu ione del segnale, date le loro intera ioni con i recettori degli ormoni steroidei e con varie c'inasi del ciclo cellulare. Ad esempio mantengono inattivi i recettori per i glucocorticoidi. :. '"!*0: le proteine 'sp/1 si ritrovano in tutte le specie e la loro !un ione ? #uella di !avorire l3assemblaggio di complessi multimerici proteici e, come c'aperones molecolari, di !acilitare il !olding intracellulare delle proteine. >ueste sono costituite da due domini !un ionali* un dominio ,7terminale "circa 65 HCa% contenente il sito di legame per il polipeptide ed un dominio -7 terminale "circa @1 HCa% contenente il sito di legame per AC+TA5+ e c'e 'a attivit A5+asica. 0un ionano come monomeri o come dimeri, riconoscendo por ioni di /78 residui amminoacidici idro!obici prima c'e la proteina lasci il ribosoma "cotradu ionale%. =n E. ,oli vengono c'iamate CnaJ, e cooperano con un coc'aperone, 'sp@1, c'e viene c'iamato Cnaa* il complesso interagisce anc'e con 2rpE "!attore di scambio del nucleotide% !ormando un sistema c'aperone A5+7dipendente dove l3attivit A5+asica ? intrinseca all3'sp/1. .3idrolisi di A5+ ad AC+ porta da un cambio con!orma ionale c'e !a legare 'sp/1 piB saldamente alla proteina bersaglio* avviene #uindi il rilascio di 'sp@1, e il riattacco di A5+ con rilascio di AC+ causa la dissocia ione di tutto la proteina c'aperone 'sp/1. >uesti cicli di attacco e rilascio !avoriscono il ripiegamento della proteina. @. '"!)0: molte Dsp61 appartengono alla !amiglia delle c'aperonine, complessi proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di /7& subunit, c'e !ormano una cavit centrale in cui vengono accolte proteine in uno stato non nativo. =l sistema 2roE. presente nei batteri ? un esempio di Dsp61. A di!!eren a di 'sp/1, le 'sp61 !ormano una struttura a botte e agiscono piB tardi nella vita della proteina, dopo c'e ? stata completamente sinteti ata "post7tradu ionale%. 2roE. !orma un complesso !ormato da 1@ subunit la cui struttura #uaternaria !orma due anelli eptamerici sovrapposti ognuno con una cavit centrale di diametro pari a 51 f c'e costituisce una camera di isolamento per la proteina denaturata. .e cavit sono due ma soltanto una delle due ? attiva in ogni istante. 2roE. ? aiutato da un coc'aperone, 2roE(, c'e ? un 'sp11. 2roE. ric'iede, inoltre, il legame e l3idrolisi di A5+. =l ciclo ? #uesto: 7 intera ioni idro!obic'e lungo il bordo della cavit attraggono la proteina par ialmente denaturata 7 =l legame del coc'aperone, in presen a di A5+, causa un cambiamento con!orma ionale nel dominio apicale* in conseguen a la proteina substrato ? rimossa dai siti di legame ed ? rilasciata all3interno della cavit, la #uale, a seguito del legame del nucleotide adenilico e di 2roE(, aumenta di dimensione e passa da una natura relativamente idro!obica ad una polare. 2roE( inoltre promuove l3idrolisi dell3A5+. 7 =l corretto ripiegamento della proteina substrato ric'iede la sua c'iusura entro la camera costituita dal complesso 2roE.72roE(7AC+ entro cui rimane per circa #uindici secondi* al termine di #uesto ciclo l3A5+ si lega al secondo anello di 2roE. con la conseguente dissocia ione del complesso 2roE.7AC+72roE(. 7 =l rilascio del coc'aperone determina un nuovo cambiamento di con!orma ione con conseguente rilascio della proteina substrato. (e il polipeptide 'a raggiunto la corretta con!orma ione nativa sar de!initivamente rilasciato, altrimenti pu8 legarsi nuovamente a 2roE. ini iando un nuovo ciclo di !olding. Dsp/1 e 'sp61 'anno in comune l3a!!init per regioni idro!obic'e di una proteina.

=n!atti, le regioni idro!obic'e di una proteina correttamente ripiegata non dovrebbero mai essere esposte bens$ condensate nel nucleo interno. (e sono esposte signi!ica c'e la proteina non ? correttamente ripiegata. 5. '"!&0: le 'sp@1, come le 'sp61, sono coinvolte in processi di stabili a ione e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti. .a piB studiata e caratteri ata ? Cnaa di E. ,oli c'e, come gi citato, agisce come coc'aperone con CnaJ "'sp/1%. 6. "mall'"!8@cri"talline: tutti i membri di #uesta !amiglia 'anno subunit minori di :5 HCa e sono caratteri ate dalla presen a di una se#uen a omologa di circa 81 residui, denominata cr)stallin domain. (ono proteine multimeric'e, costituite da due subunit, A e A, membri della !amiglia delle small Dsp "s'sp%, c'e come gli altri membri della !amiglia prevengono dall3aggrega ione le proteine denaturate. =l bersaglio !isiologico delle [7cristalline nella lente sembrano essere le altre classi di cristalline "^ e `% e alcuni en imi 'ouseHeeping, ma in ogni modo l3a ione di c'aperone delle [7 cristalline ? stata valutata e risultata valida su un3ampia variet di proteine strutturali e di en imi sottoposti a stress di vario genere "termico, EK, urea, ecc%. 1).0& rotea"oma +roteine c'e espongono regioni idro!obic'e spesso sono mal ripiegate e #uesto non solo impedisce il loro corretto !un ionamento ma pu8 anc'e renderle dannose* possono, in!atti, associarsi tramite intera ione deboli e !ormare grossi aggregati proteici insolubili c'e precipitano !uori dalla solu ione. (olitamente #uesto viene impedito dai meccanismi di controllo #ualit* #uesti meccanismi, tra i #uali l3a ione delle proteine c'aperone, riconoscono le regioni idro!obic'e e, nel momento in cui una proteina non riesce a ripiegarsi correttamente, distruggono la proteina "a ione proteolitica%. .a via proteolitica ini ia con il riconoscimento di una ona idro!obica anomala sulla super!icie della proteina e !inisce con il trasporto di #uesta al proteasoma. >uest3ultimo ? un complesso proteasico c'e distrugge le proteine c'e vi giungono dopo essere state ubi#uitate. Da un3alte a di circa 151 f. ,onsiderando il proteasoma 66(, esso ? presente in molte copie nel citosol e presenta una struttura tipica: ? costituito da un cilindro cavo centrale e da proteine regolatrici alle estremit. =l cilindro centrale ? una struttura simile ad un barile, ? detto nucleo 61( ed ? !ormato da @ anelli eptamerici cos$ disposti: 6 anelli esterni costituiti ciascuno da / subunit 6 anelli interni costituiti ciascuno da / subunit : subunit per ogni anello possiedono attivit proteasica con speci!icit diversa. Ad ogni estremit del barile troviamo un cappuccio 1&(* #uesti agiscono da cancelli regolatori e sono costituiti da 18 subunit. Ci #ueste, alcune legano l3ubi#uitina, mentre 6 delle 18 sono A5+asi coinvolte nel disavvolgimento della proteina e nella trasloca ione di #uesta nel nucleo 61(. =l proteasoma ? caratteri ato un3alta processivit, considerando c'e non si da

dissocia dopo un solo taglio proteolitico bens$ tiene legato il substrato !ino a c'e non lo 'a convertito in corti peptidi.

1).0( ;7i<uitina .3ubi#uitina ? una piccola proteina regolatrice c'e marca proteine destinate alla distru ione. Ceve il suo nome al !atto c'e ? ubi#uitaria negli eucarioti e presenta una se#uen a aminoacidica molto conservata. V costituita da una catena polipeptidica di /6 aminoacidi, il suo peso molecolare ? di 856@ Ca "circa 8 HCa% ed ? identica dal lievito all3uomo. .3ubi#uitina ione ? una modi!ica ione post7tradu ionale c'e comporta il legame di uno o piB monomeri di ubi#uitina ad una proteina: 1. E1 ? l3attivatore dell3ubi#uitina, ? A5+7dipendente. Ena sua catena laterale di ,)s !orma un legame tioestere con il ,7terminale dell3ubi#uitina* viene a !ormarsi il complesso ubi#uitina7E1 "!orma attivata%. 6. Ebi#uitina7E1 viene tras!erita su una ,)s del complesso E67E:, ubi#uitina ligasi. -ello speci!ico, viene a instaurarsi un legame tra ,)s di E6 "detto en ima c'e coniuga l3ubi#uitina% ed ubi#uitina, con !uoriuscita di E1. Esistono :11 complessi diversi E67E:, ognuno in grado di riconoscere un segnale di degrada ione diverso sulle proteine. :. Mediante E:, il complesso ora riconosce il segnale di degrada ione su una proteina. E6 cede l3ubi#uitina ad un -D6 in della catena laterale di una .)s della proteina. (egue l3aggiunta di altre numerose ubi#uitine, tutte regolate attraverso il loro ,7terminale, ad una .)s speci!ica dell3ubi#uitina precedente. (i !orma una catena multiubi#uitina riconosciuta da un recettore speci!ico sul proteasoma. =l problema principale del complesso sta nel riconoscere !ra le proteine c'e espongono segnali di degrada ione #uelle c'e non devono essere eliminate e c'e devono ancora terminare il ripiegamento. >ueste vie non solo distruggono proteine mal ripiegate, ma con!eriscono anc'e emivita breve a #uelle proteine c'e lo ric'iedono. A #uesto proposito, la regola dell3-7terminale correla l3emivita di una proteina con l3identit del suo residuo -7terminale. ,os$ se un taglio proteolitico della se#uen a -7terminale crea, ad esempio, un -7terminale piB instabile c'e viene ubi#uitinato, tramite la regola ione di #uesta proteolisi regolo anc'e l3emivita della proteina. 1).0) A##re#ati !roteici 1).0* Amiloido"i e malattie da !rioni 2li aggregati proteici c'e si !ormano #uando !alliscono tutti i meccanismi di controllo del ripiegamento tendono ad accumularsi nella cellula colpita. Alcuni di #uesti assorbiscono macromolecole c'e possono provocare persino la morte della cellula. Copo le morte della cellula #uesti aggregati si accumulano nella matrice eMtracellulare e possono danneggiare altre cellule. =l cervello ? molto vulnerabile a #uesto tipo di problemi. 2li aggregati proteici c'e si accumulano sono molto resistenti alla proteolisi* una struttura altamente resistente ? #uella costituita da alcuni aggregati c'e !ormano !ibrille costituite da catena polipeptidic'e impilate una sull3altra come pile continue di !oglietti . >uesto !ilamento ? detto cross7 ed 'a un diametro di 5 nm* !orma dei depositi c'e si colorano in modo anormale e vengono c'iamati amiloidi.

.3amiloidosi, patologia associata al deposito di tali complessi, ? presente in molte malattie neurodegenerative #uali Al 'eimer e malattia di Duntington. 0ra #ueste ve ne sono anc'e di in!ettive* #ueste prendono generalmente il nome di malattie da prioni. >ueste malattie si trasmettono mangiando il tessuto contenente l3aggregato proteico. En esempio ? la malattia di ,reut !eldt7aacob, la !orma umana dell3ence!alopatia spongi!orme bovina "A(E, mucca pa a%. 5ali malattie sono causate dal non corretto ripiegamento e aggrega ione della proteina +r+ "prionica%, la #uale si trova sulla membrana cellulare di tutte le cellule, anc'e dei neuroni, e si converte spontaneamente da 7elica a s'eet, !ormando la struttura !ibrillare ed amiloide cross7 . >uesta non solo ? resistente a proteolisi ma converte anc'e altre +r+ da 7elica a s'eet con e!!etto domino c'e si di!!onde rapidamente nel tessuto "ecco perc'? ? in!ettiva%. (olitamente il processo ? innescato da una +r+ modi!icata estranea "ad esempio assunta con la dieta%, in #uanto ? molto di!!icile c'e la muta ione avvenga spontaneamente. 1).0+ De"tinazione delle !roteine 5utte le proteine ini iano ad essere sinteti ate nel citosol sui ribosomi, salvo poc'e proteine c'e vengono sinteti ate nei e dai mitocondri stessi. (e sono destinate al citosol la loro tradu ione !inir anc'e nel citosol e l$ verranno rilasciate* in #uesto caso esse son prive di se#uen e segnale speci!ic'e. (e invece sono destinate alla membrana plasmatica, alla secre ione o ad altri compartimenti presenteranno una se#uen a segnale c'e indiri eranno e locali eranno le proteine a destina ione. =n particolare: 7 proteine per E<, secre ione, lisosomi o membrana: portano una se#uen a segnale c'e indiri a il ribosoma e la catena in crescita sulla membrana dell3E<, il #uale diventa <E<. 7 proteine per il nucleo e per i mitocondri: portano una se#uen a segnale speci!ica c'e dopo la tradu ione viene riconosciuta e la proteina viene portata a destina ione e traslocata poi attraverso appositi meccanismi. ,i sono : meccanismi diversi con cui le proteine si muovono da un compartimento ad un altro: 1. trasporto attraverso pori: trasporto attraverso compartimento in continuit tra loro. Ad esempio trasporto citosol7nucleo, i #uali sono in continuit tra loro mediante complesso dei pori nucleari. 6. trasporto transmembrana: mediante proteine traslocatrici associate alle membrane di compartimenti non in continuit con il citosol. Ad esempio il trasporto di proteine speci!ic'e dal citosol verso E< o mitocondri. :. trasporto vescicolare: proteine vengono trag'ettate entro vescicole o gemme c'iuse da una membrana c'e si caricano per gemma ione dal compartimento di parten a e si scaricano per !usione al compartimento di destina ione. Ad esempio trasporto E<72olgi. 1).0/ Se<uenze "e#nale Esistono due tipi di segnali di smistamento: 1. ona segnale: viene a !ormarsi a seguito di una disposi ione tridimensionale speci!ica dei residui, i residui amminoacidici c'e interagiscono per !ormare tale regione possono essere anc'e molto distanti nella se#uen a aminoacidica lineare. Cirige gli en imi degradativi ai lisosomi. 6. se#uen a segnale: tratto continuo di aminoacidi, lungo dai 15 ai 61 residui. (pesso #ueste se#uen e vengono rimosse da peptidasi del segnale. (ono utili ate per indiri are la proteina a E<, mitocondri, nucleo, perossisomi ed altri organelli.

,ome detto in preceden a, molte proteine arrivano all3E< e da l$ poi vengono secrete, oppure vanno alla membrana plasmatica o all3apparato di 2olgi, altre ancora restano, invece, nell3E<. 7 .e proteine c'e rimangono nell3E< possiedono una se#uen a -7terminale di 5711 residui idro!obici* #uesta ? la se#uen a di indiri amento verso l3E<. .a tradu ione di tali proteine si svolge #uindi sui ribosomi associati al reticolo endoplasmatico* una volta tradotte le proteine possono seguire due destini: 7 se possiedono una se#uen a al ,7terminale di @ speci!ici aminoacidi, vengono incorporate nel lume dell3E<, poi trasportate al 2olgi e da #uesto vengono riportate all3E<. 7 se non possiedono la se#uen a ,7terminale speci!ica, esse vengono portate al 2olgi e da #uesto sono destinati a diverse organelli o alla secre ione. 7 .a se#uen a segnale per l3indiri amento verso i mitocondri, invece, ? una se#uen a all3-7 terminale di 167:1 aa con elica an!ipatica, in #uanto si alternano aminoacidi idro!obici e polari. 7 .a se#uen a segnale per indiri are la proteina ai perossisomi ? una se#uen a al ,7terminale di : aminoacidi. 7 .a se#uen a segnale per il nucleo "-.(% ? una se#uen a interna alla proteina costituita da @7& aminoacidi ricca di .)s e Arg "aa basici e caric'i positivamente%. (pesso la se#uen a ? +ro7+ro .)s7.)s7.)s Arg7.)s7Kal =l segnale di esporta ione dal nucleo, invece, ? una se#uen a interna ben conservata di circa 11 aminoacidi, ricco in .eu. =n tutte #ueste se#uen e, non ? tanto l3ordine di aminoacidi ad essere riconosciuto, #uanto le caratteristic'e degli aminoacidi, #uali idro!obicit, carica ecc. 1).10 .ra"!orto cito"ol@nucleo .a membrana nucleare esterna ? in continuit con la membrana dell3E< e di conseguen a ? anc'3essa costellata di ribosomi. .e proteine tradotte da #uest3ultimi sono trasportate nello spa io !ra ma membrana nucleare interna ed esterna "spa io perinucleare%, il #uale ? in continuit con il lume dell3E<. V presente nella cellula un tra!!ico bidire ionale tra nucleo e citosol: vengono importate proteine #uali istoni, C-A ed <-A polimerasi e proteine ribosomiali, e vengono esportati dal nucleo m<-A, t<-A e subunit ribosomiali. =n entrambe le dire ioni il tra!!ico ? selettivo. .3involucro nucleare ? una doppia membrana per!orata dai pori nucleari "complesso dei pori nucleari -+,%. >uesti pori nucleari sono presenti in numero di :1117@111 per ogni involucro nucleare, 'anno una massa molecolare di 165 MCa e sono costituiti da piB di 51 proteine, c'iamate nucleoporine, disposte in simmetria ottagonale. ,iascun complesso contiene uno o piB canali ac#uosi aperti* avviene #uindi di!!usione "trasporto passivo% di D61 e di piccole proteine con massa compresa tra 5111 e :1111 Ca "ma c'e devono comun#ue portare il segnale di locali a ione -.(%. +roteine con massa superiore a 61111 Ca non riescono ad entrare. =l diametro del canale ac#uoso ? di & nm, ma la sua dimensione pu8 aumentare !ino a 6& nm gra ie ad un dia!ramma c'e si apre per !ar passare i substrati. =l !atto c'e alcune proteine siano selettivamente tenute !uori dal nucleo assicura la !orma ione di un corredo di proteine diverso rispetto al citosol. .a subunit ribosomiali assemblate nel nucleo devono essere esportate nel citosol, tuttavia le loro dimensioni non permettono il passaggio attraverso i pori nucleari.

.3importa ione nel nucleo di proteine avviene mediante l3a ione di recettori d3importa ione nucleare "importine e %, proteine citosolic'e solubili c'e riconoscono i segnali di locali a ione nucleare e agiscono in un sistema navetta. >uesti recettori si legano sia al segnale sulla proteina da importare sia alle nucleoporine. Ena volta all3interno del nucleo avviene il rilascio della proteina e il recettore ritorna nel citosol. 5alvolta sono necessarie proteine adattatrici c'e !un ionano da ponte tra i recettori di importa ione e il segnale di locali a ione sulla proteina* #uesto aumenta il numero di segnali di locali a ione nucleare riconoscibili. .3importa ione ? anc'e regolata con l3esporta ione nucleare "trasporto bidire ionale%. -ell3esporta ione sono coinvolti recettori di esporta ione nucleare, i #uali c'iaramente riconoscono segnali speci!ici di esporta ione. (i legano anc'3essi sia alla se#uen a segnale sia alle nucleoporine. Avviene un processo di tras!erimento del tutto simile all3importa ione gi trattata. = recettori di importa ione ed esporta ione !anno parte della !amiglia dei recettori di trasporto nucleare. En singolo complesso del poro guida il tra!!ico in entrambe le dire ioni, l3energia viene !ornita da 25+ c'e viene idroli ata dalla 25+asi monomerica <an. >uesta esiste in due stadi con!orma ionali: <an72C+ abbonda nel citosol, in #uanto nel citosol ? alta la concentra ione dell3en ima c'e attiva la 25+asi, 2A+, c'e converte <an725+ in <an72C+* <an725+ abbonda nel nucleo in #uanto in #uesto abbonda il !attore di scambio della guanina, 2E0, c'e promuove lo scambio di 2C+ con 25+. >uesta locali a ione impone una dire ionalit: 1. -el citosol, <an72C+ lega il recettore di importa ione e la proteina, oppure solamente il recettore di esporta ione vuoto, in #uanto il suo legame 'a !atto scaricare la proteina c'e dal nucleo va al citosol. 6. All3interno del nucleo, <an72C+ viene convertita in <an725+ e #uesto stimola il rilascio della proteina dal recettore di importa ione o promuove l3attacco della proteina nucleare al recettore di esporta ione. :. <an725+ ed il recettore di importa ione tornano nel citosol dove <an725+ viene convertita in <an72C+ c'e si dissocia dal recettore di importa ione c'e #uindi pu8 legare una nuova proteina da importare. <an725+ nel citosol viene convertita a <an72C+ e #uesto !a s$ c'e venga liberata la proteina da esportare. =l recettore d3esporta ione libero pu8 ora tornare nel nucleo. -.A. >uesto tipo di trasporto non ric'iede c'e venga perso il ripiegamento delle proteine. 1).11 .ra"!orto cito"ol@mitocondri V un tipo di trasloca ione post7tradu ionale.

.a se#uen a -7terminale viene poi rimossa con !orma ione di un 7elica an!ipatica c'e presenta da un lato tutti i residui idro!obici e dall3altro #uelli polari. =l trasporto ric'iede l3a ione di due traslocatori di proteine: 7 complesso 5LM, una proteina integrale della membrana mitocondriale esterna 7 complesso 5=M 6: complesso 5=M 66 sono proteine integrali della membrana mitocondriale interna, tuttavia 5=M 6: attraversa anc'e la membrana mitocondriale esterna con un 7elica an!ipatica, creando un punto di connessione tra le due membrane.

V coinvolto anc'e il complesso LIA, una proteina integrale della membrana interna. 5LM trasporta dapprima la se#uen a -7terminale della proteina* importa #uindi tutte le proteine destinate ai mitocondri e poi in particolare #uelle destinate alla membrana mitocondriale esterna. 5=M6: trasporta parte delle proteine mitocondriali alla membrana mitocondriale interna. 5=M 66 media l3inser ione di una sottoclasse delle proteine della membrana mitocondriale interna !ra cui il trasportatore di AC+, A5+ e +i. LIA media l3inser ione nella membrana mitocondriale interna di proteine sinteti ate dentro i mitocondri e c'e in preceden a sono state importate completamente nella matrice. .e proteine con destino mitocondriale si associano a 'sp/1 citosolic'e per evitarne il ripiegamento* a di!!eren a del trasporto nel nucleo, in!atti, il trasporto mitocondriale consiste nel tras!erimento attraverso i complessi della proteina nella !orma non ripiegata. .e 'sp/1 mitocondriali sono cruciali per il tras!erimento e si legano !ortemente alla proteina importata non appena #uesta emerge dal traslocatore. Avviene #uindi il rilascio mediante idrolisi di A5+ e #uesto !ornisce la !or a necessaria a terminare la trasloca ione. V il complesso 5=M6: stesso c'e deposita le 'sp/1 mitocondriali sulle proteine importate. 5utto #uesto processo ric'iede, #uindi, energia !ornita da A5+ e dal gradiente protonico. .e proteine passano #uindi attraverso il complesso 5LM e 5=M6: raggiungendo la matrice. .e proteine per la matrice mitocondriale possiedono una sola se#uen a -7terminale c'e viene riconosciuta da 5LM c'e la indiri a verso 5=M 6: e #uindi verso la matrice* #ui la se#uen a viene poi rimossa dalla peptidasi del segnale. .e proteine integrali di membrana entrano nella matrice ma portano una seconda se#uen a di aminoacidi idro!obici posta dopo #uella -7terminale* la seconda se#uen a guida la trasloca ione della proteina o nella membrana interna o nello spa io intermembrana. =l complesso LIA inserisce, in!atti, la proteina nella membrana mitocondriale interna* la se#uen a -7terminale viene rimossa in #uanto sporge nella matrice. =l risultato ? una proteina ancorata alla membrana mitocondriale interna attraverso la se#uen a idro!obica* il resto della proteina sporge nello spa io intermembrana. +u8 anc'e essere rimosso il secondo segnale da una peptidasi e in #uesto caso la proteina verr rilasciata nello spa io intermembrana. +er inserire proteine trasportatrici di metaboliti nella membrana mitocondriale interna agisce 5=M66 an ic'? 5=M 6:. 1).1$ .ra"!orto cito"ol@reticolo !la"matico E3 cotradu ionale. >uindi la proteina non ? mai libera nel citosol, #uesto evita c'e si ripieg'i prima di arrivare al E< "in #uesta !ase #uindi non necessita di c'aperonine%. (e l3m<-A porta la se#uen a per la se#uen a -7terminale di indiri amento all3E<, non appena #uesta viene tradotta, l3intero complesso ribosoma7m<-A7catena polipeptidica nascente vengono

trasportati sulla membrana dell3E<. .a sintesi proteica continua mentre la proteina viene contemporaneamente traslocata entro il lume dell3E<. >uesti ribosomi associati all3E< creano regioni c'iamate <E<. .a se#uen a segnale viene tagliata via dalla peptidasi del segnale prima del completamento della catena polipeptidica. .a se#uen a -7terminale ? riconosciuta da una +A<5=,E..A C= <=,L-L(,=ME-5L CE. (E2-A.E "(<+%: 6 catene polipeptidic'e c'e con un piccolo <-A. =l suo sito di legame alla se#uen a segnale ? una tasca idro!obica ricca di Met, #uindi !lessibile ma comun#ue idro!obica "nel senso c'e il discriminante nel riconoscimento ? l3idro!obicit non la se#uen a aa stessa della se#uen a segnale%. =l legame di (<+ con la se#uen a segnale appena emersa introduce una pausa nella tradu ione per dare tempo al ribosoma di raggiungere la membrana sull3E<. =l complesso (<+7ribosoma ? riconosciuto dal recettore S21, una proteina integrale di membrana dell3E< ruvido esposta solo in #uelle regioni c'e permettono ai ribosomi di associarsi !ormando appunto il <E<. =l complesso recettore (<+7(<+7ribosoma si sposta !ino ad un traslocatore e si dissociano in recettore e (<+. .a tradu ione riprende e intanto 'o la trasloca ione. =l traslocatore ? il complesso (E,61 c'e si allinea con il canale di uscita del peptide dal ribosoma, associato negli eucarioti a particolari 'sp/1 dette A=+ c'e svolgono lo stesso ruolo delle mitocondriali. (e le proteine traslocate sono destinate a diventare proteine integrali di membrana "il meccanismo ? un po3 piB complesso%. (e sono proteine trans membrana a singolo passaggio: 1. tutto normale, ma un segmento idro!obico interno alla proteina !unge da segnale di (5L+ del tras!erimento e #uindi la proteina di tras!erimento non viene piB traslocata, ma rimane con il segmento idro!obico all3interno dello strato lipidico e le altre due parti, una dentro il lume e una nel citosol. =l segmento idro!obico ? ad 7elica "viene rilasciata all3interno della membrana per apertura laterale del traslocatore%. 6. la se#uen a segnale per l3E< ? interna e non all3-7terminale come sempre. Kiene comun#ue riconosciuta dalla (<+ e la se#uen a segnale si lega al traslocatore in modo c'e la sua estremit positiva resti nel citosol. >uesto determina l3orientamento e #uale segmento proteico viene tras!erito nel lume dell3E<* #uesto segmento e #uello c'e segue l3estremit 7 della se#uen a di ini io del tras!erimento "pu8 essere il , o l3-7terminale%. .a proteina rimane associata alla membrana da una [7elica c'e corrisponde a #uesta se#uen a segnale "il carattere positivo o negativo ? dato dagli aa c'e precedono o seguono la se#uen a idro!obica%. (e sono proteine transmembrana a passaggi multipli : presentano una se#uen a segnale interna come nel caso 6 ma anc'e una seconda o piB se#uen e segnale idro!obica c'e !un iona da (5L+ per il tras!erimento come nel caso 1. ,os$ abbiamo due segmenti trans membrana o piB di uno in base al numero di se#uen e idro!obic'e aggiuntive. =l !atto c'e una se#uen a di segnale idro!obica serva da ini io o stop nel tras!erimento dipende dalla sua posi ione nella catena polipeptidica. .e (<+ !anno in!atti una scansione del peptide in crescita da -7terminale a ,7terminale. >uelli successivi al primo segnale di nuovo ini io sono riconosciuti some se#uen e di stop. Ca un gra!ico di idro!obicit di una se#uen a di aa posso dedurre se ? o no una proteina trans membrana, e se si, #uanti segmenti trans membrana 'a. .3inser ione di proteine di membrana sull3E< genera un3asimmetria c'e viene mantenuta anc'e #uando la membrana raggiunge la membrana del compartimento di destina ione, in!atti #ueste proteine transmembrana possono rimanere nella membrana dell3E< o raggiungere altri compartimenti per gemma ione " il lato del lume diventa #uello rivolto verso l3esterno per le proteine sulla membrana plasmatica%. .e proteine residenti nell3E< 'anno una se#uen a ,7terminale di riten ione nel lume. Aiutate nel ripiegamento da +C= "proteina disol!uro isomerasi% e A=+ "'sp1 dell3E<%.

Ma piB dell381P di #ueste proteine non riescono a ripiegarsi, vengono #uindi dislocate tornando nel citosol attraverso sec 61, una -7glicanasi rimuove gli eventuali glicosaccaridi aggiunti, vengono ubi#uitinate e !iniscono nel proteasoma.

1).1% Glico"ilazione delle !roteine .a maggior parte delle proteine solubili e di membrana prodotte dall3E< sono 2.=,L+<L5E=-E, glicosilate dall3E< "poc'e proteine citosolic'e vengono invece glicosilate%. =ni ialmente viene tras!erito in blocco alle proteine dell3E< un oligosaccaride precursore, normalmente ancorato alla membrana dell3E< da un dolicolo "un lipide isoprenoide% con un legame piro!os!ato la cui rottura !ornisce l3energia per la glicosila ione, composto da 1@ ucc'eri " 6 -7acetil glucosammina, & mannosi, : glucosi%. 7 .3oligosaccaride precursore viene costruito ucc'ero per ucc'ero sul dolicolo partendo da intermedi nucleotidi7 ucc'ero aggiunti sul lato citosolico "poi con il passaggio attraverso la membrana vengono rivolti verso il lume%. Attraverso uno di #uesti residui l3oligosaccaride precursore !orma un legame -7glicosidico con una catena laterale di Asn della proteina, andando a costituire oligosaccaridi legati a &) =l tras!erimento ? catali ato da una oligosaccaride trans(erasi con sito attivo rivolto verso il lume. Kengono aggiunti spesso cotradu ionalmente. -ell3E< nella maggior parte delle proteine vengono rimossi : 2lu e 1 mannosio, ulteriori modi!ic'e sono apportate nel 2olgi, oltre all3aggiunta di altri tipi di modi!ica ioni !ra cui una glicosila ione con oligosaccaridi legati a O " ucc'ero legato a LD di ser, treonina o idrossilisina%. (empre nell3E<, un en ima catali a l3attacco covalente di una ancora di 2.=,L(=.0L(0A5=C=.=-L(=5L.L al ,7terminale di alcune proteine di membrana plasmatic'e. .a glicosila ione delle proteine trans membrana !avorisce la con!orma ione allungata e non ripiegata del recettore. 1).1& De#radazione !roteine mal ri!ie#ate Kedi risposte precedenti.