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enantiomeri:
un approfondimento

• Le proprietà chimiche e fisiche di due enantiomeri sono identiche eccetto

che nella loro interazione con altre sostenze chirali.

Attività ottica

• Hanno identiche proprietà fisiche, eccetto che per il modo con cui
interagiscono con la luce piano-polarizzata.

• La luce piano-polarizzata (o luce polarizzata) è la luce che possiede

un vettore elettrico oscillante in un solo piano. La luce piano-
polarizzata deriva dal passaggio della luce ordinaria attraverso un
polarizzatore.

• Un polarimetro è uno strumento che consente alla luce polarizzata

di attraversare un tubo porta-campione contenente un composto
organico. Permette quindi la misura dell’angolo (in gradi) di cui un
composto organico ruota il piano della luce polarizzata.
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• Con composti achirali, la luce che esce dal porta-

campione non risulta modificata. Un composto che non
modifica il piano della luce polarizzata è detto
otticamente inattivo.

• Con composti chirali, il piano della luce polarizzata viene

invece ruotato di un angolo . L’angolo  è misurato in
gradi (°), ed è chiamato rotazione osservata. Un composto
che ruota il piano della luce polarizzata è detto otticamente
attivo.

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La rotazione della luce polarizzata può essere in

senso orario o antiorario

• Se la rotazione è in senso orario, il composto è detto destrogiro. La

rotazione è indicata con d o (+).
• Se la rotazione è in senso antiorario, il composto è detto levogiro. La
rotazione è indicata con l o (-).

• Due enantiomeri ruotano il piano della luce polarizzatra di un ugual

valore ma nella direzione opposta.

• Perciò, se l’enantiomero A ruota la luce polarizzata di

+5°, allora la stessa concentrazione dell’enantiomero B
ruota di -5°.

• Non esiste nessuna relazione fra i prefissi R o S e le designazioni (+) e (-),

che indicano la rotazione ottica.

Miscele racemiche

• Una quantità uguale di due enantiomeri è chiamata miscela racemica o

racemato. Una miscela racemica è otticamente inattiva.

• Poichè due enantiomeri ruotano la luce piano-polarizzata di

un valore uguale, ma in direzioni opposte, le rotazioni si
annullano, e non viene osservata nessuna rotazione.

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La rotazione specifica

• La rotazione specifica è una costante fisica standardizzata

ed è funzione della concentrazione. La rotazione specifica è
indicata con il simbolo [] e tiene conto della lunghezza del
tubo porta-campione (l, in dm), della concentrazione (c in
g/mL), della temperatura (25°C) e della lunghezza d’onda
della radiazione utilizzata (589 nm).

Eccesso enantiomerico

• L’eccesso enantiomerico (purezza ottica) è una misura di

quanto un enantiomero è presente in eccesso rispetto
alla miscela racemica. E’ indicato con il simbolo ee.
ee = % di un enantiomero - % dell’altro enantiomero.
• Consideriamo il seguente esempio — Se una miscela
contiene il 75% di un enantiomero e il 25% dell’altro,
l’eccesso enantiomerico 75% - 25% = 50%. Perciò, c’è un
50% di eccesso di un enantiomero rispetto alla miscela
racemica.
• L’eccesso enantiomerico può essere anche calcolato se
sono note la rotazione specifica [] di una miscela e la
rotazione specifica [] dell’enantiomero puro.
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ee = ([] miscela / [] enantiomero puro) x 100.

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Le proprietà fisiche dei diastereoisomeri

• Poichè due enantiomeri hanno identiche proprietà fisiche, essi non
possono essere separati mediante le comuni tecniche fisiche, come la
distillazione.
• I diastereoisomeri e gli isomeri costituzionali hanno differenti proprietà
fisiche, e perciò possono essere separati mediante le comuni tecniche
fisiche.

acido tartarico

Perché è importante separare gli enantiomeri?

• Due enantiomeri hanno esattamente le stesse proprietà chimiche, eccetto

che per le reazioni con reagenti chirali non-racemici.

• Molti farmaci sono chirali e spesso, per svolgere la loro azione terapeutica, devono interagire con
recettori o enzimi chirali. Un enantiomero di un farmaco può curare efficacemente una malattia, mentre la
sua immagine speculare può essere inefficace o tossica.

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Gli enantiomeri e il senso dell’olfatto

• La ricerca suggerisce che l’odore di una particolare molecola è
determinato più dalla sua forma che dalla presenza di particolari
gruppi funzionali.
• Poichè gli enantiomeri interagiscono con i recettori dell’olfatto,
alcuni enantiomeri hanno odore diverso.

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Come separiamo gli enantiomeri?

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Separazione di enantiomeri: Risoluzione

Risoluzione per mezzo di Sali diastereoisomeri

Miscela racemica + agente risolvente

enantiomericamente puro = formazione di
diastereoisomeri

Risoluzione per mezzo di Enzimi

L’enzima trasforma selettivamente solo un
enantiomero (risoluzione cinetica)

Risoluzione per mezzo delle tecniche cromatografiche

enantioselettive: metodo diretto/metodo indiretto

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Cromatografia
La cromatografia è un mezzo fisico di
separazione nel quale i componenti da separare
sono distribuiti tra due fasi, una delle quali è
fissa (fase stazionaria) mentre l’altra (fase
mobile) si muove in una direzione definita.

Cromatografia di eluizione
Una procedura nella quale la fase mobile viene fatta passare in
continuo attraverso o lungo il letto cromatografico ed il
campione è applicato nel sistema disciolto in un volume finito.

Estratto da: IUPAC Orange Book

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La cromatografia è una tecnica di separazione, che permette di

dividere i vari componenti di una miscela omogenea

La separazione avviene tra

una fase fissa (FASE STAZIONARIA)
FASE MOBILE
ed una FASE MOBILE (eluente)

FASE STAZIONARIA

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Cromatogramma
risposta del
rivelatore
picchi cromatografici

tempo

Ogni sostanza sarà quindi caratterizzata da un tempo di ritenzione

correlato all’interazione con la fase stazionaria.
La differente interazione di due sostanze con la fase stazionaria ne
consente la separazione.

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SILICE:
matrice
più utilizzata

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SILICE: inerte, porosa con elevata resistenza

meccanica

Particelle di silice Superficie

sferica totalmente velica (bolina):
porose (5 micron): 320 metri quadrati
320-340 metri
quadrati/g

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La fase stazionaria più utilizzata nei

laboratori: C18

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Altre fasi stazionarie…

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Adsorbimento Partizione

Fase Fase inversa

normale

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Fase normale: interazioni idrofiliche

Fase stazionaria: silice o matrice

POLARE

Fase mobile: esano/alcol

Soluti: sostanze poco polari e neutre

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Scelta della fase stazionaria

Normal Phase Reversed Phase
--S.P is non-polar C-18 Non-Polar
The S.P polarity order is shown to the Phenyl
right C-8
C-4
CN More Polar

Diol C8
1
2
4

0 1 2 3 4 5 0 5 10 15 20
minutes

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Classificazione in base alla forma

del letto cromatografico
Cromatografia in colonna
Una tecnica di separazione nella quale il letto stazionario è posizionato all’interno di
un elemento tubulare (colonna). Le particelle della fase stazionaria solida o il
supporto ricoperto da una fase stazionaria liquida possono occupare completamente
il volume interno della colonna (Packed Column) oppure essere concentrati su una
frazione del volume interno lungo le pareti della colonna lasciando un percorso libero
per la fase mobile nella parte centrale della colonna stessa (Open-Tubular Column).

Cromatografia planare
Una tecnica di separazione nella quale la fase stazionaria è rappresentata da un
elemento planare oppure è depositata su una superficie piana. Il piano può essere
un foglio di carta, usato tal quale oppure impregnato con una sostanza che funge da
fase stazionaria (Paper Chromatography, PC) oppure uno strato di particelle solide
distribuite uniformemente su un supporto, ad es. una lastra di vetro (Thin Layer
Chromatography, TLC).

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Cromatografia su carta

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Cromatografia su strato sottile (TLC)

Rfi = a/b

. ....
sample
a

standards

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TLC di inchiostro nero – eluente MeOH

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Cromatografia ad elevate prestazioni

HPLC

Cromatogramma

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Esempio di separazione cromatografica di composti achirali

Miscela
1) benzene
2) toluene
3) bifenile
4) naftalene

diversa idrofobicità

0 5 10 15 20
minutes

Colonna: Hypersil MOS C-8; 5μ; (150*4.0 mm I.D.)

Eluente: H20/MeCN; 60/40; (v/v)
Flusso: 1.00 ml/min
Detection: UV@254nm; T=25°C

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Tecniche cromatografiche enantioselettive

Isomerismo e Separazione Cromatografica

Strutturali Proprietà diverse Separazione mediante HPLC

convenzionale

Diastereoisomeri Proprietà chimiche e Separazione mediante HPLC

fisiche diverse convenzionale

Enantiomeri Proprietà chimiche e Difficili da separare con le

fisiche identiche in tecniche convenzionali
ambiente achirale

Per distinguere gli enantiomeri è necessaria una interazione con un’entità

anch’essa chirale con formazione di diasteroisomeri

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Tecniche cromatografiche enantioselettive

La separazione cromatografia di enantiomeri può

essere realizzata, in linea di principio, adottando uno
dei seguenti metodi generali:

1) risoluzione indiretta, basata sulla conversione degli

enantiomeri in derivati diastereoisomeri mediante la
reazione con un agente chirale enantiomericamente
puro, e successiva separazione dei diastereoisomeri su
una fase stazionaria achirale;

2) risoluzione diretta, basata sull’impiego di fasi

stazionarie chirali o, limitatamente alla cromatografia
liquida, di fasi mobili chirali.

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Metodo indiretto

Soluti enantiomerici : (R)-So e (S)-So CDA : (S)-CDA

CDA = agente derivatizzante chirale

(S)-So-(S)-CDA
(R)-So
(S)-CDA
(S)-So (R)-So-(S)-CDA

Diastereoisomeri covalenti STABILI

Differenti proprietà fisiche

Separabili mediante HPLC su fasi stazionarie convenzionali

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Metodo indiretto
Enantiomeri da separare

NH2 NH2

* *
(S)-butan-2-ammina (R)-butan-2-ammina

Chiral Derivatizing Agent (CDA)

O
H3CO
*
Cl
CF3

(R)-3,3,3-trifluoro-2-metossi-
2-fenilpropanoil cloruro

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Metodo indiretto

O
H3CO
* NH2 NH2
Cl
CF3 * *

(S) (R)
(R)

O O
H3CO H3CO
* *
NH NH
CF3 CF3
* *

(R,S) (R,R)

diastereoisomeri

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Metodo indiretto
PRO :
❑ richiedono fasi stazionarie convenzionali di comune impiego, facile reperibilità,
basso costo.

CONTRO :
❑ L’agente chirale impiegato nella prederivatizzazione deve essere
enantiomericamente puro, altrimenti il rapporto tra le aree dei due diastereoisomeri
non corrisponde al rapporto originale tra i due enantiomeri. Se il derivatizzante chirale è
impuro dal punto di vista stereochimico, l’analisi cromatografia può essere effettuata solo se ne conosce
esattamente la composizione enantiomerica.

❑ Reazione di derivatizzazione deve andare a completezza. Nello stadio di

prederivatizzazione si può verificare un frazionamento cinetico dovuto alla differente velocità con la quale i
due enantiomeri da separare reagiscono con il derivatizzante chirale.

❑ Disateroisomeri devono fornire stessa risposta al rivelatore. Il rapporto delle aree dei
segnali dei due diastereoisomeri può non corrispondere all’eccesso enantiomerico originale se il rivelatore
fornisce risposte diverse per i due diastereoisomeri.

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Metodo diretto
• Attualmente è il più utilizzato data l’ampia disponibilità
commerciale di fasi stazionarie chirali

• Si basa su selettori chirali legati alla fase stazionaria che formano

addotti diasterosiomerici non covalenti.

• La diversa stabilità degli addotti diasteroisomerici si traduce in un

diverso tempo di ritenzione in colonna per i due enantiomeri

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Metodo diretto
Da un punto di vista teorico, la discriminazione chirale richiede almeno tre
interazioni simultanee tra il selettore e l’enantiomero e uno di queste interazioni
deve dipendere dalla stereochimica dell’analita

Complessi diastereoisomerici
TRANSIENTI

Il selettore chirale
(con elevatissima purezza
enantiomerica)
è legato covalentemente
alla matrice

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Metodo diretto

Supporto cromatografico
con selettore chirale

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R
Metodo diretto RIVELATORE UV
S si basa sull'assorbimento
di radiazioni
elettromagnetiche da
parte di molecole

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

R+S minutes

Fase stazionaria chirale

RIVELATORE CD
(dicroismo circolare)
misura la differenza dei
coefficienti di
assorbimento delle
componenti della luce
pianopolarizzata

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Esempi di separazione HPLC Enantioselettiva

A 1
2 B 1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 4 6 8 10
minutes

Gli enantiomeri dell’esempio B sono più separati rispetto all’esempio A.

Maggiore è la separazione degli enantiomeri, maggiore è la differenza di
“energia” tra le due coppie di diastereoisomeri transienti

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Tecniche cromatografiche enantioselettive

metodologie semplici ed accurate in grado di fornire indicazioni

sulla purezza enantiomerica e sulla configurazione assoluta

la determinazione L’assegnazione R/S

dell’ eccesso enantiomerico mediante separazione enantioselettiva
e caratterizzazione chiro-ottica
%e.e. = (E1-E2)/(E1+E2) X100

dove E1 e E2 rappresentano l’ammontare

dei due enantiomeri

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FASI STAZIONARIE CHIRALI

SELETTORI CON PESO MOLECOLARE MEDIO-BASSO

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FASI STAZIONARIE CHIRALI

SELETTORI CON PESO MOLECOLARE ALTO

Derivati di AMILOSIO e CELLULOSA

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