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COMPENDIO DI MICROBIOLOGIA GENERALE

AGGIORNAMENTO 2009 a cura di Paolo Di Francesco, Veronica Di Cristanziano e Enrico Salvatore Pistoia
Universit degli Studi di Roma Tor Vergata Facolt di Medicina e Chirurgia Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche Cattedra di Microbiologia e Microbiologia Clinica

Si ringrazia per la collaborazione Danilo Divizia, Studente del terzo anno del Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia I paragrafi siglati NEWS rappresentano gli aggiornamenti 2009 rispetto le precedenti versioni. NOTE. Questo materiale non pu essere distribuito, modificato o pubblicato
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NEWS
Ab o Ac Ag APC ARDS DC DIC IFN Ig IL GI LPS MAC MHC MOFS NK PAMPs PBP PG PRRs TCR TLRs Th TNF

Legenda delle abbreviazioni presenti nel testo


antibody o anticorpo antigene antigen-presenting cells, cellule presentanti lantigene sindrome da insufficienza respiratoria acuta dendritic cells, cellule dendritiche coagulazioni intravasali diffuse interferon, interferone immunoglobuline interleuchine gastrointestinale lipopolisaccaride complesso di attacco alla membrana complesso maggiore di istocompatibilit sindrome da insufficienza multipla degli organi cellule natural killer pathogen-associated molecular patterns, profili molecolari associati a patogeni penicillin-binding proteins, proteine leganti la penicillina prostaglandine pattern recognition receptors, recettori di ricognizione di profili molecolari T cell receptor, recettore per lAg dei linfociti T toll-like receptors linfociti T helper tumor necrosis factor, fattore di necrosi tumorale

LA CELLULA BATTERICA
I batteri o procarioti (dal greco nucleo primitivo) sono organismi di piccole dimensioni, privi di membrana nucleare e di apparato mitotico, con un unico cromosoma batterico, detto nucleiode, circolare a doppia elica non racchiuso in un nucleo. Sono chemiosintetici, fotoeterotrofi o fotoautotrofi, unicellulari, con riproduzione asessuata mediante fissisione binaria. I batteri a forma sferica prendono il nome di cocchi, diplococchi se riuniti a coppia, stafilococchi se riuniti in ammassi irregolari e streptococchi se disposti a catenelle. I batteri di forma cilindrica sono detti bacilli, mentre se presentano le estremit con una o piu' curvature son detti vibrioni e spirilli.

I batteri sono caratterizzati da una architettura essenziale con assenza di compartimenti intracellulari separati da membrane e con strutture presenti solo nei procarioti come ad es. la parete cellulare con i suoi principali componenti: il peptidoglicano, il lipolisaccaride e strutture accessorie come la capsula, i pili, i flagelli e le endospore. Il diverso comportamento dei batteri ad un test biochimico, la colorazione di Gram, consente di suddividere i batteri in due gruppi principali, i batteri Gram positivi che al termine della colorazione appaiono evidenziati in violetto e i batteri Gram negativi che appaiono colorati in rosso. La Gram positivit e la Gram negativit legata alle diversit strutturali dei batteri che come vedremo costituiscono anche differenze funzionali che si riflettono nel meccanismo di azione patogena dei Gram positivi e dei Gram negativi.

CARATTERISTICHE DEI PROCARIOTI


Nucleo: assente, il DNA disperso in un area nucleare priva di membrana. Nucleolo: assente DNA: Cromosomi singoli Parete cellulare : presente Membrana citoplasmatica: manca di steroli. Ribosomi : 70S (50S, 30S) Respirazione: associata alla membrana. Movimento: flagelli, filamenti assiali. Riproduzione: scissione binaria Dimensioni: 0,5-5 micron.

STRUTTURE DELLA CELLULA PROCARIOTICA


MEMBRANA CITOPLASMATICA. E presente sia nei Gram positivi che nei Gram negativi. E' un doppio strato lipidico che racchiude il citoplasma batterico simile alla membrana cellulare degli eucarioti a parte la mancanza di steroli. Le principali funzioni della membrana citoplasmatica batterica sono: 1) permeabilit selettiva e trasporto di soluti; 2) trasporto degli elettroni, fosforilazione ossidativa ed altri enzimi e vettori della catena respiratoria; 3) escrezione degli enzimi idrolitici; 4) supporto per gli enzimi e per le molecole trasportatrici che agiscono in processi biosintetici come la sintesi di DNA, dei polimeri della parete cellulare e dei lipidi della membrana citoplasmatica; 5) supporto per specifici recettori del sistema chemiotattico ed altri sensori di traduzione.

IN EVIDENZA. La membrana citoplasmatica controlla il rilascio di varie proteine che svolgono un ruolo importante nella patogenesi: tossine, batteriocine ed enzimi citolitici

CITOPLASMA. E' privo di reticolo endoplasmatico e mitocondri. Sono spesso presenti granulazioni citoplasmatiche di diversa composizione (polisaccaridi, polifosfati) che rappresentano accumuli di materiali nutritivi di riserva.

PARETE CELLULARE. E una complessa struttura rigida presente solo nei procarioti che racchiude e circonda come un involucro la cellula batterica e conferisce la forma al batterio e ne garantisce la protezione dall'ambiente esterno. La diversa struttura differenzia i batteri Gram positivi dai batteri Gram negativi. La parete dei Gram positivi costituita principalmente da una spesso e stratificato strato rigido di peptidoglicano, molto piu' sottile nei batteri Gram negativi nei quali presente una membrana esterna costituita da fosfolipidi con acidi grassi saturi. I batteri Gram positivi hanno uno spesso strato di peptidoglicano che contiene acidi tecoici e lipotecoici. I batteri Gram negativi hanno uno strato piu' sottile di peptidoglicano e una membrana esterna che contiene lipopolisaccaride, proteine e fosfolipidi. Lo spazio periplasmico contiene proteine di trasporto, enzimi degradativi e di sintesi.

PRINCIPALI COMPONENTI DELLA PARETE CELLULARE DEI BATTERI GRAM POSITIVI PEPTIDOGLICANO
E' un complesso polimero costituito da catene polisaccaridiche lineari costituite da NAM: Acido N-acetilmuramico e NAG: N-acetilglucosamina unite con legami crociati. Questi legami sono catalizzati da transpeptidasi, transglicosidasi, endopeptidasi e carbossipeptidasi legate alla membrana. Questi enzimi sono chiamati proteine leganti la penicillina (PBP) poich sono bersagli per la penicillina e gli altri antibiotici beta-lattamici. Il peptidoglicano essenziale per la struttura e la forma, la replicazione e la sopravvivenza. Nellinfezione interferisce con la fagocitosi, mitogeno per i linfociti, ha attivit pirogena. E 5

degradato dal lisozima presente nelle lacrime e nel muco. Nei batteri Gram positivi strati sovrapposti di peptidoglicano costituiscono lo spesso involucro che circonda la cellula. ACIDO TECOICO E ACIDO LIPOTECOICO. Sono polimeri di ribosio legati covalentemente allo strato di peptidoglicano e presenti solo nei batteri Gram positivi. Gli acidi tecoici sono altamente antigenici e presentano una notevole diversit di composizione fra le diverse specie di batteri gram positivi da venire utlizzati per caratterizzare i sierotipi. Ad esempio il polisaccaride A di Staphylococcus aureus e il carboidrato di gruppo D di Enterococcus faecalis sono acidi tecoici differenti. Gli acidi tecoici promuovono ladesione con altri batteri o ai recettori delle cellule animali (ad es.: la proteina M di Streptococcus pyogenes). Lacido tecoico un fattore di virulenza. Lacido lipotecoico ha anche unattivit endotossica

PRINCIPALI COMPONENTI DELLA PARETE CELLULARE DEI BATTERI GRAM NEGATIVI


SPAZIO PERIPLASMATICO. E' presente solo nei batteri Gram negativi. Area compresa tra la membrana citoplasmatica e la membrana esterna contiene un sottile strato di peptidoglicano e una soluzione proteica simile ad un gel ricca di enzimi idrolitici per la digestione enzimatica (proteasi, lipasi, fosfatasi), di proteine per il trasporto di sostanze nutritive come ad es. gli zuccheri e nei patogeni sono presenti fattori litici di virulenza (collagenasi, beta-lattamasi, ialuronidasi, proteasi). Inoltre sono presenti enzimi che aggrediscono alcuni farmaci antibatterici conferendo al batterio propriet di farmaco-resistenza. PORINE. Sono canali proteici che attraversano la membrana esterna dei soli batteri Gram negativi e consentono la diffusione passiva di piccole molecole idrofile a basso peso molecolare come glucidi, aminoacidi e determinati ioni.

MEMBRANA ESTERNA. E' presente solo nei batteri Gram negativi. Ha una struttura bilaminare lipidica che circonda il batterio e costituisce una barriera impermeabile a grandi molecole e molecole idrofobiche. La membrana esterna e legata al peptidoglicano medianta lipoproteine. Lo strato piu' esterno della membrana composto principalmente da molocole di lipopolisaccaride (LPS). Le grandi molecole degli antibiotici penetrano con difficolt attraverso la membrana esterna e ci spiega lelevata resistenza agli antibiotici da parte dei batteri Gram negativi. LIPOPOLISACCARIDE (LPS) E presente solo nei batteri Gram negativi: lendotossina, fattore di virulenza che caratterizza lazione patogena dei Gram negativi. E' formato da tre sezioni strutturali: ANTIGENE O: polisaccaride lineare formato da diverse unit

saccaridiche che si estroflettono all'esterno, permette di distinguere tra sierotipi (ceppi) di una stessa specie batterica. Fornisce una notevole compatezza al batterio. CORE: polisaccaride ramificato essenziale per la struttura del batterio. LIPIDE A: formato da un disaccaride di glucosammina fosforilata e acidi grassi, responsabile dellattivit tossica dellLPS

LA PARETE CELLULARE DEI MICOBATTERI


Caratteristica dei Micobatteri, una struttura complessa di natura

polisaccaridica e proteica, i cui lipidi complessati con le cere formate dagli acidi grassi a lunga catena (acidi micolici) hanno una potente azione adiuvante la patogenicit. 7

NEWS

Il liparobinomannano un complesso glicolipide micobatterico che la soppressione della proliferazione di cellule T,

svolge una potente attivit di regolazione di funzioni correlate con l'immunit cellulo-mediata quale l'inibizione delle funzioni di IFN-gamma e di chinasi, l'eliminazione degli intermediari tossici dell'ossigeno e la secrezione di chemochine da parte di polimorfonucleati. Fattore cordale: particolare componemte derivata degli acidi micoloci, fattore di virulenza di M. tuberculosis La tubercolina o purifed protein derivative (PPD): proteine

micobatteriche purificate e utilizzate per la reazione di Mantoux B.C.G. (bacillo di Calmette e Gurin): vaccino antitubercolare, variante apatogena di M. bovis

STRUTTURE ESTERNE: flagelli, pili o fimbrie e capsula

FLAGELLI. Sono appendici filiformi formati da migliaia di una subunit proteica avvolte ad elica chiamata flagellina. Rappresentano gli organi di locomozione per i batteri che li posseggono. A seconda dello disposizione dei flagelli sulla cellula, i batteri vengono distinti in monotrichi (con un unico flagello ad un polo) lofotrichi (con un ciuffo di flagelli ad un polo), amfotrichi (con un ciuffo di flagelli ai due poli) e peritrichi (con flagelli distribuiti su tutta la superficie del batterio). Il flagello ancorato alla membrana citoplasmatica, al peptidoglicano e alla parete esterna dei batteri da una serie di anelli, indicati come L, P, S e M, allinterno dei quali il corpo basale dei flagelli pu rotare su se stesso fornendo un moto rotatorio a tutta la struttura flagellare che genera la spinta per il movimento. La presenza di una sostanza chimica che esercita una attrazione 8

(zuccheri, aminoacidi) captata da specifici recettori sulla membrana cellulare che attivano processi bioenergetici che forniscono lenergia per la rotazione dei flagelli permettendo ai batterio di avvicinarsi alla sorgente di attrazione (chemiotassi positiva). Una concentrazione di sostanze riconosciute dal batterio come tossiche possono attivare al contrario la chemiotassi negativa che allontana il batterio dalla fonte di sostanze repellenti. FIMBRIE O PILI. Le fimbrie o pili sono appendici superficiali costituite da unit proteiche dette piline le quali simili a ciglia sono presenti spesso a centinaia sulla superficie esterna dei batteri. Possono essere distinti in due classi: i pili ordinari che rappresentano fattori di adesivit: le punte delle fimbrie contengono delle proteine (lectine) che legano specifici zuccheri (e.g., mannosio) presenti sulla cellula dell'ospite. Il pilo sessuale o pilo F responsabile dell'attacco della cellula donatrice alla cellula ricevente nel fenomeno della coniugazione batterica con il quale avviene il trasferimento di materiale genetico tra cellule batteriche (vedere sezione dedicata alla genetica batterica). ADESINE. Sono proteine della parete cellulare esterna dei batteri che riconoscono specifici recettori sulla cellula ospite e permettono al batterio di aderire saldamente e colonizzare gli organi dell'ospite Sia i pili che le adesine favoriscono l'adesivit del batterio ad altri batteri per formare colonie o agli organi dell'ospite per colononizzare i tessuti ed iniziare il processo infettivo. Sono infatti importanti fattori di virulenza: ad es. le fimbrie di tipo 1, le fimbrie P e l'adesina Dr di alcuni ceppi di Escherichia coli uropatogeni si legano selettivamente sulle cellule della mucosa urinaria. La pilina di Neisseria gonorrhoeae media l'attacco iniziale del batterio alle cellule non ciliate dell'epitelio vaginale, delle tube di Falloppio e della cavit buccale. Lacido lipotecoico in associazione con la proteina M dello Streptoccus pyogenes forma microfibrille che facilitano laderenza del batterio alle cellule epiteliali della bocca. 9

IN EVIDENZA. La tossina della pertosse (esotossina PT o Tox), oltre a diffondere nellambiente extracellulare, quando ancorata alla parete della Bordetella pertussis, una adesina che permette il legame allepitelio ciliato e ai macrofagi.

CAPSULA. Strato lasso, viscoso, mucoso di natura polisaccaridica o proteica non strutturale che circonda come ulteriore involucro sia i batteri Gram positivi che Gram negativi Nel caso sia poco aderente e poco uniforme per densit e spessore, questo materiale definto strato mucoso o glicocalice. La capsula conferisce peculiari propriet ai batteri che sono in grado di sintetizzarla: previene lessicamento favorisce ladesivit, offre al batterio la possibilit di aderire ad altri batteri, alle superfici dei tessuti dellospite o colonizzare particolari distretti biologici come nel caso di Streptococcus mutans che aderisce allo smalto dentale favorendo l'adesione di altri batteri, in genere lattobacilli, che contribuiscono alla formazione della placca: i prodotti acidi della fermentazione di questi batteri demineralizzano lo smalto e si ha l'avvio del processo che porta alla formazione di carie.

ha propriet antifagocitaria. La capsula impedisce il riconoscimento


tra cellula fagocitaria ed il batterio ed impedisce la fagocitosi. Mutanti di batteri normalmente capsulati che hanno perso la capacit di formare la capsula perdono anche la loro virulenza. APPENDICE La fagocitosi e il killing microbico quel processo operato dai leucociti polimorfonucleati, dai moniciti e dai macrofagi che prevede lattacco, lingestione e la distruzione intracellulare dei batteri. Le principali fasi sono:

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Chemiotassi. Reclutamento dei fagociti nel focolaio di infezione ad opera di diversi stimoli come ad es. prodotti batterici e mediatori dellinfiammazione prodotti dallospite. Adesione. Il riconoscimento e il legame tra cellula e batterio mediato da recettori cellulari per specifiche strutture batteriche. Fagocitosi. Dopo lattacco il microrganismo viene circondato da una porzione della membrana citoplasmatica, si forma un vacuolo (fagosoma) con allinterno il batterio che viene trasportato nel fagocita. Uccisione intracellulare. Due meccanismi con i quali il fagocita elimina i batteri internalizzati: Killing ossigeno-dipendente. Il fagosoma si fonde con vescicole contenti potenti radicali tossici dellossigeno (perossido di idrogeno, ioni superossido) che attaccano la parete batterica. Killing lisosomiale: Il fagosoma si fonde con lisosomi che contengono enzimi che digeriscono il batterio fagocitato.

ENDOSPORA E SPOROGENESI
La spora una struttura disidratata, pluristratificata e protettiva che permette al batterio di sopravvivere in uno stato di vitalit sospesa. E prodotta solo dai Gram positivi. In condizioni di deplezione nutrizionale, la cellula batterica forma un unica spora interna che viene liberata nell'ambiente esterno quando la cellula va incontro ad autolisi. La spora contiene una copia completa del cromosoma, concentrazioni minime di proteine essenziali e ribisomi, alta concentrazione di calcio legato allacido dipicolinico e diverse membrane e rivestimenti esterni costituiti di proteine simil-cheratiniche che permettono al batterio quiescente di sopravvivere in condizioni sfavorevoli per un lungo periodo di tempo: le spore possono infatti sopravvivere allessicazione, ai 11

disinfettanti ed alla bollitura per parecchie ore. Quando le condizioni ambientali tornano favorevoli la spora germina e forma una nuova cellula vegetativa che riprende la divisione cellulare con conseguente moltiplicazione del batterio. Le spore hanno un ruolo importante nellepidemiologia di infezioni umane quale lantrace, il tetano e la gangrena gassosa.

METABOLISMO E CRESCITA BATTERICA


I batteri per la crescita hanno bisogno di una sorgente di carbonio e azoto, una sorgente di energia, acqua e vari ioni. I batteri patogeni ricavano energia dal metabolismo di zuccheri, grassi e proteine. In base alla fonte di carbonio utilizzato per la crescita i batteri possono essere distinti in: autotrofi: utilizzano solo carbonio inorganico (CO2) eterotrofi: utilizzano carbonio di composti organici Aerobi obbligati: cresita solo in presenza di ossigeno, e.g., Mycobacterium tuberculosis Anaerobi obbligati: crescita solo in completa assenza di ossigeno, e.g., Clostridium tetani Anaerobi facoltativi: la maggior parte dei batteri possono crescere sia in presenza che in assenza di ossigeno. Il termine metabolismo indica linsieme delle reazioni biochimiche necessarie per ricavare ed utilizzare lenergia immagazzinata in grosse macromolecole. Lo scopo finale del metabolismo batterico la duplicazione delle strutture necessarie per procedere alla divisione in due cellule figlie. Lenergia che impiega la cellula nelle reazioni di biosintesi quella rilasciata dallidrolisi dellATP in ADP. Per rigenerare ATP il batterio necessita di nuova energia che ottiene dalla degradazione di vari substrati organici (carboidrati,proteine e

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lipidi). La meccanismi:

fosforilazione

dellADP

in

ATP

pu

avvenire

attraverso

due

la fosforilazione a livello del substrato che caratterizza i processi di la fermentazione, fosforilazione in questo caso il lenergia trasporto viene di ricavata dal che catabolismo di varie sostanze in prodotti di minor livello energetico

mediante

elettroni

caratterizza i processi di respirazione e costituisce un modello molto pi efficiente e redditizio in termini di ATP La sintesi dellacido piruvico rappresenta un passaggio fondamentale sia dei processi fermentativi che di quelli respiratori. I batteri possono utilizzare diverse vie metaboliche per la sintesi del piruvato: la glicolisi, la via pi comune, presente anche nelle cellule eucariotiche e che si realizza in condizioni di anaerobiosi lo shunt dei pentosi la via di Entner-Doudoroff

Il destino metabolico del piruvato pu essere: la fermentazione, un processo catabolico che oltre a rifornire la cellula di ATP determina laccumulo nel mezzo ambiente di diversi prodotti terminali organici, caratteristici delle diverse specie batteriche, come ad es. lacido lattico nel caso dei lattobacilli, potenzialmente ancora ricchi di energia non ulteriormente utilizzabile attraverso la via fermentativa la respirazione, un processo pi complicato che richiede la presenza di O2 e che consente, attraverso il ciclo di Krebs, la completa degradazione della sorgente energetica ad H2O e CO2, il che garantisce alla cellula un apporto di ATP notevolmente maggiore rispetto alla fermentazione.

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DIVISIONE DELLA CELLULA BATTERICA

La divisione di una cellula batterica in due cellule figlie avviene mediante scissione semplice, un processo che si realizza attraverso: lestensione della parete la replicazione del materiale genetico, costituito nel caso dei batteri da ununica molecola circolare di DNA (cromosoma batterico o cromonema) ancorata alla membrana citoplasmatica la formazione del setto

FASI DELLA CRESCITA BATTERICA

Fase di latenza. lag: le cellule aumentano di volume ma non di numero: i batteri si adattano al nuovo ambiente. Fase esponenziale o logaritmica, log: i batteri si moltiplicano con un tempo di duplicazione che dipende dal ceppo e dallambiente Fase stazionaria, stat: i batteri smettono di crescere per la mancanza di metaboliti e laccumulo di sostanze tossiche. Fase di morte cellulare, death: la fase di declino o morte cellulare una funzione esponenziale e si manifesta come riduzione lineare del numero di cellule vitale nel tempo. Il tasso di mortalit aumenta fino a raggiungere un livello costante.

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GENETICA BATTERICA
Il materiale genetico presente nella cellula batterica costituito da: cromosoma batterico, molecola di DNA circolare a doppio filamento e presente in una unica copia elementi genetici extracromosomici come plasmidi e batteriofagi, autonomi rispetto al cromosoma batterico e generalmente trasmissibili da una cellula allaltra. Possono trovarsi sia in forma libera che integrati nel cromosoma batterico (episomi)

IN EVIDENZA. I fattori R sono plasmidi contenenti geni che codificano per molecole che determinano resistenza a numerosi farmaci antibatterici. Oltre ai determinanti di resistenza, un fattore R pu contenere diversi altri geni tra cui: - geni che determinano resistenza a ioni metallici, raggi ultravioletti; - allazione delle colicine, allazione battericida del siero umano; - geni che permettono il metabolismo di diversi zuccheri (lattosio, saccarasio) - geni che codificano per fattori Ent (fattori tossici). I fattori Ent determinano la produzione di enterotossine ed altri fattori di virulenza.

Come nella cellula eucariotica, la replicazione del DNA batterico un processo semiconservativo che prevede lintervento di diversi enzimi. Tra questi un ruolo chiave svolto dallelicasi che apre la doppia catena di DNA e dalle DNA polimerasi DNA dipendenti che copiano il DNA solo in direzione 53, in tal modo la sintesi del nuovo DNA procede delle forcelle di replicazione. Tra i numerosi enzimi implicati nella replicazione del genoma batterico, alcuni costituiscono i bersagli di farmaci ad azione antibatterica, ad es. le topoisomerasi rappresentano il target degli antibiotici chinolonici. bidirezionalmente a livello

IL TRASFERIMENTO DI MATERIALE GENETICO TRA I BATTERI La cellula batterica presenta una notevole capacit di adattamento. Tra i meccanismi responsabili di questa adattabilit, caratteristica che partecipa 15

allazione patogena del batterio, rientrano i meccanismi di trasferimento intercellulare di materiale genetico cromosomico che si attua attraverso: TRASFORMAZIONE: acquisizione di nuovi marcatori genetici attraverso lincorporazione di DNA esogeno TRASDUZIONE: Alcuni virus batterici (batteriofagi) possono trasferire geni batterici da una cellula allaltra. CONIUGAZIONE: trasferimento diretto di materiale genetico cromosomico attraverso un contatto fisico tra due cellule, possibile solo se il batterio possiede particolari plasmidi, detti appunto plasmidi coniugativi che generano la sintesi del pilo F.

LA PATOGENESI BATTERICA I rapporti ospite-microrganismo


Nellambito dei rapporti ospite-parassita distinguiamo: Mutualismo: particolare tipo di relazione dalla quale derivano benefici reciproci per entrambi i partners e dove i membri sono metabolicamente dipendenti luno dallaltro Commensalismo: relazione simbiotica dove un organismo, commensale, trae da essa beneficio, mentre laltro, lospite, non ne viene n danneggiato n favorito. Ad es., E.coli presente nel colon.

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Parassitismo: relazione in cui il batterio patogeno si insedia nei tessuti dell ospite, superandone i meccanismi di difesa e alterandone il funzionamento

Nellambito delle interazioni ospite-microrganismo troviamo: Contaminazione: lospite entra in contato con un microrganismo che raggiunge le superfici cutanee o mucose Colonizzazione: la presa di possesso di un distretto superficiale dellospite dove il microrganismo trova candizioni idonee per il proprio insediamento. Infezione: indica linsediamento dei microrganismi nellospite che

stabiliscono un rapporto di equilibrio con le difese dellospite generalmente senza causare danno, ma lasciando una traccia nel sistema immunitario. Le infezioni sono definite: acute autolimitanti, croniche o persistenti e latenti. Malattia: la moltiplicazione dei microrganismi nellospite in grado di causare danno. Le infezioni possono essere distinte in: endogene, in seguito allabnorme espansione di una o pi specie presenti nella popolazione microbica normale di un distretto dellorganismo (terapia antibiotica) o determinate dal trasferimento di microrganismi presenti nella flora microbica di un distretto corporeo in sedi diverse da quelle normalmente colonizzate. esogene, il microrganismo patogeno proviene da una sorgente esterna, quali materiali inanimati, animali infetti (zoonosi), esseri umani infetti.

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La capacit dindurre la malattia, o PATOGENICITA, la risultante di vari fattori e meccanismi che permettono al microrganismo patogeno di invadere i tessuti di un organismo e di moltiplicarvisi, alterando il funzionamento dellorganismo ospite attraverso la produzione di una o pi sostanze tossiche specifiche. La patogenicit caratterizzata da: fattori e meccanismi di virulenza carica batterica (numero iniziale di batteri infettanti) stato di salute, in particolare immunitario, dellospite.

I microrganismi che colonizzano luomo sia per brevi periodi che in modo permanente in genere non alterano le normali funzioni dellospite. La malattia si instaura quando linterazione tra microrganismo ed ospite induca un processo patologico caratterizzato da un danno per lospite. Il processo patologico pu dipendere da prodotti e fattori microbici (ad es., danno causato dalla moltiplicazione batterica, produzione di enzimi e di tossine) o da una alterata risposta immunitaria dellospite contro il microrganismo (ad es., stati di immunodepressione). La capacit di invadere e moltiplicarsi di un batterio strettamente associata a una serie di meccanismi di virulenza che permettono al microrganismo di: Aderire alle cellule dellospite Invadere i tessuti dellospite Resistere allimmunit innata Evadere limmunit adattativa Competere per i nutrienti

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I principali meccanismi di virulenza batterica

Adesione Invasione Produzione di metaboliti tossici legati alla crescita betterica (gas, acidi) Produzione di tossine, in particolare:
- Enzimi degradativi - Esostossine - Endotossine

Superantigeni
Induzione di una risposta infiammatoria eccessiva Elusione della risposta immunitaria Resistenza agli antibiotici Crescita intracellulare

La persistenza la permanenza a tempo indefinito di un microrganismo nellospite in assenza di danni conclamati (latenza clinica). E possibile che si verifichi una riattivazione del processo infettivo, con il passaggio dallo stato di infezione a quello di malattia. Ad esempio, il Mycobacterium tuberculosis, a seguito di una infezione primaria, pu persistere per anni in maniera latente e silente nellorganismo (polmone, linfonodi). La riattivazione e passaggio a malattia potranno avvenire per una riduzione dellimmunit cellulo mediata, evento comune con lavanzare dellet. La fase di portatore una forma di persistenza che pu instaurarsi nellorganismo ospite dopo il superamento di una malattia.

IN EVIDENZA. Nella catena epidemiologica delle malattie da infezione, una figura importante quella del portatore sano, paziente che ha superato la malattia, ma che non ha eliminato il microrganismo, il quale risiede in specifici siti anatomici (ad es., localizzazione di Salmonella typhi nella colecisti di portatori sani). Il portatore sano in grado di trasmettere linfezione, non presentando i segni clinici della malattia. 19

LE TAPPE DEL PROCESSO INFETTIVO


Sono: 1. Ingresso 2. Adesione, Colonizzazione e Invasione dei tessuti 3. Elusione delle Risposte Immunitarie 4. Produzione del Danno (tossigenicit dei batteri)

1. INGRESSO. I batteri devono penetrare nel corpo umano affinch


linfezione abbia inizio, superando i meccanismi di difesa naturale e le barriere, quali la pelle, le mucose, lepitelio ciliato e le secrezioni, che contengono sostanze ad azione antibatterica. Le principali vie di accesso al corpo umano sono: CUTE. Eccellente barriera fisica la cui integrit deve essere compromessa per permettere lingresso, come ad es. dopo microtraumi, tagli, ferite, ustioni, punture di insetti, manipolazioni come tatuaggi, liposuzioni etc. CONGIUNTIVA. Rispetto la cute pu essere oltrepassata anche se integra per contatto con acqua o liquidi contaminati, per deposizione meccanica di microrganismi (mani, fomiti, strumenti diagnostici) e per microtraumi o ferite. APPARATO RESPIRATORIO. Laria il pi comune veicolo di infezione per il passaggio dei microrganismi da soggetto a soggetto, per inalazione dei microrganismi presenti nellambiente immessi tramite goccioline di saliva eliminate con i colpi di tosse o gli starnuti e per uso di attrezzature diagnostiche o terapeutiche contaminate. E la trasmissione oro-faringea caratteristca della tubercolosi, influenza e affezione da virus respiratori. APPARATO DIGERENTE. La pi comune modalit di trasmissione quella orofecale, attraverso la quale i microrganismi eliminati con le feci arrivano in un

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nuovo ospite veicolati da mani, fomiti, acqua, alimenti, insetti (colera, tifo, epatite di tipo A). APPARATO GENITOURINARIO. Attraverso rapporti sessuali o per cateterismo. Una situazione a parte rappresentata dalla trasmissione materno-fetale per via transplacentare (trasmissione verticale) e per via ascendente a causa di lesioni delle membrane fetali, e dalle infezioni contratte nel canale del parto.

2. ADESIONE, COLONIZZAZIONE E INVASIONE DEI TESSUTI.


A tale scopo i batteri hanno sviluppato specifici meccanismi. Adesione. Ladesione microbica alla superficie delle mucose dellospite aiuta i microrganismi a stabilire una base attraverso la quale penetrare nei tessuti o invadere le cellule. Ad esempio alcuni microrganismi aderiscono attraverso le fibrille, strutture sottili sulle pareti batteriche che legano gli streptococchi alle cellule epiteliali umane. Altri batteri, come le Enterobacteriaceae (ad es., Escherichia coli), hanno organi specifici di adesivit chiamati fimbrie o pili. Le fimbrie offrono al microrganismo la possibilit di aderire a quasi tutte le cellule umane, inclusi i neutrofili, le cellule epiteliali nel tratto GU, nel cavo orale e nellintestino. I recettori microbici sul tessuto dellospite, cos come le adesine (molecole presenti allapice di fimbrie e pili o integrate nella parete batterica) determinano anche se linfezione si verificher o meno. I recettori dellospite sono le molecole o i ligandi a cui le adesine microbiche si legano per iniziare il processo di colonizzazione; questi comprendono i residui glucidici del glicocalice e le proteine di superficie quali la fibronectina, che facilitano ladesione di alcuni microrganismi gram positivi (ad es., gli stafilococchi).

IN EVIDENZA. Linterazione del microrganismo si pu realizzare, oltre che con superfici cellulari, anche con proteine del siero o con polipeptidi della matrice extracellulare, come ad es. il legame del clumping factor di S. aureus al 21

fibrinogeno che promuove ladesione batterica ai trombi sulla superficie delle valvole cardiache. Inoltre, possibile che ceppi batterici possano aderire solo in particolari situazioni patologiche che favoriscono lesposizione di recettori cellulari, come nel caso delle cellule epiteliali del tratto respiratorio le quali in condizioni fisiologiche sono ricoperte da fibronectina che rappresenta una barrieria protettiva nei confronti dei batteri gram negativi. In alcune situazioni patologiche, ad es. la fibrosi cistica, un eccesso di enzimi proteolitici, presenti nelle secrezioni mucose, distrugge la barriera di fibronectina esponendo in tal modo i recettori che vengono ora riconosciuti da adesine presenti sulla parete di batteri gram negativi. Infine, in altri casi ladesione avviene su superfici modificate dallo stesso microrganismo, come nel caso di ceppi di E. coli enteropatogeni (EPEC) che sintetizzano proteine che attivano le vie di trasduzione del segnale nella nella cellula ospite con il risultato di fosforilare la proteina Hp 90. Tale proteina modificata rappresenta ora il recettore per le adesine di EPEC.

I microrganismi possono anche aderire a presidi medici, come i cateteri urinari e a quelli vascolari, protesi vascolari e materiale di sutura. Ladesione facilitata dalla ruvidit dei materiali, dalla composizione chimica e dallidrofobicit. La capacit di alcuni microrganismi di produrre il biofilm, una struttura vischiosa che ingloba i microrganismi e genera una comunit batterica, facilita la colonizzazione ad esempio delle valvole artificiali o dei cateteri.

IN EVIDENZA. Un biofilm una aggregazione complessa di microrganismi contraddistinta dalla secrezione di una matrice adesiva e protettiva. La formazione di un biofilm inizia con l'ancoraggio di microrganismi

liberamente fluttuanti ad una superficie. I primi "coloni" aderiscono alla superfice inizialmente attraverso deboli e reversibili forze di Van der Waals. Se i batteri colonizzatori non sono immediatamente separati dalla superficie, possono ancorarsi pi stabilmente utilizzando molecole di adesione cellulare, come i pili. 22

I primi colonizzatori facilitano l'arrivo di altre cellule mettendo a disposizione diversi siti di adesione cellulare e iniziano a costruire la matrice che permette l'integrit del biofilm. Alcune specie non sono in grado di attaccarsi autonomamente ad una superficie, ma spesso riescono ad ancorarsi alla matrice o ai colonizzatori precedenti. Una volta che la colonizzazione ha avuto inizio il biofilm cresce tramite divisioni cellulari e integrazione di batteri esterni, anche di altre specie. Un biofilm contenente differenti specie prende solitamente il nome di consorzio batterico, ed quantitativamente pi frequente di biofilm composti da singole specie, pi rari e possibili solo a determinate condizioni. Ogni specie presente nel consorzio svolge differenti funzioni metaboliche e presenta solitamente diverso trofismo, richieste di ossigeno o nicchia ecologica. In questo modo il consorzio pi efficiente senza che le diverse specie entrino in conflitto tra loro. Il biofilm consolidato e protetto da una matrice di composti polimerici escreti. La matrice protegge le cellule all'interno e facilita la comunicazione tramite segnali chimici o fisici (vedi quorum sensing). Un beneficio del biofilm l'aumentata resistenza a detergenti e antibiotici, dato che la densa matrice extracellulare e lo strato esterno delle cellule protegge la parte interna della comunit. In aluni casi la resistenza agli antibiotici pu aumentare di 1000 volte. Il biofilm pu comprendere una singola specie microbica o pi specie, e pu formarsi su un ampio range di superfici abiotiche o biotiche. Nonostante i biofilm misti predominino in molti ambienti, quelli composti da una singola specie hanno un forte interesse medico, in quanto causa di una grande variet di infezioni, dal momento che possono formarsi sulla superficie di impianti medici. Pseudomonas aeruginosa la specie pi studiata tra i batteri gram negativi che formano biofilm singoli, ma anche altri microrganismi sono produttori di biofilm come P. fluorescens, E. coli e Vibrio cholerae. Mentre tra i gram positivi troviamo Staphylococcus epidermidis, S. aureus e gli enterococchi. I biofilm sono composti principalmente da cellule microbiche e matrice extracellulare (EPS). La percentuale di EPS si aggira tra il 50% e il 90% ed 23

considerata la materia prima del biofilm. Inoltre questa matrice pu associare con ioni metallici, cationi divalenti a altre macromolecole, come proteine, DNA, lipidi ed anche acidi umici. A causa della sua elevata idratazione la matrice previene lessiccamento di alcuni biofilm naturali. Inoltre pu contribuire alla resistenza agli antibiotici impedendo il trasporto di massa e la diffusione di queste sostanze attraverso il biofilm, probabilmente legando queste molecole direttamente. Alcuni studi hanno mostrato che la stabilit della struttura del biofilm legata alla presenza di zuccheri neutri, polisaccaridi acidi e aminozuccheri. Ruolo in medicina Molti biofilm hanno notevoli implicazioni in medicina. La placca dentale un biofilm, prodotto dai batteri presenti nel cavo orale come Streptococcus sanguinis. Biofilm possono crescere sulla superficie di impianti solidi nel corpo. Biofilm che si propagano lungo tubi o fili impiantati possono generare infezioni nei pazienti. Staphylococcus epidermidis pu produrre ad esempio biofilm su cateteri venosi. Pseudomonas aeruginosa e S. aureus possono produrre biofilm

sull'epitelio respiratorio dei polmoni, complicando il decorso dei pazienti affetti da fibrosi cistica. Le cellule del sistema immunitario (come i macrofagi) non sono infatti in grado di contrastare la presenza di biofilm, ma solo di generare una infiammazione cronica. La terapia si basa infatti su farmaci antiinfiammatori (come alcuni FANS) e molecole disgreganti. Biofilm possono crescere anche su lenti a contatto non sufficientemente pulite. Biofilm su pavimenti e superfici di lavoro possono rendere difficile l'igiene nelle aree adibite alla preparazione di cibo.

IN EVIDENZA. Il sistema regolatore quorum sensing, che corrisponde a una modalit di comunicazione tra i batteri, basato sulla produzione di sostanze diffusibili che correlano direttamente con la densit cellulare in un determinato ambiente. 24

Nei batteri gram-negativi, la comunicazione cellulare avviene attraverso lattivit delle molecole di omoserina lattone acetilata (AHLS). Queste piccole molecole segnale, dette autoinduttori, sono rilasciate dalle cellule e si accumulano nelle colture in funzione della densit cellulare. Ad una densit di popolazione soglia, definita quorum, gli AHLS accumulati possono interagire con i recettori situati sulla superficie della cellula batterica ed indurre dei segnali intracellulari in grado di regolare lespressione genica. Anche nei batteri gram-positivi stato descritto il meccanismo di comunicazione cellulare e di regolazione dei geni definito quorum sensing; diversa per la natura degli autoinduttori: infatti in questo caso le molecole segnale sono dei piccoli peptidi. Un esempio di interazione tra quorum sensing e biofilm sono le infezioni croniche da Pseudomonas aeruginosa nella fibrosi cistica. I polmoni della maggior parte dei pazienti con fibrosi cistica vengono facilmente colonizzati dal batterio P. aeruginosa. Un difetto genetico tipico della fibrosi cistica porta alla perdita del canale transmembrana regolatore del cloro, canale presente nelle membrane apicali delle cellule epiteliali delle vie respiratorie. Questo difetto favorisce la colonizzazione dellepitelio da parte di P. aeruginosa che diventa causa di infezione persistente sostenuta dalla produzione di un biofilm. Allinterno del biofilm, raggiunto il quorum, gli autoinduttori prodotti da P. aeruginosa interagiscono con attivatori trascrizionali (LasR e RhlR) che coordinano l'espressione di un pool di geni correlati alla virulenza. Lattivazione dei geni di virulenza induce la produzione di fattori come alginato, proteasi, esotossina A, emolisine e pigmenti che facilitano la persistenza del microrganismo nel polmone. stato anche descritto che ceppi di Pseudomonas aeruginosa mutati per alcuni fattori del sistema quorum sensing formano biofilm piatti e indifferenziati, mentre ceppi selvaggi formano biofilm con strutture pi complesse. Questa osservazione supporta l'idea che il quorum sensing giochi un ruolo importante negli stadi di maturazione del biofilm e delle sue architetture e questo lo rende un obiettivo molto interessante per lo sviluppo di nuovi 25

agenti antimicrobici. Recentemente stato dimostrato in modelli animali che una sostanza sintetica, un sale di furanone, capace di agire sul sistema regolatore quorum sensing di Pseudomonas aeruginosa, inibendo la produzione di fattori di virulenza e lo sviluppo del biofilm, riducendo in tal modo la persistenza dei batteri infettanti nell'organismo animale. Si intravede, pertanto, una nuova strategia di cura nellinfezione broncopolmonare, prevenendo la formazione di biofilm dannoso.

IN EVIDENZA. Numerosi geni, raggruppati in particolari e distinte zone del cromosoma batterico, definite isole di patogenicit (Pathogenicity Islands), determinano la produzione di tossine, di fimbrie che favoriscono ladesione alle cellule, di invasine per la penetrazione nelle cellule bersaglio e di prodotti ad alto peso molecolare necessari per la moltiplicazione intracellulare Altro fattore genomico di patogenicit il mar (Multiple antibiotic resistance), gruppo di geni descritti ad esempio in alcuni ceppi di Salmonella typhimurium, che determina la possibilit di elaborare un maggior numero di meccanismi di virulenza finalizzati alla colonizzazione e allinvasione degli organi e alla predisposizione allantibiotico-resistenza.

Colonizzazione. La colonizzazione dipende dalla capacit che il patogeno ha di competere con successo con la microflora dellospite per potere acquisire le sostanze nutritive essenziali per la crescita e la riproduzione. Invasione dei tessuti. I batteri possono penetrare nei tessuti profondi dellorganismo ospite attraverso due meccanismi principali: 1. La distruzione enzimatica dellepitelio che consente al batterio di raggiungere la sottomucosa riccamente vascolarizzata. La capacit dei batteri di penetrare e diffondere nei tessuti profondi condizionata dalla produzione di 26

esoenzimi, i cui bersagli sono i componenti tessutali dellospite. Gli esoenzimi sono anche una delle componenti del danno tissutale diretto indotto dai batteri (vedi elenco degli enzimi nella sezione 4: Tossigenicit dei batteri). 2. Linduzione di meccanismi invasivi che permettono al microrganismo di penetrare direttamente allinterno delle cellule epiteliali. Diversi batteri, dopo la fase di adesione, hanno sviluppato la capacit di essere internalizzati dalla cellula ospite nella quale si moltiplicano. Ad esempio, il riarrangiamento dei filamenti di actina del citoscheletro attraverso la microiniezione di invasine batteriche nel citosol della cellula ospite facilita la formazione di un vacuolo che internalizza il batterio.

NEWS In vivo, alcuni patogeni enterici, incapaci di penetrare l'epitelio attraverso la superficie apicale, sono internalizzati da cellule epiteliali specializzate, le cellule M, che rivestono le placche di Peyer, caratterizzate da uno strato di muco pi sottile, microvilli pi piccoli e un meccanismo attivo di endocitosi e pinocitosi rispetto alle cellule colonnari. Equivalenti delle cellule M sono presenti in regioni linfatiche organizzate, adiacenti alle superfici mucose, che includono l'intestino crasso, il nasofaringe, l'albero bronchiale. Shigella e Yersinia sono capaci di invadere l'epitelio solo attraverso la superfcie basolaterale e non attraverso quella apicale. Questo apparente mistero si spiega tenendo conto della capacit di tali microrganismi di essere internalizzati nelle cellule M, che, a loro volta, consentono l'accesso al polo basolaterale delle cellule adiacenti. Unulteriore spiegazione fornita dalla possibilit che leucociti polimorfonucleati (PMN), richiamati da molecole chemiotattiche quali IL-8, trasmigrino attraverso le tight junctions tra le cellule epiteliali e possano inglobare i batteri, che riescono cos a penetrare la barriera epiteliale raggiungendo le superfici basolaterali delle cellule epiteliali polarizzate.

Una volta raggiunta la sottomucosa, il processo infettivo pu: rimanere localizzato nei tessuti subepiteliali; 27

evolvere ulteriormente con la progressiva invasione dei tessuti vicini, con limmissione in circolo di prodotti batterici o di tossine (tossiemia). Per alcuni batteri, il superamento delle barriere epiteliali comporta la penetrazione nei tessuti subepiteliali e il raggiungimento dei linfonodi, il passaggio nel circolo linfatico e quindi nel circolo ematico con lo sviluppo di una batteriemia ed eventualmente di una setticemia con linstaurarsi di uno stato settico.

GLOSSARIO Batteremia. Presenza transitoria di batteri nel sangue: non si hanno segni clinici anche se possono essere presenti sintomi e segni di infezione locale che rappresentano la fonte dellimmissione in circolo di batteri. Setticemia. Presenza di batteri e/o loro prodotti nel sangue associata a segni di shock settico, ad es. tachicardia e ridotta pressione sanguigna. spesso una complicazione di una infezione localizzata, ad es. polmonite, meningite.

In ogni caso la risposta infiammatoria dellospite e lazione lesiva del batterio cooperano a determinare delle diverse circostanze. il danno tissutale che si manifester a livello clinico con una serie di segni e di sintomi di gravit differente a seconda

3. Elusione delle risposte immunitarie da parte dei batteri


Lazione patogena del batterio e la capacit di generare un processo infettivo non pu prescindere dalle difese microbiche nei confronti delle quali i batteri hanno sviluppato vari meccanismi per sfuggire al riconoscimento e alluccisione delle cellule fagocitiche e per inattivare o evadere il sistema complemento e anticorpale. Alcuni batteri possono sottrarsi alla risposta immunitaria moltiplicandosi intracellularmente. Meccanismi di evasione delle difese dellospite. Un esempio in tal senso la capsula polisaccaridica, di cui sono dotati alcuni batteri patogeni, che assolve diverse funzioni, quali: 28

sottrae le componenti antigeniche del batterio al riconoscimento del sistema immunitario ostacola la fagocitosi protegge il batterio dallambiente del fagolisosoma nel macrofago o nel leucocita.

Tutte queste propriet fanno della capsula un importante fattore di virulenza. Tra gli altri meccanismi di elusione della risposta immunitaria ricordiamo: il cambiamento della struttura antigenica del batterio la produzione di enzimi o proteine contro le immunoglobuline linattivazione del complemento la distruzione dei fagociti linibizione della chemiotassi e della fagocitosi lelusione dal killing intracellulare attraverso: linibizione della fusione fagolisosomica la resistenza agli enzimi lisosomiali ladattamento alla replicazione intracitoplasmatica

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Evasione dell'immunit umorale

Batteri aderenti alle superfici mucose hanno sviluppato strategie per eludere le difese specifiche umorali dell'ospite. Il ruolo protettivo svolto dalle IgA a livello delle mucose pu essere annullato dalla secrezione, da parte di alcuni patogeni (Neisseria meningitidis e gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus sanguis, Streptococcus pneumoniae, Proteus mirabilis), di proteasi capaci di scindere le IgA. Alcune metalloproteasi secrete da Pseudomonas aeruginosa degradano IgG e IgM. Alcuni batteri hanno la capacit di legare proteine dell'ospite, mascherando quindi i loro antigeni di superficie non pi in grado di evocare una risposta immunitaria (mascheramento antigenico). L'adesina FHA di Bordetella pertussis lega molecole dell'ospite, quali eparina, glicoproteine, glicolipidi. Il batterio pu inoltre produrre molecole di superficie che mimano i normali costituenti 29

dell'ospite (mimetismo antigenico). Ad es. Helicobacter pylori esprime un carboidrato superficiale, Lewis X, che riduce la risposta delle cellule T essendo riconosciuto come antigene self. Neisseria meningitidis gruppo B esprime un antigene capsulare che cross-reagisce con le proteine dell'ospite. L'acido ialuronico di Streptococcus pyogenes presenta determinanti antigenici comuni all'acido ialuronico presente nel tessuto connettivale. Una frequente strategia per evadere la risposta immunitaria umorale rappresentata dalle variazioni antigeniche di alcune strutture come pili, flagelli, LPS, capsula, strato S, proteine della membrana esterna o di alcuni prodotti solubili, es. enzimi. Tali variazioni si osservano frequentemente nei batteri che colonizzano le superfici mucose rispetto a quelli che crescono nel compartimento intracellulare. Una delle pi frequenti variazioni antigeniche riguarda i pili di Neisseria gonorrhoeae. Nel cromosoma, Neisseria presenta numerosi geni che codificano per diversi pili. Evidentemente si verificano continuamente riarrangiamenti genetici che condizionano l'espressione fenotipica di geni silenti e la comparsa di una diversa pilina. Tali variazioni sono responsabili di infezioni recidivanti che si osservano in soggetti guariti da precedenti infezioni. Le variazioni antigeniche delle proteine della membrana esterna di Borrelia recurrentis condizionano il particolare andamento della malattia (febbre ricorrente). Un meccanismo addizionale per eludere le difese anticorpali rappresentato dalla capacit di sintetizzare proteine leganti le immunoglobuline: ad es., proteina A di Staphylococcus aureus, proteina G e proteina H di Streptococchi e la proteina legante la fibronectina (Fn) di Streptococcus pyogenes: tali proteine leganti la regione Fc delle IgG rappresentano esempi di un meccanismo che favorisce l'evasione immunitaria.

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Elusione della fagocitosi e sopravvivenza intracellulare

Alcuni patogeni riescono ad evitare di essere ingeriti dal fagocita. Ad es., membri del genere Yersina, compresa Yersinia pestis (agente della peste) 30

utilizzano un sistema di secrezione di tipo III per inoculare nel fagocita proteine che bloccano la polimerizzazione dell'actina, un componente del citoscheletro indispensabile per l'ingestione e la formazione del fagosoma. Una ulteriore strategia l'espressione di strutture di superficie, come la capsula o la proteina M di Streptococcus pyogenes, che impediscono la deposizione di fattori opsonizzanti del complemento. Ci avviene attraverso il legame preferenziale con componenti del complemento che ne inibiscono l'attivazione, come il fattore H. Inoltre, la capsula ricopre alcuni PAMPs che sarebbero altrimenti riconoscibili da parte di PRRs solubili o presenti sulla superficie del fagocita. I patogeni dotati di capsula evadono l'internalizzazione da parte dei fagociti e possono resistere all'interno di compartimenti corporei ricchi di sostanze antibattriche come il sangue: ad es., i batteri che infettano per via ematogena il sistema nervoso centrale e le meningi sono tutti. Alcuni patogeni non solo non ostacolano il processo di ingestione, ma lo utilizzano per sopravvivere all'interno delle cellule dell'ospite, macrofagi compresi. Ci possibile poich questi microrganismi riescono a controllare il proprio destino all'interno del fagocita, spostandosi in compartimenti favorevoli o creandone di nuovi. Esistono due strategie principali: evasione da vacuoli fagocitari e replicazione all'interno di vacuoli modificati. Esempi della prima strategia sono patogeni come Shigella spp. o Listeria spp. che forano la membrana del fagosoma sfuggendo nel citosol, dove si replicano per poi diffondersi alle cellule adiacenti. Spesso i patogeni intracellulari persistono in vari tipi di vacuoli modificati. E il caso di membri dei generi Mycobacterium, Salmonella, Chlamydia, Brucella, Leishmania e Toxoplasma. Queste specie adottano differenti strategie per generare un ambiente favorevole alla propria replicazione. Ad esempio, i micobatteri impediscono l'acidificazione del fagosoma, che non pu quindi interagire con endosomi tardivi o con i lisosomi. Altri patogeni, come Chlamydia spp., intercettano le vescicole esocitosiche prima che queste riversino all'esterno i propri contenuti secretori. Infine Toxoplasma gondii, Brucella spp. e Legionella pneumophila interagiscono con il reticolo endoplasmico, un ambiente ideale per la propria riproduzione.

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L'lFN-

riesce a sovvertire le strategie evasive dei patogeni intracellulari, si lega a specifici recettori presenti sul fagocita inducendo

conferendo ai macrofagi unamplificata capacit di eliminazione. Questa citochina un'aumentata espressione di diversi geni. I pi importanti sono quelli che codificano per il complesso della NADPH ossidasi, per la NO sintetasi inducibile (iNOS), per NRAMP1 (natural-resistance-associated-macrophage protein 1), per IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) e per la famiglia delle p47GTPasi. E stato gi descritto il ruolo di questi prodotti come fattori microbicidi (NADPH ossidasi e iNOs) o nutriprivi (NRAMP1 ed IDO). Le p47GTPasi hanno destato molto interesse in quanto regolano la maturazione del fagosoma e la fusione dei lisosomi con i fagosomi. Queste funzioni dipendono dalla localizzazione delle varie p47GTPasi in compartimenti cellulari diversi e dalla loro capacit di contollare il trasporto di questi vacuoli e di regolare fattori che promuovono i processi di fusione e di maturazione del fagosoma.

IN EVIDENZA. La capacit di molti batteri di indurre malattia correlata alla produzione di una capsula o di uno strato mucoide che proteggono lagente infettivo dalla fagocitosi. Pur non essendo in genere un potente antigene, lospite monta una risposta anticorpale contro la capsula che favorisce il processo di opsonizzazione e di lisi mediata dal complemento. Un caso particolare rappresentato dalla dallHaemophilus influenzae di tipo B (Hib). Il motivo per cui le patologie meningee da Hib sono particolarmente gravi nei primi anni di vita risiede nella struttura polisaccaridica (antigene Tindipendente) della capsula contro la quale un adulto produce un particolare tipo di IgG, le IgG di tipo 2. Il bambino di et inferiore a 24 mesi, per una fisiologica immaturit del proprio sistema immunitario, produce una quantit estremamente bassa di IgG di tipo 2 per cui non in grado di difendersi da patologie sostenute da batteri provvisti di capsula polisaccaridica.

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IN EVIDENZA STRATEGIE DEI MICRORGANISMI PER CONTRASTARE LE DIFESE ASPECIFICHE DELLOSPITE Inibizione della chemiotassi dei polimorfonucleati e dei macrofagi: ad es., le emolisine di S. aureus e di S. pyogenes Uccisione dei fagociti: ad es., B. pertussis causa apoptosi dei macrofagi; le emolisine e in particolare la leucocidina di Panton-Valentine di S. aureus e le due emolisine O e S di S. pyogenes. Mancato inglobamento da parte dei fagociti: ad es., ladesina MIAT di Klebsiella pneumoniae che interagisce con i PMN; le fimbrie di Neisseria gonorrhoeae; la proteina M di S. pyogenes e la capsula di S. pneumoniae. Inibizione della fusione del fagosoma con i lisosomi: ad es., Mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis che causa un aumento intracellulare di cAMP che inibisce la fusione e nellinfezione da Legionella pneumophila in cui i fagosomi si ricoprono di mitocondri e ribosomi che ne impediscono la fusione con i lisosomi. Fuoriuscita del microrganismo dal fagosoma: ad es. Listeria

monocytogenes che produce listeriolisina O allinterno del fagosoma e ne distrugge la membrana legandosi al colesterolo, permettendo alla Listeria di passare nel citoplasma dove si moltiplica. Lo Strptococcus pyogenes che produce la streptolisina S allinterno del fagosoma e ne distrugge la membrana e ne permetta la fuoriuscita. Moltiplicazione Criptococcus nei fagociti: Listeria ad es., Brucella spp., Chlamydia, spp.,

neoformans,

monocytogenes,

Mycobacterium

Salmonella typhimurium, Toxoplasma gondii, Yersinia pestis.

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Come i batteri alterano la presentazione dell'antigene nella risposta immunitaria cellulo-mediata.

I batteri eludono le difese immunitarie dell'ospite interferendo anche con le risposte immunitarie cellulo-mediate. Per i batteri a crescita intracellulare, il possibile meccanismo per eludere la risposta dell'ospite consiste nell'inibire la presentazione e la capacit di processare l'antigene, l'attivazione delle cellule T e dei macrofagi e la proliferazione delle cellule T. In Salmonella il gene pho P, che controlla la sintesi di alcune proteine necessarie per la sopravvivenza nei macrofagi e regola la presentazione degli antigeni batterici. Mutanti di Salmonella enterica serovar Typhimurium che non esprimono pho P non sono processati efficientemente dai macrofagi con conseguente inibizione della presentazione dell'antigene associato con MHC-II. Legionella pneumophila inibisce la sintesi degli antigeni del complesso maggiore di istocompatibilita I e II, con conseguente inibizione della presentazione degli antigeni batterici. Helicobacter pylori produce una tossina, Vac A, che agisce sul traffico vacuolare, distruggendo gli endosomi tardivi e inibendo la presentazione degli antigeni di classe II. Altri geni presenti sullisola di patogenicita Cag A inducono l'espressione di Fas ligando (Fas-L) sulle cellule T e inducono la morte del linfociti per apoptosi. La listeriolisina di Listeria monocytogenes interferisce con la presentazione dell'antigene. Chlamydia trachomatis riduce i livelli di MHC-II indotta da IFN- e sopprime inoltre l'espressione di MHC-I sia costitutiva che indotta da IFN. Inoltre Mycobacterium leprae inibisce la produzione di IL-2, fattore di proliferazione dei linfociti T. IL-6 prodotta da macrofagi infettati con Micobatteri inibisce l'attivazione delle cellule T. Citochine indotte da Micobatteri generano cellule T immunosoppressive che down-regolano lattivazione immunitaria. L'emoagglutinina filamentosa (FHA) di Bordetella pertussis stimola la produzione di IL-l0 da cellule dendritiche, che, a sua volta, sopprime la produzione di IFNda cellule T antigenespecifiche. Tutto ci consente al microrganismo invasore di modulare le difese 34

dell'ospite ed evadere il riconoscimento immunitario. YopH di Yersinia pseudo tuberculosis sopprime l'attivazione delle cellule T antigene-specifiche e la produzione di IL-2 inibendo la fosforilazione di residui di tirosina del recettore delle cellule T. La proteina Opa di Neisseria gonorrhoeae inibisce l'attivazione e la proliferazione delle cellule T CD4+. Questi sono alcuni esempi di come alcune componenti batteriche contribuiscano alla scarsa risposta immunitaria specifica evidenziabile nei pazienti infettati.

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DI SEGUITO BREVI SCHEMI RIASSUNTIVI DELLE DIFESE IMMUNITARIE ANTIMICROBICHE


NEWS Presentiamo in questo capitolo una breve e sintetica presentazione aggiornata delle cellule immunocompetenti, dei meccanismi e delle fasi che caratterizzano lattivazione delle risposte immunitarie dellospite verso le infezioni batteriche. Rimandiamo per una approfondita conoscenza al Corso di Immunologia e di Patologia Generale, indispensabili per la comprensione dei rapporti tra ospite e parassita che caratterizzano la patogenesi del processo infettivo.

IN EVIDENZA. Lospite mette in campo tre linee base di difesa contro gli agenti infettivi: 1. Barriere naturali, che limitano l'ingresso dell'agente infettante (ad es., cute, muco, epitelio ciliato, acidit gastrica, bile).

2. Difese immunitarie innate non antigene-specifiche, che forniscono una rapida risposta locale all'aggressione da parte di un qualsiasi agente infettivo (ad es., febbre, interferone, neutrofili, macrofagi, cellule NK).

3. Risposte immunitarie antigene-specifiche (ad es., anticorpi e linfociti T), che localizzano, attaccano ed eliminano gli agenti infettivi che sono riusciti ad eludere le precedenti due barriere.

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La microflora autoctona come difesa antibatterica

La microflora intestinale presente durante il primo anno di vita ridotta rispetto a quella degli adulti. Questo relativo basso sviluppo (sia come numero di batteri sia come diversit di specie) della flora intestinale non consente adeguati fenomeni di competizione con specie patogene. Ci spiega l'aumentata frequenza di infezioni da Pseudomonas aeruginosa o da ceppi

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enteropatogeni di Escherichia coli durante il primo anno di vita. Un esempio analogo costituito dal botulismo infantile. Nell'adulto il botulismo causato esclusivamente dall'ingestione di tossina preformata negli alimenti e non dall'infezione con il Clostridium botulinum, in quanto la normale flora enterica ne impedisce la colonizzazione. Ci non si verifica nei primi mesi di vita, durante i quali il botulismo pu svilupparsi come conseguenza di una colonizzazione dell'intestino da parte del patogeno con produzione locale di tossina. In qualsiasi et, l'equilibrio ecologico del microbiota autoctono pu essere turbato da fattori esterni. Ci comporta situazioni di dismicrobismo, cio un'alterazione delle normali proporzioni delle specie all'interno del microbiota. La dieta pu alterare la composizione qualitativa e quantitativa della flora enterica diminuendo il potenziale competitivo nei confronti dei patogeni. La riduzione della flora enterica puo spiegare l'aumentata suscettibilit degli individui malnutriti a Vibrio cholerae. L'assunzione frequente di carboidrati semplici (principalmente tali substrati saccarosio con sotto forma di di dolciumi lattico. e Per bibite) alcuni determina, a livello della placca dentaria, un aumento dei batteri in grado di fermentare produzione acido microrganismi, come Streptococcus mutans, il saccarosio un fattore di colonizzazione in quanto facilita la sintesi di esopolisaccaridi insolubili che promuovono l'aderenza batterica sulla superficie dentaria. L'abbassamento del pH dovuto all'accumulo di acido lattico determina la demineralizzazione dell'idrossiapatite dello smalto e l'insorgenza di carie dentaria. Nei corso di terapie antibiotiche, soprattutto se ad ampio spettro o prolungate, sono frequenti infezioni causate dal micete Candida albicans, principalmente a livello della bocca (mughetto), della vagina (vaginiti) o della zona perianale. Questo fenomeno legato all'eliminazione, da parte degli antibiotici, di membri della flora normale in grado di rallentare la crescita di C. albicans, tra cui streptococchi, Enterobacter aerogenes, E. coli e P. aeruginosa. Un meccanismo simile legato all'insorgenza di enteriti (da forme lievi di diarrea a gravi coliti pseudomembranose) nei corso di terapie antibiotiche. Queste condizioni sono invariabilmente causate dal batterio Clostridium difficile, un membro 37

relativamente resistente agli antibiotici della flora intestinale residente. La vagina colonizzata da diverse specie del genere Lactobacillus. Queste producono acido lattico come unico prodotto terminale della fermentazione del glucosio che, a sua volta, deriva dal glicogeno presente nelle cellule esfoliate dall'epitelio vaginale. La produzione di acido lattico da parte dei lattobacilli mantiene il pH vaginale a livelli acidi (pH 4) e difende la vagina dall'attacco di diversi patogeni esogeni ed endogeni che non tollerano condizioni di acidit. Batteri commensali della vagina, quali alcuni anaerobi obbligati e la specie Gardnerella vaginalis, possono prendere il sopravvento quando diminuisce il numero di lattobacilli (e quindi l'acidit delle secrezioni), causando una condizione infiammatoria nota come vaginosi batterica. Anche le vaginiti causate dal protozoo Trichomonas vaginalis si verificano prevalentemente in presenza di un innalzamento del pH (> 4,5). La diminuzione del numero di lattobacilli, che alla base di queste infezioni, anche dovuta a squilibri ormonali con diminuita produzione di estrogeni. II nesso tra numero di lattobacilli e livelli di estrogeni dato dal fatto che questi ormoni sono responsabili dell'accumulo nelle cellule epiteliali vaginali di glicogeno che costituisce il principale substrato energetico per la riproduzione dei lattobacilli e la produzione di acido lattico.

IN EVIDENZA. I peptidi e le proteine antibatteriche che intervengono nella difesa delle superfici mucose: Lisozima Proteine leganti il ferro Lattoperossidasi Mucina Idrolizza il peptidoglicano Inibiscono la crescita batterica Genera superossidi Previene laderenza alle mucose

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Fosfolipasi A2 Peptidi chemiotattici Proteine fase acuta Collectine Properdina Defensine

Danneggia le membrane Richiamano i fagociti Opsonizzano i batteri Opsonizzano i batteri Attiva il complemento Danneggiano la membrana

IN

EVIDENZA.

Le

defensine

sono

un

numeroso

gruppo

di

peptidi

antimicrobici prodotti da cellule di molti mammiferi. Nelluomo sono state identificate due classi di defensine: le alpha-defensine (6 diversi peptidi prodotti principalmente tenue) e dai le polimorfonucleati beta-defensine (4 e dalle cellule peptidi Paneth prodotti dellintestino diversi

principalmente dalle cellule dellapparato respiratorio, del tessuto urogenitale, del pancreas, del rene e dai cheratinociti). Le alpha-defensine agiscono su batteri gram positivi e negativi, su miceti e sullenvelope di alcuni virus. Le beta-defensine agiscono soprattutto sui batteri gram negativi e sui miceti. Le defensine si legano sulla superficie esterna dei batteri: nei gram positivi interagiscono con gli acidi tecoici e con gruppi anionici esterni al peptidoglicano; nei gram negativi si legano alla porzione polianionica dellLPS. Linterazione delle defensine con le diverse stutture batteriche determina una permeabilizzazione della parete batterica, sia attraverso un effetto detergente sia attraverso la formazione di pori, che induce la fuoriuscita di materiale citoplasmatico dalla cellula batterica. IN EVIDENZA. Le opsonine sono delle macromolecole le quali, se ricoprono un microrganismo, aumentano l'efficienza della fagocitosi in quanto sono 39

riconosciute da recettori espressi sulla membrana dei fagociti. Il termine "opsonina" deriva dal greco "opsao, preparare. Le opsonine funzionano da ponte, legandosi da una parte al microrganismo e dallaltra al fagocita tramite specifici recettori posti sulla superficie di questi ultimi. Esistono varie opsonine: uno dei sistemi pi potenti rappresentato da anticorpi specifici di tipo IgG1 e IgG3 che ricoprono il microrganismo e sono riconosciuti dal recettore per Fc dei fagociti. I fagociti possiedono sulla propria membrana dei recettori capaci di legare direttamente i microrganismi e quindi di inglobarli anche in assenza degli anticorpi specifici: questo un meccanismo proprio dell'immunit innata. Quando invece i microbi sono rivestiti da anticorpi specifici, le opsonine specifiche, i fagociti neutrofili o i mononucleati possono legarsi con un legame ad alta affinit con il recettore di membrana per il frammento Fc delle IgG, in tal modo l'efficienza della fagocitosi notevolmente aumentata. Molte cellule immunocompetenti posseggono recettori specifici per il frammento Fc che svolgono molteplici azioni in seno al sistema immunitario. Un altro sistema di opsonine efficace rappresentato da alcuni prodotti derivanti dall'attivazione del complemento, soprattutto il C3b, sia che il complemento sia stato attivato seguendo la via classica, e quindi in presenza di anticorpi, oppure secondo la via alternativa, e quindi in assenza di anticorpi. In questo caso il C3b che ricopre le cellule microbiche si lega ai recettori specifici espressi sui macrofagi e sui neutrofili favorendo la fagocitosi. Altre opsonine naturali sono molte proteine presenti nel circolo ematico. Tra esse ricordiamo la fibronectina, il fibrinogeno, la proteina C-reattiva. Queste proteine rivestendo il microrganismo determinano una opsonizzazione non specifica, cio non mediata da anticorpi. E' da evidenziare che l'opsonizzazione non specifica molto meno efficace di quella specifica, tuttavia riveste un ruolo di difesa molto importante nella fase che precede la produzione degli anticorpi specifici.

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APPENDICE

Schema riassuntivo delle risposte immunitarie antibatteriche attivate nellospite Complemento. Svolge la propria funzione antibatterica attraverso:

- Via alternativa attivata dalle strutture batteriche - Via classica attivata tardivamente dai complessi Ag-Ac - Produzione di proteine chemiotattiche (chemotassine C3a, C5a) e di
proteine che aumentano la permeabilit (anafilotossine C3a, C4a, C5a)

- Opsonizzazione dei batteri (C3b e C4b) - Eliminazione diretta dei batteri (MAC: complesso di attaco alla
membrana, di tipo litico con formazioni di pori a livello della parete esterna dei Gram negativi, mediato da proteine del complemento, C5b-C9)

- Attivazione dei linfociti B (C3d)


Anticorpi. Svolgono la propria funzione antibatterica attraverso: Legame a strutture di superficie (pili, acidi tecoici e lipotecoici, capsula) Inibizione delladesione Opsonizzazione dei batteri per la fagocitosi Attivazione del complemento Eliminazione diretta dei batteri Neutralizzazione di tossine ed enzimi tossici

Macrofagi. Svolgono la propria funzione antibatterica attraverso: Azione fagocitaria antibatterica con killing intracellulare mediato da meccanismi ossigeno dipendenti (perossido di idrogeno, NADPH ossidasi e NADH ossidasi, superossido, radicale ossidrile, mieloperossidasi, ossido nitrico) ed ossigeno indipendenti (acidi, 41

lisozima, lattoferrina, proteine cationiche, proteasi, elastasi, catepsina G) Produzione di citochine (IL-1, IL-6, IL-12, TNF, IFN) Attivazione di risposte infiammatorie e di fase acuta Presentazione dellantigene ai linfociti T CD4

Neutrofili. Svolgono la propria funzione antibatterica attraverso:

- Azione fagocitaria antibatterica con killing intracellulare mediato da


meccanismi ossigeno dipendenti ed ossigeno indipendenti Linfociti T. Svolgono la propria funzione antibatterica attraverso:

- Attivazione risposte di tipo CD4 Th1 e CD4 Th2 importanti per le


risposte antinfettive

- Linfociti T citolitici CD8

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Mediatori umorali

Le molecole solubili della risposta infiammatoria e immunitaria innata sono le proteine della fase acuta, il complemento, le citochine. Le proteine della fase acuta sono prodotte dal fegato, dai macrofagi, dagli epiteli. Esse comprendono la proteina C-reattiva, l'amiloide A serica, il fibrinogeno, le proteine leganti il mannosio, alcuni componenti del complemento, gli inibitori delle proteinasi, la ferritina, LPS- binding protein (LBP). Il complemento svolge importanti funzioni nell'immunit innata intervenendo sia nel riconoscimento che nel killing batterico. Il complemento pu essere attivato per via classica e per via alternativa. Una terza via di attivazione, di recente osservazione, richiede l'intervento di proteine leganti il mannosio, MBL (mannose binding lectins), che legano residui di mannosio presenti sulla superficie batterica, ma non su cellule umane. Tali proteine non solo attivano la cascata complementare, ma causano anche aggregazione dei batteri che vengono eliminati dai fagociti. 42

Durante l'attivazione della cascata complementare si generano prodotti biologicamente attivi che favoriscono la fagocitosi (C3b e C4b si legano alla superficie batterica e fungono da opsonine), aumentano la permeabilit vascolare (anafilotossine C3a, C4a, C5a), stimolando le risposte infiammatorie, richiamano leucociti nel sito di infezione (chemotassine C3a, C5a, C5, 6, 7). Le anafilotossine sono capaci di attirare mastcellule e basofili e aderire ad essi. Il complesso di attacco alla membrana (MAC=C5b-C9) si inserisce nel bilayer lipidico della membrana esterna dei batteri Gram-negativi, formando pori e lisando le cellule. Il poro formato dai componenti terminali del complemento simile ai pori formati dalle perforine. Il ruolo protettivo del complemento nella difesa contro i batteri si esplica attraverso le seguenti funzioni: Opsonizzazione dei batteri Gram-positivi Lisi dei batteri Gram-negativi Vasodilatazione e aumento della permeabilit vascolare Richiamo di leucociti polimorfonucleati. Le citochine e le chemochine costituiscono una classe di molecole solubili effettrici che intervengono nel processo infiammatorio e nella risposta immunitaria sia innata che specifica. Costituiscono un ampio gruppo di peptidi, proteine e glicoproteine che formano un network integrato e agiscono da segnali intercellulari. Intervengono in numerose funzioni, quali differenziazione cellulare, apoptosi, chemiotassi, infiammazione, proliferazione cellulare, attivazione metabolica. Le citochine sono prodotte da una ampia variet di cellule, inclusi monociti, macrofagi, cellule NK, cellule epiteliali ed endoteliali, linfociti, fibroblasti. I componenti batterici capaci di indurre sintesi e liberazione di citochine sono definiti "moduline". Citochine liberate durante il processo infiammatorio, quali IL-1, IL-6 e TNF-a, agiscono come opsonine, favorendo la fagocitosi, attivano il complemento, attivano alcune funzioni cellulari. IL-1 e TNFa sono le principali citochine proinfiammatorie, responsabili dell'attivazione di leucociti e cellule endoteliali. Chemochine (IL-8) richiamano leucociti e ne controllano il traffico nei processi

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infiammatori. IL-8, liberata dalla superficie basolaterale delle cellule epiteliali richiama i neutrofili nei siti coinvolti dal processo infettivo TNFa induce apoptosi, altre citochine agiscono da mitogeni e stimolano la proliferazione cellulare (IL-2, IL-4, PDGF), altre la differenziazione cellulare (CSF, IL-4, IL-12). Gli effetti combinati dell'attivazione del complemento, il rilascio di citochine, la trasmigrazione e attivazione dei fagociti, la produzione di prostaglandine e leucotrieni processo inducono infettivo: gli eventi vascolari e cellulari colony caratteristici stimulating dell'infiammazione. Alcune citochine vengono prodotte nella fase precoce del GM-CSF (granolocyte-macrophage factor) e IL-3 favoriscono il rilascio di monociti e granulociti dal midollo osseo in circolo, TNF-a, IL-1, IFN-gamma e IL-8 stimolano monociti e granulociti a migrare dal sangue nei focolai infettivi, inducendo lespressione di selettine sulle cellule endoteliali e di integrine sui PMN e favorendo il legame di tali cellule alle molecole di adesione (ICAM) sull'endotelio. Condizioni predisponenti dell'ospite, come l'uso di steroidi, lo stress, l'abuso di alcool, riducono l'effcacia di tale sistema e la trasmigrazione dei PMN; tali situazioni giustificano l'aumentata suscettibilit dell'ospite alle infezioni. Numerosi osservazioni cliniche e sperimentali hanno evidenziato l'associazione tra stress e suscettibilit alle infezioni ed hanno confermato i rapporti esistenti tra sistema nervoso e sistema immunitario. Lo stress stimola l'ipotalamo a produrre un fattore (ACTH= che rilascia corticotropina (CRF= corticotropin-releasing induce la factor). di Quest'ultimo stimola, a sua volta, la produzione di ormone adrenocorticotropo adreno-corticotropic hormone) che produzione glucocorticoidi dal surrene e di epinefrina. Inoltre lo stress induce la produzione di norepinefrina dai neuroni simpatici. Monociti, macrofagi, cellule B e T hanno recettori per i glucocorticoidi. Glucocorticoidi, epinefrina e norepinefrina sopprimono l'attivit delle cellule del sistema immunitario.

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Immunit innata e immunit adattativa

L'immunit innata identifica uno stato di resistenza presente fin dalla nascita e quindi indipendente da precedenti contatti con l'agente patogeno. L'immunit adattativa comporta invece una reazione d'adattamento a uno specifico microrganismo. Tale adattamento acquisito in quanto indotto da un precedente contatto con l'agente patogeno. L'immunit adattativa estremamente specifica perch lo stato immunitario limitato al patogeno con cui avvenuto il precedente contatto e non si estende ad altri patogeni. Ad es., chi ha gi contratto la parotite resistente per tutta la vita al virus della parotite, ma pienamente suscettibile a tutte le altre malattie infettive (ad es. alla rosolia, alla scarlattina ecc.). Al contrario della risposta adattativa, la risposta innata si sviluppa in maniera simile nei confronti di diversi tipi di agenti. Fenomeni d'immunit innata che sono buoni esempi di questa aspecificit sono le barriere cutanee e mucose, la fagocitosi, il complemento, l'infiammazione e la febbre. Un'altra importante differenza tra i due tipi d'immunit sta nell'intervallo che intercorre tra stimolo e risposta. L'immunit innata pienamente efficace gi dalle primissime fasi dell'infezione e rappresenta la prima linea di difesa contro i patogeni. Al contrario, le risposte adattative necessitano di diversi giorni prima di raggiungere una qualsiasi efficacia. Esse hanno la massima importanza in quelle situazioni in cui l'immunit innata da sola non riesce a eliminare completamente i microrganismi. In questi casi l'intervento, a distanza di giorni, del sistema adattativo quasi sempre risolutivo ed eradica completamente l'infezione. I fenomeni d'immunit innata sono dovuti a tipi cellulari diversi da quelli dell'immunit adattativa. Alcune cellule dell'immunit innata sono altamente specializzate, come i fagociti professionali (i leucociti polimorfonucleati, i monociti e i macrofagi), le cellule dendritiche e le cellule natural killer. Anche cellule meno "professionali" quali le cellule epiteliali, i fibroblasti e le cellule endoteliali svolgono un ruolo importante nelle risposte innate. I fenomeni d'immunit adattativa sono mediati dai linfociti T e B. Ognuna di queste cellule (sia quelle dell'immunit innata sia quelle dell'immunit adattativa) presenta 45

recettori di ricognizione diversi per ciascun tipo cellullare. Per recettori di ricognizione si intendono quelle molecole che sono in grado di legarsi agli stimoli che innescano la risposta immunitaria e di trasmettere alla cellula segnali di attivazione. Ai recettori di ricognizione dell'immunit innata si da il nome di PRRs o Pattem Recognition Receptors (recettori di ricognizione di profili molecolari). I ligandi dei PRR, e cio le proteine microbiche da loro riconosciute, vengono denominati PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns o profili molecolari associati a patogeni). I PAMPs possiedono tutti la caratteristica di essere molecole indispensabili per la sopravvivenza del microrganismo e sono pertanto comuni a un vasto numero di specie microbiche diverse e relativamente invarianti. Sono alcuni esempi di PAMPs, l'LPS della parete dei Gram negativi, gli acidi lipoteicoici della parete dei Gram positivi, il peptidoglicano o alcune sue componenti, RNA doppia elica, beta glucano e mannano dei funghi. I recettori di ricognizione dei linfociti T e B vengono denominati recettori per l'antigene. I recettori per l'antigene sono, nel caso dei linfociti B, un'immunoglobulina di superficie (sig) e, nel caso dei linfociti T, da un TCR (recettore per l'antigene dei linfociti T). I recettori per l'antigene sono altamente variabili, al punto che essi costituiscono un repertorio di centinaia di migliala di tipi differenti: esistono migliaia di sig o di TCR diversi, ciascuno dei quali capace di legare un antigene diverso. Al contrario, i PRRs presenti su una cellula dell'immunit innata sono identici ai PRRs presenti su altre cellule del medesimo tipo cellulare: ciascun tipo di PRRs sar assolutamente identico in tutte le cellule di un individuo, in quanto il gene che lo codifica presente nella linea germinale. L'immunit adattativa si distingue in immunit umorale (mediata da linfociti B) e immunit cellulare o cellulo-mediata (mediata da linfociti T). L'attivazione dei linfociti B comporta quasi sempre un "aiuto" svolto da parte di linfociti T, che per questo motivo vengono definiti helper o Th. in seguito all'attivazione innescata da uno specifico antigene, i linfociti B si differenziano in plasmacellule che producono immunoglobuline (Ig o anticorpi) di vari isotipi (classi e sottoclassi) nel plasma e nelle secrezioni. Le immunoglobuline prodotte dalle 46

plasmacellule

conservano

la

capacit

di

legarsi

all'antigene

che

ha

originariamente stimolato i linfociti B. Le immunoglobuline hanno importanti funzioni nel controllo delle infezioni. In primo luogo, possono neutralizzare l'attivit biologica di prodotti microbici che funzionano come fattori di virulenza. Inoltre le immunoglobuline potenziano i meccanismi effettori dell'immunit innata, funzionando come opsonine, attivando il complemento, inducendo la degranulazione di mast-cellule o processi di citotossicit. Ogni isotipo di immunoglobuline ha diverse attivit effettrici. Ad esempio, solo le IgE inducono la degranulazione delle mast-cellule e solo le IgG sono capaci di attraversare la placenta e di proteggere il neonato nei primi mesi di vita.

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Correlazione tra immunit innata e immunit adattativa: i tre segnali immunologici.

L'immunit innata fondamentale per le risposte immunitarie adattative: queste sono parziali, deboli o assenti in mancanza di un'attivazione del sistema innato. Quindi il sistema innato il protagonista di una scelta cruciale: se rispondere o meno a un microrganismo o a un antigene e con quali modalit. Se il sistema innato risponde, ci avviene attraverso risposte progammate che comportano tre effetti strettamente connessi: infiammazione; attivazione dei processi microbicidi; innesco dell'immunit adattativa. Linnesco dell'immunit adattativa nei linfociti T avviene attraverso due segnali (denominati segnale 1 e segnale 2). Perch si verifichi una risposta adattativa, entrambe i segnali devono essere trasmessi contemporaneamente a un linfocita T da parte di una cellula APC. L'interazione tra questi due tipi cellulari viene definita sinapsi immunologica. I macrofagi, i linfociti B e soprattutto le cellule dendritiche possono fungere da APC. La presentazione dell'antigene (Ag) ai linfociti T comporta la parziale frammentazione dellAg, l'assemblaggio di frammenti antigenici su molecole del Complesso Maggiore di Istocompatibilita di classe I o II (MHC I o II) e l'esposizione del complesso 47

frammento antigenico-molecola MHC (Ag-MHC) sulla superficie cellulare. Il legame del recettore per l'antigene presente sui linfociti T (TCR) con il complesso Ag-MHC genera il segnale 1. Contemporaneamente lAPC (se opportunamente attivata da PRRs proinfiammatori) esprimer sulla propria superficie molecole costimolatorie come ad es. CD40, CD80 o CD86. Le molecole co-stimolatorie vengono riconosciute da recettori complementari sui linfociti T (CD40L e CD28) che innescano il segnale 2. Un prerequisito per l'attivazione dei linfociti T la presenza contemporanea sulla APC di Ag-MHC (che impartisce il segnale 1) e molecole costimolatorie (che impartiscono il segnale 2). La presenza del solo segnale 1 insufficiente all'attivazione dei linfociti T e induce inoltre anergia, rende cio i linfociti incapaci di rispondere a stimoli successivi. Le molecole co-stimolatorie vengono indotte solo in seguito a un'attivazione del sistema innato, in associazione alla produzione di citochine proinfiammatorie. Poich anche questultime hanno un ruolo importante nel favorire la proliferazione dei linfociti T (e nel polarizzarii in senso Th1) stato proposto che le citochine vengano considerate come il segnale 3. Risulta chiaro che, attraverso la produzione di molecole co-stimolatorie e di citochine, le cellule dell'immunit innata controllano e regolano le risposte adattative.

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Il complesso maggiore di istocompatibilit

II complesso maggiore di istocompatibilita (major histocompatibility complex, MHC) costituito da una serie di molecole che svolgono un ruolo primario nella corretta maturazione della risposta immunitaria adattativa. Tali molecole sono infatti coinvolte nel riconoscimento specifico di peptidi di origine esogena da parte dei linfociti T. Sulla base della struttura e della presenza sui vari elementi cellulari si distingue nelle seguenti classi: MHC DI CLASSE I: costituito da glicoproteine codificate in tre locus differenti (HLA-A, HLA-B, HLA-C), da ciascuno dei quali possono essere espresso piu di 100 varianti alleliche. I recettori di questa classe sono presenti 48

sulla superficie di tutte le cellule nucleate dell'organismo (con l'importante eccezione delle cellule nervose). A livello di una piccola tasca (cleft), ogni recettore pu esporre piccoli peptidi (8-10 aa) originati dal processamento di proteine espresse a livello citoplasmatico nel corso di infezioni virali o a seguito della replicazione di batteri intracellulari. MHC DI CLASSE II: costituito da eterodimeri espressi sulla superficie di un numero limitato di elementi cellulari: cellule dendritiche, macrofagi, linfociti B e alcuni linfociti T. Le proteine appartenenti a questo sistema sono codificate da tre regioni differenti (HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR), in ognuna delle quali sono presenti locus con diverse varianti alleliche per la subunit a e la subunit b di ogni eterodimero. Nel punto di contatto tra le due subunit si viene a creare una tasca (cleft) in grado di accogliere peptidi leggermente piu grandi di quelli esposti sui recettori di classe I (18-20 aa). Tipicamente tali peptidi originano dalla degradazione, a livello lisosomiale, di microrganismi fagocitati o proteine di origine esogena.

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Pattern Recognition Receptors (PRRs)

Lattivazione del sistema immunitario innato comporta l'induzione di: - infiammazione; - meccanismi microbicidi (ad esempio fagocitosi e citotossicit); - risposte adattative. Questi effetti sono mediati dall'attivazione di recettori di ricognizione, i Pattern Recognition Receptors, in seguito al loro legame con prodotti di microrganismi o di cellule danneggiate. Esistono gruppi funzionalmente diversi di PRRs. Alcuni recettori si limitano semplicemente a propagare il segnale ad altri recettori. Alcuni PRRs stimolano direttamente l'internalizzazione di particelle (recettori fagocitari), stimolano la citotossicit (recettori delle cellule natural killer) o la produzione di molecole co-stimolatorie. Probabilmente il gruppo pi importante di PPR quello che induce direttamente la produzione di mediatori dell'infiammazione (recettori proinfiammatori). 49

L'infiammazione ha un ruolo cruciale nelle risposte antimicrobiche in virt della sua capacit di concentrare i componenti (cellulari e umorali) del sistema immunitario nel sito di infezione, amplificando, nel contempo, i fenomeni di attivazione. Inoltre, i PRRs proinfiammatori mediano un'aumentata espressione di molecole co-stimolatorie sulle APC, e quindi l'innesco dell'immunit adattativa, favorendo, in particolare, una polarizzazione in senso Th1. Ciascun PRRs in grado di legarsi a specifici prodotti microbici ampiamente conservati tra i principali gruppi di microrganismi (cio a PAMPs come il peptidoglicano, presente in tutti i gram positivi, o al lipopolisaccaride, presente in tutti i batteri gram-negativi). I PRRs sono capaci di riconoscere la presenza di qualsiasi tipo di microrganismo, dai virus ai protisti eucarioti. Alcuni PRRs sono in grado di percepire segni tipici di sofferenza cellulare (ad es. la diminuzione della pressione osmotica intracellulare) o segni di lisi cellulare, tipica della necrosi (ad es. la presenza nello spazio extracellulare di molecole di ATP). Sofferenza e necrosi cellulare si verificano costantemente nel corso delle malattie infettive e rappresentano, pertanto, utili segnali indiretti della presenza di patogeni. I PRRs possano essere suddivisi in quattro gruppi in base alla sede dove sono presenti o espressi: nel plasma o nelle secrezioni (forma solubile); sulla superficie cellulare (membrana plasmatica); sulla membrana degli endosomi e su altri organuli intracellulari; nel citosol. Il segnale di attivazione pu essere propagato da PRRs solubili a PRRs espressi sulla superficie cellulare o da un PRRs di superficie (co-recettore) a un altro PRRs di superficie. I PRRs solubili comprendono il complemento, le collectine e le pentrassine. I PRRs cellulari si distinguono in recettori Toll-like (TLR) e in svariati recettori fagocitari. Certi TLR sono espressi sulla superficie (ad esempio TLR2 e TLR4), mentre altri sono espressi a livello endosomale (TLR7, TLR8 e TLR9).

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I Toll-like receptors

Con la scoperta e la caratterizzazione dei toll-like receptors (TLRs) divenuto evidente che la risposta immunitaria innata essenziale per innescare le risposte immunitarie adattative. I TLRs, considerati particolari PRRs, sono espressi su cellule mielomonocitiche, su cellule endoteliali ed epiteliali e anche a livello dell'endotelio ipotalamico. La famiglia dei TLRs in grado di riconoscere profili molecolari microbici altamente conservati (PAMPs): ne sono alcuni esempi il recettore intracellulare TLR3 specifico per l'RNA a doppia elica (dsRNA), il TLR9 per oligodeossinucleotidi ricchi in sequenze citosina-guanina (CpG) non metilate prodotte dal metabolismo di diversi agenti microbici, il TLR4 come responsabile del riconoscimento dell'endotossina batterica, il TLR2 per il peptidoglicano e per lacido lipotecoico e il TLR5 per la flagellina. Il riconoscimento dei PAMPs, che attiva vie di segnalazione intracellulari mediate da secondi messaggeri fosforilati, porta alla rapida produzione di citochine proinfiammatorie, promuove la maturazione delle cellule dendritiche, favorisce una risposta orientata verso un profilo di tipo T helper 1 e pu direttamente influenzare diverse funzioni antimicrobiche. Visto il ruolo primario nel riconoscere patogeni batterici, virali o fungini, recenti osservazioni sperimentali hanno evidenziato come mutazioni a carico dei TLRs possano contribuire ad aumentare la suscettibilit verso alcune infezioni o rendere pi grave il decorso della malattia. Ad esempio, mutazioni rare del TLR4 contribuiscono a sviluppare gravi infezioni meningococciche. Per la loro capacit di attivare e potenziare le cellule dell'immunit innata stato recentemente proposto il possibile utilizzo di ligandi dei TLR come adiuvanti vaccinali e in strategie terapeutiche di immunostimolazione.

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Le citochine

Per lattivazione e la regolazione sia dell'immunit innata che di quella adattativa fondamentale la produzione di citochine, ovvero piccole proteine secrete, con un peso molecolare in genere inferiore a 20.000 daltons, in grado di trasmettere segnali da cellula a cellule legandosi a specific recettori. 51

Le citochine agiscono sulla stessa cellula che le produce (azione autocrina), su cellule vicine (azione paracrina) o su cellule lontane (azione endocrina). L'azione endocrina alla base dell'insorgenza della febbre, dovuta alla stimolazione del centri termoregolatori dell'ipotalamo da parte di citochine proinfiammatorie rilasciate nella circolazione sanguigna. Alcune citochine, definite primarie (come il TNF- , l'IL-1, gli interferoni e e

l'IL-12) sono prodotte precocemente nell'infezione e cio immediatamente dopo l'attivazione di PRRs proinfiammatori da parte di prodotti microbici. Altre citochine (definite secondarie, quali l'IFNe l'IL-6) vengono prodotte in seguito a stimolazione da parte delle citochine primarie. Va precisato che il termine primario o secondario non ha nulla a che vedere con l'importanza del ruolo biologico di una specifica citochina ma indica solo il fattore temporale che interviene nella produzione di tali citochine. Le cellule Th1 producono citochine, principalmente IFN, che attivano i macrofagi, innescando risposte di ipersensibilit ritardata. Il riconoscimento del macrofago contenente batteri intracellulari da parte del linfocita Th1 avviene attraverso due segnali. Il primo rappresentato da IFN- che si lega allo specifico recettore presente sul macrofago, il secondo un ligando sulla superficie del Th1, il CD40, che si lega al rispettivo recettore e attiva il macrofago, con conseguente produzione intracellulare di specie reattive dell'O2 e del nitrossido, secrezione di citochine (TNF- , IL-1, IL-12), up-regolazione di molecole costimolatorie (CD80/86), aumentata espressione di molecole MHC di classe II. All'attivazione del macrofago segue da un lato il killing intracellulare del microrganismo, dall'altro la presentazione dell'antigene. In aggiunta, IFN- e TNF attivano le cellule T citotossiche, mentre IL-2 e IFNstimolano le cellule B a produrre IgG2, anticorpo capace di attivare il complemento ma dotato di scarsa capacit opsonizzante. La cellula Th2 produce IL-2 e IL-4 che stimolano le cellule B a produrre anticorpi opsonizzanti della classe IgG1. Produce inoltre IL-5, IL-6 e IL-13 che stimolano le cellule B a produrre IgE e IL-3, IL-4 e IL-10 che stimolano la crescita di mastcellule ed infine IL-5 che stimola la crescita e la differenziazione degli eosinofili. IL-4 e IL-5 in sinergia favoriscono la 52

produzione di IgA. Dunque, le risposte Th2 svolgono un ruolo nella produzione di anticorpi opsonizzanti importanti per leliminazione dei batteri extracellulari e nel controllo delle infezioni parassitarie. Le risposte verso antigeni T-indipendenti sono meno efficaci perch mancano di memoria immunologica e gli anticorpi prodotti sono di tipo IgM e IgG2: quest'ultimo anticorpo scarsamente opsonizzante e, in aggiunta, le IgM sono meno efficaci, come opsonine, rispetto a IgG1 e IgG3. Antigeni T-indipendenti, come polisaccaridi e lipidi, attivano una risposta immunitaria nei bambini di et superiore ai 2 anni, ma non nei bambini pi piccoli, il che spiega la scarsa efficacia di vaccini contenenti antigeni T-indipendenti nei bambini di et inferiore ai 2 anni, et a maggior rischio per infezioni causate da microrganismi capsulati (polmoniti e meningiti). Le risposte anticorpali risultano particolarmente importanti nei confronti di patogeni capsulati, i quali sono eliminati dai fagociti solo in presenza di anticorpi opsonizzanti. La suscettibilit di ospiti verso infezioni causate da batteri capsulati, come Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, condizionata, infatti, dal deficit di tali immunoglobuline.

NEWS neutrofili.

I fagociti polimorfonucleati Questultimi svolgono un ruolo fondamentale nelle difese

I fagociti polimorfonucleati comprendono i granulociti eosinofili, basofili e antibatteriche e sono elementi terminali, cio cellule pienamente differenziate, incapaci di riprodursi. I neutrofili possiedono quattro tipi di granuli preformati denominati primari (azzurrofili), secondari (specifici), terziari (di gelatinasi) e secretori. I neutrofili subiscono un rapido ricambio (si calcola che ogni giorno 100 miliardi di neutrofili vanno incontro ad apoptosi e sono rimpiazzati). Solo l1% della popolazione complessiva di neutrofili si trova nel sangue. Il resto risiede quasi interamente nel midollo osseo, dal quale pu essere rapidamente mobilizzato in presenza di un fenomeno infiammatorio. La funzione fondamentale dei neutrofili quella di presidiare i tessuti, segnalando la presenza di situazioni che richiedono un'attivazione del sistema 53

di difesa e uccidendo i microrganismi. In condizioni normali, i neutrofili lasciano il sangue e si spostano nei tessuti. I neutrofili esprimono PRRs e recettori per varie citochine proinfiammatorie e chemochine prodotte dai macrofagi residenti e da altre cellule (ad es. cellule epiteliali produttrici di IL-8). In assenza di "segnali di pericolo", i neutrofili vanno incontro spontaneamente ad apoptosi o lasciano l'organismo attraverso le secrezioni. In presenza di segnali di pericolo, i neutrofili bloccano il processo di apoptosi e si dirigono verso il punto in cui massima la concentrazione del segnale, seguendo un gradiente chemiotattico. I pi importanti fattori chemiotattici per queste cellule sono il TNF , il granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) e il

granulocyte/macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). Sono fattori chemiotattici anche le chemochine CCL3 (conosciuta anche come MIP1alpha) e il CXCL8 (conosciuta anche come IL-8) e il componente C5a del complemento e i peptidi batterici formilati. Se i neutrofili incontrano microrganismi, li inglobano e riversano nel fagosoma il contenuto dei granuli. Durante la migrazione lungo il gradiente chemiotattico e durante la fagocitosi, parte del contenuto dei lisosomi e riversato all'esterno (esocitosi) in un ordine ben preciso, in base al tipo di granuli. Si tratta di un meccanismo importante per amplificare l'infiammazione e richiamare altre cellule, quali i monociti e le cellule dendritiche. Se la fagocitosi inibita (ad es. ad opera di fattori batterici di virulenza o per la presenza di fibre della matrice connettivale o di cellule che ostacolano l'accesso ai microrganismi), ma persistono segnali di presenza microbica, i neutrofili liberano interamente all'esterno i contenuti cellulari con la distruzione del tessuto circostante. La liberazione all'esterno del contenuto dei granuli ha la funzione di uccidere i microrganismi a distanza, immergendoli in una specie di magma tossico. La formazione di pus (un liquido ricco di batteri, neutrofili e di loro prodotti, comprese abbondanti reti di cromatina) la conseguenza di questa strategia. Il colore verdastro del pus dato dalla presenza di mieloperossidasi, un enzima contenente ferro che abbondante nei granuli dei neutrofili, ma poco rappresentato nei lisosomi dei fagociti mononucleati. La

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viscosit del pus legata alla presenza di lunghe fibre di cromatina provenienti dal nucleo dei neutrofili. Con il risolversi dell'infezione, i neutrofili vanno incontro a morte per apoptosi. Durante questo processo, essi esprimono sulla parte esterna della membrana un fosfolipide, la fosfatidil-serina, normalmente presente solo sul foglietto interno. Ci segnala ai macrofagi che il corpo apoptotico pronto per essere fagocitato e assicura la distruzione dell'arsenale dei granuli senza ulteriori danni. La fagocitosi di neutrofili apoptotici da parte dei macrofagi stimola fortemente in questultimi l'attivazione di un programma di riparazione dei tessuti e di spegnimento dell'infiammazione.

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Fagociti mononucleati

Sono costituiti da macrofagi presenti in vari organi e tessuti, oltre al connettivo, e dai monociti del sangue. Anche le cellule dendritiche (DC) immature vanno considerate come fagociti mononucleati, in quanto sono capaci di buona attivit fagocitaria. E interessante sottolineare che questa capacit viene persa durante il processo di maturazione, processo che permette per alle DC di diventare eccezionali cellule in grado di presentare l'antigene e di esprimere alti livelli di molecole del complesso maggiore di istocompatibilita e molecole co-stimolatorie. E verosimile che in molte situazioni i microrganismi siano digeriti dai neutrofili e dai fagociti mononucleati e passati poi a cellule dendritiche per la presentazione degli antigeni e l'innesco dell'immunit adattativa. I monociti sono fagociti mononucleati presenti nel sangue che danno origine, dopo differenziazione, ai macrofagi dei tessuti e a una sottopopolazione di DC: le cellule dendritiche mieloidi. I macrofagi hanno dimensioni maggiori dei monociti (sino a 10 volte) e sono costituenti importanti dei tessuti reticoloendoteliali. Questi tessuti rappresentano una forma di connettivo lasso abbondantemente presente nel midollo osseo, nella milza e nei linfonodi. Diversi organi presentano forme specializzate di macrofagi, quali la microglia 55

del tessuto nervoso centrale, i macrofagi polmonari e le cellule di Kupffer del fegato. I macrofagi hanno scarsa capacit di fagocitosi e killing in uno stato di quiescenza. Tali processi sono tuttavia enormemente amplificati dai processi di attivazione. Lo stato di attivazione pu essere misurato come quantit di citochine o di radicali tossici dell'ossigeno prodotti e come potenziale microbicida attivato attraverso la fagocitosi e il killing intracellulare. Lo stato di attivazione dei macrofagi dipende principalmente dalla produzione di IFNda parte delle cellule circostanti. Questa citochina, che rappresenta un fattore fondamentale delle difese antibatteriche, viene prodotta soprattutto dai linfociti T e dalle cellule natural killer. I macrofagi possono essere attivati, in maggior o minor grado, da vari recettori opsoninici e non-opsoninici o da PRRs. Con l'eccezione della dectina-1, i recettori non-opsoninici inducono solo un grado di moderata attivazione. L'inglobamento di batteri non opsonizzati (non ricoperti cio da anticorpi opsonizzanti) avviene attraverso recettori "scavenger" (spazzino) presenti sui macrofagi residenti e sulle cellule dendritiche, recettori che riconoscono costituenti strutturali di superficie dei batteri, quali LPS, peptidoglicano, acido lipoteicoico e recettori per il mannosio,. Al contrario, i recettori opsoninici tendono ad attivare i macrofagi pi di altri. Alcuni PRRs come i TLR e gli NLR hanno una capacit particolarmente spiccata nellattivare i fagociti e nellindurre la maturazione delle cellule dendritiche.

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Il killing intracellulare

Luccisione dei microrganismi ingeriti pu essere opera della semplice acidificazione del fagosoma. Pi spesso l'uccisione avviene ad opera di una serie di sostanze presenti nel fagolisosoma classificabili come: intermedi reattivi dell'ossigeno; intermedi reattivi dell'azoto; proteine canoniche, comprese le defensine e la proteina battericida che incrementa la permeabilit (BPI); 56

idrolasi, comprese serin proteasi e fosfolipasi; fattori nutriprivi, cio proteine capaci di sottrarre sostanze nutritive essenziali quale lo ione ferrico e il triptofano. Lingestione del microrganismo ad opera di recettori innesca una serie di reazioni a livello del complesso enzimatico nicotinamide-adenina dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi, presente sulla membrana dei fagociti e nel fagolisosoma che culminano nella produzione di intermedi reattivi dell'ossigeno (ROI). In questo processo uno dei cinque componenti del complesso della NADPH ossidasi, il flavocitocromo trasporta un singolo elettrone cedendolo a una molecola di ossigeno con formazione dell'anione superossido (02-). Questo da luogo alla formazione di prodotti tossici quali il perossido di idrogeno o acqua ossigenata (H2O2), il radicale idrossilico (OH) e lossigeno singoletto. I fagociti fanno uso di queste forme tossiche dell'ossigeno per uccidere i microrganismi ingeriti. L'attivit microbicida dei ROI viene esaltata dalla mieloperossidasi che in presenza di ioni cloruro forma acido ipocloroso, una sostanza a forte attivit antibatterica. L'acido ipocloroso reagisce a sua volta con un'altra molecola di H2O2 per dar luogo a una seconda molecola di ossigeno singoletto. Il risultato lossidazione di costituenti strutturali o enzimatici essenziali per il microrganismo. In questo processo gioca un ruolo importante la perossidazione dei lipidi e di costituenti della cromatina che sono in grado a loro volta di ossidare altri prodotti microbici. Lattivazione dei macrofagi induce inoltre la produzione di intermedi reattivi dell'azoto (RNI) da parte dell'enzima inducibile NO (ossido nitroso) sintetasi. NO tossico per i batteri e inibisce la replicazione virale. Esistono importanti differenze tra i fagociti mononucleati e i polimorfonucleati neutrofili. I neutrofili hanno vita breve (2-3 giorni) e, all'esame istologico, non si riscontrano in condizioni normali negli organi, con leccezione del sangue e del midollo osseo. I fagociti mononucleati, al contrario, vivono per diversi anni nei tessuti, e hanno un ruolo importante nel regolare il funzionamento e la differenziazione delle cellule circostanti.

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Linfociti T

I linfociti T possono essere classificati per la presenza o assenza di particolari molecole (markers). Dal punto di vista dei markers, i linfociti T si dividono in CD4+ e CD8+. I CD4+ vengono attivati da complessi Ag-MHC di classe II e i CD8+ da complessi Ag-MHC di classe I. Da un punto di vista funzionale, i linfociti T, dopo essere stati stimolati a proliferare dall'Ag, possono differenziarsi in diverse sottopopolazioni, alcune delle quali, i linfociti T helper (Th), prestano aiuto allattivazione e alla regolazione di altre cellule del sistema immunitario. I linfociti Th (che sono, ma non esclusivamente, CD4+) influenzano prevalentemente le attivit dei macrofagi e dei linfociti B. I Th si differenziano in due sottopopolazioni, Th1 e Th2, in base alle citochine da loro prodotte. I linfociti Th1 producono principalmente IFN di tipo II (IFN- ), una citochina fondamentale nel potenziare la fagocitosi e il killing da parte dei macrofagi. I linfociti Th1 hanno un ruolo cruciale nelle difese antibatteriche e antifungine, particolarmente nei confronti di quei patogeni che sopravvivono all'interno dei macrofagi. I linfociti Th2 producono principalmente IL-4, IL-5 e IL-13 e svolgono un ruolo protettivo nei confronti di parassiti pluricellulari (ad es. elminti) attraverso l'attivazione delle mast-cellule e degli eosinofili. Sia i linfociti Th1 che Th2 sono in grado di favorire la produzione di anticorpi cooperando con i linfociti B. I Th2, ma non i Th1, hanno un ruolo essenziale nella produzione di IgE. Questo isotipo particolarmente importante nella difesa contro grossi parassiti come gli elminti e nella patogenesi di fenomeni allergici. La differenziazione in senso Th1 o Th2 viene determinata dal tipo di citochine secrete dalle APC durante la presentazione dell'antigene e nelle fasi successive della proliferazione dei linfociti T. La presenza di IL-12, di IFN di tipo I (principalmente IFNe ) e di altre citochine infiammatorie come TNF e IL-1,

induce una polarizzazione in senso Th1. In assenza di queste citochine, o in presenza di IL-4 prodotta da mast-cellule, i linfociti T si differenziano in Th2. Un'ulteriore sottopopolazione di linfociti T (denominata T-reg) ha la funzione di inibire l'attivit di altre sottopopolazioni T. I T-reg, che dal punto di vista dei

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markers sono CD4+ e CD25+, hanno un ruolo centrale nel prevenire l'insorgenza di malattie autoimmuni. Infine, i linfociti T citotossici (per lo pi, ma non esclusivamente, CD8+) hanno la funzione di uccidere mandando in apoptosi le cellule infettate da patogeni. In questo caso lo stimolo che scatena l'uccisione della cellula bersaglio data dal legame del TCR con l'antigene microbico espresso sulla superficie della cellula bersaglio nel contesto di MHC di classe I.

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Apoptosi

Le cellule gestiscono un delicato equilibrio che oscilla tra sopravvivenza e morte, scegliendo continuamente se andare incontro a replicazione, alla permanenza in uno stato di quiescenza o all'apoptosi. Poich la cellula partecipa Alterazioni attivamente nellapoptosi all'evento possono scelto, l'apoptosi sotto (o morte di cellulare malattie programmata) un aspetto fisiologico nella vita della cellula. manifestarsi forma degenerative (eccesso di apoptosi) o tumorali (difetto di apoptosi). Nel caso di cellule infettate da microrganismi (patogeni intracellulari obbligati o facoltativi) l'apoptosi spontanea o indotta da altre cellule pu rappresentare un importante meccanismo di difesa. Va tuttavia notato che in alcune circostanze un eccesso di apoptosi pu inibire le difese antibatteriche favorendo la replicazione del patogeno. Questo effetto legato ai segnali antinfiammatori indotti quando i macrofagi fagocitano cellule apoptotiche. Ad es., durante la sepsi o gravi infezioni batteriche, possono andare incontro ad apoptosi non solo le cellule infettate, ma anche un gran numero di linfociti e cellule dendritiche non infettate. Nel fagocitare queste cellule apoptotiche, i macrofagi producono citochine antinfiammatorie che possono inibire le attivit antibatteriche di altre cellule dell'immunit innata. L'apoptosi, a differenza della necrosi, un processo attivo: la stessa cellula che, trascrivendo geni specifici, sintetizzando nuovi enzimi e consumando energia, porta avanti il processo di morte, e alla fine emette segnali che

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possono influenzare il comportamento delle cellule vicine, comprese quelle che la devono ingerire. Anche la morte per necrosi innesca specifiche reazioni nelle cellule vicine, quale il rilascio di citochine proinfiammatorie da parte dei fagociti. Queste reazioni sono di segno nettamente contrario rispetto a quelle indotte dall'apoptosi. La necrosi si verifica in seguito a gravi e irreversibili danni causati da ipossia, ipertermia, infezione virale, esposizione a vari agenti tossici o per l'attacco da parte del complemento. Al contrario dell'apoptosi, la necrosi comporta una perdita dell'integrit delle membrane degli organelli, incluso il nucleo, con conseguente rilascio del loro contenuto (ATP, proteasi ed enzimi litici) fino alla lisi dell'intera cellula e alla degradazione aspecifica del DNA. L'apoptosi puo essere suddivisa in 3 fasi: induzione: esempi di stimoli induttori sono il TNF- , farmaci citotossici, radiazioni ionizzanti e ultraviolette, shock da calore, ipossia, infezioni virali; esecuzione: l'innesco cio di reazioni enzimatiche a cascata paragonabili a quelle del complemento o della coagulazione del sangue; riconoscimento da parte dei fagociti. Nei tessuti, i corpi apoptotici vengono rapidamente fagocitati dalle cellule circostanti e dai macrofagi e sono degradati all'interno dei lisosomi.

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La suscettibilit alle infezioni

La suscettibilit dell'ospite alle malattie infettive influenzata da variazioni genetiche che controllano le risposte ai patogeni. Identificare i polimorfismi genetici responsabili della diversa risposta alle infezioni aiuta a disegnare specifici adattiva. Polimorfismi nei geni che codificano per recettori Toll-like (TLRs) del sistema innato forniscono una spiegazione circa le variazioni individuali nella risposta a MAMs che influenzano sia la suscettibilit a determinate infezioni, sia la 60 trattamenti terapeutici. Le pi importanti variazioni genetiche coinvolgono recettori ed altri componenti della risposta immunitaria innata e

risposta infiammatoria e la risposta a particolari vaccini. Ad es., polimorfismi del gene TLR2 sono associati a ridotta produzione di IL-12 nei pazienti affetti da lebbra e ad aumentato rischio di infezioni stafilococciche. Varianti genetiche di TLR4 si associano al rischio di severe malattie sistemiche causate da batteri Gram-negativi. Polimorfismi dei geni che codificano per i componenti del complemento, i loro recettori e le proteine che ne regolano la funzione influenzano la suscettibilit alle infezioni. Ad esempio variazioni nellattivatore del plasminogeno sono associati ad aumentata suscettibilit alla malattia meningococcica. Polimorfismi nei geni che codificano per la sintesi di peptidi antimicrobici, come le defensine, condizionano aumentata suscettibilit a infezioni da Candida, ad altre patologie infettive orali ed a patologie polmonari croniche. Anche variazioni nei geni che codificano citochine e chemochine aumentano la suscettibilit: alcuni individui ad es. con difetti nella risposta a IFN gamma sviluppano malattie micobatteriche o virali particolarmente severe. Polimorfismi genetici responsabili di elevati livelli della produzione di IL10 sono associati alla maggiore incidenza di infezioni pneumococciche particolarmente gravi, condizionate dalla immunosoppressione e dalla alterata clearance batterica. Il complesso maggiore di istocompatibilit nell'uomo influenza la risposta alle malattie. Gli streptococchi di gruppo A rappresentano un eccellente modello per studiare l'interazione patogeno-ospite. Tali microrganismi sono responsabili di un ampia variet di patologie, che vanno da faringiti non complicate a patologie severe, come la febbre reumatica, lo shock tossico, la fascite necrotizzante. Sebbene siano conosciuti pi di 100 sierotipi, lo stesso ceppo pu essere isolato da patologie severe, da casi di batteriemia non severa cos pure da individui asintomatici. Si deduce, pertanto, che i fattori dell'ospite debbano contribuire alla evoluzione della patologia. Due diversi aplotipi di classe II sembra che incrementino il rischio di malattie severe invasive. La diversa severit delle patologie da streptococchi di gruppo A quindi una caratteristica immunogenetica dell'ospite, legata alla diversa risposta a superantigeni streptococcici e quindi alla produzione di diversi livelli di citochine. 61

4. LA TOSSIGENICITA DEI BATTERI.


Il danno il quale sfocia nella malattia il risulatato di una serie di eventi diretti, indiretti e su base immunitaria. DANNO DIRETTO ad opera di metabolismo batterico enzimi batterici tossine batteriche DANNO INDIRETTO ad opera di infiammazione attivazione del complemento produzione di citochine induzione apoptosi DANNO SU BASE IMMUNITARIA ad opera di immunocomplessi reazioni cellulo-mediate superantigeni autoimmunit

In ogni caso la risposta infiammatoria dellospite e lazione lesiva del batterio cooperano a determinare il danno tissutale che si manifester a livello clinico con una serie di segni e sintomi di gravit differente a seconda delle diverse circostanze. Tra i fattori batterici responsabili del danno tissutale diretto troviamo: il metabolismo batterico, in particolare la fermentazione, mediante la produzione di acidi, gas, ed altri prodotti tossici per il tessuto; il rilascio di enzimi degradativi, quali ialuronidasi, lipasi, etc. la produzione di tossine (esotossine ed endotossine).

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Principali enzimi batterici e loro funzione Aerobactina: sideroforo che veicola il Fe2+ allinterno del batterio dopo essere stata prodotta e secreta dallo stesso batterio Catalasi: converte il perossido di idrogeno ad acqua ed ossigeno Coagulasi: causa la formazione di fibrina che pu depositarsi sulla superficie del microorganismo ed inibire la fagocitosi Collagenasi: digerisce il collagene del tessuto connettivo (fattore di diffusione) Emolisine: lisano i globuli rossi ed altre cellule del sangue Fosfolipasi: lisi delle cellule del sangue (resistenza alle difese dell'ospite) Ialuronidasi: scinde lacido ialuronico, componente del tessuto connettivo (fattore di diffusione) Lecitinasi: scinde la lecitina, componente delle membrane citoplasmatiche Streptochinasi o fibrinolisina: trasforma il plasminogeno in plasmina che digerisce la fibrina Superossido-dismutasi: catalizza la conversione del superossido in perossido di idrogeno ed ossigeno molecolare

IN EVIDENZA. In alcuni casi il danno che causano gli enzimi batterici fondamentale nel quadro della malattia. Ad es., Pseudomonas aeruginosa e cheratite: la produzione di elastasi batterica pu portare entro 2-3 giorni alla totale distruzione della cornea. Streptoccoccus mutans e carie dentale: con lenzima glucosiltransferasi, il batterio si procura dal saccarosio il glucano per 63

la capsula che gli consente di colonizzare la superficie dentale (placca cariogena); con gli enzimi della omofermentazione lattica, il batterio produce acido lattico dagli zuccheri abbassando il pH al di sotto di 5.2, valore che favorisce la demineralizzazione dello smalto.

La produzione di tossine. I microrganismi possono liberare tossine che


interagiscono con cellule adiacenti o distanti. Queste tossine sono molecole che possono aggravare il processo della malattia o essere totalmente responsabili dello sviluppo della malattia (ad. es., difterite, colera, tetano, botulismo). La maggior parte delle tossine si lega a recettori specifici delle cellule da colpire. Ad eccezione delle tossine preformate responsabili delle tossinfezioni alimentari, le tossine sono prodotte dai microrganismi durante il decorso di uninfezione locale o sistemica. Le esotossine sono proteine dimeriche (componenti A e B) prodotte da batteri gram positivi e gram negativi e rilasciate nellambiente esterno. Il legame della subunit B (binding = legame) a specifici recettori sulla superficie cellulare consente il trasferimento della porzione tossica A (active = tossica) allinterno della cellula dove viene indotto il danno cellulare. In base al meccanismo dazione, possiamo classificare le esotossine in: tossine emolitiche (emolisine o citolisine) enzimi che producono pori nella membrana cellulare, digeriscono materiali cellulari, alterano la composizione della membrana tossine che alterano il contenuto intracellulare di AMP-ciclico (azione catalitica ADP-ribosilante). Ad es., la tossina colerica che nelle cellule della mucosa intestinale induce un accumulo di AMPc con una ipersecrezione di elettroliti ed acqua che produce la profusa diarrea acquosa caratteristica del colera. 64

tossine che alterano il contenuto intracellulare di AMP-ciclico (azione enzimatica adenilato ciclasica). Ad es., la tossina del Bacillus anthracis, causa dellantrace, che nella sua forma piu letale, lantrace polmonare, provoca laumento di AMPc nelle cellule bersaglio con edema localizzato.

tossine che inibiscono la sintesi proteica cellulare. Ad es., la tossina difterica che nelle cellule epiteliali della faringe blocca la sintesi proteica e causa la morte cellulare.

tossine

neurotrope

che Ad es.,

interferiscono la tossina

con

il che

rilascio causa

di una

neurotrasmettitori.

tetanica

diminuzione nel rilascio dei neurotrasmettitori dai neuroni inbitori che determina la paralisi spastica caratteristica del tetano, e la tossina botulinica che causa la diminuzione del rilascio di acetilcolina nelle sinapsi periferiche con paralisi flaccida caratteristica del botulismo alimentare.

IN EVIDENZA. Le anatossine o tossoidi sono esotossine alle quali stato artificialmente eliminato il potere tossico preservando le propriet antigeniche. Sono i costituenti dei principali vaccini antibatterici (vaccino antitetanico, antidifterico e antipertosse).

ENDOTOSSINA
Al contrario lendotossina il lipolisaccaride (LPS), una delle strutture che costituiscono il rivestimento esterno dei batteri gram negativi. E presente e prodotta per lisi della cellula batterica solo dai batteri Gram negativi.

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batteri

Gram

negativi

rilasciano

lendotossina

durante

linfezione.

Questultima si lega a specifici recettori presenti sulla superficie delle cellule del sistema immunitario stimolando la produzione di citochine proinfiammatorie che alimentano la reazione flogistica acuta. Nel caso di sepsi da Gram negativi, i livelli di endotossina nel sangue possono raggiungere valori molto alti, scatenando una risposta infiammatoria eccessiva, non pi protettiva, ma addirittura dannosa, che conduce allo shock settico e nei casi pi gravi al decesso. Meccanismi dazione delle endotossine: Liberazione massiccia di alcune citochine. Linterazione con gli endoteli vascolari Attivazione del complemento per via alternativa. Attivazione della cascata di eventi legati alla coagulazione del sangue. Produzione di mediatori come TNF, IL-1. Aumento della permeabilit vascolare, vasodilatazione, ipotensione, shock emodinamico, aumento del catabolismo proteico (cachessia).

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Il lipide A possiede la maggior parte delle propriet biologiche

associate al lipopolisaccaride (LPS) ed coinvolto nelle manifestazioni cliniche indotte da batteri gram-negativi (Salmonella, Shigella, Escherichia ecc.), come la febbre, la proteolisi muscolare, la coagulazione intravascolare disseminata (CID) e lo shock. La tossicit del lipide A risiede nella sua capacit di attivare il complemento e di stimolare il rilascio di citochine (IL-1, IL-6, IL-8 e TNF- ) da parte di monociti, macrofagi e altre cellule con funzioni biologiche coinvolte nella difesa dell'ospite contro i patogeni. E dimostrato che lLPS rilasciato in seguito alla lisi dei batteri gram-negativi in grado di legare una glicoproteina plasmatica, la LPS-binding protein (LBP), essenziale per la rapida induzione della risposta infiammatoria. Il complesso LPS-LBP interagisce con il recettore CD14 presente su monociti, macrofagi, su cellule endoteliali e su altre cellule ospiti. CD14 una glicoproteina ancorata alla membrana cellulare. I recettori 66

CD14 espressi in membrana (mCD14) sono organizzati in microdomini chiamati lipid raft e coinvolti in numerosi processi cellulari tra cui la transcitosi, la podocitosi e la trasduzione del segnale. CD14 esiste anche come molecola solubile (sCD14), che sembra avere un ruolo importante nell'attivazione, mediata dal LPS, di cellule CD14 negative come le cellule epiteliali e le cellule muscolari lisce. Il recettore CD14 risulta anche implicato nell'attivazione dei monociti, nell'interazione dei leucociti con le cellule endoteliali, nella regolazione dellapoptosi in monociti e in cellule endoteliali, e nello sviluppo di alterazioni vascolari come l'aterosclerosi e la coagulazione intravascolare disseminata. Per l'attivazione dei pathways intracellulari di trasmissione del segnale necessaria l'interazione di CD14 con un co-recettore, tra cui il piu importante il TLR4 (toll-like receptor 4), sia con proteine accessorie come MD-2. I TLR (toll-like receptors) sono membri della famiglia di recettori per IL1 (IL-1R), un sistema di trasduzione del segnale, il quale, attraverso l'attivazione delle MAPK (mitogen activated protein kinase) svolge un ruolo critico nella risposta immunitaria innata e nella risposta infiammatoria contro i patogeni.

IN EVIDENZA: SEPSI Indica una risposta infiammatoria sistemica (SYRS, Systemic Inflammatory Response Syndrome) in organi o apparati (polmoni, addome, vie urinarie) sostenuta da gravi infezioni, principalmente da gram negativi. In misura minore, il peptidoglicano e prodotti di degradazioni (acidi tecoici e lipotecoici) dei batteri gram positivi e componenti strutturali di miceti possono stimolare una risposta pirogena della fase acuta endotossino-simile. La sepsi caratterizzata dalla massiccia produzione di elevate quantit di fattori infiammatori (PG,TNF, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12). Le citochine proinfiammatorie innescano:

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- alterazione degli endoteli vascolari con collasso ipotensivo (sepsi


ipotensiva)

- la cascata della coagulazione con la formazione di diffuse coagulazioni


intravasali (DIC: disseminated intravascular coagulation)

- estesi fatti emorragici con la grave compromissione di diversi organi


(shock settico) ed effetti fatali per il paziente. SHOCK SETTICO Termine utilizzato per raggruppare una serie di eventi fisiopatologici che portano al collasso del sistema circolatorio causando il quadro clinico della sindrome da insufficienza multipla di organi (MOFS) che pu provocare la morte del paziente. Lo shock settico spesso causato da bacilli gram negativi acquisiti in ospedale e si manifesta comunemente in pazienti immunocompromessi e in quelli con patologie croniche. In circa 1/3 dei pazienti, tuttavia, causato da cocchi gram positivi e dalla Candida. Lo shock causato da tossine stafilococciche denominato shock tossico, una condizione incontrata pi frequentemente nelle ragazze. Inizialmente si verifica la vasodilatazione delle arterie e delle arteriole che fanno diminuire la resistenza arteriosa periferica con una gettata cardiaca normale o aumentata, anche se la frazione di eiezione pu risultare diminuita all'aumentare del battito cardiaco. Successivamente la gittata cardiaca diminuisce e le resistenze periferiche possono aumentare. Malgrado una gittata cardiaca aumentata, il flusso sanguigno verso i vasi capillari di scambio risulta diminuito, come diminuito il rilascio dei substrati vitali, in particolare O2 e la rimozione della CO2 e dei prodotti del catabolismo. Questa condizione di diminuita perfusione dell'organo colpisce particolarmente i reni e il cervello con conseguente danneggiamento di uno o pi organi viscerali. Alla fine, la gettata cardiaca diminuisce e compare il quadro tipico dello shock.

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Fattori predisponenti allo shock settico comprendono diabete mellito, cirrosi, stati leucopenici, specialmente quelli associati a neoplasie o al trattamento con agenti citotossici, infezioni antecedenti nel tratto urinario, biliare o GI, presidi invasivi, inclusi i cateteri, i tubi di drenaggio e altri corpi estranei. Inoltre costituiscono fattori predisponenti una precedente terapia con antibiotici, corticosteroidi o interventi strumentali per la ventilazione. Lo shock settico si verifica pi spesso nei neonati, nei pazienti con pi di 35 anni, nelle donne in gravidanza e nelle persone con un grave grado di immunocompromessione indotto da patologie di base o nei casi di complicanze iatrogene. GLOSSARIO DIC: disseminated intravascular coagulation: la formazione di diffuse

coagulazioni intravasali ARDS: Acute Respiratory Distress Syndrome, sindrome da insufficienza respiratoria acuta MOFS: Multiple Organs Failure Syndrome, sindrome da insufficienza multipla degli organi

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Le principali caratteristiche delle esotossine:


Neosintetizzate si liberano nellambiente esterno. Si possono separare per filtrazione, centrifugazione Sono di natura proteica Sono prodotte sia dai Grampositivi che dai Gram negativi Sono termolabili Resistono ai succhi gastrici tranne per lenterotossina stafilococcica e botulinica. Il loro potere tossico neutralizzato dallanticorpo specifico. Alcune vengono trasformate in laboratorio in anatossine (tossine a cui stato elimanto il potere tossico mantenendo le caratteristiche antigeniche. Principali componenti dei vaccini antibatterici)

Le principali caratteristiche delle endotossine:


Sostanze presenti costitutivamente nella cellula batterica, non si liberano nellambiente se non dopo la lisi dei batteri stessi. Sono prodotte dai soli GramSono di natura lipopolisaccaridica. Il potere tossico non neutralizzato dallanticorpo specifico. Resiste allazione dei succhi gastrici. Non pu essere detossificata.

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I SUPERANTIGENI sono proteine batteriche ad azione toxin-like che attivano i linfociti T CD4+, in genere senza presenza di Ag specifico, legandosi al TCR (T cell receptors) presente sui linfociti e allMHC di classe II presente sulle cellule APC presentanti lantigene. Linterazione APC-linfocita T mediata dal superantigene, senza presenza di un Ag specifico, si traduce in unalterata attivazione e proliferazione delle cellule T e nellattivazione dei macrofagi con rilascio di elevate dosi di diverse interleuchine (IL-1, IL-2, TNF- ) coinvolte nella patogenesi dello shock. Mentre un antigene stimola un clone di linfociti Ag-specifico, il

superantigene pu indurre uno stato di attivazione di pi cloni linfocitari, inducendo nel linfocita uno stato cronico di non responsivit definito anergia che pu portare allapoptosi (morte cellulare) con conseguente perdita di un notevole numero di linfociti T. Esempi di alcuni superantigeni di origine microbiologica Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1), prodotta da alcuni ceppi di Staphylococcus aureus che causano la sindrome dello shock tossico (TSS). Tossine pirogeniche dello Streptococcus pyogenes Le enterotossine stifilococciche di Staphylococcus aureus Le Sta (heat-stable toxins) di ceppi enterotossigenici di Escherichia coli (ETEC). Superantigeni associati a Streptococcus pyogenes possono essere

responsabili della psoriasi e antigeni di Mycobacterium tuberculosis, del virus rabbico e di HIV possono essere considerati superantigeni.

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IN EVIDENZA

DANNO MEDIATO DALLOSPITE SU BASE IMMUNITARIA Ipersensibilit di II tipo o danno citotossico: cellule dellospite possono essere distrutte da anticorpi, complemento o cellule killer se esprimono sulla propria superficie antigeni microbici o se antigeni dellospite presentano una reattivit crociata con antigeni del microrganismo. Ad es., la reattivit crociata indotta da Streptococcus pyogenes alla base di una ipotesi patogenetica della malattia reumatica post-streptococcica in quanto in questa malattia si ritrovano anticorpi e complemento legati al miocardio e nel siero sono presenti anticorpi anti-cuore con reattivit crociata verso antigeni streptococcici di varia natura. Ipersensibilit di III tipo o danno da immunocomplessi: complessi immuni solubili che si formano in eccesso di antigene circolano nel sangue e si possono depositare in vari distretti vascolari (glomeruli, processi corioidei, articolazioni, etc.). In queste sedi possono verificarsi attivazione del complemento, chemiotassi da polimorfonucleati e fenomeni infiammatori, tutti eventi in grado di creare danno. Ad es., la glomerulonefrite acuta poststreptococcica indotta da Streptococcus pyogenes un tipico esempio di malattia da immunocomplessi. Ipersensibilit di IV tipo o danno cellulo-mediato: sono effettori sia i linfociti T CD4+ con la liberazione di linfochine, sia i linfociti T CD8+ con la loro azione citolitica diretta contro le cellule infette. Ad es., la tubercolosi indotta da M. tuberculosis la tipica malattia sotto il controllo dellimmunit cellulomediata nella quale esiste un precario equilibrio tra gli effetti positivi per lospite (immunit) e quelli negativi (danno).

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MODALIT DI TRASMISSIONE DEGLI AGENTI INFETTIVI


1. Ingestione di alimenti o bevande contaminate (circuito oro-fecale) 2. Vie aeree respiratorie 3. Contatto diretto cutaneo-mucoso: contagio sessuale 4. Trasmissione attraverso artropodi vettori 5. Trasmissione per contaminazione di oggetti 1. INGESTIONE DI ALIMENTI O BEVANDE CONTAMINATE Le malattie infettive che si trasmettono per via alimentare sono quelle nelle quali lagente infettante viene eliminato con le feci e, in presenza di cattive condizioni igieniche, riesce a raggiungere il cibo realizzando quel circuito di infezione che prende il nome di trasmissione oro-fecale (colera, tifo, epatite di tipo A). Le intossicazioni alimentari, invece, fanno seguito alla ingestione di cibi contaminati da batteri che si moltiplicano negli alimenti producendo la tossina: quindi le patologie sono causate dallingestione di cibo contaminato dalla tossina, come ad es. nel botulismo (tossina botulinica) o nelle patologie dovute alle tossine prodotte dallo Staphylococcus aureus o dal Clostridium perfringens. 2. VIA AEREA Attraverso linalazione di microrganismi presenti nellaria su polveri o immessi tramite goccioline di saliva eliminate con i colpi di tosse o gli starnuti. E la trasmissione oro-faringea caratteristca della tubercolosi, pertosse, influenza e affezioni sostenute da virus respiratori 3. CONTATTO DIRETTO CUTANEO-MUCOSO: CONTAGIO SESSUALE Per un certo numero di microrganismi, che penetrano attraverso la cute o le mucose esposte, la trasmissione tra soggetto ammalato a soggetto sano si realizza per contatto diretto, come ad es. nelle malattie veneree (sifilide e 73

gonorrea) e diverse infezioni cutanee causate ad es. da Staphylococcus aureus da Bacillus anthracis etc. In questa categoria, si possono annoverare le infezioni che si instaurano al momento del passaggio attraverso il canale del parto (infezioni perinatali come ad es. quelle sostenute da Neisseria gonorrhoeae). 4. TRASMISSIONE ATTRAVERSO ARTROPODI VETTORI Infezione di tessuti o nel sangue circolante da parte di microrganismi patogeni o di virus veicolati da un animale infetto (rabbia, peste) o in seguito a puntura di un artropode ematofago che si sia nutrito di sangue di un soggetto infetto (malaria). I vettori pi comuni sono zecche, pidocchi, pulci, mosche, zanzare etc. 5. TRASMISSIONE PER CONTAMINAZIONE DI OGGETTI La contaminazione di biancheria, utensili, aghi, siringhe, strumenti medici favorisce la trasmissione di microrganismi responsabili di patologie cutanee, respiratorie, dispositivi urinarie sanitari, e quali intestinali. cateteri, Tale tubi modalit di trasmissione apparecchi per particolarmente attiva in ambito ospedaliero (infezioni nosocomiali), dove endotracheali, ventilazione meccanica, tubi da dialisi etc., rappresentano una importante fonte di contagio. Vanno inoltre ricordate: la trasmissione trans-placentare, che comporta il trasferimento dellagente infettivo dalla madre al feto attraverso la placenta (infezioni congenite), come ad es. la sifilide congenita, listeriosi e la maggior parte delle infezioni virali. la trasmissione per ferite accidentali, chirurgiche, graffi, morsi con infezioni sostenute da Clostridium tetani, Escherichia coli e Staphylococcus aureus.

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AGENTI ANTIBATTERICI E MECCANISMI DI RESISTENZA


GLOSSARIO AGENTI ANTIBATTERICI. Sostanze con caratteristiche inibitorie verso i

microrganismi (comprendono gli antibiotici ed i composti sintetici) e con effetti minimi sulle cellule dellospite (tossicit selettiva). ANTIBIOTICI. Sostanze prodotte da microrganismi che inibiscono la crescita batterica (batteriostatici) o provocano la morte del batterio (battericidi) ATTIVITA BATTERIOSTATICA: il livello di attivit antibatterica che inibisce la crescita del microrganismo. ATTIVITA BATTERICIDA: il livello di attivit antibatterica che uccide il microrganismo saggiato. ANTIBIOTICI SEMI-SINTETICI. Antibiotici modificati chimicamente per

migliorarne le propriet, come ad es. la stabilit e lo spettro di azione. COMBINAZIONE DI ANTIBIOTICI. Si possono usare combinazioni di antibiotici per: 1) ampliare lo spettro antibatterico per una terapia empirica o per il trattamento di infezioni polimicrobiche; 2) prevenire la comparsa di microrganismi resistenti; 3) ottenere un effetto sinergico di uccisione. EFFETTO SINERGICO. Combinazione di due antibiotici che hanno attivit battericida amplificata se somministrati insieme rispetto lattivit dei singoli antibiotici. EFFETTO ANTAGONISTA. Combinazione di antibiotici in cui lattivit di uno interferisce con lattivit dellaltro, ad es. lattivit della somma minore dellattivit dei singoli farmaci. 75

I PRINCIPALI MECCANISMI DI AZIONE DEI FARMACI ANTIBATTERICI 1. INIBIZIONE DELLA SINTESI DELLA PARETE BATTERICA Penicilline, cefalosporine, cefamicine, monobattamici, carbapenemici: agiscono legando le PBP e gli enzimi responsabili della sintesi del peptidoglicano.

inibitori della beta-lattamasi (acido clavulanico): lega le beta lattamasi e inibisce linattivazione enzimatica del beta-lattamico Vancomicina: interagisce con la D-alanina D-alanina terminale delle catene laterali penta-peptidiche interferendo con la formazione dei ponti tra gli strati di peptidoglicano. I batteri resistenti sostituiscono una D-alanina con un Dlattato che non lega lantibiotico

Bacitracina: altera il trasporto dei precursori del peptidoglicano Isoniazide e etionammide: impedisce la sintesi dellacido micolico Etambutolo: impedisce la sintesi dellarabinogalattano Cicloserina: altera i legami crociati degli strati del peptidoglicano La maggior parte degli antibiotici attivi sulla parete batterica sono classificati come beta-lattamici, cos chiamati per la presenza di un anello beta-lattamico nella loro struttura chimica. Generalmente agiscono come battericidi, inducendo la morte della cellula batterica attraverso il blocco di specifici enzimi, detti proteine leganti la penicillina (PBP), implicati nella sintesi del peptidoglicano, componente strutturale della parete delle cellule batteriche.

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NEWS

Le proteine leganti la penicillina (PBP)

PBP-1A e PBP-1B intervengono nei processi di accrescimento e l'inibizione dell'attivit di questi enzimi determina una rapida lisi batterica. L'inibizione di PBP-2 porta alla formazione di corpi batterici sferici facilmente lisabili. PBP-3 interessata alla formazione del setto, per cui l'inibizione di questo enzima produce strutture filamentose e lisi. PBP-4 non rappresenta un enzima essenziale in quanto l'attivit endopeptidasica, che consiste nella rottura del legame D-alanin-mesodiaminopimelico del peptidoglicano, pu essere sostituita da altre PBPs. PBP-4 non svolge solo funzione idrolitica ma in certe condizioni svolge attivit transpeptidasica catalizzando la formazione di legami crociati tra le catene del peptidoglicano. PBP-5 e PBP-6 catalizzano il processo di rimozione della D-alanina terminale delle catene pentapeptidiche dai filamenti di peptidoglicano neoformati.

batteri

possono

sviluppare

resistenza

nei

confronti

di

tali

molecole

principalmente attraverso tre meccanismi: lantibiotico non riesce a penetrare nella cellula per modificazione dei pori della membrana esterna, caratteristica strutturale esclusiva dei GRAM lantibiotico non riesce a legarsi alle PBP poich risultano modificate in seguito a mutazioni geniche il batterio produce beta-lattamasi che inattivano lantibiotico

2. INIBIZIONE DELLA SINTESI PROTEICA Amminoglicosidi: streptomicina, kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina. Si legano irreversibilmente alle proteine 30S dei ribosomi ed esplicano unazione battericida mediante due effetti: la produzione di proteine aberranti e linterruzione della sintesi proteica per rilascio prematuro del mRNA. I principali meccanismi di resistenza agli amminoglicosidi sono: Mutazione del sito legante il ribosoma Ridotta penetrazione nella cellule batterica 77

Modificazione

enzimatica

dellantibiotico

mediante

fosforilazione,

adenilazione o acetilazione dei gruppi amminici e idrossilici Tetracicline: tetraciclina, doxiciclina, minociclina. Si legano reversibilmente alla subunit ribosomiale 30S e bloccano lattacco dellaminoacil-RNA transfer. Possiedono unazione batteriostatica. I principali meccanismi di resistenza alle tetracicline sono: Diminuita penetrazione dellantibiotico Efflusso attivo (pompe di efflusso) Alterazione del sito bersaglio ribosomale, con produzione di fattori simili che legano lantibiotico senza che la sintesi proteica sia alterata Modificazione enzimatica dellantibiotico Macrolidi: eritromicina, azitromicina, claritromicina. Si legano reversibilmente al ribosoma 50S e bloccano lallungamento del polipeptide. Possiedono unazione batteriostatica. I principali meccanismi di resistenza ai macrolidi sono: Metilazione dellRNA ribosomale 23S che impedisce il legame dellantibiotico Distruzione enzimatica dellanello lattonico Efflusso attivo dellantibiotico Cloramfenicolo e clindamicina: interferiscono, al pari dei macrolidi, con la subunit ribosomiale 50S. Il principale meccanismo di resistenza al cloramfenicolo lalterazione del legame alla subunit 50S dopo acetilazione del gruppo ossidrilico della molecola antibiotica 3. INIBIZIONE DELLA SINTESI DEGLI ACIDI NUCLEICI (DNA e RNA) Chinoloni: acido nalidixico, ciprofloxacina, levofloxacina, ofloxacina, etc. Inibiscono le subunit alfa della DNA girasi o topoisomerasi necessari per superavvolgere il DNA batterico. 78

I principali meccanismi di resistenza ai chinoloni sono: Ridotta assunzione del farmaco per alterazione delle porine di membrana Modificazione della DNA girasi Rifampicina: Si lega allRNA polimerasi DNA-dipendente ed inibisce linizio della sintesi dellRNA. E battericida per Mycobecterium tuberculosis. ll principale meccanismo di resistenza alla rifampicina : Mutazione nella subunit beta dellRNA polimerasi DNA-dipendente I Gram negativi sono naturalmente resistenti poich lantibiotico idrofobico non supera la parete esterna 4. ANTIMETABOLITI Sulfamidici: competono con lacido p-amminobenzoico, impedendo la sintesi di acido folico richiesto come vitamina dai mammiferi che non lo sintetizzano I principali meccanismi di resistenza ai sulfamidici sono: Barriere di impermeabilit Ridotta affinit per la idrolato riduttasi

5. ALTERAZIONE DELLE MEMBRANE CELLULARI Polimixina e bacitracina: alterano la membrana citoplsmatica del batterio.

LA RESISTENZA AI FARMACI ANTIBATTERICI


I principali meccanismi di resistenza ai farmaci antibatterici sono: 1. Alterazione ed interferenza nel trasporto del farmaco, ad es. con lalterazione delle proteine poriniche della membrana esterna dei batteri. I principali antibatterici coinvolti da tale meccanismo sono: Beta lattamici 79

Bacitracina Farmaci contro la parete dei micobatteri Amminoglicosidi Chinoloni Rifampicina Antimetaboliti

2. Modificazione del sito bersaglio dellantibiotico, ad es. con la produzione di proteine simili ai fattori di allungamento che proteggono il ribosoma 30S ai quali lantibiotico si lega senza che la sintesi proteica venga alterata I principali antibatterici coinvolti da tale meccanismo sono: Beta lattamici (alterate PBP) Vancomicina (sostituzione nel peptidoglicano del terminale del pentapeptide da D-alanina in D-lattato o D-serina) Amminoglicosidi (mutazione del sito legante il ribosoma) Tetracicline (produzione di proteine simili al fattore di allungamento che protegge il ribosoma 30S) Macrolidi (metilazione dellRNA ribosomiale 23S che impedisce il legame dellantibiotico) Chinoloni (alterazione delle subunit alfa della DNA girasi) Rifampicina (modificazione della subunit beta dellRNA polimerasi) Sulfamidici (ridotta affinit di idrofolato riduttasi)

3. Distruzione o inattivazione del farmaco, ad es., la modficazione enzimatica mediante fosforilazione, adenilazione o acetilazione dei gruppi amminici e idrossilici degli antibiotici I principali antibatterici coinvolti da tale meccanismo sono: Beta lattamici (beta lattamasi) Amminoglicosidi (fosforilazione, adenilazione molecola) Cloramfenicolo (acetilazione) 80 e acetilazione della

Macrolidi (distruzione dellanello lattonico da parte di una eritromicina esterasi) Sulfamidici (produzione di timidina come antagonista)

4. Attivazione di pompe di efflusso, il trasporto cio dellantibiotico


allesterno della cellula batterica

NEWS

Quando un fenotipo di resistenza espresso da tutti i ceppi di una

specie batterica, la specie viene detta naturalmente (o intrinsecamente) resistente a quel farmaco antibatterico. Questa resistenza naturale o intrinseca riflette la presenza di un meccanismo biochimico di resistenza. Alcuni esempi: Escherichia coli naturalmente resistente ai glicopeptidi perch la membrana esterna impermeabile a questi farmaci; Mycobacterium tuberculosis naturalmente resistente a molti farmaci per impermeabilit della parete; Pseudomonas aeruginosa naturalmente resistente a molti beta-lattamici perch produce una beta-lattamasi che viene indotta in loro presenza e li degrada. All'intemo di una specie batterica naturalmente sensibile a un dato farmaco antibatterico possono emergere ceppi resistenti. Questa resistenza acquisita riflette una modificazione genetica nel genoma del ceppo resistente e costituisce un carattere ereditabile trasmesso alle cellule figlie. Le basi genetiche della resistenza acquisita includono eventi di mutazione o ricombinazione di geni residenti, oppure l'acquisizione di nuovi geni (geni di resistenza acquisiti) mediante fenomeni di scambio genico orizzontale. La resistenza intrinseca, essendo un carattere prevedibile, non pone particolari problemi al clinico nella scelta della terapia antibiotica. Viceversa, la resistenza acquisita pu essere la causa di insuccessi terapeutici qualora venga instaurata una terapia antibiotica senza aver preventivamente saggiato la sensibilit in vitro del patogeno ai farmaci.

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APPENDICE FATTORI CHE INFLUENZANO LA SCELTA DI UNA TERAPIA ANTIMICROBICA Farmacologia Interazione con altri farmaci Penetrazione nel sito di infezione Costo Tossicit Patogeni coinvolti Spettro di attivit antimicrobica Valutazione delle resistenze Et del paziente Tollerabilt Particolari condizioni patologiche (ad es. insufficienza renale o epatica) Allergie del paziente Gravidanza

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PRINCIPI DI DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA


Lo scopo dellesame batteriologico quello di verificare la presenza di un batterio patogeno in un individuo. La dianosi microbiologica un processo articolato in diverse fasi: 1. PRELIEVO del materiale da esaminare che pu essere costituito da: campioni oro-faringei liquido pleurico sangue urine campioni ostetrici escreato o lavaggio bronchiale liquido peritoneale liquido cefalo rachidiano

In questa fase del processo diagnostico doveroso osservare alcune regole tra cui: eseguire il prelievo al momento pi opportuno a seconda del tipo di batterio e di materiale e comunque prima di intraprendere qualunque terapia antibiotica evitare linquinamento da parte di microrganismi estranei evitare alterazioni del materiale dal momento del prelievo a quello dellesame 2. ESAME MICROSCOPICO DIRETTO eseguito in preparati colorati con il metodo di Gram. Generalmente non consente lidentificazione definitiva dei batteri osservati ma fornisce informazioni di carattere generale che aiutano ad orientare le tappe successive dellindagine diagnostica. 3. ISOLAMENTO dei batteri presenti nel materiale prelevato attraverso lesame colturale. Questultimo implica la scelta del terreno e delle condizioni di 83

incubazione pi idonee alla crescita del batterio di cui si ricerca la presenza o limpiego di diversi terreni e varie condizioni dincubazione in assenza di uno specifico sospetto diagnostico. 4. IDENTIFICAZIONE DEFINITIVA che richiede lallestimento di colture pure ed omogenee, ottenute inoculando il terreno con una singola coltura ben isolata, al fine di poter esaminare i caratteri del ceppo batterico in esame: caratteri microscopici (morfologia, aggruppamento, caratteri tintoriali) caratteri biochimici (produzione di specifici metaboliti, presenza di particolari enzimi) caratteri antigeni

5. ANTIBIOGRAMMA: test per lindividuazione degli antibiotici nei confronti dei quali il nostro isolato sensibile e/o resistente. A tale scopo necessario allestire delle piastre inoculate in superficie con una quantit di batteri in grado di formare una patina uniforme sul terreno. A questo punto si depongono, sulla superficie della piastra, una serie di dischi di carta imbevuti di adatte concentrazioni di antibiotico. Se il batterio in esame sensibile al farmaco si assister alla comparsa, attorno al disco stesso, di una zona circolare pi o meno ampia (in rapporto alla maggiore o minore sensibilit del batterio), il cosiddetto alone di inbizione. Prove sierologiche I test sierologici misurano la risposta anticorpale sierica del paziente in seguito ad una infezione. I principali sono: - Saggi di agglutinazione - Reazione di fissazione del complemento - ELISA o immunoenzimatico - Immunofluorescenza diretta e indiretta - Western blot

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Occorre ricordare che la presenza di anticorpi non sempre sta ad indicare uninfezione in atto ma pu essere la conseguenza di vaccinazioni o infezioni pregresse. Per escludere tali dubbi opportuno analizzare due campioni di siero, prelevati a distanza di alcuni giorni luno dallaltro, in modo tale da verificare, in caso di risultato positivo del test, se c un aumento del titolo anticorpale.

LE VACCINAZIONI

da: Michela La Placa Principi di Microbiologia Medica, Esculapio Editore

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IL CALENDARIO VACCINALE PER LINFANZIA

da: Michela La Placa Principi di Microbiologia Medica Esculapio Editore

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FONTI BIBLIOGRAFICHE CONSULTATE

Microbiologia Medica a cura di P.R. Murray, K.S. Rosenthal, G.S. Kobayashi, M.A. Pfaller. EDISES Principi di Microbiologia Medica, a cura di M. La Placa. Societ Editrice Esculapio Principi di Microbiologia Medica a cura di G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi e G.M. Rossolini. Casa Editrice Ambrosiana Microbiologia Medica: la Batteriologia a cura di M. Bendinelli, C. Chezzi, G. Dettori, N. Manca, G. Morace, L. Polonelli e M. A. Turano. Monduzzi Editore Microbiologia Clinica, a cura di G. Fadda, C. Favalli e B. Oliva. EMSI Editore

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