Università degli Studi di Milano

Facoltà di Farmacia

Impiego di metodiche computazionali

nella progettazione di farmaci

Alessandro Pedretti
Drug discovery

Il termine di drug discovery viene utilizzato per indicare tutti quei processi
che portano all’identificazione o allo sviluppo di un nuovo farmaco.

Identificazione di un bersaglio (target) a cui è correlata una certa

patologia su cui intervenire con un farmaco.
Identificazione di una molecola attiva (hit compound) mediante:
screening;
approccio razionale;
fortuna (serendipty).
Studio della molecola attiva al fine di realizzare derivati con un più definito
profilo di attività, metabolismo e tossicità (lead compounds).
Studi pre-clinici (animali).
Studi clinici (uomo).
Interazione farmaco-recettore

Perché un farmaco possa esplicare la propria azione deve interagire con un

bersaglio chiamato recettore.

Affinità Potenza
Effetto
biologico

Complesso
Farmaco Recettore
farmaco-recettore

Tipologie di recettori:

Enzimi Inibizione
•Proteine
Recettori per mediatori chimici Attivazione
Inibizione
•Acidi nucleici
Forze coinvolte nell’interazione

Forze d’interazione Lipofilia

Interazioni elettrostatiche
 legami ionici
Forze
 interazioni di trasferimento di carica
ioniche  interazioni 
 interazioni ione - dipolo
(permanente o indotto)
Polarità
 legami di idrogeno rinforzati
 legami di idrogeno normali
 forze di orientazione
(dipolo permanente - dipolo permanente)
Forze di
 forze di induzione
Van der (dipolo permanente - dipolo indotto)
Waals
 Forze di dispersione
(dipolo indotto - dipolo indotto)
Idrofobicità
Interazioni idrofobiche
Progettazione razionale di molecole bioattive

Può avvenire secondo:

• Approccio indiretto:
- la struttura del recettore è ignota;
- utilizzo di metodiche QSAR (relazioni struttura-attività quantitative).

• Approccio diretto:
- la struttura del recettore è nota;
- utilizzo di metodiche di docking molecolare.

L’obiettivo di entrambi gli approcci è quello di ottenere un modello chiamato

farmacoforo sulla base del quale verranno progettate le nuove molecole.
Il farmacoforo

E’ l’insieme delle sottostrutture della molecola di un farmaco necessarie

all’interazione col recettore.

Tasca recettoriale Gruppo carico Farmaco

negativamente

Gruppo accettore
di legami d'idrogeno

Spaziatore

Gruppo idrofobico
QSAR - Relazioni struttura-attività quantitative

E’ il processo col quale le proprietà chimico-fisiche sono messe in relazione

con l’attività biologica o la reattività chimica.

Attività = f(proprietà chimico-fisiche)

Assunzione fondamentale:
molecole con proprietà chimico-fisiche simili fra loro avranno anche attività
simile.
Identificazione delle proprietà (descrittori) adatte al problema che si vuole
affrontare (es. peso molecolare, area, volume, momento dipolare,
flessibilità, capacità di formare legami d’idrogeno, ecc).
Calcolo dei descrittori per un set di molecole per cui è nota
sperimentalmente l’attività biologica.
Calcolo dell’equazione correlativa (es. mediante PLS).
Utilizzo dell’equazione per predire l’attività di composti la cui attività
sperimentale è ignota.
QSAR – Analisi dei risultati
10

9.5

9
Attività

8.5

7.5

7
-50 -40 -30 -20
Descrittore

pEC50 = 6.06 (0.35) – 0.070 (0.01) x Descrittore

n = 35; r2 = 0.57; q2 = 0.51 s = 0.29; F = 44.30
3D-QSAR1

Si basa sull’impiego di descrittori chiamati campi calcolati proiettando una

proprietà della molecola su una griglia 3D.

Prerequisiti:
• Struttura 3D delle molecole.
• Allineamento ottimale delle strutture 3D di tutte le molecole, necessario
all’allineamento dei campi.

Tipologie di campi:
• Sterici
• Elettrostatici
• Lipofilici
• Basati su legami d’idrogeno
3D-QSAR – Visualizzazione dei campi

Interazioni steriche
Interazioni elettrostatiche favorevoli
sfavorevoli

Farmaco

Interazioni steriche
Interazioni elettrostatiche sfavorevoli
favorevoli
Il docking molecolare

Si tratta di un approccio computazionale per lo studio delle interazioni fra

un generico ligando e una biomacromolecola bersaglio.
E’ necessario conoscere la struttura tridimensionale sia del ligando, sia
della biomacromolecola bersaglio.

Le informazioni estrapolabili da uno studio di docking possono servire per:

l’identificazione degli elementi strutturali chiave per l’interazione sia del

ligando, sia del recettore (modello farmacoforico);
la progettazione di nuovi ligandi con maggiore affinità e,
conseguentemente con maggiore potenza;
ipotizzare un plausibile meccanismo d’azione.
Applicazioni del docking molecolare

Il docking molecolare permette lo studio di complessi:

• Recettore macromolecolare - ligando a basso PM*

recettore/enzima – attivatore/inibitore

• Recettore macromolecolare - ligando a basso PM*

proteina – proteina, DNA – proteina, DNA – DNA.

• Recettore a basso PM – ligando a basso PM*

inclusi (es. beta-ciclodestrine), sali binari.

Il primo caso è quello più frequente in chimica farmaceutica poiché la

stragrande maggioranza dei farmaci è a basso PM.

*PM = peso molecolare

Struttura 3D del ligando

C19H23NO5
1D
COc1cccc(OC)c1OCCNCC3COc2ccccc2O3

O MeO

H
O
N
O
2D
OMe

Conversione 2D →3D:
• Meccanica molecolare
(MD, conformational search)
• Quantomeccanica 3D
Struttura 3D del recettore

Può trattarsi di un problema estremamente complesso soprattutto se non si

dispongono di informazioni sperimentali sufficienti, viste le elevate
dimensioni che un recettore presenta (> 50.000 atomi).

Difrattometria a raggi X

Accuratezza
della struttura 3D Risonanza magnetica nucleare

Predizione della struttura 3D

•Metodica sperimentale
•Metodica computazionale
Difrattometria a raggi X

E’ la miglior metodica attualmente disponibile per la risoluzione di

strutture tridimensionali.
E’ necessario disporre del cristallo della molecola da analizzare, cosa
non sempre facile da ottenere.
Il cristallo si deteriora durante l’analisi per via dell’alta energia dei raggi X.
Fornisce un’immagine statica di
una realtà fisica (cristallo) che
non coincide con quella biologica.
I cristalli delle macromolecole
possono contenere un elevato
numero di molecole d’acqua.

Struttura secondaria

Molecole d’acqua
Risonanza magnetica nucleare - NMR

Si basa sul fatto che i nuclei atomici essendo costituiti da protoni e

neutroni hanno un intrinseco momento magnetico ed angolare.
Non permette di risolvere completamente la struttura 3D di una
macromolecola.
E’ possibile eseguire l’analisi in soluzione, quindi in un ambiente più
simile a quello biologico.
Come risultato fornisce dei parametri geometrici (distanze interatomiche)
che possono essere usate per creare il modello 3D mediante l’impiego
della meccanica molecolare (MM) e della dinamica molecolare (MD).
Predizione della struttura 3D

Si può parlare anche di predizione del folding di una proteina.

Assunzione:
Proteine con sequenza aminoacidica simile (struttura primaria) hanno
anche una disposizione spaziale degli atomi simile (sequenza secondaria e
terziaria).
Ciò è comprovato da un’evidenza sperimentale:

Proteina Denaturazione Proteina Rinaturazione Proteina

allo stato nativo denaturata allo stato nativo
pH
Temperatura
Forza ionica

Le informazioni per il folding sono contenute nella struttura primaria della

proteina.
 Predizione del folding proteico

Ab-initio Comparative modelling

Sequenza aminoacidica

…AYDKLATT…


Uso di parametri e Confronto con
“regole” dedotte modelli a struttura
da strutture 3D 3D risolta
Etot=WVdWEVdW+WhbEhb+…

Funzione di score Funzione di score

Predizione del folding

Docking manuale

L’operatore è guidato dalla grafica computerizzata.

E’ necessario postulare un’ipotesi sulla modalità d’interazione.
Si posiziona il ligando mediante rototraslazioni manuali.

Docking
manuale

Ligando
Recettore
Docking manuale – visualizzazione del recettore

Visualizzazione wireframe

Sito di legame

Superficie DEEP
Docking manuale – visualizzazione del recettore

Zone cariche -
Superficie MEP

Accettori di HB

Zone cariche +

Superficie accettrice di HB
Docking manuale – visualizzazione del ligando

Zona carica +

Zona carica -

Donatore di HB

Superficie di Superficie MEP

Van der Waals

Superficie donatrice di HB
Il docking automatico

Non richiede particolari manualità da parte dell’operatore.

Il ligando è posizionato nel recettore in modo automatico.
La validità del complesso (o orientamento) risultante è stimata mediante
un punteggio chiamato score:
Lo score è un valore numerico che permette di stabilire a priori, cioè
senza l’ausilio della grafica, se un orientamento è di potenziale
interesse:
 score  interazione ligando recettore
All’operatore resta il compito di giudicare la validità delle soluzioni
proposte dal punto di vista chimico-farmaceutico-biologico.
Caratteristiche ideali del docking automatico

Accuratezza dell’attribuzione dello score per ciascun orientamento

ligando-recettore calcolato.
Pertinenza delle proprietà considerate nell’attribuzione dello score in
relazione allo specifico sistema ligando-recettore.
Rapidità nella generazione dei complessi.
Interfaccia con banche dati di molecole per il virtual screening.

Ligando
Complesso Classificazione
ligando-recettore del complesso
Algoritmo di Valutazione
Recettore docking dello score
Funzione di score

Permette di valutare la complementarità chimico-fisica e geometrica fra

ligando e recettore in un complesso.
E’ l’elemento più critico di un metodo di docking.

Score = Cs + Ci + ENB + EDes + ...

Cs = complementarità sterica;
Ci = contributo idrofobico;
ENB = energia di non legame;
EDes = energia di desolvatazione.
Calcolo dell’energia di una molecola

Indispensabile per:
• ottimizzazione delle geometrie di una molecola (minimizzazione
energetica);
• analisi conformazionale (evasione dai minimi locali);
• dinamica molecolare;
• docking molecolare.

Calcoli quantomeccanici

Accuratezza Calcoli semi-empirici Velocità

Calcoli di meccanica molecolare

Meccanica molecolare

Approssima gli atomi a delle sfere rigide e i legami a delle molle.

Energia di non-legame

Etot = Eb + Ea + Et + Ei + EVdW + Ec+ EHB

Energia di legame

Eb = energia di legame
Ea = energia angolare
Et = energia torsionale
Ei = energia degli angoli impropri
EVdW = energia di Van der Waals
Ec = energia elettrostatica (coulombiana)
EHB = energia dei legami d’idrogeno
Energia di non legame

ENL = EVdW + Ec+ EHB

Nel caso del campo di forze AMBER:

 A 12
  Bij  
6

E NB  ij  ij   2.   
 rij 

r  
 ij  

qi q j  Cij Dij 
  .rij
 ij  12  10 
 rij rij 
ij
Riduzione dei tempi di calcolo

Computo dello score mediante meccanica molecolare o altri metodi

empirici.
Riduzione del numero di parametri che costituiscono la funzione di score.
Riduzione delle dimensioni dell’area da esplorare.
Conformazione bloccata del recettore.
Conformazione bloccata del ligando.

Inaccuratezza del complesso generato.

Lo screening virtuale1

Strumento basato su metodiche computazionali atto all’identificazione di

composti biologicamente attivi a partire da banche dati di strutture reali o
puramente virtuali.
Virtuale Reale

Database
Database di
di composti
composti Sintesi
Sintesi chimica
chimica
(milioni)
(milioni) (decine)
(decine)

Modello
Modello farmacoforico
farmacoforico Test
Test farmacologico
farmacologico

Molecole
Molecole potenzialmente
potenzialmente Molecole
Molecole attive
attive
attive (alcune
(alcuneunità)
unità)
attive (decine)
(decine)
Lo screening virtuale2
Virtuale

Database
Database di di composti
composti
reali
reali(migliaia)
(migliaia)

Reale

Modello
Modello farmacoforico
farmacoforico Test
Test farmacologico
farmacologico

Molecole
Molecole potenzialmente
potenzialmente Molecole
Molecole attive
attive
attive (alcune
(alcuneunità)
unità)
attive (decine)
(decine)

Situazione tipica di un’industria farmaceutica.

Vantaggi: risparmio di tempo nello sviluppo = risparmio di denaro.
Nuove frontiere
per la modellistica molecolare
QSAR 2D½

Le molecole non sono rappresentate come un insieme di atomi ma da dei

vettori che ne descrivono le proprietà chimico fisiche (es. momento
dipolare, momento di lipofilia, legami d’idrogeno, ecc).

Con i vettori è possibile tener conto della flessibilità della molecola

calcolandoli come una media dei diversi conformeri.

Relativa facilità di sovrapposizione dei vari modelli vettoriali.

Possibilità di rappresentare graficamente sia le molecole, sia il

farmacoforo in modo comprensibile.

Attualmente non esiste una soluzione accademica di QSAR che possa

competere con i programmi commerciali.
Analisi delle dinamiche molecolari

Premessa:
• Le simulazioni di dinamica molecolare permettono di studiare come
evolve nel tempo un sistema sottoposto all’effetto dell’energia cinetica.
• Durante la simulazione vengono campionate le coordinate atomiche a
salvate in un file di traiettoria (trajectory).
• Il quantitativo di informazioni contenute nella traiettoria è talmente elevato
che spesso quelle più importanti sono “coperte” da quelle secondarie.

Analisi dei risultati:

• Si potrebbero considerare i movimenti degli atomi alla stessa stregua di
onde e applicare la teoria di del campionamento Shannon.
• I segnali più importanti potrebbero essere filtrati per evidenziarli al meglio
(es. FFT, DFT, ecc).
• Analisi dei movimenti dei domini di una proteina.
Fingerprint per il de novo drug design

Fingerprint e similarità:

• Le fingerprint sono stringe di bit comunemente utilizzate per comparare

fra loro molecole e nel caso più specifico per il virtual screening.

• La codifica delle strutture in fingerprint comporta un notevole incremento

della velocità di interrogazione di una database (indice di similarità di
Tanimoto).

Fingerprint e progettazione di nuovi farmaci:

Codifica di strutture biologicamente attive in fingerprint.

Combinazione dei bit (es. mediante operatori logici o algoritmi genetici).

Nuova molecola
Predizione del folding proteico

Si è ben lontani dall’aver compreso le regole codificate nella struttura

primaria che determinano la disposizione spaziale degli atomi.

Il campo meno esplorato è quello della predizione ab-initio.

Predizione dei loop.

Ottimizzazione della catene laterali degli aminoacidi.

Automatizzazione della generazione di modelli in forma apo (enzima) ed

olo (enzima + cofattore).
Meccanica molecolare

E’ già stato fatto molto ma mancano algoritmi realmente veloci.

Calcolo dell’interazione di non-legame.

Problema della costante dielettrica.

Parallelizzazione del codice.

Rilevamento delle collisioni degli atomi (bump-check) in tempo reale.

GPGPU e stream processing

Vantaggi:
Campo ancora poco esplorato (es. SETI@Home, Folding@home).
Permette di avere prestazioni di calcolo eccezionali a costi bassissimi:
- 8x AMD Opteron 750 2.4 GHz (16 core totali) ~ 20 GFlops (20.000 €)
- 1x AMD/ATI HD3870 (320 stream processor) ~ 60 GFlops (~1.200 €)

Programmazione relativamente semplice grazie al compilatore C/C++ -

like Brook+ (AMD).
Non esiste ancora alcun programma di meccanica molecolare.

Svantaggi:
Due standard incompatibili:
• CAL (AMD).
• CUDA (NVIDIA).
Ringraziamenti

Giulio Vistoli Roberto Cordone

www.ddl.unimi.it