Vaccini

Cosa sono
I vaccini sono sostanze che iniettate nel nostro organismo
producono una risposta immunitaria contro determinati antigeni
permettendo al nostro sistema immunitario di riconoscerli nel
tempo.

Requisiti:
 di sicurezza
deve garantire l'immunità alla stragrande maggioranza dei
vaccinati, con la minima percentuale di effetti collaterali che
possono essere tollerati in base alla gravità della malattia.
 di immunogenicità
il vaccino deve essere in grado di produrre una valida risposta
immunitaria verso quel microrganismo. Solitamente i vaccini
sono costituiti da sostanze antigeniche provenienti dal
microrganismo stesso.

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 Tipi di vaccini
Esistono diversi tipi di vaccini, a seconda della modalità con le
quali vengono preparati

 Inattivati
 Vivi attenuati
 Sintetici
 2° generazione

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 Vaccini inattivati

Tali vaccini vengono prodotti uccidendo il microrganismo

responsabile della malattia, mediante agenti chimici o fisici
come il calore, ed inoculandolo nell'organismo.

sono stabili e sicuri poiché una volta ucciso il microrganismo

non può tornare alla sua forma patogena

parte dei vaccini inattivati fornisce una protezione immunitaria

relativamente debole e devono essere utilizzati mediante più
richiami.

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 Vaccini attenuati

I vaccini attenuati vengono preparati coltivando il microrganismo

in causa in condizioni particolari per fare in modo che perda la
sua virulenza e la sua patogenicità, ma provochi comunque la
risposta immunitaria desiderata.

Tali vaccini richiedono particolari condizioni di conservazione,

ma hanno il vantaggio di fornire una buona risposta immunitaria
che si ottiene in genere con un'unica somministrazione o al
massimo con una seconda dose di richiamo.

Generalmente questi vaccini vengono somministrati per via

iniettiva.

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 Vaccini sintetici

Alcuni batteri utilizzano delle tossine per provocare la malattia,

ad esempio il Clostridium tetani, responsabile del tetano,
provoca la malattia mediante la produzione della tossina
tetanica.

In questi casi è più comodo ed utile produrre un vaccino che

fornisca l'immunizzazione contro la tossina in questione. Tale
risultato si raggiunge producendo in laboratorio un'anatossina,
cioè una forma attenuata, e quindi non patogena, della tossina
in questione.

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 Vaccini di 2° generazione

vaccini preparati tramite l'ingegneria genetica e la tecnologia del

DNA ricombinante.

 Vaccini composti da subunità

 Vaccini con vettori ricombinanti

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 Vaccini con vettori Ricombinanti

•Consistenti nella semplice inoculazione di DNA plasmidico

nell’ospite.

•Wolf nel 1990 evidenziò come la inoculazione di tali prodotti

nei topi fosse seguita da una risposta anticorpale. Tale
osservazione venne confermata nel 1992 da Tang e
collaboratori, suggerendo pertanto la possibilità del loro impiego
quali presidi immunizzanti.

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 Caratteristiche di un vaccino a DNA.

• Consiste in una molecola di DNA plasmidico codificante

proteine verso le quali è rivolta la risposta immunologica
dell’organismo.

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 Schema di un vaccino a DNA
La maggior parte dei vettori plasmidici contiene :

1. Un sito replicativo che consente la sintesi di elevate

concentrazioni del plasmide nella cellula batterica,
generalmente E. coli.

2. Un gene di controllo (marker) responsabile, ad esempio,

della resistenza ad un antibiotico e che assicura la sola
replicazione del batterio contenente il plasmide.

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3. Una sequenza genica codificante per l’antigene di
interesse.

4. Elementi che controllano il processo di trascrizione nelle

cellule eucariotiche quali il promotore e l’amplificatore della
sequenza (spesso di origine virale, ma anche specifica per il
tessuto).

5. Un fattore responsabile dell’arresto della trascrizione quale

ad esempio l’ormone della crescita del bovino al fine di
assicurare il blocco della sintesi dell’mRNA.

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elementi in grado di incrementare la stabilità del messaggero
la maggiore stimolazione dei linfociti T helper
l’inserzione di sequenze immunostimolanti ad azione
adiuvante.

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 Ruolo delle sequenze immunostimolatrici

Il vaccino a DNA agisce esso stesso come un adiuvante. Esso

rafforza la risposta immunitaria stimolata dagli antigeni. L’effetto
sembra legato all’elevata frequenza di sequenze GC contenute
nel plasmide. Alcuni ricercatori pensano che l’organismo
interpreti l’elevata frequenza di coppie CG non metilate come
segnale di pericolo.

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• Una proposta per incentivare la reattività è emersa dallo studio
del DNA nelle zone attorno alle sequenze CG.

• Si è dimostrato che il DNA plasmidico produce una risposta

immunitaria più potente quando le sequenze CG sono
fiancheggiate da due purine (adenina o guanina) dal lato della
C, e da due pirimidine (timina o citosina) dal lato della G.

• Nei topi i Plasmidi con queste sequenze immunostimolanti

inducevano un’attività anticorpale e citotossica maggiore.

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• Un altro metodo prevede l’inserimento nel plasmide del gene
per le citochine come per esempio la GMCSF fattore di
stimolazione delle colonie di granulociti e macrofagi. Inoltre si è
scoperto che si può indurre maggiormente o solo l’attività
umorale o citotossica inserendo nel plasmide la citochina
responsabile di tale attivazione preferenziale.

• Citochine Th1 promuovono la risposta cellulare.

• Citochine Th2 promuovono la risposta umorale.

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• Allo stesso modo possono essere incorporati nei plasmidi geni
che codificano per le chemochine. Queste molecole richiamano
le cellule che presentano l’antigene e i linfociti T verso tessuti
danneggiati o infettati e si differenziano per i tipi di cellule su cui
agiscono e per il loro specifico effetto.

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 Formulazione di un vaccino a DNA

 DNA plasmidico in solvente acquoso è la formulazione più

semplice da preparare e caratterizzare, e la sua preparazione è
certamente meno costosa di quella relativa alla produzione e
purificazione di proteine ricombinanti.

 Può anche essere introdotto in particelle rivestite da una lamina

dorata ed inoculate sotto pressione nell’epidermide e nelle
mucose dell’ospite. Tale sistema viene generalmente definito
"gene gun". Altri metodi possono consistere nell’associazione
del plasmide a liposomi ed inoculazione per via intramuscolare
o respiratoria.

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 Vie di inoculazione

Le vie che si possono seguire possono essere le seguenti:

Cutanea tramite il sistema "gene gun".
Intradermica.
Sottocutanea.
Endovenosa.
Orale.
Mucosale.

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 Meccanismo d’azione dei vaccini a DNA

L’efficacia dimostrata da questo tipo di vaccinazione è subordinata

a 3 fattori principali :

Ottimale presentazione dell’antigene

Prolungata sintesi dell’antigene
Azione adiuvante delle sequenze immunostimolatrici inserite nel
plasmide.

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 Presentazione dell’antigene

I risultati delle ricerche svolte suggeriscono che dopo

l’inoculazione, il plasmide trasfetta i miociti che possono fungere
da sede di elevata espressione antigenica o, in alternativa,
l’antigene stesso è trasferito alle cellule adiacenti che lo
esprimono (cellule presentatrici l’antigene - PCA), le quali danno
inizio alla attivazione della risposta immunologica.

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 Come agisce un vaccino a DNA

1. I plasmidi sono introdotti in piccoli gruppi di cellule, spesso

mediante iniezione in cellule muscolari o per azione di una forte
pressione direttamente nella cute, mediante le pistole geniche.

2. Una volta che il plasmide è penetrato all’interno del nucleo della

cellula, i geni che codificano per l’antigene contenuti nel plasmide
vengono copiati in filamenti di RNA messaggero.

3. I mRNA vengono trasferiti nel citoplasma per essere tradotti in

proteine antigeniche.

Gli antigeni diventano visibili al sistema immunitario in due modi:

•possono uscire dalla cellula

•possono venir frammentati e associati alle molecole di Classe 1
del complesso maggior di istocompatibilità (MHC) e esposti sulla
superficie cellulare.

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• Gli antigeni che escono dalla cellula si legano ai linfociti B e
vengono inglobate dalle cellule specializzate che presentano
l’antigene sulle molecole MHC di classe II.

• Questi stimolano le cellule T helper a secernere le citochine

Th1e Th2 che andranno ad attivare i linfociti B e i linfociti T
citotossici.

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 Durata della sintesi dell’antigene

L’espressione genica codificata dal plasmide può persistere a

lungo soprattutto quando essa viene espressa in cellule
incapaci di replicare come quelle muscolari. In tali circostanze
l’espressione può persistere anche per due anni (nel topo).

Tuttavia, anche se è stato accertato che le cellule muscolari

esprimenti l’antigene vengono distrutte dopo 10-20 giorni
dall’inoculazione genica, l’immunità che ne consegue è sempre
di lunga durata.

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 Vie di inoculazione e risposta immunologica
stimolata dai vaccini a DNA.

Via intramuscolare

La inoculazione del plasmide per via intramuscolare stimola una

risposta cellulare e umorale.

In alcune circostanze una sola inoculazione è sufficiente ad indurre

una risposta immunitaria elevata mentre, in altre circostanze, sono
necessari due interventi. Tale variabilità è attribuibile alle
caratteristiche dell’antigene che deve essere espresso, alla dose e
al modello animale.

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• La concentrazione di DNA plasmidico necessaria per indurre
una stimolazione immunologica significativa è superiore
rispetto a quella occorrente per altre vie in quanto il DNA
rimane nell’ambiente extra-cellulare e viene degradato,
almeno parzialmente, dalle nucleasi cellulari.

• Essa presenta il vantaggio della semplicità di inoculazione ed

un solo intervento induce una risposta immunologica
superiore rispetto a quella stimolata con altri metodi.

• Una delle caratteristiche richieste da un vaccino a DNA è la

sintesi dell’antigene cui segue la stimolazione di linfociti CD8+
citotossici. La risposta cellulo-mediata può essere
incrementata da successive inoculazioni.

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 POSSIBILI RISCHI E ASPETTI FAVOREVOLI

• Una delle principali perplessità correlate a questa tecnologia

riguarda la possibile integrazione del plasmide nella cellula
ospite con conseguente induzione di un evento mutageno,
possibile attivazione di oncogeni, inattivazione di geni
soppressori e alterazioni genetiche conseguenti ad eventi di
ricombinazione.

29
• Dai risultati delle prove attuate si è evidenziato come, con i
plasmidi attuali, il processo di integrazione sia un evento
pressoché impossibile.

• Tuttavia, il rischio può essere ulteriormente ridotto facendo

ricorso a nuovi tipi di plasmidi caratterizzati da estremamente
limitata o assente omologia delle sequenze genomiche con
quelle dell’ospite.

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Prove sperimentali non hanno evidenziato sequenze geniche
virali in animali immunizzati con DNA plasmidico, riducendo
quindi l’eventuale possibilità di integrazione.

L’immunizzazione genica riduce inoltre gli effetti collaterali

conseguenti all’impiego di adiuvanti comunemente impiegati nei
vaccini tradizionali in quanto il plasmide viene inoculato in
soluzione salina o veicolato da particelle o microproiettili
completamente inerti.

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•Animali gestanti inoculati con concentrazioni significative di
DNA plasmidico (1 mg) non hanno presentato alcuna
controindicazione.

•Un ulteriore aspetto favorevole è rappresentato dalla

incapacità ad indurre tolleranza. Infatti, dosi ridotte di DNA
plasmidico sensibilizzano il sistema immunitario che risponde
attivamente ad un successivo contatto con l’antigene.

• Una particolare caratteristica consiste nella elevata

termostabilità di questi prodotti e quindi la non assoluta
dipendenza dalla catena del freddo per la distribuzione, come
invece richiesto per i vaccini di prima e seconda generazione.

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Applicazione della tecnologia dei vaccini a
DNA in acquacoltura

Metodi di somministrazione

Iniezione
Immersione
Somministrazione orale

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Iniezione

Metodica stressante per il pesce

Laboriosa
Più efficace

DNA plasmidico viene iniettato in un piccolo volume di buffer

intramuscolarmente, sotto o vicino la pinna dorsale.

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Dose e volume
Maggiori volumi sono associati con una riduzione dell’attività del
gene reporter
Dose tipica 1-50 µg di DNA in un volume di 10-50µl.
La dose ottimale dipende dalla specie e la taglia dell’animale e
dalle condizioni fisiologiche.
Localizzazione dell’espressione del transgene
In letteratura ci sono discrepanze riguardo al sito di espressione
dopo iniezione intramuscolare.
In pesci di grande taglia l’espressione del gene reporter sembra
ristretta al sito d’iniezione.
Trasfezione di cellule presentanti l’antigine (PCA), contribuisce ad
aumentare la risposta immunitaria.
In pesci di piccola taglia il gene reporter iniettato in IM viene
rilevato anche nelle branchie, rene, milza. 37
Durata dell’espressione e effetto sui tessuti del
pesce.

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Somministrazione orale e per immersione

Metodo ideale per un allevamento

Metodo non stressante per il pesce
Induzione di immunita associata alle mucose
Non consente di determinare la quantita di vaccino ingerita
Risulta meno efficente dell’iniezione o immersione

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