Neoplasie annessiali degli animali d’ affezione come

modello per il trattamento di neoplasie down-staged dell’

uomo: risultati nel campo dell’ elettrochemioterapia

Enrico P. Spugnini,
DMV, PhD
DACVIM, DECVIM-CA (Oncology)
SSD - SAFU
Istituto Regina Elena-Roma
 Background
• Gli studi farmacologici su colture
cellulari e quelli “ in vivo “
effettuati su modelli murini
possono essere completati
mediante il reclutamento di
animali d’affezione affetti da
neoplasia spontanea.

Chabner BA et al.
 Vantaggi dei modelli
spontanei
• Aspetti epidemiologici
• Aspetti biologici
• Aspetti economici
• Aspetti etici
Epidemiologia dei tumori
canini
• Il cane condivide lo stesso
ambiente dell’uomo ed è esposto
agli stessi carcinogeni.
• I cani non hanno le stesse
abitudini pericolose dell’uomo:
non fumano e non bevono.
• I cani hanno una dieta costante
nel corso della loro esistenza.
Epidemiologia dei tumori
canini
• Incidenza del cancro è 381 casi per
100,000 individui a rischio (300 per l’uomo).
• I cani hanno un breve periodo di latenza tra
l’esposizione ai carcinogeni e lo sviluppo di
una neoplasia.
• Uno studio decennale sul cane genera
altrettanti dati di uno studio di 80 anni
sull’uomo.
( Glickmann L. Epidemiologic Reviews
1999 ).
Epidemiologia dei tumori
canini
• Identificazione dell’esposizione
ad erbicidi (2,4 D) come causa di
linfoma nel cane. (Hayes H. JNCI
1991).
• Identificazione dell’esposizione a
vernici come causa di linfoma nel
cane. ( Gavazza A JVIM 2000).
Epidemiologia dei tumori
negli animali d’affezione
Biologia dei tumori canini
• Il 45% dei cani che vivono fino a 10 anni
od oltre muoiono di cancro.
• Il 23% di tutti i cani riferiti per
necroscopia risultano deceduti di malattia
neoplastica.
• Il cancro è la prima causa di decesso tra I
cani a causa della mancanza di patologie
cardiovascolari da aterosclerosi.
• I cani sviluppano tumori in proporzione
doppia della loro controparte umana.
Biologia dei tumori canini
• I tumori canini hanno un’evoluzione più
rapida della loro controparte umana.
• Il loro “ time course” è sufficientemente
lungo da permettere di confrontare la
durata della risposta ma abbastanza
breve da permettere l’accumulo di dati.
• L’incidenza di alcuni tumori è maggiore tra
i cani.
Biologia dei tumori canini
• I tumori del cane presentano
dimensioni e cinetica maggiormente
simili a quelle dell’uomo.
• I modelli canini sono più flessibili dei
tumori murini per quanto concerne la
raccolta di campioni, approccio
chirurgico e studi di imaging.
Biologia dei tumori canini
• Il reclutamento di pazienti canini
permette una migliore valutazione delle
tossicità di un protocollo antiblastico.
• L’avanzato stato della malattia al tempo
del referral mima la condizione di pazienti
umani down-staged.
• Nel cane sono facilmente monitorabili
numerose sindromi paraneoplastiche; in
particolare la cachessia tumorale.
 Aspetti etici
• Aumentata attenzione volta ad una
maggiore economia degli animali da
laboratorio.
• Maggiore applicabilità all’uomo dei
dati preclinici con ridotta tossicità in
studi di fase.
• Ottenibilità di consenso informato.
• Pet therapy.
 Aspetti economici
• Trials clinici su pazienti veterinari
possono essere completati ad un
costo significativamente più basso di
studi similari su pazienti umani.
• Servizi professionali, patologia
clinica, imaging hanno un costo
molto più contenuto confrontato con
il costo di molti servizi ospedalieri.
 Linee Guida del Veterinary
Comparative Oncology Group
 Razionale
dell’elettrochemioterapia (ECT)
• Tutti i farmaci antiblastici sono
potenzialmente efficaci, a patto che
raggiungano il loro sito d’ azione.
• Il principale ostacolo per farmaci che
hanno un bersaglio intracellulare è la
membrana cellulare.
 Razionale
dell’elettrochemioterapia (ECT)
• Studi in vitro hanno evidenziato che l’
applicazione di impulsi elettrici aventi
adeguata forma d’ onda poteva indurre
la formazione di “pori” nella membrana
citoplasmatica permettendo un flusso
transmembranario di molecole quali
farmaci o DNA plasmidico.
 Chi ha pensato per primo ad
applicazioni in vivo?
• Okino e coll. Hanno trattato ratti
Donryu con xenograft tumorale
mediante la combinazione di
doxorubicina ed impulsi
esponenzialmente decadenti.

(Okino et al. Jp J Cancer 1987)

Cos’è l’elettrochemioterapia?
• Aumentata captazione di farmaci
chemioterapici da parte di cellule
neoplastiche a seguito
dell’applicazione di impulsi elettrici
aventi onda elettrica di forma
opportuna. (Mir e al. Cancer 1991).
Meccanismi di morte cellulare
indotti dalla bleomicina
• Quando penetrano poche migliaia di
molecole, la cellula si arresta in fase
G2-M dilatandosi e diventando
polinucleata, simulando il
comportamento di cellule irradiate
letalmente.

(Tounekti et al. Cancer Res. 1993 )

Meccanismi di morte cellulare
indotti dalla bleomicina
• In seguito alla penetrazione di
numerosi milioni di molecole dopo
ECT, la cellula muore mostrando
dilatazione e dissoluzione nucleare,
cambiamenti suggestivi di morte
apoptotica.
( Tounekti et al. Cancer Res. 1993 )
DC-3F controllo
DC-3F + ECT
DC-3F + ECT
 Onde elettriche usate in ECT
• Onda esponenzialmente decadente
• Onda quadra
• Onda bifasica
Onda esponenzialmente
decadente
Onda quadra
Onda bifasica
 Caratteristiche della ECT ad
impulso bifasico
• Un trasformatore toroidale permette la
generazione di onde rettangolari.
• L’onda primaria viene divisa in due
metà che sono dirette sequenzialmente
per generare un impulso ad onda
bifasica.
• Il trattamento è pressoché istantaneo
ed a bassa morbidità.
GENERAZIONE DI IMPULSI
BIFASICI

tп

t1

t2

3б-4в
 VARIAZIONI INDOTTE DA ECT NELLE
MEMBRANE CELLULARI

Uso di M 14 xenografts per spiegare le alterazioni di

membrana indotte dall’ elettrochemioterapia ad
impulso bifasico.

Spugnini EP, Arancia G, Porrello A, Colone M, Formisano G,

Stringaro A, Citro G, Molinari A.
Ultrastructural modifications induced by “electroporation” on
melanoma xenografts.
Micr Res Tech 2007; 70: 1041-1050.
Un piccolo gruppo di topi è stato usato
in questo studio, alcuni potrebbero
meditare vendetta…
 Controlli freeze-fractured : lato
protoplasmico ed esoplasmico delle
membrane cellulari

Spugnini et al. Micr Res Tech 2007; 70: 1041-1050

 TEM IMAGING DI MEMBRANE
ELETTROPORATE E DI CONTROLLO

Spugnini et al. Micr Res Tech 2007; 70: 1041-1050

Membrane Freeze-fractured dopo
elettroporazione

Spugnini et al. Micr Res Tech 2007; 70: 1041-1050

 Gruppi di ricerca coinvolti
nella elettrochemioterapia
• Consorzio franco-sloveno.
• Alcuni gruppi inglesi, tedeschi ed
americani.
• Consorzio italo-bulgaro
 Perché
l’elettrochemioterapia?
• Necessità di ridurre la morbidità
• Desiderio di trovare alternative alla
radioterapia
• Speranza di far restare disoccupato il
proprio mentore statunitense.
Stomatite radioindotta in un paziente con neoplasia nasale
Desquamazione radioindotta

Cortesia di Dr Ruslander NC Specialists

State of the art in oncologia
clinica
Applicazione of ECT in
oncologia dermatologica
 Perché l’onda bifasica
• Minore dolorabilità post trattamento.
• Ridotto reclutamento di fibre muscolari.
• Migliore porazione delle cellule
neoplastiche grazie al loro allineamento
non omogeneo rispetto al campo
elettrico.
Apparecchio Chemopulse
Elettrodo a calibro
 Studio fase II
• Valutazione dell’ECT in pazienti
veterinari con tumori down-staged.
 Obiettivi
• Individuare neoplasie responsive
• Sviluppare nuovi protocolli
• Testare nuovi farmaci o combinazioni
• Individuare fattori prognostici o
tossicità
• Sviluppare nuovi elettrodi
Protocollo terapeutico fase II
• Bleomicina intralesionale (1 mg/ml)
• 8 impulsi bifasici 50+50 µs
1300volts/cm
 Risultati studio fase II
• Percentuale di risposta: 80%
• Controllo a medio e lungo termine 40%
• Tumori che producono molto collagene
(ad esempio i sarcomi) sono meno
responsivi all’ ECT come unica
modalità terapeutica.
(Spugnini et al. JECCR 2003)
 Evoluzione dell’ ECT
• Testare la metodica in modalità
adiuvante.
• Sviluppare nuovi elettrodi.
• Studiare nuovi protocolli.
• Studiare la risposta di specifici istotipi:
melanoma, sarcomi dei tessuti molli e
mastocitomi.
Sviluppo di nuovi elettrodi
Sviluppo di nuovi elettrodi
Sviluppo di nuovi elettrodi
 Epidemiologia dei
sarcomi
• Gruppo eterogeneo di tumori
mesenchimali che interessa soggetti di
media età o di età avanzata.
• Incidenza 35 per 100.000 cani a rischio e
17 per 100.000 gatti a rischio.
• Non c’ è predilezione di razza o di sesso.
• Simili ai sarcomi di alto grado dell’ uomo
(in particolare il liposarcoma della coscia)
Sarcomi dei tessuti molli
nel cane
• 35/100,000 soggetti a rischio.
• Secondari a trauma, radiazioni, corpi
estranei, impianti ortopedici ed il
parassita Spirocerca lupi (Vascellari
et al. Vet Pathol 2006: STS causato
da microchip).
• Difficilmente curabili con la sola
exeresi chirurgica.
Sarcomi dei tessuti molli
Sarcomi dei tessuti molli
 Istotipi più frequenti
• Fascite nodulare/dermatofibrosi desmoide
infantile.
• Lipoma, lipoma intermuscolare, lipoma
infiltrante.
• Fibrosarcoma
• Emangiopericitoma
• Neurofibrosarcoma PNST
• Rabdomiosarcoma
• Emangioma/Emangiosarcoma
• Sarcoma delle sinovali
Sarcomi dei tessuti molli
ECT per sarcomi del cane

J Exp Clin Cancer Res 2003

ECT per sarcomi dei
tessuti molli
ECT perdei
Sarcomi sarcomi dei
tessuti molli
tessuti molli

Spugnini et al. Vet Rec. 162: 186-188; 2008

ECT perdei
Sarcomi sarcomi dei
tessuti molli
tessuti molli
ECT perdei
Sarcomi sarcomi dei
tessuti molli
tessuti molli
ECT per la terapia di un Sarcoma di
alto grado in un Malinois
• Grado 3, Stadio T4 N0 M0
• Elettrochemioterapia preoperatoria
(2 sedute)
• Chirurgia
• Una seduta di ECT intraoperatoria.
• Paziente in remissione a 2.5 anni
dalla chirurgia (Spugnini et al. Vet
Rec 2008)
 Elettrochemioterapia in 22
cani con STS
• 22 pazienti arruolati in 5 anni
• DFI 730 giorni
• 11 pazienti sono in remissione
• 3 morti per altre cause
• 2 hanno avuto recidiva con amputazione o
eutanasia
• 4 hanno avuto metastasi e recidiva
• 2 sono stati ritrattati dopo recidiva
(Spugnini et al. In Vivo 2007)
Elettrochemioterapia in 22
cani con STS
Sarcomi di alto grado nel
gatto
• Injection Sarcoma: o sarcoma
post vaccinale o sarcoma
infiammatorio del gatto.
Incidenza 1-3,6/10000 gatti a
rischio.
Sarcomi
Sarcomidei tessuti
dei tessuti molli
molli
Chirurgia
Chirurgia
Chirurgia
Chirurgia
Chirurgia
Chirurgia
Chirurgia

E adesso che si fa?

 Chirurgia +
elettrochemioterapia
• 14 gatti trattati con sola chirurgia
• 19 gatti arruolati nella coorte
intraoperatoria
• 39 gatti arruolati nella coorte
postoperatoria
(Spugnini et al. Cancer Chemother
Pharmacol 2006).
Disease-free interval for 14 cats with fibrosarcoma
treated with surgery

Patients %

Time (months)
 Overall control time for 19 Impact of tumor size on the
cats treated with outcome of cats receiving
intraoperative ECT intraoperative ECT
Tumor < 25 cm
Time to recurrence
Mean: 19,05
Median: 16,00
Time to recurrence Tumor > 25 cm
Mean: 14,58 Time to recurrence
Median: 12,00 Mean: 8,00
Median: 5,00
Patients % Patients %
1,0 1,0

0,8 0,8

P=0.004
0,6 0,6

0,4 0,4

0,2 0,2

B
0,0 A 0,0

0,00 10,00 20,00 30,00 0,00 10,00 20,00 30,00

Time (months) Time (months)

Overall time to recurrence for 39 cats treated with
postoperative ECT

Time to recurrence
1,0

Mean: 24,74
Patients % 0,8
Median: 19,00

0,6

0,4

0,2

0,0

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00

Time (months)
Impact of previous treatments on the Impact of tumor size on the
outcome of cats treated with outcome of cats treated with
postoperative
No treatment ECT postoperative ECT
Time to recurrence Time to recurrence
Mean: 33,34 Tumor < 10 cm
Median: 34,00 Mean: 33,13
Previous treatment Median: 46,00
Time to recurrence Tumor > 10 cm
Mean: 14,30 Time to recurrence
Median: 5,00 Mean: 17,13
Median: 10,00

Patients % Patients %

1,0

P=0.0003
1,0

0,8
P=0.0021
0,8

0,6

0,6

0,4

0,4

0,2

A 0,2
B
0,0

0,0
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00

Time (months) Time (months)

Elettrochemioterapia adiuvante
nel mastocitoma canino
• Ha il vantaggio di trattare malattia
residua (minor numero di cellule da
distruggere).
• Migliore distribuzione del farmaco nel
letto tumorale (aiutato dalla
ialuronidasi)
• L’ impulso elettrico non viene
perturbato da tessuto collagene intra e
peri-tumorale.
Elettrochemioterapia per mastocitomi
incompletamente escissi
• Studio di fase II
 Protocollo terapeutico
• Resezione chirurgica marginale o
debulking.
• Inoculazione intraoperatoria o
postoperatoria di bleomicina.
• Elettroporazione con elettrodi a calibro
o ad ago.
• Monitoraggio cardiaco e dell’
ossigenazione.
• Seconda sessione 1-2 settimane dopo.
ECT intraoperatoria
ECT intaoperatoria
ECT intraoperatoria
 Risultati
• 24/28 (85.7% ) pazienti in remissione completa.
• Un paziente con recidiva ha risposto bene ad
un secondo trattamento di ECT (22+ mesi di
remissione).
• Le uniche tossicità sono state edema ed
eritema al sito di elettroporazione.
• Un paziente con un MCT stadio III ha avuto
deiscenza della ferita.
• Tempo medio di recidiva 52.76 6.5 mesi
(intervallo: 39.99 - 65.54 mesi, 95% CI).
(Spugnini et al. Anticancer Res. 26: 4585-4589,
2006).
Deiscenza di ferita
Curva di Kaplan-Meier per il calcolo del
disease free interval in 28 cani affetti da
mastocitoma

Spugnini EP, Vincenzi B, Baldi F, Citro G and Baldi A: Adjuvant electrochemotherapy

for the treatment of incompletely
resected canine mast cell tumors. Anticancer Res 2006; 26: 4585-4589
Mastocitoma labiale
recidivante
 ECT adiuvante per il
mastocitoma: considerazioni
1. Trattamento efficace della malattia
residua.
2. Bassa tossicità.
3. Bassa incidenza di metastasi:
possibile stimolazione del sistema
immunitario?
4. Necessità di valutare il meccanismo di
elettroporazione.
 ECT con CDDP nel trattamento del
mastocitoma canino
• Valutazione dell’ efficacia e della
tollerabilità dell’ ECT adiuvante
utilizzando CDDP.
• Monitoraggio con pulsossimetro e
monitor cardiologico.
MCT grado II trattati con ECT
 Risultati
• 23 cani con grado II e III MCT sono stati
trattati finora.
• 17/23 (74%) non presentano segni di
ricorrenza.
• Media di controllo: 342 giorni.
• Assenza di aritmie cardiache.
• L’ ossigenazione dei pazienti è rimasta
stabile durante il trattamento.
• Assenza di tossicità sistemiche.
• Un paziente con una neoplasia di grosse
dimensioni ha avuto una deiscenza.
• Non si è osservata infiammazione locale.
Curva di Kaplan-Meier per 23 pazienti
con MCT trattati con ECT e CDDP
 Conclusioni
• ECT adiuvante con CDDP sembra essere
efficace nel controllo del MCT.
• I dati preliminari indicano che il CDDP ha
un’ efficacia simile alla bleomicina in ECT.
• CDDP sembra localmente meno tossico
della bleomicina.

Spugnini et al. 1st worldvet cancer meeting. Copenhagen 2008

Sarcoma di Sticker

Modello di chemioresistenza
nel distretto genitale
Patterns di risposta tumorale all’ ECT in
animali d’ affezione: uno studio
retrospettivo
• Il pattern di risposta precoce (dopo 1
sessione di ECT) vede una risposta
infiammatoria acuta mediata da neutrofili,
linfociti e plasmacellule, seguita da estesa
necrosi tessutale.
 Patterns of tumor response
in pets
• Alla fine del trattamento, I campioni tumorali
mostrano una drammatica riduzione della
cellularità, con la maggioranza delle cellule in
apoptosi, senza una evidente risposta
infiammatoria, mentre la maggior parte del
tessuto residuo è composto da tessuto
cicatriziale. In alcuni casi di tumori recidivanti, la
recidiva è risultata essere un istotipo meno
aggressivo (es da sarcoma a neurofibroma).

(Spugnini et al. J Trasl Med 5: 48, 2007)

 Sviluppi futuri
• Sviluppo di nuove apparecchiature e di
nuovi elettrodi.
• Sviluppo di nuovi protocolli terapeutici
investigando farmaci diversi da
bleomicina e CDDP.
• Sviluppo della elettroterapia genica
(promettenti risultati preliminari in
modelli murini).
 ACKNOWLEDGEMENTS
• Prof. Ivan Daskalov, Centre of Biomedical
Engineering, Sofia, BG
• Prof. Alfonso Baldi, II Università di Napoli
• Dr. Gennaro Citro, IRE-Roma
• Dott. Bruno Vincenzi, Università Campus
Biomedico, Roma
• Dott. Giuseppe Arancia, Istituto Superiore di
Sanità
• Prof. Giuseppe Tonini, Università Campus
Biomedico, Roma
• Prof. Nikolay Mudrov, Centre of Biomedical
Engineering, Sofia, BG
• Prof. Ivan Dotsinsky, Centre of Biomedical
Engineering, Sofia, BG
Domande ?