TAREA 3 :

INTERCAMBIO IÓNICO
 MATERIALES

. Columna de vidrio ( 10 x 1.1 cm ).

. CM-Sephadex C-50
. Lysozima (4 mg/ml) PM= 14,30 kDa pI= 11
. Albúmina sérica bovina (4 mg/ml) PM= 66 kDa pI= 4, 8
. Buffer acetato de amonio 0.05M pH 6,0
. Buffer acetato de amonio 0.05M pH 6,0 con cloruro de sodio
0,35M
. 50 tubos de ensayo 13 x 100 mm
. Pipeta de vidrio 1 ml
. Papel milimetrado
. Regla milimetrada
. Tapones de jebe, mangueras finas y agujas descartables No.
19 y 20.
. Plumón para escribir sobre vidrio.
. Calculadora
De acuerdo a los resultados dados a
continuación o con sus datos de obtenidos en
la práctica:
 Graficar en excel No. Fracción vs absorbancia a
280 nm.
 Hacer los cálculos cromatográficos de la columna
empleada.
 Elabore el cromatograma y determine en que
volumen eluyeron las proteínas y establezca sus
características químicas.
 RESULTADOS:

No. Tubo Abs 280 nm No. Tubo Abs 280 nm

1 0.000 21 0.011
2 0.070 22 0.013
3 0.200 23 0-015
4 0.370 24 0.016
5 0.480 25 0.017
6 0.350 26 0.023
7 0.270 27 0-028
8 0.160 28 0.068
9 0.072 29 0.174
10 0.015 30 0.196
11 0.008 31 0.164
12 0.003 32 0.129
13 0.002 33 0.118
14 0.002 34 0.099
15 0.005 35 0-090
16 0.004 36 0.083
17 0.008 37 0.062
18 0.009 38 0.044
19 0.009 39 0.021
20 0.010 40 0.012
SAL
 RESULTADOS:

No. Tubo Abs 280 nm No. Tubo Abs 280 nm

1 0.000 21 0.010
2 0.070 22 0.083
3 0.220 23 0-025
4 0.347 24 0.516
5 0.400 25 0.077
6 0.350 26 0.083
7 0.260 27 0-098
8 0.140 28 0.104
9 0.082 29 0.154
10 0.025 30 0.250
11 0.018 31 0.174
12 0.013 32 0.139
13 0.010 33 0.128
14 0.009 34 0.090
15 0.005 35 0-080
16 0.004 36 0.063
17 0.003 37 0.052
18 0.002 38 0.044
19 0.000 39 0.021
20 0.000 40 0.012
SAL
 RESULTADOS:

No. Tubo Abs 280 nm No. Tubo Abs 280 nm

1 0.000 21 0.011
2 0.080 22 0.023
3 0.200 23 0-036
4 0.350 24 0.056
5 0.510 25 0.077
6 0.320 26 0.092
7 0.260 27 0-105
8 0.150 28 0.148
9 0.092 29 0.174
10 0.045 30 0.220
11 0.018 31 0.168
12 0.019 32 0.139
13 0.015 33 0.128
14 0.010 34 0.102
15 0.005 35 0-090
16 0.004 36 0.083
17 0.002 37 0.062
18 0.002 38 0.044
19 0.000 39 0.021
20 0.000 40 0.012
SAL
 Se tiene una mezcla de 4 proteínas:A,B,C y
D cuyos pI son:5, 9.2, 8 y 6.5
respectivamente.
 a) Cuál es el patrón cromatográfico si se
pasa esta mezcla de proteínas a través de
una columna de I. catiónico a pH 5.
 b) Cuál será el patrón cromatográfico si se
pasa esta mezcla de proteínas a través de
una columna de I. aniónico a pH 7.
Proteína pI pH Carga

A 8 6
+

B 4 6
--

C 9 6
++

D 5 6
-
 EJERCICIO 3:
 En el siguiente gráfico se lleva a cabo una
corrida de intercambio catiónico a pH 7.5.
Responda las siguientes preguntas
a) Cuál es la proteína más ácida
b) Cuál es la proteína más básica
c) Qué perfil cromatográfico se obtendrá, si la
misma muestra de proteínas se pasa por una
columna de I. aniónico al mismo pH
 CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO
IONICO

Intercambio
catiónico a
pH 7.5

a) Cuál es la proteína más ácida

b) Cuál es la proteína más básica
c) Qué perfil cromatográfico se obtendrá, si la misma muestra
de proteínas se pasa por una columna de I. Aniónico al
mismo pH
1) Por una columna de intercambio aniónico se pasa una mezcla de
proteínas y se obtiene inicialmente dos picos y luego de establecer
una gradiente lineal de NaCl se obtienen tres picos más. Determine
lo siguiente:
a) ¿Cuál es la naturaleza ácido-base de los dos primeros picos?
b) ¿De qué naturaleza es el último pico en ser eluído?

2) Tres proteínas A,B y C tienen PI de 10, 4 y 8 respectivamente.

Determine lo siguiente:
a) ¿Qué patrón cromatográfico se obtendrá si esta mezcla de
proteínas se pasa por una columna de intercambio catiónico a
pH 4?
b) ¿Qué cambios de pH haría para separar ordenadamente las
proteínas que hubieran interactuado con el gel?
3) Cuatro proteínas A,B,C y D cuyos PI son 8, 7, 11 y 3
respectivamente se pasan por una columna de intercambio
aniónico a pH 8. Determine:
a) ¿Qué patrón se obtendrá, si la mezcla de proteínas se
hace pasar por una columna de intercambio aniónico a pH 6?
b) ¿Qué resultado se obtendría en cada caso?. Señale que
cambios de pH haría para eluír las proteínas que interactúan con
el gel?