Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale

Conoscenza proteina Malattia genetica

Determinazione sequenza aminoac. Mappatura genetica con marcatori

polimorfici

Deduzione sequenza nucleotidica Identificazione cloni genomici

che coprono il sito mappato

Sintesi sonda oligonucleotidica Ricerca del gene (varie tecniche)

Isolamento clone di cDNA Deduzione della struttura aminoac.

Isolamento clone genomico Ricerca mutazioni nucleotidiche

nelle famiglie affette

Caratterizzazione clone genomico

Ricerca di mutazioni nucleotidiche Ricerca funzione proteica

CLONAGGIO IN VETTORI PROCARIOTICI

Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

CARATTERISTICHE VETTORE PLASMIDICO DI CLONAGGIO

- Origine autonoma di replicazione (ORI)

- Geni per la selezione: resistenza ad uno o due antibiotici

- Altri geni per la selezione del plasmide ricombinante

- Siti multiplo di clonaggio

oppure
elettroporazione

T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007

 Piastramento
su terreno con antibiotico

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 Selezione per la presenza
del vettore: resistenza ad
antibiotico

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 VETTORI DI CLONAGGIO PER E. coli
Tipo Dimensioni Dimensioni Sistema Metodo
(kb) inserto (kb) selezione introduzione
Plasmidi
pBR322 4,3 6 2 Antibiotici Trasformazione

pUC 2,1 8 Amp + Lac Z Trasformazione

Batteriofago lambda 25 20-25 Infezione

Fago filamentoso M13 6,4 3 Lac Z Trasfezione

Cosmidi 5-6 35-50 Antibiotico Infezione

Cromosomi artificiali 7 fino a 300 Amp (CM) + Lac Z Elettroporazione

BAC
Plasmide pBR322

Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

pBR322: screening delle
colonie ricombinanti

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Vettori plasmidici (pUC18)

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Il gene LacZ codifica per il polipeptide
β-galattosidasi (1021 a.a.)

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•Ceppo di E.coli: gene Lac Z β-galattosidasi
mutante: peptide parziale
Complementano
ATTIVA
•Vettore pUC: gene LacZ
mutante: peptide parziale

•Ceppo di E.coli Lac Z mutante Non c’è β-galattosidasi

•Vettore LacZ interrotto dal complementazione INATTIVA
clonaggio

β-galattosidasi
Colonie
ATTIVA
Metabolizzato
Blu
Terreno + X-Gal

β-galattosidasi Non metabolizzato Colonie

INATTIVA
bianche

X-Gal: 5-Bromo-4-Cloroindolil-β-galattoside (incolore)

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(induttore)
Metodi di inserimento dei vettori ricombinanti nelle
cellule batteriche

Trasformazione: plasmidi (DNA) trasformano cellule procariotiche rese

competenti

Infezione: fagi (DNA con capsidi) che lisano il batterio

Trasfezione: come una trasformazione ma con DNA fagico senza capsidi

per es: per introdurre la forma replicativa di M13 a doppio filamento

Infezione: cosmidi (DNA con capsidi) che nel batterio si comportano come
plasmidi
 BATTERIOFAGO LAMBDA COME VETTORE DI CLONAGGIO

Lambda w.t. = 50 Kb
Estremità “cos” di 12 nt
per circolarizzazione

Infezione di E. coli
Batteriofago lambda
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 Batteriofago lambda

Lambda w.t. = 50 Kb

Lambda di sostituzione: eliminati geni ciclo lisogenico, componenti capside:

inserti fino a 23 Kb

Clonaggio di frammenti DNA esogeno e packaging in vitro per costituzione

particelle fagiche per infezione batterica
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 Creati siti unici per
clonaggio

Formazione di catenani

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 Fago difettivo (siti cos alterati)
non può replicarsi ma produce
proteine per i capsidi che possono
essere purificate

Fagi difettivi che da soli non

producono capsidi.
Le singole proteine possono
essere purificate

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CLONAGGIO IN BATTERIOFAGI

Placche di lisi
Tappeto batterico

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 Infezione fagica
Screening placche di lisi

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Fago filamentoso
Fago filamentoso
Infetta solo i ceppi F+
attraverso il pilo codificato
dal fattore F

La cellula
batterica non
viene lisata!

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Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Fago filamentoso

Clonaggio nella forma replicativa a doppia elica,

Trasfezione del ricombinante senza capsidi
Genoma modificato con inserzione LacZ parziale
Selezione colonie per il colore
Metodi di inserimento dei vettori ricombinanti nelle
cellule batteriche

Trasformazione: plasmidi (DNA) trasformano cellule procariotiche rese

competenti

Infezione: fagi (DNA con capsidi) che lisano il batterio

Trasfezione: come una trasformazione ma con DNA fagico senza capsidi

per es: per introdurre la forma replicativa di M13 a doppio filamento

Trasduzione: cosmidi (DNA con capsidi) che nel batterio si comportano

come plasmidi
Clonaggio in cosmidi

Formazione di catenani

Formazione di colonie

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CROMOSOMI ARTIFICIALI DI BATTERIO
(BAC)
Fattore di fertilità F di E. coli ha 3 geni (parA, parB, repE) per la
replicazione e per mantenere basso il numero di copie del fattore
(1- 2 per cellula)

Gene per la resistenza al cloramfenicolo (per selezione trasformanti)

Siti di clonaggio nel gene LacZ (identificazione ricombinanti per

complementazione)

Inserto tra 150 e 350 Kb

Integrazione batterica per elettroporazione

Promotori per la trascrizione (promotore fagico T7 e promotore del

fagico SP6)
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VETTORI DI CLONAGGIO IN LIEVITO:
YAC (YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOME)

Saccharomyces cerevisiae: 16 cromosomi da 250 kb a 2 Mb

Inserto: 300 kb – 1 Mb
Sferoplasting: liticasi

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 SUP 4

CEN = Centromero
ARS = sequenze autonome di replicazione
TRP1 e URA3 per selezione di molecole con entrambi i bracci
URA 3 = gene per un enzima della sintesi dei nucleotidi pirimidinici
TRP1 = gene per un enzima della sintesi del triptofano

SUP 4 = gene per il tRNA per la tirosina che sopprime la mutazione non
senso “ochre” nel gene ADE2 del ceppo di lievito
ADE2 = gene per la sintesi di adenina: un precursore dell’adenina (fosforibosil
amminoimidazolo) che sta a monte nella via biosintetica si accumula e dà colonie rosse

S. cerevisiae (ceppo per il clonaggio): URA (-), TRP (-), ADE2 (-) per mutazione
“ochre”.
Nel codone UAU (tyr) nel gene ADE2 si verifica la mutazione “ochre” UAA “non
senso” e diventa ADE2(-): l’adenina non viene sintetizzata e si accumula come
premetabolita rosso
S. cerevisiae (w.t): crescono se nel in terreno c’è uracile e triptofano

S. cerevisiae (utilizzato per clonaggio): URA (-), TRP (-), ADE2 (-) per mutazione
“ochre”
accumulo di premetabolita dell’adenina colonie rosse

YAC con gene SUP 4 = gene per il tRNA con UAA Tyr*
SUP 4 integro sopprime la mutazione non senso “ochre” nel gene ADE2 del
ceppo di lievito: viene sintetizzata adenina, non c’è accumulo di premetabolita
rosso colonie bianche

S. cerevisiae (terreno minimo) + YAC senza inserto (SUP attivo)

colonie bianche
colonie bianche
S. cerevisiae (terreno minimo) + YAC con inserto (SUP inattivo)
colonie rosse
 VANTAGGI E SVANTAGGI DEL CLONAGGIO IN YAC:

- Chimerismo (co-saldatura di più regioni nello stesso YAC)

- Instabilità (soprattutto a livello di regioni ripetute)
- Co-trasformazione (più di uno YAC per cellula di lievito)

Distribuzione dei cloni in griglie

Produzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare in screening
Allineamento dei cloni in contigui
ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS