2.

Le difese antiossidanti
Dal momento che i ROS sono continuamente prodotti in numerosi processi cellulari,
gli organismi hanno evoluto un sistema di difesa antiossidante costituito sia da
componenti non enzimatiche che da molecole enzimatiche.
I sistemi enzimatici maggiormente coinvolti sono rappresentati dalla superossido
dismutasi (SOD), dalla catalasi che agiscono rispettivamente sullO2- e sull H2O2, e
dalla glutatione perossidasi Se-dipendente (GPx), un importante enzima che
decompone i perossidi utilizzando come co-substrato il glutatione. Gli antiossidanti
non enzimatici comprendono varie molecole a basso peso molecolare come
vitamine, composti tiolici. Quando le difese antiossidanti cellulari non sono in grado
di contrastare l'azione dei ROS si instaura nelle cellule un processo noto come stress
ossidativo.

Le difese non enzimatiche

Lipotesi che lo stress ossidativo potesse rappresentare un pericolo per la
sopravvivenza cellulare, venne consolidata dalla scoperta di molecole non
enzimatiche capaci di attenuare e/o bloccare gli effetti tossici dei ROS. Il nome di
scavengers (spazzini), che queste molecole assumono, sta proprio ad indicare le
caratteristiche chimiche alla base della loro azione antiossidante. Essi possono essere
catalogati in due classi principali:

1. Composti tiolici, come il glutatione (GSH) e la tioredossina (Trx), in grado di

agire, direttamente o mediante la catalisi di specifici enzimi, donando
equivalenti riducenti e formando disolfuri.
2. Molecole che possiedono strutture intrinsecamente capaci di delocalizzare la
carica positiva che si viene a formare in seguito alla reazione con il radicale,
come i tocoferoli, lacido citrico, il -carotene e i polifenoli.
Il Glutatione. Il glutatione considerato il principale sistema tampone ossidoriduttivo
cellulare appartenente alla famiglia dei tioli (Gilbert, 1990). Mediamente la sua
concentrazione citosolica dellordine di 1-10 mM (Smith et al., 1996) ed di gran
lunga pi elevata rispetto a molti altri composti redox attivi. Il glutatione partecipa
direttamente alla neutralizzazione dei radicali liberi, che si formano dalla
perossidazione dei lipidi e mantiene gli altri antiossidanti a basso peso molecolare,
come la vitamina C ed E , nella loro forma ridotta, cio attiva, inoltre, attraverso il
processo di coniugazione diretta, detossifica molti xenobiotici. A livello cellulare il
glutatione sintetizzato a partire dal glutammato, dalla glicina e dalla cisteina.
Questultima il donatore del gruppo tiolico (- SH ), responsabile della sua attivit
biologica. Allinterno delle cellule il glutatione si pu presentare: a) sotto forma
ridotta (GSH); b) sotto forma ossidata (GSSG), in cui due molecole di glutatione
sono unite tra loro da un ponte disolfuro; c) come disolfuro misto con proteine (GSS-Prot o GS-SP o GS-R), in cui il legame si instaura tra latomo di zolfo del
tripeptide ed un residuo di cisteina della proteina (Figura 2). La reazione di
ossidazione che porta alla formazione del GSSG mediata dalla glutatione
2

perossidasi (GPx) e da alcune transidrogenasi. La riduzione del GSSG a GSH

invece catalizzata dallenzima glutatione reduttasi (GSSG-Red): un enzima
NAD(P)H e flavina adenina dinucleotide (FAD)-dipendente che trasferisce elettroni
dallNADPH al glutatione ossidato, attraverso il FAD. Per le caratteristiche chimicofisiche e per lelevata concentrazione, generalmente lo stato redox di un sistema
cellulare si calcola prendendo in esame il rapporto [GSH]/[GSSG].
Tioredossina. Quello rappresentato dalla tioredossina un altro sistema redox tiolico
fondamentale nella riduzione dei ponti disolfuro tra le cisteine coinvolte nel legame
al DNA di numerosi fattori di trascrizione, ed inoltre importante nellespressione
genica (Matthews et al., 1992; Okamoto et al., 1992). Le concentrazioni intracellulari
della tioredossina nei mammiferi variano approssimativamente da 1 a 10 M
(Holmgren e Luthman, 1978) e sono quindi da 100 a 1000 volte inferiori a quelle del
GSH. La tioredossina una proteina, a basso peso molecolare (~11kDa), che
normalmente forma ponti disolfuro intra-molecolari. La riduzione della forma
ossidata (disolfuro) a quella ridotta catalizzata dallenzima tioredossina reduttasi
(TrxR), mentre il donatore di elettroni lNADPH (Luthman e Holmgren 1982; Lee
et al., 2000).

Le difese enzimatiche: la superossido dismutasi e gli enzimi operanti a

valle della dismutazione.
La protezione delle strutture citoplasmatiche dal danno ossidativo, avviene
principalmente attraverso lazione delle difese antiossidanti enzimatiche. Il sistema di
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difesa enzimatico costituito dalla superossido dismutasi (SOD), dalla catalasi e

dalla glutatione perossidasi (GPx).
Le superossido dismutasi. Le superossido dismutasi (SOD) sono metallo enzimi che
catalizzano la dismutazione dello ione superossido a ossigeno molecolare e
perossido di idrogeno, attraverso la seguente reazione di ossido-riduzione:
O2+ O2+2H+ H2O2+O2
Sotto questo aspetto, la SOD assume un ruolo centrale nella risposta dell'organismo
alla tossicit dei sottoprodotti metabolici dell'ossigeno. Sono state descritte tre classi
di SOD negli eucarioti, ognuna caratterizzata dal metallo che partecipa al sito attivo:
Cu/Zn-SOD, Mn-SOD e SOD extracellulare (ECSOD) anchessa contenente Cu e Zn.
La prima localizzata nel citosol e nello spazio intermembrana mitocondriale,
mentre, la seconda contenente manganese localizzata nella matrice mitocondriale.
La presenza di questi enzimi stata indicata come indispensabile per proteggere
molti tipi cellulari dai danni indotti dai ROS e da altre forme di degradazione
ossidativa delle cellule.
La Cu,Zn SOD. La Cu,Zn SOD una metallo-proteina che si trova in tutte le cellule
eucariotiche ed in alcuni procarioti. La Cu,Zn SOD riceve il rame dalla ramechaperonina chiamata CCS (Copper Chaperon for Superoxide) che indispensabile
per lincorporazione del metallo nel sito catalitico della proteina (Culotta et al.,
1997). Inoltre, da studi condotti sia in vitro che in vivo stato scoperto che questo
meccanismo di incorporazione del metallo prevede uninterazione proteina-proteina
4

tra la Cu,Zn SOD ed il CCS (Casareno et al., 1998). Studi di cinetica effettuati in
precedenza, avevano dimostrato che il Cu2+, una volta entrato nella cellula in grado
di legarsi al glutatione ridotto, il quale successivamente lo trasferisce alla
metallotioneina (MT) e infine alla Cu,Zn SOD, la quale, quindi, pu ricevere il Cu2+
anche attraverso una via alternativa al CCS (Ciriolo et al., 1990).
La Cu,Zn SOD costituita da due subunit identiche di 16.5 kDa, tenute insieme da
interazioni idrofobiche. Ciascuna delle subunit formata da 153 amminoacidi che
costituiscono una struttura -barrel, caratterizzata da otto catene disposte
antiparallelamente. Da un lato di ogni subunit sporgono due anse non elicoidali,
mentre al lato opposto si trova un sito idrofobico per linterazione tra i due
monomeri. Il sito attivo di ciascun monomero formato anchesso da anse non
elicoidali e comprende un atomo di Cu2+ e uno di Zn2+, legati a ponte dall'anello
imidazolico di un'istidina, lo ione rame inoltre coordinato con altri tre anelli
imidazolici istidinici e il quinto legame occupato da una molecola di solvente
(Rotilio et al., 1972), mentre lo ione zinco , a sua volta, coordinato con altri due
anelli imidazolici istidinici e il gruppo carbossilico di un aspartato, secondo una
geometria tetraedrica distorta. Lo ione rame risulta essere esposto al solvente ed
situato in fondo al canale del sito attivo, mentre lo zinco completamente circondato
dalla proteina (Figura 2.1). Nel dimero i due siti attivi risultano trovarsi in zone
opposte della molecola e sembra che essi agiscano indipendentemente luno
dallaltro. Sono stati effettuati studi sulla Cu,Zn SOD, di pesce spada, dissociata in
urea 8 M, i quali hanno dimostrato che le subunit esibiscono la stessa attivit
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catalitica, sia quando sono associate che quando sono separate (Bannister et al.,
1978). Mentre lo ione Zn2+ sembra avere unicamente un ruolo strutturale, lo ione
Cu2+ partecipa direttamente alla reazione di dismutazione:
1. E-Cu2+ + O2 E-Cu+ + O2
2. E-Cu+ + O2 + 2H+ E-Cu2+ + H2O2
Questo meccanismo consiste di due stadi: nel primo il Cu2+ viene ridotto a Cu+ con
conseguente rottura del ponte istidinico fra Cu2+ e Zn2+ ed ossidazione di un radicale
superossido ad ossigeno. Nel secondo stadio il Cu + cede un elettrone ad un altro
radicale superossido, per produrre, insieme a due protoni, una molecola di H2O2. La
reazione della Cu,Zn SOD con O2 molto rapida ed ha unenergia di attivazione
molto bassa.
Inoltre, la formazione di H2O2 nel corso della catalisi, collega la funzione
antiossidante della Cu,Zn SOD allattivit di altri enzimi antiossidanti quali la
catalasi e la GPx. Dato il ruolo cruciale della Cu,Zn SOD nella protezione contro
lO2, di grande interesse cercare di comprendere come ne venga regolata lattivit
enzimatica.
Gli enzimi operanti a valle della dismutazione. Il prodotto finale della dismutazione
dello ione superossido lH2O2. L H2O2 una delle molecole pi abbondanti fra i
ROS, implicata sia nella morte per apoptosi caspasi-indipendente, sia in quella per
necrosi. I sistemi primari di difesa contro la tossicit dell H2O2 sono quello della
catalasi e della GPx che utilizza il ciclo redox del glutatione (Michiels et al., 1994;
Reed, 1990). In particolare la catalasi un enzima contenente Fe-eme presente
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virtualmente in tutti gli organismi aerobi. Lefficienza di questo enzima alta a tal
punto che nessuna concentrazione di H2O2 in grado di saturarlo (Lledias et al.,
1998). La catalasi converte l'H2O2 in H2O e O2 e compie la sua rapida azione in due
tappe: nella prima fase, una molecola di H2O2 si lega all'enzima e viene scissa, un
atomo di ossigeno viene estratto e legato all'atomo di ferro, ed il resto della molecola
viene rilasciata come semplice acqua. Nella seconda fase, un'altra molecola di H 2O2
si lega all'enzima. Anche questa viene dismutata e l'ossigeno estratto viene combinato
con l'atomo di ossigeno legato al ferro. Infine, viene rilasciata acqua e ossigeno
gassoso:
2H2O2
La GPx, un enzima selenio-dipendente citosolico e mitocondriale che catalizza le
reazioni di riduzione dell H2O2 e degli idroperossidi organici secondo la seguente
reazione:
ROOH + 2GSHROH + GSSG + H2O
In questa reazione, lenzima presenta una specificit per quanto riguarda il donatore
di elettroni (GSH) mentre lidroperossido pu essere rappresentato sia dallH 2O2 che
da qualunque idroperossido derivato dagli acidi grassi, nucleotidi e steroidi.

2.1 Regolazione dellespressione genica della Cu,Zn SOD

La Cu,Zn SOD umana codificata da un gene (sod1) localizzato sul cromosoma
21q22. Questa regione implicata nella pi comune forma di malattia genetica: la
sindrome di Down. In questa patologia il corredo cromosomico risulta alterato dalla
presenza della trisomia del cromosoma 21. I soggetti affetti da questa sindrome sono,
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perci, portatori di una copia accessoria della Cu,Zn SOD che, paradossalmente,
sembra indurre stress ossidativo ed essere responsabile della morte dei neuroni
durante lo sviluppo embrionale e causa del ritardo mentale dei soggetti adulti
(Avraham et al., 1988). E stato, inoltre, dimostrato che la forma familiare di sclerosi
laterale amiotrofica (SLA), una malattia neurodegenerativa, associata ad una
mutazione dominante nel gene sod1 (Rosen et al., 1993). Infatti, la causa della SLA
sembra essere una mutazione definita gain of function (acquisto di funzione) del
gene, piuttosto che un difetto di attivit della Cu,Zn SOD. In accordo con tale
osservazione, topi omozigoti per la mutazione della Cu,Zn SOD (Cu,Zn SOD -/-) sono
vitali e non mostrano sintomi patologici della SLA. Tuttavia, questi topi presentano
unaumentata morte cellulare dei neuroni solo in seguito a ischemia-riperfusione,
suggerendo che la presenza di Cu,Zn SOD indispensabile in condizioni di stress
(Reame et al., 1996; Kondo et al., 1997). Bench lattivit della Cu,Zn SOD sia stata
trovata

alterata

in

diverse

condizioni

come

nelle

cellule

tumorali,

nel

differenziamento delle cellule ematopoietiche (Auwerx et al., 1989), il gene sod1

spesso considerato un housekeeping gene e la sua espressione regolata da una
serie di fattori di trascrizione che riconoscono specifiche sequenze sul promotore del
gene. Differenti analisi di delezione dimostrano lesistenza di parecchie sequenze cisagenti regolatrici posizionate al 5 del gene sod1: la regione del promotore situata tra
i nucleotidi -59/-48 considerata il sito di legame del fattore Sp1, mentre la C/EBP
(CCAAT/enhancer-binding protein ) riconosce la sequenza tra i nucleotidi -64 al -55.
Sp1 un membro di una famiglia di fattori di trascrizione che si legano al DNA,
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caratterizzati da tre domini a dita di zinco che gli permettono di riconoscere sequenze
ricche in guanosina e citosina (Briggs et al., 1986; Lania et al., 1997; Suske et al.,
1999; Yang et al., 2000). Questa famiglia include anche altri membri omologhi a
Sp1: come Sp2 Sp3 e Sp4. Anche C/EBP fa parte di una famiglia di fattori di
trascrizione che include sia regolatori positivi (C/EBP, C/EBP, C/EBP) che
negativi (C/EBP, LIP, CHOP-10). Alcuni di questi fattori mostrano unespressione e
una regolazione tessuto specifica. La regione di 1,5 Kb a cui si legano questi fattori,
pu mediare la transattivazione non solo di Sp1, ma anche del fattore Egr-1 e della
proteina WT1 del tumore di Wilms (soppressore tumorale), suggerendo che lo stesso
sito di legame potrebbe giocare un ruolo importante nel regolare lespressione del
gene sod1, in risposta ad una variet di segnali biologici. Il ruolo della proteina WT1
nella regolazione del gene sod1 non ancora del tutto chiaro, ma sembra che riesca a
stabilizzare p53, inibendo la sua capacit di indurre apoptosi (Minc et al., 1999).
Studi pi recenti, hanno dimostrato che il sito di attacco della proteina C/EBP
parzialmente sovrapposto e coincide con la sequenza a cui si legano Sp1 e Egr-1
(posizioni -59/-48), suggerendo lesistenza di una complessa rete di interazioni tra i
fattori che regolano lespressione del gene sod1 (Seo et al., 1997).
Alcuni di questi fattori di trascrizione interagiscono con la casein chinasi (CK2) che
possiede labilit di fosforilarli su residui di serina o treonina e inattivarli (Pinna,
1997). CK2 distribuita in modo ubiquitario negli organismi eucarioti, la sua attivit
indipendente dalla presenza di secondi messaggeri e, infine, utilizza come donatore
di fosfato sia lATP che il GTP. In molti organismi CK2 esiste sotto forma
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tetramerica con due subunit catalitiche (CK2 e CK2) e due regolatorie (CK2)
(Fauste et al., 2000). Recenti studi condotti in lievito (Saccharomyces cerevisiae)
hanno dimostrato che la Cu,Zn SOD potrebbe influenzare direttamente lattivit della
protein chinasi CK2 attraverso il suo legame con la subunit catalitica CK2,
formando un complesso Cu,Zn SODCK2 di circa 73 kDa. In condizioni di stress
ossidativo, infatti, CK2 viene inattivata dalla presenza della Cu,Zn SOD
permettendo quindi ai fattori di trascrizione come Sp1, di regolare la sintesi di molti
geni tra cui lo stesso gene della Cu,Zn SOD ed i geni che codificano per le proteine
citoscheletriche (Abramczyk et al., 2003; Litchfield et al., 2003).

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