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Lezione 1 del 03/03/2017

Medicina di laboratorio - Prof. Ferraguti

Come analizzare un campione biologico

Definizione: la medicina di laboratorio studia gli effetti della malattia o della terapia sui processi
biochimici delluomo.
Nel corso della patologia ci potrebbe essere un aumento di sostanze presenti in circolo, a data
concentrazione, a causa di vari fattori:
- danno cellulare
- aumento di espressione genica (es. immunoglobulina durante le infezioni).

Quindi attraverso la modifica della concentrazione di queste sostanze nel circolo la medicina di
laboratorio pu valutare landamento della terapia e della malattia.
Per determinare se la terapia riuscita si possono vedere se i parametri alterati sono tornati nella
norma dopo la terapia, o monitorare i livelli del farmaco stesso.
Diventeranno familiari i termini ipo-, iper- (ipoglicemia, iperglicemia o ipocolesterolemia,
ipercolesterolemia), parlando di concentrazione. Degli elementi cellulari studiamo anche il
numero (es. citosi ) e la dimensione (es. microcitosi) .

Quali sono i fluidi biologici presi in analisi?


Es. sangue, feci, urine, versamenti, liquido spermatico ect
Questi fluidi analizzati in laboratorio sono fondamentali per la conferma dellipotesi diagnostica;
attraverso i dati che vengono rilevati dalle analisi si decider ladeguato trattamento da seguire,
per questo che bisogna essere sicuri che i dati di laboratorio siano affidabili.

Le sostanze prese in analisi sono quelle che hanno un ruolo preciso allinterno dei fluidi con
proteine e lipidi;
o Es. ragionamento diagnostico PROTEINE
Numero nel sangue: 60-80 g/l
- Possibili cause aumento:
Processo infiammatorio
Produzione eccessiva da parte delle cellule tumorali
Perdita di fluidi

1
- Possibili cause diminuzione:
ustione
Perdita attraverso intestino
Danno epatico

o Es 2 UREA e CREATININA (azoto non proteico)

- tolte tutte le proteine da un campione, sono le uniche sostanze che presentano azoto
- nelle analisi vanno richieste sempre insieme perch da solo non danno una risposta completa:
lazotemia (urea) molto sensibile ma aspecifica, al contrario la creatinina poco sensibile
(es creatinina alta danno renale ma ci vuole molto tempo)

Cosa vuol dire dosare una certa sostanza allinterno di un liquido biologico?
(Es. determinare numero proteine in un campione)

Il metodo pi usato sfrutta la luce:


- luce visibile: 400 nm 800nm
- Fotometria: si basa sulla misurazione della luce da parte di una particella fotoelettrica;
quindi abbiamo un sistema di rivelazione della luce, trasformando il segnale luminoso in un
impulso elettrico.
MECCANISMO: 1. la luce colpisce un campione biologico
2. a) luce assorbita (assorbanza)
b) luce rifratta (rifrattometria)
c) luce catturata e riemessa in lunghezza donda diversa (fluorescenza)

METODI DI STUDIO

ASSORBANZA
inverso della trasmittanza
Premessa: il colore delle cose che vediamo dipende dalle radiazioni che vengono riemesse:
- nero tutte le radiazioni sono assorbite
- bianco tutte le radiazioni sono riemesse

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Es. se si analizza una soluzione contenente lEMOGLOBINA ci apparir una luce rossa,
perch tutte le radiazioni delle gamma del verde vengono assorbite dallemoglobina; dunque
misurare le radiazioni della luce verde al passaggio nella soluzione equivale a misurare la
quantit di emoglobina presente (misurazione dellassorbanza).
LEGGE DI LAMBERT: afferma che lassorbanza una grandezza direttamente
proporzionale alla concentrazione della soluzione contenuta nel recipiente:
A= *l*C
A= assorbanza
= coefficiente di assorbimento molare
l = spessore della soluzione contenuta nel recipiente
C= concentrazione espressa in M (mol/L)

CURVE DI CALIBRAZIONE
STRUTTURA: dato uno specifico materiale per ogni segnale luminoso avremo una determinale
concentrazione.
Relazione fra un segnale luminoso e la concentrazione dalla sostanza ignota:
a concentrazione ignota, attraverso la misura del segnale luminoso, si pu determinare la
concentrazione confrontando la misura effettuata con la curva di calibrazione.
Per fare una curva di calibrazione bisogna avere una materia pura (di riferimento), dalla quale verr
prodotto un materiale per i laboratori. Arrivata la sostanza viene mischiata insieme a una matrice
(sangue, urine) per renderla pi verosimile ai fluidi biologiche che si andranno ad analizzare; con
questa miscela si andranno a determinare le curve di calibrazione.
COMMUTABILITA': il materiale di calibrazione si deve comportare esattamente come un
campione vero anche cambiando la procedura analitica.

TURBINOMETRIA
1. anticorpi riconoscono una determinata sostanza
2. formano delle sospensioni chiamati immunocomplessi
3. emissione della luce
4. la luce viene deviata
misurazione della luce incidente e della luce deviata

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NEFELOMETRIA
studio della luce deviata a 90
permette di ricavare la quantit di sostanza oggetto di analisi misurando la radiazione
diffusa per effetto Tyndall
EFFETTO TYNDALL: un fenomeno di diffusione della luce dovuto alla presenza
di particelle, di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze d'onda della luce.

FLUORESCENZA
Alcune sostanze si possono legare a degli anticorpi fluorescenti che assorbono una data
energia per poi riemetterla a lunghezza donda diversa.

POTENZIOMETRICO
Studio degli ioni
1. Posizionare due elettrodi: uno di rifermento a potenziale zero e uno per la misurazione
2. Lelettrodo di misurazione lega selettivamente una specie (es. ioni Na+, K+)
3. formazione di una differenza di potenziale tra i due elettrodi
4. attraverso questa differenza applicando lequazione di Nerst si pu determinare la
concentrazione di ogni singola specie ionica.

Quando si pu fare la misurazione?


Se la reazione rapida, la misurazione si pu effettuare alla fine (END POINT)
REAZIONI ENZIMATICHE:
Se la relazione enzimatica il prodotto potrebbe scomparire alla fine della reazione
(A+B = C):
1. STUDIO DELLATTIVITA: (si studia il tempo di reazione) si determina la differenza
della scomparsa dei reagenti e comparsa dei prodotti;
in base a questo di pu determinare la quantit di enzima.
2. STUDIO DELLA MASSA (pi affidabile): individuazione della proteina attraverso un
anticorpo monoclonale in fluorescenza.
METODO PIU' ECONOMICO PER DETERMINARE LA CONCENTRAZIONE DEGLI
ENZIMI ATTRAVERSO LO STUDIO DELLATTIVITA

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SCELTA ESAME APPROPRIATO

ESAME OBIETTIVO
Conoscenza del tipo di esame richiesto
Essere aggiornati sulle novit metodologiche di laboratorio
Rapporto costo-beneficio

Sbobinatore: Cristina He
Revisore: Sara Occhipinti