TEST

ENTERUTUBE
C A S C I O L I EM M A,
C A S C I OL I M A R T A ,
F A L S A R O N E VE R O N I C A ,
C O M I D A G IO R G I A E
S A B B AT I N I F R AN C E S C O .
 CHE COS’E’?
L’enterotube è una provetta autonoma in plastica,
suddivisa in 12 comparti, contenente 12 terreni
diversi che consentono la determinazione di 15
reazioni biochimiche (glucosio, produzione di gas
dal glucosio, lisina decarbossilasi, ornitina
decarbossilasi, acido solfidrico (H2S), indolo,
adonitolo, lattosio, arabinosio, sorbitolo, Voges-
Proskauer (VP), dulcitolo, fenilalanina deaminasi
(PA),urea e citrato).
 GLUCOSIO (COMPARTO 1)
 Terreno1 - glucosio (20,0 g/L) contenuto in un terreno base
appropriato, con rosso cresolo come indicatore di pH. Il terreno è
coperto di cera per fornire condizioni di anaerobiosi e consentire la
rilevazione della formazione di gas. Non inoculato: rosso. Esso serve
per verificare la fermentazione del glucosio eseguita dai batteri.
REAZIONI
 Negativa: La negatività della prova è data dal non viraggio del
terreno o anche da una lieve alterazione. Colore tra rosso-arancio.
 Positiva: i prodotti finali della fermentazione batterica del glucosio
sono acido oppure acido e gas. Qualsiasi grado di giallo nel terreno
deve essere interpretato come reazione positiva. Questo comparto
serve anche ad indicare la produzione o meno di gas, indicata dal
sollevamento o distacco dello strato di cera dalla superficie
dell’agar. Si deve fare attenzione anche a non prendere in esame le
piccole bolle d’aria presenti nell’agar che non indicano sviluppo di
gas.
 LISINA (COMPARTO 2)
 Terreno 2 - lisina (10,0 g/L) contenuta in un terreno base
appropriato, con porpora di bromocresolo come indicatore di pH. Il
terreno è coperto di cera per fornire condizioni di anaerobiosi. Non
inoculato: giallo. Esso serve per verificare se il batterio in questione
svolge reazioni di decarbossilazione (reazione che porta alla perdita
di una molecola di anidride carbonica) della lisina.
REAZIONI
 Negativa: Il terreno rimane giallo se non si verifica la
decarbossilazione della lisina.
 Positiva: la decarbossilazione batterica della lisina, che determina
la formazione di cadaverina, prodotto finale alcalino, è indicata dal
viraggio dal giallo pallido (acido) al porpora (alcalino) dell’indicatore
nel terreno. Anche qui vi è uno strato di cera che assicura le
condizioni anaerobie indispensabili per evitare reazioni false
positive.
 ORNITINA (COMPARTO 3)
 Terreno 3 - ornitina (10,0 g/L) contenuta in un terreno base
appropriato, con porpora di bromocresolo come indicatore di pH. Il
terreno è coperto di cera per fornire condizioni di anaerobiosi. Non
inoculato: giallo. Esso serve per verificare se il batterio in questione
svolge reazioni di decarbossilazione dell’ornitina.
REAZIONI
 Negativa: Il terreno rimane giallo se non si verifica la
decarbossilazione dell’ornitina.
 Positiva: la decarbossilazione dell’ornitina, che determina la
formazione di putrescina, prodotto finale alcalino, è indicata dal
viraggio dal giallo pallido (acido) al porpora (alcalino) dell’indicatore
nel terreno. Anche qui vi è uno strato di cera che assicura le condizioni
anaerobie indispensabili per evitare reazioni false positive.
 H2S/INDOLO (COMPARTO 4)
 Terreno 4 - tiosolfato di sodio (4,7 g/L), citrato ferrico di ammonio (0,6 g/L)
e triptofano (1,2 g/L) in un terreno base appropriato. Non inoculato: da
beige ad ambra chiaro. Serve per verificare la reazione di produzione dell’
H2S (acido solfidrico) e dell’indolo.
REAZIONI
 Negativa: Il terreno rimane beige-ambra chiaro se non si verifica la
produzione di H2S e dell’indolo.
 Positiva: L’acido solfidrico è prodotto da batteri in grado di ridurre i
composti contenenti zolfo, come per esempio i peptoni e il tiosolfato di
sodio presenti nel terreno. L’acido solfidrico reagisce con i sali di ferro
anch’essi presenti nel terreno, formando un precipitato nero di solfuro
ferrico, generalmente lungo la linea di inoculo. Mentre La produzione di
indolo dal metabolismo del triptofano da parte dell’enzima triptofanasi, è
indicata dallo sviluppo di una colorazione rosa – rossa in seguito
all’aggiunta del reagente di Kovacs.
 ADONITOLO (COMPARTO 5)
Terreno 5 - adonitolo (20,0 g/L) contenuto in un terreno base
appropriato, con rosso cresolo come indicatore di pH. Non
inoculato: rosso. Esso serve per verificare la fermentazione
batterica che determina la formazione di prodotti finali acidi.
REAZIONI
Negativa: Il terreno rimane rosso o vira ad arancione che indica
una reazione negativa.
Positiva: la fermentazione batterica di adonitolo, che determina
la formazione di prodotti finali acidi, è indicata dal viraggio dal
rosso (alcalino) al giallo (acido) dell’indicatore nel terreno.
Qualsiasi grado di giallo deve essere interpretato come reazione
positiva.
 LATTOSIO (COMPARTO 6)
Terreno 6 - lattosio (20,0 g/L) contenuto in un terreno base
appropriato, con rosso cresolo come indicatore di pH. Non
inoculato: rosso. Esso serve per verificare la fermentazione
batterica che determina la formazione di prodotti finali acidi.
REAZIONI
Negativa: Il terreno rimane rosso o vira ad arancione se la
reazione negativa.
Positiva: la fermentazione batterica del lattosio, che determina
la formazione di prodotti finali acidi, è indicata dal viraggio dal
rosso (alcalino) al giallo (acido) dell’indicatore nel terreno.
Qualsiasi grado di giallo deve essere interpretato come reazione
positiva.
 ARABINOSIO (COMPARTO 7)
Terreno 7 - Arabinosio (20,0 g/L) contenuto in un terreno base
appropriato, con rosso cresolo come indicatore di pH. Non
inoculato: rosso. Esso serve per verificare la fermentazione batterica
che determina la formazione di prodotti finali acidi.
REAZIONI:
Negativa: Il terreno rimane rosso o vira ad arancione se la reazione
negativa.
Positiva: La fermentazione batterica dell’arabinosio, che determina
la formazione di prodotti finali acidi, è indicata dal viraggio dal
rosso (alcalino) al giallo (acido) dell’indicatore nel terreno.
Qualsiasi grado di giallo deve essere interpretato come reazione
positiva
 SORBITOLO (COMPARTO 8)
Terreno 8 - Sorbitolo (20,0 g/L) contenuto in un terreno base
appropriato, con rosso cresolo come indicatore di pH. Non
inoculato: rosso. Esso serve per verificare la fermentazione batterica
che determina la formazione di prodotti finali acidi.
REAZIONI:
Negativa: Il terreno rimane rosso o vira ad arancione se la reazione
è negativa.
Positiva: La fermentazione batterica del sorbitolo, che determina la
formazione di prodotti finali acidi, è indicata dal viraggio dal rosso
(alcalino) al giallo (acido) dell’indicatore nel terreno. Qualsiasi
grado di giallo deve essere interpretato come reazione positiva.
VOGER PROSKAUER (COMPARTO
9)
 Terreno 9 - glucosio (20,0 g/L) contenuto in un terreno base
appropriato. Non inoculato: da incolore ad ambra chiaro. Essa
serve per verificare se i batteri eseguono la fermentazione
butandiolica del glucosio.
REAZIONI
 Negativa: Il terreno rimane ambra chiaro se la reazione è
negativa.
 Positiva: L’acetilmetilcarbinolo (acetoina) è un prodotto
intermedio nella produzione di butilenglicole dalla fermentazione
del glucosio. La produzione di acetoina si rileva aggiungendo i
reagenti VP chimici dopo l’incubazione. La presenza di acetoina è
indicata dallo sviluppo di una colorazione rossa entro 5–20 min.
DUDICITOLO (COMPARTO 10)
 Terreno 10-dulcitolo (20,0 g/L), fenilalanina (7,0 g/L) e citrato ferrino di
ammonio (0,5 g/L) contenuti in un terreno base appropriato, con blu di
bromotimolo come indicatore di pH. Non inoculato: verde. Esso serve per
verificare la fermentazione del dulcitolo eseguita dai batteri.
Reazioni
 Negativa: La reazione è da considerarsi negativa se dopo l’incubazione il
terreno mostra un colore verde più scuro a quello originale. Da notare con
molta attenzione, che i batteri dulcitolo-positivi, sono fenilalanina-
negativi; quindi non è possibile avere reazioni fenilalanina (PA) e
dulcitolo-positive contemporaneamente.
 Positiva: il terreno di coltura diviene acido provocando il viraggio
dell’indicatore da verde a giallo. Il test della fenilalanina evidenzia invece
la formazione di acido piruvico da quest’ ultima. L‘acido piruvico reagisce
con il ferro ammonio citrato presente nel terreno e in circostanze ottimali
forma un colore marrone o, nel caso di alcuni batteri, marrone oliva.
 UREA (COMPARTO 11)
 Terreno 11- urea (20,0 g/L) contenuta in un terreno base
appropriato, con rosso fenolo come indicatore di pH. Non
inoculato: da beige ad ambra chiaro. La capacità di
produrre l’enzima ureasi è una caratteristica di alcuni
Enterobatteri .
Reazioni
 Negativa: la prova è da considerarsi negativa quando la
idrolizzano debolmente, dando origine ad una lieve
alterazione del terreno;
 Positività: La positività di questo test è data dall’idrolisi
batterica dell’urea che produce ammoniaca e abbassando
il pH fa virare il terreno a rosa;
 CITRATO (COMPARTO 12)
Terreno 12- citrato di sodio (2,0 g/L) contenuto in un
terreno base appropriato, con blu di bromotimolo come
indicatore di pH. Non inoculato: verde. Su questo
terreno possono crescere solo quei batteri capaci di
utilizzare il citrato come unica fonte di carbonio e sali di
ammonio come unica fonte di azoto.
Reazioni
Negativa: Se il terreno rimane verde è da considerarsi
negativa.
Positiva: Una colorazione blu chiaro è da considerarsi
positiva.
 CENNI TEORICI
Questo tipo di identificazione è stato
studiato per identificare le
Enterobatteriacee e cioè batteri
aerobi, anaerobi facoltativi, Gram-
che sono ossidasi-negativi.
 PRINCIPIO
Metodo microbiologico. Le enterobatteriacee svolgono un
ruolo primario come agenti infettivi. Questo gruppo di batteri
utilizza i carboidrati principalmente per fermentazione e per
ossidazione. Sono catalasi-positivi e quasi tutti ossidasi-
negativi. L’identificazione delle enterobatteriacee si basa sulle
reazioni biochimiche descritte da Ewing e Farmer. Per dettagli,
consultare la documentazione appropriata.1-11 Mentre
un’enorme gamma di generi e specie è stata descritta nel corso
degli anni, i microrganismi isolati da campioni clinici
appartengono a 20 – 25 specie ben conosciute da molti anni.
 OBIETTIVO
L’enterotube è un sistema pronto
all’impiego per l’identificazione rapida
delle Enterobacteriacee che consente
l’esame simultaneo di 15 differenti
caratteristiche biochimiche dei batteri.
 MATERIALE
UTILIZZATO
Reattivi: 12 terreni differenziali, ceppo batterico S, reaggenti:
Kovacs, VP1 E VP2.
Materiale vario: becco bunsen, enterotube, piastra seminata.
Strumenti di laboratorio utilizzati: termostato.
 PROCEDIMENTO
1. Lavorare in sterilità accanto alla fiamma del becco bunsen;
2. Svitare i due tappi ai lati dell’enterotube;
3. Con la punta dell’ago, all’interno dell’enterotube, prelevare una
colonia isolata da una piastra già seminata e incubata in
precedenza;
4. Afferrare l’estremità opposta dell’ago e tirarlo lentamente verso
l’esterno in modo da far passare la punta dell’ago con la colonia
prelevata in precedenza in tutti i terreni, ruotando ed estraendo
l’ago non completamente;
5. Riinserire delicatamente l’ago all’interno dell’enterotube fino alla
tacca contrassegnata e poi spezzarlo piegandolo. La parte dell’ago
che rimane all’interno assicura l’anaerobiosi.
6. Con lo spezzone dell’ago perforare la pellicola di plastica in
corrispondenza dei fori dei primi 8 scomparti al fine di creare un
ambiente aerobio.
7. Riavvitare i tappi e incubare a 35-37°C per 20-24h
in posizione verticale sul porta provette.
8. osservarela variazione di colore del terreno
verificando la presenza o meno di enterobatteri .
9. Dopo la prima osservazione inserire nello scomparto
dell’indolo 2 gocce di reattivo di kovacs. Il reattivo,
dopo 10 secondi, virerà in rosso il terreno se la prova
è positiva.
10. Inserire 3 gocce di soluzione alfa-niftolo e 2 gocce di
KOH nello scompartimento VP e aspettare 10 minuti.
RISULTATI ATTESI
RISULTATI
OTTENUTI