Osservabili: spettro di emissione

• λecc. fissa.
• λem. variabile.
• F in funzione di λem..
 Rilassamento del solvente
c-Hex DMF EtOH H2O
d = 10 Debye

d = 2.8 Debye

6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene
(PRODAN)
Rilassamento del solvente

4-dimetilammino-4'-nitrostilbene
(DNS)
H, hexane; CH, cyclohexane; T, toluene;
EA, ethyl acetate; Bu, n-butanol.
Rilassamento del solvente

S1
S1’
E Em.
Ass. hν
hν
S0’
S0
 Denaturazione proteica

The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins.

Biophys. J. 1994 66: 482.
 Denaturazione proteica
360
Y63C
Y62D
Y63D
7
2 10 355
Fluorescence Intensity (a.u.)

WT

350
<λ>
7
(nm)
1 10 345

340

0 335
320 340 360 380 400 0 1 2 3
λ (nm) [Guanidinium] (M)

Destabilizing effect of SHP-2 N-SH2 domain pathogenic mutations,

Stella et al., in preparation
 Partizione acqua-membrana
Lipid 365
concentration

Average Wavelength (nm)

Fluorescence (a.u)

360

350 400 0 100 200

Wavelength (nm) Lipid (µM)

Orioni et al., BBA 2009.

KP
Transizioni di fase in membrana
 Transizioni di fase in membrana
DMPC vesicles

0.9

GP=[F(440nm)-F(490nm)]/[F(440nm)+F(490nm)]
6C
24
31
36 0.6
52
Fluorescence (a.u.)

60

0.3

-0.3

-0.6
400 450 500 550 0 20 40 60 80

λ (nm)
Bocchinfuso et al., J. Pept. Sci., 2009 T, °C

Biophys. J. 2000, 78: 290

 Segnale di fondo:
diffusione elastica ed anelastica
della luce
Perché vediamo la luce del laser
anche osservando a 90°?
 Scattering Rayleigh

È una diffusione elastica.

L’energia e la lunghezza d’onda della radiazione vengono conservate.
 1
I∝
λ
4
 Visione classica Visione quantistica

 
μ = αE

•Il dipolo indotto oscilla alla stessa frequenza

del campo applicato.
•Un dipolo oscillante emette radiazione.
•La molecola emette radiazione della stessa
frequenza di quella incidente.
 Intensità (cps)
• Normalmente la diffusione
elastica non crea problemi
perché è alla lunghezza d’onda
di eccitazione (mentre la
fluorescenza è a lunghezze
d’onda maggiori). 300 350 400 450 500

λ (nm)

• E’ dovuta essenzialmente al
solvente (Csolvente>>Csoluto). Si
può sottrarre misurando uno Intensità (cps)

spettro del solo solvente.

300 350 400 450 500

λ (nm)
Diffusione della luce e assorbimento

• Tenere presente λ4 !
Diffusione Raman (anelastica)
Stokes ed anti-Stokes

A T ambiente normalmente la linea anti-

Stokes non si vede.
 Visione classica

Se la molecola vibra, con

frequenza ωm, la sua polarizzabilità
cambierà con la stessa frequenza.

Il dipolo oscillante emetterà a ωp, ωp −ωm,, ωp +ωm.

• L’energia persa dipende dai livelli vibrazionali della
molecola coinvolta.
1 1 ∆EV
− = cost. = ecc. 350 nm
λ0 λ hc
Methanol
Water
Intensità (u.a.)

380 390 400 410

λ (nm)
• La differenza in energia (non λ) tra luce incidente e
diffusa è costante.
1 1 ∆EV ecc. 350 nm
− = cost. = ecc. 400 nm
λ0 λ hc

Intensità (u.a.)

300 350 400 450 500

λ (nm)
 Raman e fluorescenza
• Come la fluorescenza è a lunghezze d’onda maggiori dell’eccitazione

• A differenza della fluorescenza si sposta al variare della lunghezza

d’onda di eccitazione.

• Può essere spostata a lunghezze d’onda diverse da quelle di

emissione cambiando lunghezza d’onda di eccitazione.

• È dovuta essenzialmente al solvente e può essere sottratta.

 Osservabili: spettro di eccitazione
• λem. fissa.
• λecc. variabile.
• F in funzione di λecc..

Se:
unico fluoroforo
Φ indipendente da λecc.
(unico stato eccitato).
A<<1
Allora F(λecc.) ∝A(λecc.)

•Altrimenti: separazione dei diversi cromofori

 λexc=variable, λem= fixed

λexc=510 nm
λem=525 nm

λem=540 nm λexc=480 nm