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Capacità antiossidante

Estrazione
Le sostanze antiossidanti sono state estratte in successione con metanolo (frazione idrofila) ed esano
(frazione lipofila). Brevemente: 0.100 ± 0.010 g di sfarinato sono stati risospesi in una provetta
Eppendorf con 1 mL di soluzione di metanolo all’80%, vortexati, messi in un bagnetto a ultrasuoni
per 10 minuti, agitati per 20 minuti e centrifugati a 12000 giri per 10 minuti; dopo aver recuperato il
surnatante, l’estrazione è stata ripetuta ed il secondo surnatante unito al precedente. Il processo è
stato ripetuto analogamente con esano.
Per valutare la capacità antiossidante dei lupini sono stati utilizzati il metodo ABTS secondo Re et
al. (1999), il metodo FRAP e il metodo DPPH secondo Yilmaz et al. (2015).

ABTS
Il metodo ABTS misura la riduzione dell’assorbanza in presenza di sostanze antiossidanti che
cedono un atomo di idrogeno al radicale. L’assorbanza degli estratti viene misurata a 734 nm con
uno spettrofotometro DU-62 (Beckman, Brea, CA, USA) utilizzando 50 µL di estratto e 1.6 mL di
una soluzione radicalica composta da 10 mL di soluzione acquosa di ABTS 7 mM e 170 µL di
soluzione acquosa di persolfato di potassio 140 mM (valore di assorbanza di 0.70 ± 0.02), lascita
riposare per una notte. L’assorbanza viene misurata dopo aver lasciato la miscela estratto-soluzione
radicalica per 10 minuti a 30 °C.

FRAP
Il metodo FRAP misura l’aumento di assorbanza dovuto alla riduzione da parte dei composti
antiossidanti del complesso Fe3 +¿−TPTZ ¿ . In questo caso, 80 µL del campione estratto vengono
miscelati con 1.8 mL del reagente FRAP (contenente in rapporto 10:1:1 buffer acetato 0.3M pH 3.6,
TPTZ 0.1M in HCl e FeCl3 0.02 M in acqua distillata) e agitato per 1 ora in un bagnetto
termostatato a 37 °C; l’assorbanza viene misurata a 593 nm.

DPPH
Il metodo DPPH si basa sull’inattivazione del radicale stabile 1,1-difenil-2-picrilidrazide DPPH. A
2 mL di DPPH è stato aggiunto 1 mL di metanolo con diverse diluizioni degli estratti. Dopo una
sosta a 25 °C per 30 min si effettua la misurazione della riduzione del radicale da parte degli
antiossidanti a 517 nm. Tre rette di regressione sono state tracciate per la sostanza antiossidante di
riferimento Trolox (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), con concentrazioni tra 0 and 500 M
(ABTS), tra 0 e 2500 M (FRAP) e tra 0 e 500 M (DPPH). La capacità antiossidante è stata
espressi in millimoli di Trolox equivalente (TE)/kg ss.
TPC
For total polyphenol content (TPC) determination, 1.5 g oil was weighed in a test tube, then 2 mL
of hexane was added and vortexed. Subsequently, the mixture was transferred to a 50 mL separating
funnel and a total volume of 5 mL of 60% methanol, split into 1.5, 1.5 and 2 mL, was added. The
methanolic phase was retrieved in a 10 mL tube to measure the recovered volume. TPC in samples
extracted with methanol was assessed with the Folin-Ciocalteu method as described by Yilmaz,
Brandolini, and Hidalgo (2015) using a Du-62 Beckman spectrophotometer (Beckman Coulter,
Nyon, VD, Switzerland). The TPC, in mg gallic acid equivalent (GAE)/kg, was computed from a
reference curve obtained from six gallic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) concentrations
(range: 0–250 mg/L).

Antioxidant capacity
Exactly 2 g of oil was weighed, and 2 mL of n-hexane was added, vortexing until complete
dissolution. Subsequently, 2 mL of 80:20 methanol-water was added and vortexed. The mixture was
centrifuged at 987g for ten minutes. Finally, the methanolic phase (located in the lower part of the
centrifuge tube) and the n-hexane phase (found in the upper part of the tube) were separated, and
their volumes measured.