Riguardo le citochine avevamo detto la volta scorsa che le caratteristiche biologiche fondamentali sono

quelle della ridondanza, del pleiotropismo, della sinergia e dell’antagonismo.

Abbiamo detto per esempio che ci sono dei supset (???1.30min) di citochine pro-infiammatorie, dette di
tipo 1, che stimolano la risposta immunitaria cellulo-mediata, ci sono dei supset(??? 1.37) di citochine anti-
infiammatorie dette di tipo 2 e di tipo 3 che antagonizzano la risposta infiammatoria e tendono a
sopprimerla.

Avevamo parlato del TGF beta e dell’importanza di questo nel caso della tolleranza orale e che ha portato
all’adozione di alcuni protocolli sperimentali che prevedono l’ingestione dell’autoantigene in alcune
malattie autoimmunitarie organo specifiche o sistemiche per bloccare la risposta immunitaria. È importante
capire che le citochine agiscono come ormoni del sistema immunitario , che una citochina lega un proprio
recettore, che quindi c’è una specificità di legame.

Esistono dal punto di vista funzionale quattro famiglie di recettori per le citochine.

Un primo tipo di recettore, il cosiddetto recettore della famiglie delle emopoietine ed è caratterizzato da
due catene nella porzione extracitoplasmatica, in queste due catene possiamo distinguere una parte
prossimale ed una parte distale. Nella parte distale c’è una sequenza aminoacidica composta da triptofano
serina, un aminoacido variabile e poi di nuovo triptofano serina. All’interno della parte citoplasmatica che è
la parte che poi trasdurrà il segnale si lega e attiva il cosiddetto sistema delle tirosinchinasi ed in particolare
del JAK/STAT che la janos kinese, che è un enzima della famiglia delle tirosinchinasi che in seguito all’azione
della tirosina con il recettore determina la dimerizzazione dei monomeri espressi sulla superficie della
cellula e trasduzione del segnale attraverso le fosforilazione del JAK, cioè dell’enzima che è presente nella
porzione extracitoplasmatica delle citochine.

Questo cosa determina?

Determina dei processi di fosforilazione che porta all’attivazione dello STAT (signal transducer and activator
transcription) il quale è un sitema di trasduzione del segnale per cui quando il recettore viene attivato nella
parte extracitoplasmatica dell’agonista si fosforila, determina la fosforilazione dello STAT e, lo STAT intra-
citoplasmatico si dimerizza ( perché è in forma monometrica) e quindi trasloca lo STAT dimerizzato dal
citoplasma al nucleo, al nucleo si lega ad alcuni geni promotori e determina la de-repressione genica e la
trascrizione del gene specifico per quella citochina, quindi una delle caratteristiche biologiche delle
citochine, cioè quella di indurre una funzionalità genica nella cellula bersaglio è raggiunta attraverso il
sistema delle JAK-STAT. Questo sistema che segnale per i recettori di citochine di tipo 1 e di tipo 2 che
hanno una struttura assolutamente analoga a quella dei recettori di tipo 1. Quindi recettori di citochine di
tipo 1, in particolare per citochine che per la conformazione strutturale di questo recettore è adatto a
citochine che si piegano in quattro domini alfa-elica.

Questo recettore di tipo 1 è caratterizzato a livello della porzione extra-citoplasmatica distale ( rispetto alla
membrana) dall’alternanza di residui aminoacidici tirosina-triptofano-serina-X-triptofano-serina.

Il recettore per citochine di tipo 2 ha la stessa conformazione ma manca della coppia e della sequenza di
residui aminoacidici, segnala attraverso il JAK-STAT ed è in particolare utilizzato dagli interferoni.

C’è un altro sistema che è il cosiddetto sistema dei TNF receptor, del quale fanno parte pure il FAS e il CD40
può, a seconda che leghi il TNFreceptor di tipo 1 o quello di tipo 2, indurre fenomeni apoptotici o fenomeni
di sintesi proteica attraverso la attivazione di AP1 (?? 7.17) o dell’NF-KB che sono fattori di trascrizione
nucleari.

Cosa determina che il recettore del TNF di tipo 1 induce apoptosi mentre invece quello di tipo 2 induce
sintesi proteica?

Il fatto che questi recettori si legano a delle proteine adattatrici che nel caso del recettore di tipo 1 sono
chiamate TRAD (tnf receptor associated domain) oppure nel caso del FAD (Fas associated death domain).

Nel caso invece di recettori di tipo 2 che solitamente inducono sintesi proteica attraverso l’attivazione di
fattori di trascrizione di tipo nucleari quali AP1 (AP-one) ed NF-KB determinano l’attivazione del cosiddetto
TRAF ( tnf receptor associated factor ) che sono fattori di trascrizione.

Un'altra famiglia di recettori per le citochine sono quelle che hanno una somiglianza strutturale con i geni
delle immunoglobuline.

Un'altra famiglia di recettori per le citochine segnala in particolare quella per l’IL-1 e dell’IL-18, segnala
attraverso dei recettori che hanno delle analogie strutturali con dei recettori trovati nei batteri che si
chiamano TOLL LIKE RECEPTOR (TLR). In particolare quelli di voi che sono venuti al seminario del professore
Bensen ricordano che il meccanismo dell’autoinfiammazione nasce dal dis-regolazione
dell’inflammosoma(??? 9.02), cioè dalla dis-regolazione dei patogeni che attivano il sistema dell’immunità
innata che segnala attraverso il sistema dei TLR e dei NOD-receptor(??? 9.20). quindi questa segnalazione
dell’IL-1, dell’IL-18 attraverso i TLR è un altro sistema di segnalazione.

Poi c’è un altro sistema di regolazione del tirosin-chinasi che viene utilizzato da altre citochine come il coron
stimulating factor ( ??? 9.37).

Infine c’è un altro recettore per le citochine che è il recettore per le cosiddette chemiochine che sono
citochine ad attività chemio-tattica, cioè la capacità di attrarre le cellule nel sito dell’infezione. Queste sono
dei recettori a sette eliche trans membrana che passano come serpeggiando lo strato lipidico della
membrana cellulare.

Inizio visione vari lucidi

Questo rappresenta quello che ho detto prima:

il primo a sinistra è il recettore di tipo 1 ( dell’emopoietina) coppia di cisteina conservate, nella parte
prossimale della membrana citoplasmatica vediamo la coppia di residui aminoacidici e la trasduzione del
segnale con la coda intra-citoplasmatica che attiva le STAT (signal transducer activator transcription),
vedete che sono due monomeri che in seguito all’azione dell’agonista dimerizzano e soprattutto
permettono la dimerizzazione dello STAT intra-citoplasmatico. Questa catena di attivazione dello JAK/STAT,
siccome tante volte ho cercato di dire che in biologia, in fisiologia, ogni sistema più è importante e più
sottostà ad una regolazione omeostatica, è possibile fisiologicamente che c’è un sistema endogeno che si
chiama in sigla SOX che blocca l’attivazione di JAK/STAT quindi abbiamo un antagonista endogeno, un
regolatore endogeno.

Poi c’è il recettore di tipo 2 che ha fondamentalmente la stessa struttura e segnale pure con lo stesso
sistema di azione ma manca della coppia di aminoacidi.
Poi c’è il recettore per il TNF, il quale è in grado di indurre o sintesi proteica, o apoptosi. Abbiamo detto che
della famiglia del recettore per il TNF fanno parte il TNF-alfa, la Linfotossina, il FAS, il CD40.

Abbiamo quindi i recettori per le immunoglobuline, per conformazione strutturale simile alle
immunoglobuline e poi abbiamo i recettori a sette elica trans membrana che sono recettori per le chemio
chine.

In una condizione patologica sapete come l’HIV lega il suo target cellulare, qual è il suo target?

Il virus dell’hiv a seconda che abbia un ceppo ??? o un ceppo ??? (20-30sec) ha necessità per entrare nella
cellula CD4 infettata di un corecettore che è appunto il recettore per le chemiochine. L’esistenza di questo
recettore per le chemio chine ha permesso di identificare un target terapeutico che sono degli inibitori del
legame del corecettore che sono adesso in terapia clinica.

Abbiamo concluso i recettori per le chemiochine che sono dei recettori importanti per la chemiotassi.

Ora passiamo alla schematizzazione del processo di attivazione di JAK/STAT, quindi il recettore della
citochina lega il monomero, determina la dimerizzazione, questo determina la fosforilazione e
dimerizzazione di STAT che è a livello intracitoplasmatico, da li trasloca nel nucleo dove si lega ad alcune
regioni del promotore e quindi determina la trascrizione della citochina in questione.

Altro lucido

Questi sono i meccanismi di trasduzione del segnale, notate in ultime che la via di trasduzione del segnale
per i recettori delle chemiochine avviene attraverso le proteine G quindi il sistema delle G-protein.

Altro lucido

Questo spiega le due possibilità di segnalazione del messaggio da parte del recettore del TNF che potrebbe
essere un recettore di tipo 1 o 2. Abbiamo visto che nel caso del recettore di morte, cioè nel caso che il TNF-
receptor sia di tipo 1 è più frequentemente associato a delle proteine adattatrici che sono dette proteine
adattatrici di morte ovvero DD che sta per death domain, questo attiva la via dell’apoptosi attraverso
l’attivazione della caspasi 8 e quindi morte cellulare.

Viceversa, nel caso del recettore del TNF di tipo 2 si ha, soprattutto, l’attivazione, la de-repressione genica e
l’attivazione del segnale, perché lega delle altre proteine adattatrici che sono il TRAF che significa tumor
necrosis factor associated factor che attraverso un'altra proteina adattatrice che si chiama RIP (receptor
interactive protein) determina l’attivazione di alcune enzimi, per esempio come le JenKey (pronuncia
7.38min) che attiva l’AP1(??) e da un lato mi determina trascrizione genica e dall’altro un attivazione
dell’NF-KB attraverso la liberazione da parte del suo antagonista endogeno, il suo legatore endogeno che è
IKKB.

NF-KB: fattore di trascrizione nucleare importante nella regolazione della sintesi proteica che si lega ad
alcuni promotori, li attiva e determina la trascrizione. A livello citoplasmatico è legato da una proteina
regolatrice che si chiama IKKB, la sua fosforilazione libererà il complesso NF-KB/IKKB e permette la
traslocazione dell’NF-KB libero nel nucleo e il legame al promotore, e quindi l’induzione della sintesi
proteica.
Discutiamo adesso di una tra le citochine più importanti sia dal punto di vista fisiologico ma anche dal
punto di vista storico. In quanto è stata una delle prime ad essere scoperta che è il fattore di necrosi
tumorale o detto pure TNF-alfa.

È una citochina dell’immunità innata che è importante nella regolazione di processi acuti della
infiammazione è prodotta dal sistema dei fagociti mononucleati soprattutto in risposta ad infezioni
batteriche, da batteri gram- attraverso il legame dell’LPS con il CD14 espresso sulla superficie del recettore
monocitario/macrofagico.

Che funzione svolge il TNF-alfa?

Fondamentalmente, essendo una citochina del sistema dell’immunità innata deve avere la funzione di
accelerare quelli che sono i processi fisiologici responsabili dell’immunità innata quindi:

1. Eliminazione rapida del patogeno, favorendo la migrazione di cellule del sistema dei fagociti
mononucleati al sito di infezione.

Come può favorire la migrazione al sito di infezione?

Per esempio favorendo la trasmigrazione, e quindi per esempio favorendo l’espressione di antigeni che
permettono la segnalazione tra il leucocita e le cellule endoteliali. E quindi una delle caratteristiche del TNF-
alfa è proprio quello di indurre l’espressione di integrine nei leucociti e del loro contro recettore che sono le
selectine nelle cellule endoteliali. Questo permette la trasmigrazione dei leucociti dal torrente circolatorio a
sito dell’infezione.

Dal punto si vista strutturale com’è conformato il TNF-alfa?

È una proteina espressa trans membrana, quindi è una proteina espressa dalla cellula, espressa in forma
trimerica e somiglia ad un tronco di piramide rovesciato. In ognuno dei lati è presente un monomero di
TNF-alfa, il peso molecolare del trimero è di 51, di ogni monomero è di 17.

Abbiamo detto che il TNF-alfa può legarsi a due recettori, il recettore di tipo 1 che ha un peso molecolare di
55 KD ed il recettore di tipo 2 che ha un peso molecolare di 75 KD. Questi recettori in presenza di una
eccessiva risposta infiammatoria vengono clivati dalla superficie della cellula, vengono rilasciati in circolo e
quindi possono essere misurati, sono un indice di infiammazione, un indice di attivazione cellulare ma
servono anche a regolare la risposta al TNF perché legano il TNF circolante e gli impediscono di legarsi al
recettore funzionalmente attivo espresso sulla superficie della cellula bersaglio.

Quindi questo è un ulteriore sistema di regolazione di regolazione del TNF che viene mediato dal clivaggio
di recettori per il TNF nel torrente circolatorio che legano il TNF.

La maggior parte delle azioni del recettore del TNF è svolta attraverso il recettore di tipo 1, tant’è vero che
topi che sono knockout per il recettore di tipo 1 perdono gran parte delle attività biologiche svolte dal TNF-
alfa e dal suo recettore.

Ancora due altre cose importanti sul TNF-alfa.

La prima è che siccome si trova espresso dalla cellula, è una proteina trans membrana espressa dalla
cellula. La cellula che esprime il TNF-alfa, che è un TNF-alfa funzionalmente attivo può in un certo momento
anche senza secernere legare un altro recettore per azione autocrina attraverso un contatto cellula-cellula.
Quindi diciamo che una cellula che esprime il TNF-alfa che incontra una cellula adiacente che ha il
corrispettivo recettore indipendentemente dalla liberazione della molecola può attivare i fenomeni
fisiologici indotti dal TNF-alfa. Paradossalmente se nella cellula stessa produttrice c’è un recettore per i TNF-
alfa e, in particolare, un recettore di tipo 1, può esistere un meccanismo autocrino che porta all’apoptosi
della cellula presentante il recettore.

Per essere liberato dalla cellula, il TNF-alfa ha bisogno di essere clivato da una proteina che si chiama TACE
(tumor necrosis factor converting enzime), la quale è una proteasi che cliva il TNF-alfa e lo libera nel
torrente circolatorio.

Viene prodotto, anche se è una citochina principalmente e caratteristicamente denominata citochina del
sistema dell’immunità innata, non viene prodotta solo dal sistema dell’immunità innata ma anche da quello
dell’immunità acquisita e anche da cellule non proprie del sistema linfo-monocitario, per esempio cellule
epiteliali, osteoblasti, adipociti e cheratinociti. Prodotto in risposta allo stimolo precedentemente spiegato.

Abbiamo detto che i tipi batterici si legano in particolare al CD14 che è un antigene espresso sulla superficie
del sistema monocitario/macrofagico; l’LPS per legare il CD14 ha necessita di legarsi prima con una proteina
carrier che si chiama LBP (LPS binding protein). L’interazione patogeno recettore, in questo caso LPS col
CD14 fa partire una serie di segnali che inducono la neosintesi da parte del fagocita di citochine quali il TNF,
IL-1, IL-6, IL-10 e chemochine che reclutano sul posto ulteriori monociti, ma anche cellule T questa risposta
innata regola le successive risposte immuno-specifiche. A sua volta le risposte immunospecifiche possono
up-regolare o down-regolare la risposta del sistema dell’immunità innata, perché se il sistema
dell’immunità specifica producono più IFN-gamma attivano ulteriormente il sistema dell’immunità innata.
Viceversa se viene attivato il segnale di down-regolazione producono più IL-4 e il sistema dell’immunità
innata tende a spegnersi con riduzione dell’attività del sistema linfocitario-macrofagico.

Uno dei meccanismi farmacologici che è stato studiato per la inibizione (perché abbiamo detto che questa
molecola è importante nei meccanismi di infiammazione, in alcune patologie autoimmunitarie, in
particolare l’artrite reumatoide, la psoriasi e la conoscenza dei meccanismi patogenetici, del ruolo
importante svolto dal TNF-alfa in queste patologie ha permesso di disegnare degli approcci terapeutici che
mirano specificamente a inibire la sintesi o l’azione del TNF-alfa come pensate di poter inibire la sintesi? Si
è pensato in passato, sbagliando, di inibire la sintesi del TNF-alfa andando ad inibire l’azione delle proteasi
che clivavano la molecola dalla cellula; quindi si pensava che se si fosse stati in grado di inibire l’azione del
TACE, cosi non è perché si riduce una quota di azione del TNF-alfa che è quella dell’azione circolante della
molecola ma non si riduce l’azione della molecola che è legata, nella sua forma trans cellulare.

Altra possibilità per inibire l’azione del TNF-alfa è quella di creare degli anticorpi monoclonali che bloccano
questa citochina oppure quella di somministrare dei recettori solubili andando a capire quella che la
fisiologia ci insegna che in corso di eccessiva risposta infiammatoria il recettore del TNF-alfa viene clivato è
liberato in circolazione. Quindi se noi mimiamo quello che ci dice la fisiologia noi potremmo creare
attraverso, per esempio, sintesi ricombinante dei recettori per il TNF-alfa dei recettori che potremmo
somministrare dall’esterno in patologie infiammatorie per inibire specificamente l’azione del TNF-alfa;
oppure potremmo creare degli anticorpi monoclonali che legano il TNF-alfa.

Secondo voi l’azione è perfettamente sovrapponibile?

No, perché per prima cosa il recettore ha un problema di farmacocinetica, è una proteina e come tale ha
una breve emivita e quindi va eventualmente somministrato varie volte ma possiamo aumentare l’emivita
se leghiamo la proteina ad un frammento di immunoglobulina, creiamo quindi una fusion protein che ha un
immunoglobulina legata alla proteina attraverso il suo frammento Fc. Cosi che la fusion protein avrà la
farmacocinetica dell’immunoglobulina e la specificità del recettore solubile del TNF-alfa.

E infatti uno di questi recettori che si chiama ebrei (??? 24.37) è stato approvato per il trattamento
dell’artrite reumatoide e della psoriasi. Stranamente questo tipo di recettore, di fusion protein, è attivo
nella psoriasi, nell’artrite reumatoide ma non è attivo nelle malattie infiammatorie intestinali la retto-colite
ulcerosa e Chron Disease che viceversa rispondono agli anticorpi monoclonali. Ci sono vari tipi di anticorpi
monoclonali che sono utilizzati in terapia, tra cui l’infliximab e l’adalimumab. L’infliximab è un anticorpo
chimerica che quindi ha una parte umana e una parte murina, l’adalimumab è un anticorpo monoclonale
anti-TNFalfa interamente umanizzato. E secondo voi perché può esserci una differenza nella risposta?
Perché le malattie infiammatorie intestinali rispondono ad un anticorpo e non ad un recettore solubile?

Perché gli anticorpi, se ricordate come funziona il complemento, può indurre una citolisi complemento-
mediata, quindi quello che succede è che con l’anticorpo voi andate a bloccare il TNF-alfa circolante ma
andate anche a distruggere e ad uccidere le cellule che sono produttrice di TNF-alfa, viceversa col recettore
solubile voi levate solo il TNF dalla circolazione.

Ad oggi inibitori del TNF-alfa, anticorpi monoclonali o recettori solubili, sono stati utilizzati, approvati per il
trattamento dell’artrite reumatoide, della psoriasi, delle malattie infiammatorie intestinali.

Recentemente è stato dimostrato che, a proposito dell’autoinfiammazione, che alcune malattie

neurodegenerative come per esempio l’Alzaimer, possono riconoscere come meccanismi patogenetici
quello dell’infiammazione e recentemente è stato dimostrato in uno studio di fase 2, quindi in uno studio
con un relativo numero di pazienti, che la somministrazione epidurale di inibitori del TNF-alfa determina un
netto miglioramento delle condizioni cliniche di pazienti con alzaimer il che potrebbe significare che in
pazienti affetti da questa patologia sia attiva una risposta infiammatoria dell’immunità innata ma che poi
può coinvolgere anche l’immunità specifica a livello del SNC, che il TNF-alfa è coinvolto e che se noi
troviamo un sistema per permettere agli inibitori del TNF-alfa di passare la barriera emato-encefalica
possiamo avere un beneficio terapeutico.

Quindi, anticorpi monoclonali e fusion protein.

Vorrei però anche dire, e per me è importante che uno dovrebbe rimanere sorpreso dal fatto che molecole,
citochine che hanno superato la barriera evolutiva, la selezione evolutiva nel corso di milioni di anni stiano
nel nostro corpo soltanto per fare ammalare qualcuno; evidentemente devono avere una diversa funzione
ma la dis-regolazione della loro funzione è patogeneticamente importante, infatti i pazienti trattati con
inibitori specifici del TNF-alfa presentano a lungo tempo una serie di complicanze come suscettibilità alla
infezioni, una riattivazione tubercolare (che viene adesso evitata con un pre-screening del paziente con la
reazione di Mantù per vedere se c’è una passata infezione) cosi come c’è pure un’elevata frequenza e
incidenza di linfomi.

C’è anche un osservazione interessante.

Voi sapete che che noi per registrare un farmaco abbiamo necessità di avere delle dimostrazioni di efficacia
in vitro ed in vivo nella fase sperimentale. Quindi abbiamo necessità che un farmaco per essere registrato,
se noi vogliamo specificamente bloccare il TNF-alfa, sia in grado di inibire la produzione di questa molecola
nelle cellule in vitro e che ci dia dimostrazione di efficacia in vivo in alcuni modelli di malattie
autoimmunitarie. E per esempio sappiamo che gli inibitori del TNF-alfa in pre-clinica erano efficaci
nell’inibire lo sviluppo di artrite reumatoide in modelli animali, erano efficaci nell’inibire la mortalità da
shock endotossico nel topo iniettato con alti dosi di LPS, erano efficaci in alcuni modelli preclinici di psoriasi;
ma non sempre quello che osserviamo in preclinica nel topo, nel ratto, nella scimmia può essere trasferito
all’uomo ed è stato sorprendente anche per non avere un paradigma unico che il TNF-alfa fa solo male e
abbiamo visto un effetto importante di prevenzione di inibitori del TNF-alfa in modelli di sclerosi multipla
umana e viceversa quando abbiamo trasferito gli inibitori in pazienti con sclerosi multipla si è avuta una
esarcebazione della malattia a differenza di pazienti non trattati. E nello shock endotossico dove in
preclinica potevamo ridurre la mortalità dei topi con inibitore del TNF-alfa non si sono avuti gli stessi effetti
quando lo stesso inibitore è stato dato a pazienti con shock endotossico.

Quali sono le azioni del TNF-alfa?

Abbiamo detto che la principale è quella di indurre l’espressione di integrine, leucociti e di selectine
nell’endotelio vascolare per permettere la trasmigrazione.

Il TNF-alfa insieme all’IL-1 beta è il cosiddetto pirogeno endogeno che agisce sul centro di regolazione di
termoregolazione ipotalamica e determina l’innalzamento della temperatura corporea e quindi la febbre.

È responsabile nei fenomeni di cachessia che sono osservabili nel corso di neoplasie.

È in particolare responsabile nella patogenesi dello shock endotossico attraverso vari azioni fisiopatologiche
che svolge a livello …

Per esempio un altro approccio sperimentale che veniva utilizzato per capire il coinvolgimento del TNF-alfa
in patologie sperimentali era quello di determinare l’espressione attraverso un transgene che esprimeva il
TNF-alfa in alcuni siti e per esempio l’induzione della iper-espressione del TNF-alfa nella beta-cellula
pancreatica determinava l’insorgenza di diabete spontaneo. Allo stesso modo, si sono visti alti livelli di TNF-
alfa nei sinoviociti nel liquido sinoviale di pazienti affetti da artrite reumatoide.

La iper-espressione locale di TNF-alfa nei sinoviociti di modelli animali determina insorgenza di artrite
reumatoide.