BIOCHIMICA DEL CLACIO

CALCIO: 5oelemento più abbondante nel corpo umano. Funzione di stabilizzazione nelle ossa e nei denti (legato
come idrossiapatite e nelle proteine nel fluido extracellulare. Nelle cellule ha attività di secondo messaggero legando
proteine specifiche.
In CONdizioni di riposo il calcio intracellulare ha una bassa concentrazione di 50-100 nM mentre la concentrazione
extracellulare è nell’ordine dei millimoli = 2.5 mM. L’energia contenente in questo gradiente consente rapidi influssi
dello one in seguito ad apertura di canali. Il mantenimento del gradiente richiede elevata espesa energetica e
dipende dalle coordinate funzioni di pompe-trasposrtatori della membrana e degli organelli subcellulari e delle
proteine di legame del calcio.

CALMODULINA: proteina sensore della concentrazione del calcio. Contiene 4Helix-loop-Helix = EF-hand dominii di
legame per il calcio.

Proteine con domini EF: EF= struttura del dominio legante il calcio, motivo altamente conservato in cui gli aa
invariate consistono in due eliche che chiudono il Ca2+ entro un loop di legame.

LIGAZIONE DEL CALCIO: tramite donatori (mono o bidentati) carbossilati o neutrali. Questo perché lo ione calcio
preferisce notevolmente l’ossigeno come gruppo donatore di legame.

- Flessibilità di coordinazione tra 6-8 comunemente fino 12 legami di coordinazione possibili

- Geometria irregolare nella lunghezza di legame e nell’angolo di legame. Questa flessibilità consente al calcio
di poter formare legami di coordinazione vari.

IL CALCIO NELLO SPAZIO EXTRACELLULARE

Strettamente controllato in un range incluso tra 2-5mM.

Nell’ECM stabilizza la struttura delle proteine e media le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Ci sono quindi
numerosi processo extracellulari che richiedono il calcio come ad esempio la coagulazione, l’attivazione del
complemento e l’interazione dei recettori della superficie cellulare e i loro ligandi come nel Notch signaling.

Il calcio intracellulare si lega a proteine che mostrano un arrangiamento sequenziale dei loro residui di ligazione in
contrasto con quello che avviene a lv extracellulare:

Lv extracellulare = disposizione di residui di ligazione distanti nella sequenza aa.

Quindi queste proteine hanno una cavità di legame con il calcio preformata con un relativo alto grado di rigidità
ragion per cui il legame con il calcio è relativamente lento con una relativamente elevata velocità di dissociazione
e quindi un’affinità per il calcio tipicamente bassa per le proteine extracellulare. Poiché però la conc. Extrac. Del
calcio è relativamente alta le proteine lo legano difendendosi dal destino di clevage proteolitico.

FUNZIONE DI MEDIAZIONE DELL’ADESIONE CELLULA CELLULA: tramite le adherine. Le adherine sono glicoproteine
che richiedono il calcio per la loro attività di giunzione intercellulare. Le più studiate sono l’uvomorulina e l’E-
caderine in cui la parte extracellulare di queste prot. Transmembrana è largamente composta da 3 domini ripetuti
ciascuno dei quali contiene 2 siti deputati al legame per il calcio diversi dai motivi EF, ricchi in acido aspartico e
residui di asparagina.

LE CELLULE CHE FORMANO LE OSSA, osteoblasti, sintetizzano e secernono un numero di proteine non collagenose che
legano il calcio come: osteocalcina, osteopontina, osteonectina, che legano la matrice minerale delle ossa similmente
all’idrossiapatite in una modalità calcio dipendente.

 Osteocalcina: appartiene a una famiglia ricca di insoliti amminoacidi di acido glutammico gamma carbossilato
che mediano le proprietà di legame del calcio.
 Osteopontina: glicoproteina ricca in acido aspartico e glutammico
  Sia osteocalcina che osteopontina contengono la sequenza arginina-glicina-acidoaspartico che è importante per
mediare il legame con i recettori della membrana della superficie cellulare
 L’osteonectina è una proteina extracellulare legante calcio che contiene almeno un dominio EF (nonostante
questi siano tipicamente limitati alle proteine di legame del calcio intracellulari). Un’anormalità di questo
dominio è che viene stabilizzato da un ponte disolfure che in genere non si ritrova nelle proteine EF.

DOMINIO DI LEGAME : un numero limitato di domini in forma modulare si assembla a formare le proteine leganti
calcio extracellulari: es. dominio ricco di acidoglutammicogammacarbossilato, dominio Gla nei fattori di
coagulazione dipendenti da vitamina K, le caderine, il dominio EGF simile epidermal growth factor.

EGF:ruolo generale nella coagulazione e adesione cellulare e interazione recettore ligando. 40-45 aa + 6 cisteine che
costruiscono ponti disolfuro + sottofamiglia che contiene domini leganti calcio.
Sequenza consenso specifica di legame.

SENSORE DI CALCIO EXTRACELLULARE:

Il calcio extracellulare è strettamente regolato. I recettori di diversi ormoni quali PTH CT, vitamina D3 sono coinvolti
nella sua regolazione. Questi recettori si trovano nella membrana come recettori sensibili al calcio con funzioni simili
ai recettori prot.G accoppiati.

- CaR glicoproteina simile ai recettori del glutammato, con un dominio extracellulare a bassa affinità per il
calcio che lega i siti caratterizzati da cluster di aa carichi negativamente. Si trova soprattutto nelle cellule
regolate dalle concentrazioni di calcio extracellulari es. osteoblasti e osteoclasti, cellule delle gh. Paratiroidi
e del rene e dell’intestino.
 PRINCIPI DI TRASDUZIONE

PLC
beta attivati da Gq e o Gbetagamma di Gi/Go.
Tutte le isoforme sono attivate dalla Gq
Idrolizza il PIP2 (4,5) e genera due molecole segnale:
- DAG
- IP3
IP3 attiva il recettore = canali del Ca2+ attivati da ligando del RE
Rilascio di calcio = incremento intracellulare della concentrazione di Ca2+ =
- Legame del Ca2+ con la calmodulina = legame caCaM ad altre proteine
- Legame del calcio ai domini EF-hand delle proteine
Risposta al DAG: reclutamento della PKC
Isoenzimi di PKC traslocano dal citosol alla membrana plasmatica per legare il DAG in presenza di Ca2+= attivazione delle PKC =
modificazione fosforilativa degli effettori
Eventuale regolazione dell’espressione genica per attivazione dei pathway di segnalazione delle chinasi mitogeno attivate (MAPKs) = chinasi
ser-thr
PLC fosfoinositidi fosfolipasi C: è un enzima che catalizza il cleavage dei glicerofosfolipidi a livello del legame fosfodiesterico tra il glicerolo e
il gruppo fosfato.
Il PIP2 (fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato) sembra essere l’unico substrato fisiologico di PLC. L’attività di PLC determina la formazione di IP3
(1,4,5) e 1,2DAG.
Esistono 12 differenti PLC nei mammiferi raggruppate in 5 subfamiglie in base alla loro struttura primaria.
Si costituisce di una N-terminale
stringa di domini PH (pleckstrino omolo) 120 Residui che fungono spesso da sito di ancoraggio alla membrana nell’interazione
modulari che si con i fosfoinositidi
organizzano attorno 4 copie di EF-hands motivi di legame con il calcio-calmodulina
al dominio catalitico
a barile formato dai regioni X e Y Formano un’unità di catalisi e sono separate da una regione linker nella struttura
due box X e Y = dominio catalitico primaria.
Si costituisce di alfaeliche e foglietti beta alternati.
Sono presenti I residui catalitici sono ad un’estremità del barile e il sito è parzialmente contornato da
eventuali motivi residui idrofobici che formano una fessura poco profonda all’estremità C-ter. Il bordo
addizionali di incompleto del barile forma una struttura spoutlike che permette l’ingresso e la
regolazione nelle fuoriuscita del substrato e o del prodotto.
isoforme beta e dominio C2 segue direttamente il box Y.
gamma. Di 120aa e agisce da moduli calcio dipendenti che legano i lipidi.
Meccanismo di Gli ioni calcio sono necessari per tutti gli isoenzimi di PLC perché avvenga la catalisi.
catalisi Nel centro catalitico interagiscono con l’estremità dell’IP3 del PIP2
Il catione attiva il gruppo 2-idrossile dell’anello dell’inositolo che a sua volta attacca il fosfato1 rimuovendo la testa
per formare un intermedio 1,2ciclico fosfato e il DAG.
I derivati ciclici vengono conseguentemente idrolizzati negli inositolofosfati aciclici.
Numerosi residui positivi trovati nel sito attivo interagiscono con i gruppi fosfati in 4- 5- dell’anello di inositolo
giustificando la preferenza dell’enzima per il PIP2 rispetto al fosfatidilinositolo o il fosfatidilinositolo4 fosfato.
Inoltre la struttura ha indicato che la tasca non può accomodare i fosfoinositidi che hanno il fosfato in posizione 3.
Non compatibile quindi con gli inositidi 3 fosforilati.

struttura recettori IP3 Sono grandi proteine, ciascun recettore ha 4 subunità organizzatte attorno a un poro centrale permeabile al calcio
che si apre quando il recettore viene attivato per il legame con l’IP3.
Ciascuna subunità N-ter regione citoplasmatica che trova il sito di legame per l’IP3;
distingue La regione di legame per l’IP3 si costituisce dell’unione tra due domini che formano una struttura ad L.
Regione regolatoria citoplasmatica 7 alfa eliche transmembrana
Regione a canale che contiene i segmenti transmembrana vicini all’estremità C-ter.
La regione C-terminale si costituisce di un bundle di 8 alfa eliche.
Il recettore tetramerico ha sede nel RE
Poiché ciascuna subunità ha un sito di legame per l’IP3, ciascun recettore ha complessivamente 4 siti di legame per l’IP3 ciascuno dei quali
deve legare il substrato perché avvenga l’attivazione e quindi l’apertura del canale
Al poro contribuisce ciascuna delle 4 subunità.
Il poro si costituisce degli ultimi due segmenti transmembrana e del loop di congiunzione.
Il poro condivide considerevoli similitudini con numerosi altri canali cationici suggerendo una struttura organizzativa
conservata.
REGOLAZIONE
dal calcio Il legame di entrambi è richiesto prima che il canale possa aprirsi. Risultano quindi IP3 e Ca2+ agonisti cooperativi per il
citosolico recettore= coagonisti.
Gli effetti incrementi modesti della concentrazione del Calcio potenziano l’effetto dell’IP3.
del calcio Incrementi più sostanziali determinano l’inibizione
= effetto bifasico del Ca2+.

Il legame dell’IP3 regola il legame del Ca2+ al sito di legame cosìcchè la sensibilità del recettore al calcio dipende ed è regolata
da IP3.
Il calcio rilasciato in seguito all’attivazione del recettore sembra indurre l’attività di canali IP3 più distanti provvedendo al calcio
che necessitano perché vengano aperti.
Entrata Il rilascio del calcio dai depositi citoplasmatici per attivazione del recettore IP3 induce un incremento della concentrazione di
del calcio Ca2+ intracellulare che a sua volta induce l’entrata di calcio entro la membrana citoplasmatica attivando canali per il calcio di
membrana. = rilascio di Ca2+ calcio indotto.

La PKC è una proteina chinasi serina treonina multifunzionale nucleotide-ciclico indipendente.

Gruppo omogeneo di 10 isoforme enzimatiche.
Esistono 10 isoenzimi nei mammiferi
Struttura in due parti: chinasi C-ter + moduli regolatori N- Dominio PS fosfatidilserina dominio di legame per l’interazione di membrana
ter;
Le strutture di entrambi i domini si costituiscono di:
- regioni conservate indicate come C1-C4
- e regioni variabili V0-V5
Moduli regolatori sequenza autonibitorice-pseudosubstrato che mantiene l’enzima nella
conformazione inattiva
1-2 moduli di targeting della membrana che dirigono la PKC alla membrana
Dominio C1 lega DAG e esteri del forbolo
C2 lega Ca2+
Ciascun evento nel legame di C1 e C2 con i rispettivi substrati determina l’associazione dei rispettivi domini alla membrana citoplasmatica.
Prima che la PKC sia 1. Fosforilazione della chinasi fosfoinositide dipendente (PDK-1); PDK-1 fosforila un segmento conservato
competente nel vicino all’entrata del sito attivo denominato come loop di attivazione. Un evento che struttura il sito
trasferimento del attivo in modo utile al legame con il substrato
segnale deve prima 2. La fosforilazione di PDK triggera due autofosforilazioni intramolecolari a livello di due posizioni
essere processata da una conservate presso la regione C-terminale.
serie di fosforilazioni - Motivo turn
ordinate. - Motivo idrofobico
ATTIVAZIONE PER Queste fosforilazioni obbligano la PKC nella sua conformazione matura e cataliticamente competente.
FOSFORILAZIONE
ATTIVAZIONE PER La PKC matura e fosforilata si localizza tipicamente a livello citosolico dove rimbalza sulla membrana tramite un
TRASLOCAZIONE meccanismo di diffusione controllato.
é mantenuta comunque in una conformazione inattiva perché la sequenza pseudosubstrato occupa il sito
catalitico.

Il legame di Ca2+ a C2 e di DAG a C1 permette la traslocazione a livello della membrana.

Il legame alla membrana determina l’attivazione dell’attività enzimatica rimuovendo lo pseudosubstrato dalla
cavità catalitica.

Pretargeting del calcio:

Poiché nella sua diffusione controllata della membrana nello stato inattivo la PKC ha una bassa probabilità di
trovare il DAG incastonato alla membrana, il legame con il Ca2+ a livello di C2 determina come un pretargeting
della PKC alla membrana che ora può iniziare una ricerca ben più efficace del DAG.

Modificazione C1 e C4 interagiscono tra loro con legami ionici bloccando l’enzima.

conformazionale
Scaffold della PKC
DOWNREGULATION
Il legame di C2 (carico negativamente) con Ca2+ determina la facilitazione dell’interazione con le teste polari
cariche negativamente dei fosfolipidi rendendo il pretargeting di membrana da parte della PKC. C1 lega DAG
distaccandosi da C4 e inserendosi nel foglietto della membrana (arricchito dal DAG quivi incastonato); ciò
permette l’ancoraggio.
Il C4 (carico negativamente) lega quindi il substrato (carico positivamente) e l’enzima traslocato sulla
membrana adesso attivo può fosforilare i residui di treonina e serina delle proteine substrato.
La corretta localizzazione subcellulare è necessaria per la normale trasduzione del segnale mediata da PKC.
Numerose proteine scaffold provvedono al legame della PKC vicino ai suoi substrati, attivatori, proteine
regolatoria.
L’attività prolungata dalla PKC risulta nella degradazione della stessa= downregulation.
 Il meccanismo molecolare consiste nella defosforilazione della PKC attivata con probabilmente una conseguente
ubiquitinazione e quindi proteolisi.

LE PROTEINE DI LEGAME INTRACELLULARI

In contrasto con quelle extracellulari che legano a bassa affinità il calcio, quelle intracellulari legano il calcio ad alta
affinità possedendo uno specifico dominio di legame, il legame EFhand per la prima volta identificato nella struttura
cristallina della paravalbumina.

Il dominio EF si costituisce di due eliche perpendicolari che racchiudono un loop di legame per il calcio.

Tutti i domini EF presentano una coordinazione pentagonale bipiramidale degli ioni calcio nel loop tra le due eliche
perpendicolari ove si collocano dei residui altamente conservati che si dispongono in una sequenza continua di 12
aa entro il loop e la seconda elica.

- Residui 1,3,5,12 = coordinazione mono o bidentata del calcio tramite gli ossigeni carbonilici delle catene
laterali
- Residuo 7 = coordinazione tramite l’ossigeno carbonilico
- Glicina invariata in posizione 6 = ripiegamento necessario per legare il calcio tramite l’ossigeno della catena
laterale del residuo 5 e 7
- Il residuo 9 provvede un ligando addizionale o tramite l’O della cat. Lat o indirettamente tramite molecole
d’acqua.
- Nella posizione 1 del loop in genere si colloca un aspartato mentre nel 12 un acido glutammico

In genere i domini di legami del calcio si trovano in paia stabilizzati da ponti idrogeno tra i residui centrali e loop
adiacenti = beta sheet antiparallelo. Questa associazione determina tra i due siti un incremento della cooperatività
di legame.

La calmodulina e la troponina C contengono 4 siti di legame del calcio = paio di paia modello di EF in due domini
globulari ammino e C-ter che contengono ciascuno due siti per il calcio e sono connessi da una lunga elica centrale
che costituisce complessivamente una forma a campana della proteina.

CALMODULINA

I domini N e C terminali legano il calcio cooperativamente ma il C ter con maggiore affinità. La parte centrale è
flessibile e il legame con il calcio determina la modificazione conformazionale della proteina da una forma estesa
della campana in assenza del target in una forma compatta tramite il ripiegamento dell’elica centrale ravvicinando i
due domini ingolfando il peptide rappresentante il dominio di legame CaM

In assenza del substrato: N ter e C ter hanno un comportamento come unità strutturali indipendenti.

Dominio di legame del target: brevi seq. peptidiche di 20-30 aa che hanno propensione ad assumere la forma di
un’alfa elica anfifilica. (es. lega MLCK chinasidellacat.leggeradimiosina nel muscolo liscio, chinasi II CaM dip., chinasi
della CaM chinasi dipendente. )

CHINASI CALMODULINA DIPENDENTE

Due categorie: monosubstrato es. MLCK, fosforilasi chinasi, CaM chinasi III dip. VS multisubstrato CaM chinasi I, II, IV

MLCK catalizza la fosforilazione di specifici residui di serina nella porzione N-ter delle catene laterali della miosina II.
Ne esistono due tipi geneticamente e biochemicamente e fisiologicamente differenti espressi in due differenti tipi di
muscolo:
- MLCK scheletrica, nel muscolo scheletrico l’actomiosina ATPasi, differentemente dal muscolo licio, è regolata da
proteine strutturali rappresentate da tropomiosina e troponina. Probabilmente in questo tessuto la MLCK modula il
rate e aumenta la contrazione isometrica
- smLCK del t.m.liscio o non muscolare. Nel muscolo liscio triggera la contrazione mediante la fosforilazione della
catena leggera e rimuovendo l’inibizione imposta da parte di queste sulla miosina ATPasi.

Il substrato di MLCK è molto specifico e il riconoscimento si basa dall’appropriata disposizione di 4 residui basici nella
regione Nter dei residui fosforilati di serina.

L’attivazione degli enzimi calmodulina dipendenti dipende dalla rottura di un segmento di autoinibizione che in
assenza di calmodulina interagisce come pseudosubstrato con il core catalitico dell’enzima.

CaM CHINASI MULTISUBSTRATO I, II, IV e KK (che attiva I e IV)

I-IV-KK = sono monomeri; I-IV attivati da un’altra chinasi calmodulina dipendente CaMKK. CaMKK è a sua volta
attivata da una chinasi .

II = enzima multimerico di 12 subunità. Attivata da autofosforilazione.

CaMKII funzione: metabolismo, rilascio di neurotrasmettitori, struttura citoscheletrica, espressione genica, controllo
del ciclo cellulare e LTP e LTD nel tessuto nervoso + memoria e apprendimento.

 STRUTTURA: complesso oligomerico di 6-12 subunità che può essere omoultimerico o eteromultimerico ,
probabilmente enzima bilobato
- la catalisi si svolge nella fessura tra i due lobi orientando la seq. consensus per il substrato in modo che i
residui basici siano in vicinanza dei residui di ser-thr che devono essere fosforilati possano interagire con
residui polari conservati sulla superficie del lobo maggiore.
- Il lobo minore contiene i residui di lisina essenziali per il legame dell’ATP
 REGOLAZIONE:
- Richiesta minia per il riconoscimento del substrato: arginina in posizione P-3 e serina o treonina fosforilati in
posizione P + residui idrofobici in P-5 e P+1
- A valle del dominio catalitico: il dominio autoinibitorio e numerosi domini variabili interspersi
 DIFFERENZA CON MLCK: l’affinità della calmodulina con CaMKII è molto minore. L’affinità può essere però
aumentata tramite autofosforilazione della treonina 286 = trapping della calmodulina perché riduce il rate di
dissociazione dall’enzima funzionale.

PROTEINE S100 proteine associate alla funzione di controllo del ciclo cellulare e di crescita dei neuriti che contiene
domini EF e viene secreta nello spazio extracellulare come fattore di crescita.

LE PROTEINE PENTA EF con motivi EF in genere ripetuti in tandem. Es. calpaina, sorcina, grancalcina, peflina, ALG2.
Caratteristica di tutti i membri è l’inserzione di due amminoacidi nel loop del quindo dominio EF che quindi, in
condizioni fisiologiche potrebbe non essere funzionale al legame del calcio ma piuttosto disporre un sito di
dimerizzazione.

CALPAINA: due isoenzimi I e II che differiscono nella dipendenza dal calcio. Cal. I attivata concentrazioni micromolari
vs II attivata da concentrazioni millimolari. Esistono entrambe in forma di eterodimero con una subunità maggiore
catalitica e una minore regolatoria. Il dominio catalitico distingue due domini ruotati l’uno rispetto all’altro che
interrompono il sito attivo e dilegame del sustrato = inattività in assenza di calcio. Il legame coopertivo del calcio a 2
siti non EF determina l’attivazione dell’enzima. Il elgame del calcio ai domini EF contribuisce alla sensibilità al calcio.
Entrambe le isoforme sono mantenute inattive dall’interazione con la calpastatina fino a che un segnale esterno non
attiva una proteasi specifica. FUNZIONE: differenziazione, apoptosi, rimodellamento citoscheletrico.

ALG-1 Forma dimeri con il quinto dominio EF dei monomeri fornendo un’interfaccia che potrebbe essere il sito di
interazione con altre proteine target come AIP e Alix (che sono connesse al processo di maturazione degli oovociti) o
di annessine/ peflina. I substrati interagiscono con ALG-2 in modo calcio dipendente giustificando la presenza dei
domini EF come sensori del calcio che ne regolano l’attività.

PROTEINE NON EF

ANNESSINE solubili e anfipatiche, legano le membrane che contengono fosfolipidi carichi negativamente in modo
Ca2+ dipendente. Funzione: annessina V = canale per il calcio a struttura quasi interamente alfaelicale con 5
alfaeliche e una superelica. I residui di legame al calcio non sono raccolti in sequenze ravvicinati ma possono essere
anche distanti nella proteina.

Presentano 3 siti di legame per il calcio, Il calcio anche qui è eptacoordinato coni ligandi organizzati una struttura
pentagonale bipiramidale.

GELSOLINA lega l’actina in modo Ca2+ dipendente. Può anche consentire la nucleazione nella polimerizzazione
dell’actina legandosi a due monomeri di actina. 2 domini di legami per il calcio regolano la sua funzione. In assenza di
calcio è inattiva e in una struttura globulare molto compatta bloccando il sito di legame con l’actina. Legando il Ca2+ i
domini N e C terminali della proteina si separano e smascherano il sito di legame per l’actina.

DOMINI C2 SINAPTOGAMINA: proteina transmembrane delle vescicole sinaptiche che agisce come maggiore
sensore del calcio nell’esocitosi regolata.
La regione citoplasmatica: due domini C2 = C2A-C2B che sono domini non EF di legame con il calcio.

C2 = dominio di beta sandwitch con 4 strand beta connessi da loop alcuni dei quali legano cluster di ioni calcio
primariamente mediante gli ossigeni delle catene laterali dell’aspartato. Sembra che solo il dominio C2B sia
necessario come sensore per del calcio per la fusione delle vescicole.

SISTEMI DI CONTROLLO DELLE CONCENTRAZIONI DI CALCIO INTRACELLULARI:

Il calcio viene mantenuto in una cocentrazione tra i 100-300 nM considerando le sue ampie funzioni di segnalazione
nella cellula. La concentrazione libera di calcio extracellulare è di 2-5 mM. Ciò risulta i un gradiente di concentrazione
transmembrana molto elevato e quindi piccole modificazioni della concentrazione di calcio possono influenzare i
diversi pathway di trasmissione.

SISTEMI DELLA MEMBRANA BLASMATICA:

I canali del calcio: 6 tipi: L, N, T, P ,Q, R.

 LTYPE = long lasting corrente ENTRANTE a elevata conduttanza

 TTYPE = corrente entrante transiente a elevata conduttanza
 NTYPE = prevalentemente collocati a livello neuronale caratterizzati da un’attivazione per forte depolarizzazione
e conduttanza intermedia.
 PTYPE attivati ad alto voltaggio presenti prevalentemente nei neuroni cerebellari di P.
 QTYPE meno sensibili all’agatossina omega VS RTYPE insensibili ma sensibili al Ni2+.

Secondo meccanismo di attivazione: VOC (voltage gated) VS ROC (receptor operated) VS SOC (attivazione
dipendente dalla deplezione di calcio nel RE tramite un meccanismo noto come entrata capacitiva di calcio CCE.

1. VOC: suddivisi in L-N-O-Q-R e T in base alle caratteristiche fisiologiche e farmacologiche.

2. ROC: 3 tipi diversi identificati: includono i recettori ionotropici e metabotropici del glutammato.
In base alla selettività i recettori ionotropici sono ulteriormente divisi in 3 tipi. Sono tutti e 3 attivati da L-
glutammato e sono denominati secondo l’agonista che lega i3 tipi:
- KA cainato
- alfa amino 3 idrossi 5 metil 4 isozaleproprionato AMPA. Considerati classicamente come impermeabili al calcio;
si è poi visto che l’impermeabilità dipendeva da una delle subunità: GluR2. Nei casi in cui tale subunità non è
presente sono quindi permeabili al calcio.
 - NMDA n metil-d aspartato, hanno la maggiore permeabilità al calcio. L’attivazione dipende dal potenziale di
membrana e il flusso di calcio attraverso questo recettore è quindi voltage gated.
Collocati nelle membrane postsinaptiche dei neuroni
- KA e AMPA sono primariamente permeabili a Na+ e K+ ma possono condurre anche Ca2+
- NMDA conducono Na+ e Ca2+
I recettori metabotropici sono invece recettori associati a proteine G.
3. SOC: nelle cellule neuroendocrine le correnti entranti di calcio sono attivate dai SOC. Sono canali in cui gli store
intracellulari di calcio del RE probabilmente comunicano i propri livelli di Ca2+ alla membrana plasmatica
formando un forma di segnale che apre il canale. Il processo è denominato entrata CAPACITIVA DI CALCIO CCE,
mediata da influssi ci calcio piccoli rispetto ai VOC. Due ipotesi del CCE:
- liberazione di piccoli fattori chimici di apertura dei SOC
- interazione fisica tra ER e CCE = trigger di apertura.

Le basse concentrazioni di calcio intracellulare sono mantenute da varie proteine

A livello di membrana esistono due sistemi coinvolti nell’estrusione del calcio:
1. Bassa affinità alta capacità Na+/Ca2+ exchanger (NCX). Ha una Kd di 10-15 muM = funziona al megio quando le
conc. Di Ca2+ si elevano tra 1-10 muM.
2. Alta affinità bassa capacità PCMA (Ca2+ ATPasi). Ha una Kd < 0.5 muM e si assume svolga ruolo dominante quando
la concentrazione citosolica sia inclusa tra 0.1-0-2 muM.

LA POMPA DEL CALCIO PMCA:

P-TYPE ATPasi (la sua controparte è la pompa del reticolo sarcoplasmatico SERCA). É ubiquitaria nella membrana
cellulare.
ATTIVAZIONE:
- I più efficaci ad attivare la PMCA sono i fosfolipidi acidi e in particolare i mono e bisfosforilati derivati del
fosfatidilinositolo.
- La CaM (calmodulina) attiva la PMCA tramite diverse interazioni. (troncare l’estremità C-ter della pompa
determina la costitutiva attivazione della stessa)
- PKA / PKC aumentano l’affinità per il calcio.

Nell’uomo esistono 4 diverse idoforme. PMCA 1-2 (ubiquitarie, 2-3 prevalentemente collocate nel cervello.
L’espressione di PMCA è regolata dal Ca2+.
La PMCA risulta come l’estrusore di calcio dominante nelle cellule non eccitabili mentre NCX gioca un ruolo
fondamentale nei tessuti eccitabili essendo la capacità di pompa 10 volte maggiore.

Differenza PMCA e SERCA: dipende dal rapporto stechiometrico calcio/ATP

Nella PMCA: 1 VS SERCA :2. In tal senso è stata predetta una struttura con un maggior numero di residui polari che
partecipano al trasporto del calcio tramite la membrana del RE mediato da SERCA.

STRUTTURA: singolo polipeptide che attraversa la membrana un numero pari di volte dipendente dal tipo di
isoforma. Quindi risultano N e C ter entrambi sullo stesso lato della membrana.

La maggior parte della massa della pompa protrude nel citosol con loops molto brevi che connettono il dominio
transmembrana con il lato extracellulare. Il lato citosolico può essere diviso in 3 parti:
1. Dominio di trasduzione o attuatore A: comprende la parte della pompa tra i domini TM 2-3 + Nter di 1. É il
dominio responsabile dell’accoppiamento tra idrolisi di ATP e trasporto ionico.
2. Dominio catalitico: Si estende tra il 4-5° dominio transmembrana e, in analogia con la SERCA, contiene i domini di
fosforilazione e di legame del nucleotide.
- Il dominio P (di forsforilazione) contiene l’aspartile fofato;
- nel dominio N c’è una regione denominata come hinge altamente conservata che porta il sito di fosforilazione
vicino al sito di legame dell’ATP.
-L’unità catalitica contiene infine un recettore per il dominio di legame alla calmodulina autoinibitorio. Questo
recettore si costituisce di due siti di contatto uno tra P-N e uno all’N-terminale del dominio di legame fosfolipidico
che costituisce un ponte tra il dominio di trasduzione e il dominio catalitico.
3. Dominio regolatorio: Protrude nel citosolo e presenta numerosi siti importanti per la regolazione:
- il sito di legame della CaM
- le sequenze consenso per la fosforilazione da PKA (a lv. C-ter del CaM) e dalla PKC (entro il dominio di legame per la
CaM). La fosforilazione di questi siti è impedita dalla presenza della CaM.

SCAMBIATORE Na+/Ca2+
Pompa scambiatrice presente soprattutto nelle cellule di tessuti eccitabili. Ha bassa affinità per il calcio rispetto alla
pompa per il calcio ma una capacità di trasporto molto maggiore. É un sistema ELETTROGENICO. Trasporta 3 Na+ VS
1 Ca2+. La direzione del trasporto dipende dalle concentrazioni transmembrana dei due ioni. Struttura di 9-11
domini transmembrana con N e C ter conseguentemente su lati opposti della membrana. Sono stati identificati 3
cambiatori omologhi 1-2-3 NCX che sono differentemente espressi nel cuore, cervello e rene.

NCX è un trasportatore che media l’import di 3Na+ e l’estrusione di 1Ca2+. L’estrusione di Ca2+ è contro il suo
gradiente elettrochimico e dipende dall’energia fornita dal gradiente del sodio generato dalla pompa sodio potassio.
La direzione di NCX può essere invertita. L’attività di NCX è inoltre regolata da pH, ATP, altri ioni e agenti redox.
La fosforilazione da parte di PKA e PKC ne aumenta l’attività.

Esistono 3 isoforme NCX1 in tutti i tessuti NCX2-3 prevalentemente a livello neuronale e muscolo scheletrico.

SISTEMI DI TRASPORTO NEL RETICOLO SARCOPLASMATICO

RECETTORE IP3
Attivato dall’ IP3 ottenuto dal cleavage da parte di PLC di PIP2 (= IP3+DAG). Si trova soprattutto nelle cellule di P del
cervelletto.
Può essere fosforilato da diverse chinasi in modo stechiometrico risultando in una riduzione della potenza di IP3 (da
parte di PKC, PKA, CaMKII) nel rilascio del calcio.

La maggior parte della massa della proteina protrude nel citosol con entrambe le terminazioni N e C = numero pari di
domini transmembrana. Il sito di legame dell’IP3 giace a livello dell’estremità N ter mentre il canale per il Ca2+ si
colloca a livello della regione transmembrana del Cter indicando una notevole distanza spaziale nell’accoppiamento
tra il legame con il calcio e la modificazione conformazione conseguente.

I RECETTORI RIANODINICI MUSCOLARI

LA POMPA DEL CALCIO DEL RETICOLO SARCOPLASMATICO: SERCA

Pompa che trasporta il calcio dal citosol al lume del reticolo contro gradiente di concentrazione. Rappresenta il 90%
delle prot. Di membrana del RS del muscolo scheletrico e il 50% nel muscolo cardiaco. Similmente alle pompe del
calcio della membrana citoplasmatica si costituisce di una struttura a singolo polipeptide.
Le proprietà della SERCA:
1. La porzione idrofobica si costituisce di 10 alfa eliche transmembrana
2. L’elica M5 continua nel citosolo accoppiando la porzione di membrana al dominio citosolico
3. La maggior parte della massa della proteine protrude nel citosolo e si divide in un dominio attuatore A, di
fosforilazione P, e un dominio di legame nucleotidico N; quest’ultimo è inserito entro il dominio P.
I domini P e N connettono le eliche 4 e 5 e forniscono il centro catalitico dell’enzima che presente un aspartile
conservato che viene fosforilato come intermedio durante il ciclo di reazione.
4. Due ioni calcio legano i siti di legame identificati entro la porzione transmembrana della pompa e comprendono i
residui polari delle eliche M4-5-6-8. Questo è un prerequisito necessario per la stechiometria di due ioni calcio
pompati durante il ciclo di reazione.
5. Durante la reazione i domini A P e N subiscono ampie modificazioni conformazionali che si accoppiano con il tilt
della posizione delle eliche da M1 a M6
6. Una delle differenze sostanziali tra la SERCA e la pompa della membrana citoplasmatica consiste nel dominio C ter.
Nella pompa citoplasmatica la proteina interagisce direttamente con la calmodulina. Nella pompa SERCA non esiste il
dominio regolatorio che permette la diretta interazione con la calmodulina. Alcune isoforme sono regolate dalla CaM
chinasi tramite fosforilazione del fosfolambano PLN
7. La SERCA cardiaca e del muscolo liscio è regolata da una proteina fosforilabile fortemente idrofobica denominata
FOSFOLAMBANO che si costituisce di un dominio ad elica N e C terminale interconnessi da una breve e flessibile
hinge region. PLN interagisce con SERCA a livello della regione transemembrana e con il piccolo loop del dominio P.
PLN può anche essere fosforilato come da PKA e CaMK che inducono una significativa stimolazione della SERCA. La
forma non fosforilata di PLN può essere vista come un INIBITORE ENDOGENO della serca, similmente alla
calmodulina che lega la pompa del calcio della membrana citoplasmatica come dominio autoinibitorio.

3 Differenti geni: SERCA1 (m. scheletrico) SERCA2 (m. cardiaco e liscio + t. non muscolare), SERCA 3 (nel rene e nelle
piastrine).

IL TRASPORTO MITOCONDRIALE DEL CALCIO

Anche il mitocondrio fornisce un sistema di trasporto e sequestro di calcio in modo energia dipendente. I
trasportatori del mitocondrio sono l’uniporter di calcio e lo scambiatore sodiocalcio.
Il mitocondrio svolge un ruolo molto importante nel registrare le modificazioni della concentrazione del calcio nei
microdomini della cellula piuttosto che nell’intero citoplasma. Es. l’incremento di calcio citosolico indotto da IP3
viene parallelamente accoppiato a un incremento rapido di calcio mitocondriale. L’attivazione dell’uptake di calcio
dal mitocondrio è il risultato della prossimità del mitocondrio e dell’ER e il rilascio di calcio dall’ER crea microdomini
di elevate concentrazioni locali di calcio che attivano l’uniporter a bassa affinità di calcio mitocondriale.