L’ecosistema vaginale: un ambiente densamente

popolato
La zona intima non è sterile, né asettica, anzi. È un’area densamente
popolata, dove convivono pacificamente numerose popolazioni di
microrganismi che – insieme – costituiscono quello che i medici
chiamano ecosistema flora vaginale.
•Lattobacilli
•Candida spp.
•Streptococchi
•Enterococchi
•Stafilococchi
•Enterobatteri
•Mobiluncus spp.
occasionalmente
•Trichomonas vaginalis
•Gardnerella vaginalis
I guardiani della zona intima

Sono i bacilli di Doederlain, chiamati anche lattobacilli, a garantire la convivenza pacifica dei microrganismi che
costituiscono la flora vaginale. Attraverso la produzione copiosa (e, soprattutto, costante) di l’acido lattico, la sostanza
che ha il compito chiave di assicurare la giusta acidità (cioè un pH compreso tra 3,5 e 5,5) nell’ambiente vaginale. Un
ambiente sufficientemente acido, infatti, rappresenta l’ostacolo più efficace alla colonizzazione di batteri “cattivi”, che
potrebbero perturbare l’equilibrio dell’ecosistema. La produzione di acido lattico è strettamente legata alla quantità di
glicogeno (zucchero) presente nel tessuto vaginale, e il glicogeno a sua volta subisce l’influenza degli ormoni estrogeni.
Fino alla pubertà, nell’organismo femminile circolano ben pochi estrogeni e, quindi, anche la presenza di glicogeno
(zucchero) nelle mucose è piuttosto scarsa. I lattobacilli sono assenti: il pH vaginale, di conseguenza, non può essere
acido, bensì neutro.
Nell’età fertile gli estrogeni sono presenti in abbondanza. La loro azione è responsabile di un aumento del volume delle
mucose, particolarmente ricche di glicogeno (zucchero). Tanto glicogeno significa tanti lattobacilli, che vanno ad
acidificare il pH vaginale, il quale – in condizioni di equilibrio generale – si assesta, infatti, intorno a 3,5-4,5. Durante la
gravidanza gli ormoni estrogeni schizzano alle stelle, con conseguenze facilmente intuibili: un maggiore aumento di volume
della mucosa vaginale, così come la quantità di glicogeno e di lattobacilli, che raggiunge l’apice. Va da sé che il pH vaginale
diventi ancora più acido, raggiungendo valori intorno a 3,5.
In menopausa gli estrogeni vengono prodotti a singhiozzo, poi la produzione di questi preziosi ormoni si fa sempre più
irregolare, fino a scomparire quasi del tutto con la menopausa vera e propria.
Le conseguenze locali non si fanno attendere: la mancanza di estrogeni si traduce in scarso glicogeno e in una mucosa via
via più atrofizzata, povera, sottile, a corto di nutrimento. Stessa sorte per i lattobacilli, che pian piano diminuiscono, fino
a latitare quasi del tutto. Il pH, senza bacilli di Doederlain, perde progressivamente acidità fino a raggiungere livelli vicino
al neutro (intorno a 7).
Punti critici
 Informazioni necessarie
al Laboratorio
 Età
 Sintomatologia
 Gravidanza
 Interruzioni di gravidanza
 Farmaci assunti nell’ultimo mese
 “Fishy odor” test
Ruolo del laboratorio di Microbiologia
Potenziali agenti eziologici
Protocollo operativo
I GIORNATA III GIORNATA

•CNA Incubazione per 48h

•MCK
•CAN₂

Colorazione automatica
MGG (May-Grunwald
Giemsa)
Terreni di coltura
LETTURA
Gardnerella vaginalis
Gardnerella vaginalis
 Trichomonas vaginalis
E’ un protozoo appartenente alla classe dei flagellati,
conosciuta come parassita umano all'origine dell'omonima
malattia della trichomoniasi vaginale, un'infiammazione
vaginale.

Phylum: Sarcomastigophora
• Subphylum: Mastigophora
• Al genere Trichomonas appartengono 3 specie:
T. tenax (orale)
T. hominis (intestinale)
T. vaginalis (genitale)
• T. tenax e T. hominis sono scarsamente patogeni per l’uomo
• T. vaginalis è patogeno franco per l’uomo

• T. vaginalis causa trichomoniasi, una delle principali infezioni a trasmissione sessuale.

Negli USA, la tricomoniasi rappresenta il 56% delle STI, facendo registrare 2-3 milioni
di nuovi casi annui in donne sessualmente attive (oltre 250 milioni di casi nel mondo)
• T. vaginalis ha una distribuzione mondiale indipendente dallo status socio-economico.
• L’uomo è l’unico ospite naturale per l’infezione
• Prevalenza maggiore (circa 70%) in soggetti a rischio: prostitute, persone con differenti
partnersessuali od affette da altre malattie veneree.
 Trichomonas vaginalis

• Trofozoite: 15-18 mm in diametro, piriforme,

mononucleato, 2 paia di flagelli anteriori ed un
flagello laterale accolto in una membrana ondulante.
Due assostili disposti asimmetricamente.

Non forma cisti – trasmissione diretta

Riproduzione asessuata (fissione binaria)
Anaerobi (metabolismo fermentativo)
 Trichomonas vaginalis: malattia

• L’infezione è nelle donne frequentemente sintomatica. Vaginiti con

secrezioni purulente (giallastre, di cattivo odore) rappresentano il
sintomo principale, e può essere accompagnato da lesioni ulcerative
cervicali e vulvari, edema mucosa vaginale (“a fragola”) dolore
addominale.
Il periodo di incubazione è di 5-28 giorni.

• Negli uomini, l’infezione decorre generalmente in maniera

asintomatica; occasionalmente compaiono uretriti, prostatiti con
dolore alla minzione

• Dati recenti suggeriscono:

– un possibile ruolo causale dell’infezione nelle nascite sottopeso,
rischio di parto pre-termine, rottura prematura delle membrane
 Tricomoniasi: diagnosi di laboratorio

Campioni clinici:
•donna: secrezione vaginale o uretrale:
•uomo: secrezione uretrale anteriore o prostatica.

Esame microscopico:
Colorazione di MGG (May-Grunwald Eosina e blu di
metilene)
EZIOLOGIA MICOTICA
 Candida
Manifestazioni cliniche
•Bruciore e/o prurito
•perdite vaginali bianche, caseose o a volte liquide e schiumose

la forma fenotipica di lievito si presenta come lievito con

blastospore rotondeggianti che si moltiplicano per
gemmazione, e che è responsabile della trasmissione o della
diffusione della colonizzazione asintomatica.
La seconda forma è quella di pseudomiceti formata da ife,
cioè da filamenti composti da più cellule separate da setti
che sono in grado di invadere i tessuti e si riscontrano in
corso di infezioni sintomatiche
ALTRI QUADRI SIGNIFICATIVI
 Secreto cervicale:
potenziali agenti eziologici


Neisseria gonorrhoeae

Chlamydia trachomatis

Anaerobi

Micoplasmi (> 104 UFCml)
N. gonorrhoeae
formano pori o canali
nella membrana esterna e
mediano la sopravvivenza
intracellulare inibendo la
fusione con il
fagolisosoma
Stadi dell’infezione:
•Adesione
attraverso i pili che si attaccano
all’epitelio delle mucose.
Intimo attacco grazie alla
proteina Opa.
•Penetrano e si moltiplica sulla
membrana basale.
Vengono fagocitati dai neutrofili
che poi muoiono e rilasciano i
batteri fagocitati
•Inibizione della fusione
fagosoma-lisosoma grazie alla
proteina Por
•Disseminazione
SINTOMATOLOGIA
N. gonorrhoeae
esame microscopico
Diagnostica microbiologica di N. gonorrhoeae

Esame microscopico dopo colorazione di Gram

Esame colturale: thayer-martin agar cioccolato in CO 2 5%

per 48h.

Real Time PCR

 Micoplasmi
• Appartengono alla famiglia dei Mycoplasmataceae.
• Aerobi obbligati o aerobi/anaerobi facoltativi, sono le più
piccole cellule capaci di vita autonoma (con un diametro di 0,2-
0,3 µm)
• Assenza di parete batterica rigida
• Presenza di membrana cellulare a struttura lipoproteica con
contenuto di steroli.
• Le specie associate a quadri infettivi nell’uomo sono :
Responsabili di
•Endometriti
•Infezioni corion-amniotiche
•Rottura precoce delle membrane scarso sviluppo del
neonato
•infertilità

Ureaplasma urealyticum

 E’ associato ad aborto spontaneo, parto prematuro e nati-mortalità

La natimortalità è il nome con cui si definisce la nascita di un bambino morto dopo 24
settimane di gravidanza compiute. Se il bambino muore prima delle 24 settimane non si
parla di natimortalità ma di aborto tardivo.

 E’ causa di uretriti non gonococciche e non clamidiali

 Può essere isolato dal sistema nervoso centrale dove causa meningiti
silenti o asintomatiche nel neonato
Caratteristiche colturali
 Mycoplasma IST2 kit

Consente contemporaneamente la coltura, l’identificazione, la conta

e l’antibiogramma.
Brodo di coltura liofilizzato (R2), contenenti substrati utilizzati dai
Micoplasmi: urea (U.u) e arginina (M.h,) ed altri fattori nutrizionali.
Il brodo, di colore giallo, viene distribuito nelle cupole della galleria
e incubate a 37°C per 24h.

Il viraggio dal giallo al rosso o

giallo-arancio del brodo indica
la positività al test
Chlamydia trachomatis
 CHLAMYDIA
 Involucro esterno costituito da una componente lipopolisaccaridica
(LPS) e da poche proteine tra cui il MOMP (major outer membrane
protein) di 40 kD, con probabile funzione di “porina”
 Rigidità della parete (ponti disolfuro tra le molecole MOMP e residui
di cisteina delle proteine della membrana esterna)
 Non producono ATP (utilizzano quello della cellula parassitata) perché
mancano dei sistemi enzimatici per la produzione di energia e di altre
molecole come il NAD
 Il lipopolisaccaride delle clamidie è molto simile a quello dei batteri
gram negativi, con la caratteristica porzione lipidica (lipide A),tuttavia
la sua attività endotossica è più blanda
 CICLO VITALE

 Ciclo vitale dimorfico contempla due forme morfologiche distinte:

 corpo elementare (CE) infettante, per la sopravvivenza
extracellulare. piccolo, rotondeggiante e denso
  corpo reticolare (CR) non infettante, per la moltiplicazione
intracellulare.

A corpo reticolare B corpo elementare

 CICLO VITALE

 corpo elementare (CE) si lega ai recettori presenti sulla superficie delle cellule
dell’epitelio mucoso mediante legame delle MOMP
penetra con un meccanismo di endocitosi 
penetrato nel fagosoma inibisce la fusione del fagosoma con i lisosomi cellulari
impedendo la lisi intracellulare.

•6-8 ore dall’entrata nella cellula la maggior parte dei corpi

elementari si idratano, si accrescono e si trasformano in
forme metabolicamente attive: i corpi reticolari (CR)
sintetizzano DNA, RNA e proteine ma utilizzano l’ATP della cellula.
Si dividono per scissione binaria per le successive 18-24 ore
 Il fagosoma in cui si accumulano viene detto “inclusione” ed è visibile al microscopio
ottico
Dopo circa 24 ore i corpi reticolari vanno incontro a condensazione riformando CE
che vengono liberati per autolisi cellulare
I corpi reticolari sono sprovvisti di potere infettante mentre i CE sono capaci di
infettare altre cellule
SIGNIFICATO CLINICO
 DIAGNOSI MICROBIOLOGICA

• DIAGNOSI DIRETTA

 Isolamento del microrganismo in culture cellulare

 Immunofluorescenza diretta

 Test di amplificazione genica

 DIAGNOSI MICROBIOLOGICA
Coltura cellulari

Crescita su cellule Mc Coy

Non produce effetto citopatico
Evidenziazione di inclusioni
intracellulari mediante uso di
anticorpi monoclonali fluorescenti

Risposta tardiva (72 ore)

Laboratorio attrezzato per colture
cellulari
 DIAGNOSI MICROBIOLOGICA

• TEST PER LA DETERMINAZIONE DI Ag SPECIFICI

• IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA

 Il reagente diagnostico è un anticorpo IgG monoclonale di topo,

coniugato a fluoresceina, che identifica in modo specifico la

principale proteina della membrana esterna (Major Outer Membrane

Protein - MOMP) di tutti i 15 sierotipi di C. trachomatis.

 Svantaggi: applicabile per un basso numero di campioni

DIAGNOSI MICROBIOLOGICA
 Streptococcus agalactiae
Morfologia e generalità

Diplococco Gram-positivo

Beta-emolitico

Gruppo B di Lancefield

Nove tipi sierologici

Causa di infezioni neonatali a

trasmissione verticale

Colonizzazione vaginale della gravida

prerequisito per la trasmissione
dell’infezione al neonato
Streptococcus agalactiae
Infezione neonatale
Precoce: trasmissione verticale può essere trasmessa per via
transplacentare, ma più frequentemente si realizza per via ascendente nel liquido
amniotico, tramite aspirazione da parte del feto di liquido amniotico contaminato.
L’infezione può essere acquisita in utero anche a membrane integre per micro
rotture che si formano prima del parto. Infine la trasmissione può verificarsi
durante il passaggio attraverso il canale del parto per contatto con secrezioni ano-
vaginali
esordio dei sintomi < 7 gg
polmonite (35-55%), sepsi (25-40%), meningite (5-15%)
•
Tardiva: trasmissione verticale/orizzontale. L’infezione può
insorgere a seguito della colonizzazione del tratto naso-faringeo e gastro-
intestinale che si verifica durante il parto. In altri casi si trasmette per via
orizzontale, o per trasmissione nosocomiale o per contatto con portatori
asintomatici dopo la dimissione ospedaliera
esordio dei sintomi > 7gg, fino a 3-5 mesi
meningite (30-40%), sepsi (40-50%), infezioni focali (5-10%)
 PREVENZIONE DELL’INFEZIONE PRECOCE

Profilassi antibiotica durante la gravidanza

non eradica SGB dal tratto gastro-intestinale da cui può
colonizzare la vagina al momento del parto

Profilassi antibiotica durante il parto

da iniziare il più precocemente possibile (almeno 4 ore prima del
parto)
impedisce la trasmissione madre-neonato dell’infezione

47
 PROFILASSI
• Quali donne sottoporre a profilassi?
– Tutte?
- maggiore rischio di reazioni allergiche
- fenomeni di resistenza nel neonato associati a sepsi da parte dei batteri
antibiotico-resistenti
• 1996 CENTRE FOR DISEASE CONTROL (rivedute nel
2002)
• Linee Guida:
 Screening strategy: tampone vaginale e/o retto-vaginale alla 35a-37a
settimana di gestazione e profilassi alle sole donne risultate positive

 Risk strategy: nessun tampone in gravidanza e profilassi solo alle donne con
fattori di rischio ostetrici

– Vari studi testimoniano la maggiore efficacia della prima strategia, in quanto solo metà dei
nati infetti presenta fattori di rischio . Il farmaco di elezione utilizzato è la penicillina; in
caso di stati allergici della madre è bene esserne a conoscenza già al momento dello
screening, per testare la sensibilità nei confronti di altri antibiotici
48
 Protocollo operativo
I GIORNATA II GIORNATA III GIORNATA

cromID STREPTO B

Tampone vaginale Incubazione 24 ore a 37°C Incubazione 24 ore a 37°C

Atmosfera controllata di CO2 Atmosfera controllata di CO2

49
 colonie rosso-violetto su terreno cromID STREPTO B

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Secondo livello
Terzo livello
Quarto livello
Quinto livello

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