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28/03/14
Ci occuperemo della diagnostica virologica, laltra volta abbiamo parlato di quella batteriologica. Ve la ricordate
Vediamo ora le metodologie c!e vengono usate nella diagnosi delle in"e#ioni virali. $erc!% "are diagnosi $erc!%
abbiamo bisogno di sapere con quale agente e#iologico abbiamo a c!e "are per uneventuale terapia con tanto di punto
esclamativo perc!%, come sapete, per quanto riguarda la virologia la terapia & molto relativa. 'a terapia per la virologia
si limita a un gruppo di virus c!e appartengono alla "amiglia del ((((((((, dell)*V e qualcosa abbiamo pure per
qualc!e virus epatitico, il virus dellepatite C. +on !anno la stessa e""icacia c!e !anno gli antibiotici per i batteri,
lasciano sempre il tempo c!e trovano, in"atti sono a volte accompagnati ad altre sostan#e c!e sono delle
immunomodulatori per potere sopperire alle caren#e c!e !anno questi antivirali. ,uindi un antivirale come, per
esempio, la molecola antesignana contro gli )erpes & l-ciclovir ma gi. i ceppi di virus !erpetico all-ciclovir sono pi/
c!e resistenti, se non lo sono pensate c!e dopo un paio di0 e!m, se "acciamo in vitro un esperimento e mettiamo
questi virus insieme alla dose, c!e poi dovrebbe dare delle indica#ioni terapeutic!e in vivo di -ciclovir, dopo due cicli
replicativi si sele#ionano dei mutanti c!e sono resistenti all-ciclovir. *n"atti ci sono tutti i derivati, cos1 come per gli
antibiotici si cerca di modi"icare le molecole aggiungendo dei radicali pi/ o meno complessi, dei gruppi organici pi/ o
meno complessi anc!e per quanto riguarda gli antivirali esiste questa problematica c!e viene risolta in qualc!e maniera
modi"icando la molecola base c!e sarebbe questo -ciclovir, in"atti c& il $enciclovir, il Vanciclovir e cos1 via0 2a
questo non toglie c!e questi virus, ripeto, acquisiscono "acilmente questa capacit. di resistere allattacco di queste
molecole. $er esempio unaltra terapia usata contro lepatite C & data dallassocia#ione tra la 3ibavirina c!e & una
molecola dallattivit. antivirale sempre molto limitata insieme alla somministra#ione di *nter"eron, c!e & una molecola
biologica per eccellen#a antivirale, quella c!e le nostre cellule "ormano per combattere le in"e#ioni virali. ,uindi si deve
associare sempre qualcosa per potere poten#iare queste""etto. 4i solito questi antivirali sono associati o con degli
immunomodulatori, come l*nter"eron, oppure il bel coc5tail c!e si da contro lin"e#ione da )*V nei sieropositivi, non si
da soltanto l-67 ma unassocia#ione di altri "armaci c!e sempre !anno la poten#iale capacit. di stimolare il poten#iale
ad e""etto dellantivirale stesso mentre per lantibiotico non & cos1, lantibiotico, di solito, se & un buon antibiotico, &
capace di distruggere completamente la replica#ione dei batteri, la moltiplica#ione batterica, meglio parlare di
moltiplica#ione batterica. -nc!e l. c& il problema delle resisten#e c!e non & da sottovalutare, in"atti gi. nei laboratori
si sele#ionano, dicevamo laltra volta, dei ceppi c!e sono multiresistenti perc!% anc!e i batteri si organi##ano in tal
senso per cercare di sopravvivere, quindi si tras"eriscono queste resisten#e, questi meccanismi li avete "atti in
microbiologia e li sapete sicuramente meglio di me. ,uindi "are diagnosi "ormula#ione di ((((((((( e#iologica per
esempio (((((((((((((((((((((( ma di quale epatite 4i un epatite C, di un epatite 8 o di unepatite - ,uindi &
importante sapere con quale tipo di agente in"ettante (((((((((((((. 9e "osse unepatite - & unin"e#ione acuta c!e si
risolve da se, dove non c& neanc!e lantivirale. *l problema pu: sussistere se & unepatite di tipo C, perc!% come sapete
e vi ricordate sicuramente dalla virologia, questo & un virus c!e tende a cronici##are la malattia e quindi levolu#ione
della malattia pu: portare alla cirrosi e al carcinoma epatocellulare e quindi & importante a questo punto c!e i soggetti
c!e sono a""etti da questo tipo di in"e#ione abbiano una terapia mirata. )anno "atto un nuovo "armaco in -merica c!e
per adesso non & in commercio neanc!e in ;uropa, ogni somministra#ione costa mille euro credo se ne "acciano non so
ogni quanti mesi una somministra#ione al giorno, ci vuole una bella ci"ra. ,uanto prima sar. pi/ di""uso e non solo per
una nicc!ia di persone c!e se lo pu: permettere. +on tutti possono permettersi una terapia di questo genere. Ve lo
cercate su internet, vedete pure il nome di questa nuova molecola contro lepatite C. -desso mi s"ugge il nome per:
quello c!e mi !a sconvolta & c!e ogni somministra#ione costasse mille euro, mille dollari. -d ogni modo qui in ;uropa
ancora non & arrivato.
; poi vediamo ancora lado#ione della terapia virale, avevamo detto ((((((((((((((((((, in occasione di epidemie.
<gni tanto non solo in occasione di epidemie ma, come sapete, ogni tanto c& qualc!e microrganismo c!e prima era
silente e c!e diventa di nuovo emergente, me ne viene uno in mente il (((((((((((((((((((c!e non & un virus ma un
batterio ma & la stessa cosa, il concetto & uguale. *l concetto & quello di andare a vedere se compare in una popola#ione
c!e per qualc!e motivo, perc!% per molti motivi si era liberato un certo agente in"ettante, ad un certo punto si ritrova
lagente in"ettante. ,uindi questo agente in"ettante riprende la sua a#ione patogena. Vi "accio un esempio di virus & il
=est +ile Virus c!e !a "atto diversi0 nel nord *talia, in 'ombardia, in ;milia, nel Veneto ci sono state addirittura delle
piccole epidemie locali di questo virus. Virus c!e "ino a qualc!e anno "a non era stato isolato, quindi ci sono sempre
delle in"e#ioni emergenti e sono i cosiddetti casi sentinella sia per quanto riguarda i batteri c!e per quanto riguarda i
virus e se ne ripropongono sempre di nuove.
-llora, andiamo avanti. $arliamo un poco delle tecnic!e, io questanno !o voluto cominciare con le tecnic!e perc!%
pensavo c!e queste "ossero gi. nel possesso0 c!e avevate gi. acquisito nel corso di studio di microbiologia ma poi io
mi rendo conto agli esami c!e poi non & cos1 e allora !o voluto ini#iare con queste tecnic!e prima batteriologice e ora
virologic!e giusto per c!iarirci le idee. $oi man mano c!e parleremo delle in"e#ioni del sistema nervoso centrale
andremo a vedere dove si "a, su c!e materiale si "a, c!e tecnica si usa ma adesso "acciamo un quadro generale di tutte le
tecnic!e c!e abbiamo a disposi#ione, va bene -llora diagnostica diretta e diagnostica indiretta, sapete bene c!e
signi"ica & lo stesso concetto c!e abbiamo gi. a""rontato in batteriologia. 'a diagnostica diretta & quella c!e si pre"igge
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di andare a diagnosticare quale tipo di agente e#iologico c& in quel dato materiale, quindi va a cercare direttamente il
virus nello speci"ico. 'a diagnostica indiretta c!e cosa cerca +on cerca direttamente lagente e#iologico, quindi quel
dato virus, ma cerca gli anticorpi presenti nel siero del pa#iente contro quel dato virus, quindi & indiretta. ,uesta & la
di""eren#a tra diretta e indiretta.
-llora dimostra#ione dellorganismo in"ettato di una risposta anticorpale speci"ica. $er: voi lo sapete bene c!e la
risposta anticorpale speci"ica quando compare 'avete "atta limmunologia no 'immunologia vi insegna c!e se io !o
unin"e#ione acuta, "acciamo lepatite -, mi sono beccata unin"e#ione da epatite - e allora vengo da te e ti dico !o
questi sintomi, tu sospetti0 io ti dico c!e !o mangiato dei mitili crudi e allora tu dici c!e potrebbe essere unepatite -.
Ci siamo 2i state seguendo nelle>cursus -llora c!e cosa mi ric!iedete al laboratorio $otete c!iedere gli anticorpi
+o, perc!% ancora non si sono "ormati. ,uanto ci vuole perc!% si "ormino gli anticorpi Ci vogliono da due a quattro
settimane. ,uindi io poi la mia epatite me la sono risolta e tu non !ai concluso niente e allora c!e cosa "ai Visto c!e
non mi puoi cercare gli anticorpi perc!% ancora il mio organismo non li !a "ormati e poi vediamo come e quanti e quali
si "ormano. 2i "ai unindagine diretta, quindi mi cerc!i questo virus, per esempio, nelle "eci. $erc!% nelle "eci ?
unin"e#ione oro @ "ecale, c!e io !o assunto mangiando dei mitili crudi c!e erano in"etti o delle ostric!e crude o un
qualunque crostaceo crudo o una verdura, uninsalata mal lavata a contatto con materiale c!e conteneva questo virus.
,uindi & unin"e#ione c!e si assume per via orale e quindi dove lo posso cercare Certo non lo cerco nel liquor questo
virus. ,uindi dove lo posso cercare +elle "eci. $ensando alla patogenesi, pensando a come penetra, come si moltiplica
ecc, lo puoi cercare solo l1 o nel vomito se c& il vomito ma & pi/ "acile nelle "eci e quindi tu devi discernere. 9e invece
si presenta da te un signore c!e !a unepatite 8 c!e !a assunto, c!e gi. ce l!a, c!e vuole sapere com& il suo stato e
lepatite l!a avuta dieci anni prima tu cosa gli cerc!i Ali cerc!i solo gli anticorpi Ali cerc!i anticorpi e antigeni. Ali
antigeni non dovrebbe averli ma se ce li !a e quale !a ')8s-g. ; quindi se !a l)8s-g e gli anticorpi li avr.
sicuramente se !a anc!e gli antigeni allora qui siamo in unin"e#ione cronica non acuta. Bna volta c!e cronici##a non si
riacuti##a, & cronica sta l1, pu: evolvere in cirrosi e carcinoma epatocellulare.
9e ci sono gli antigeni ci sono sempre stati, una volta c!e c& e non guarisce ma il virus continua a replicarsi, gli
antigeni sono sempre presenti, non scompaiono mai "orse non gliel!anno mai cercati prima e allora tu devi vedere, ti
riporter. le analisi di prima. 9e prima non gliel!anno mai cercate sicuramente ce le aveva e non gliel!anno mai
cercate, !anno cercato solo gli anticorpi quindi !a avuto a c!e "are con un medico ignorante, arrivi tu e gli risolvi il
problema. $erc!% se cera c& sempre stato, se lantigene non c& pi/ vuol dire c!e il virus non si sta replicando e se non
si sta replicando non si pu: dare unepatite cronica, te la da solamente se resta li e continua a replicare in "orma non cos1
violenta come quando c& la "orma acuta ma si continua a replicare, certo se poi si continuer. a replicare & provato c!e
da lepatite "ulminante e non viene pi/ da te perc!% & gi. morto, va bene questo concetto
-llora andiamo avanti, diagnosi indiretta. C& qualc!e peculiarit. rispetto alla diagnosi indiretta c!e abbiamo visto in
batteriologia perc!% abbiamo a c!e "are con altri microrganismi c!e !anno caratteri ben diversi da quelli dei batteri,
giusto ; quindi vediamo un po, quindi abbiamo detto c!e la diagnosi diretta va a dosare gli anticorpi. 'e prime a
comparire sono le *g2, i primi ma quanto primi Ci vogliono sempre due @ quattro settimane perc!% compaiano.
4opodic!& c!e cosa succede 'e *g2 rimangono presenti circa "ino al secondo mese da unin"e#ione ma questo vale sia
per le batteric!e c!e per le virali, dopodic!& vanno calando ma a quattro settimane dallin"e#ione gi. mi compaiono le
*gA, quindi il potere capire se & in "ase acuta se & in "ase di remissione & importante landamento di questi due anticorpi,
& c!iaro ,uindi prima compaiono le *g2 per: ci vogliono sempre quelle due settimane, due @ una, a volte un po
prima0 *n media, diciamo in media. $oi queste qua vanno calando, in due mesi si levano davanti, circa in due mesi.
$u: essere anc!e in tre, un mese e me##o, dipende. <gnuno risponde in maniera diversa. 4opodic!& se la situa#ione si
risolve le *gA rimangono per un bel po, le *g2 scompaiono, per: le *gA rimangono per un bel po presenti. - volte in
alcune in"e#ioni rimangono presenti per tutta la vita, per esempio, nella maggior parte delle in"e#ioni virali. $er esempio
se io !o avuto il morbillo e non mi sono "atta la vaccina#ione perc!% ai miei tempi non cera la vaccina#ione
antimorbillosa e mi sono beccata lin"e#ione in quanto tale, & ovvio c!e se io oggi mi vado a dosare gli anticorpi
qualc!e residuo di anticorpi *gA ce l!o. ,uindi ce l!o ancora gli anticorpi, nonostante siano passati decenni da quando
!o avuto il morbillo. $erc!% c& una sorta di memoria immunologica, giusto
-llora ecco qua c& il quadro della situa#ione, le *gA permangono per anni, a volte permangono le *gA per tutta la vita.
4iagnosi indiretta quindi dimostra#ione di anticorpi speci"ici della classe *g2 in ogni singolo campione di siero per: se
la dimostra#ione di una sieroconversione, cio& c& il siero c!e prima era negativo e non aveva gli anticorpi Cquesto
signi"ica sieroconversioneD e ora !a gli anticorpi !anno avuto un incremento del titolo anticorpale di almeno quattro
volte in campioni prelevati uno in "ase acuta e uno in "ase di convalescen#a, questo dimostra c!e cosa 4imostra c!e la
malattia, intanto c!e a questa malattia puoi dare un nome perc!% lanticorpo c!e vai a dosare & un anticorpo speci"ico,
giusto ; poi questo & quello c!e avviene nelle prime "asi c!e poi dovrei seguire nel tempo e dipende dallagente
e#iologico c!e !ai davanti se & un virus epatitico o un )*V & c!iaro c!e lo devi seguire nel tempo ma se stiamo parlando
invece di unin"e#ione abbiamo detto per esempio dellepatite - e allora quella & unin"e#ione acuta c!e si risolve
nellarco di venti giorni o anc!e di meno, dipende dalla risposta cellulomediata soprattutto e poi anticorpale del
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soggetto c!e l!a acquisita e quindi vedrai c!e per un bel po rimarranno presenti soltanto le *gA ma poi andranno a
scemare nel tempo. 9e permangono le altre & un campanello dallarme. Vediamo la diagnosi diretta.
'a diagnosi diretta si avvale di alcuni metodi c!e sono strettamente legati alla diagnostica virologica c!e non trovate
nella diagnostica batteriologica e uno di questi & la neutrali##a#ione, ma neutrali##a#ione di c!e cosa -llora io cerco
degli anticorpi neutrali##anti ma c!e neutrali##ino c!e cosa 4ipende dal virus. 9e io voglio "are, per esempio, una
diagnosi per un virus respiratorio sinci#iale e allora questi virus voi lo sapete a quale tipo di "amiglia di virus
appartengono i virus respiratori ? l398, appartiene ai $arami>ovirus. Vi ricordate come sono "atti i $arami>ovirus
allesterno del capside e del pericapside )anno delle agglutinine, vi ricordate 'emagglutinina e la neuraminidasi, ve
le ricordate queste strutture 9ono degli antigeni strettamente virali c!e appartengono sia agli <rt!omE>ovirus, sia ai
$arami>ovirus quindi tutti dallin"luen#a, all398, al $arain"luen#a a tutto quello c!e c& in queste due "amiglie e in pi/
al $arvovirus.
*l $arvovirus c& uno importante e patogeno per luomo c!e & il $arvovirus 81F, ve lo ricordate 'avete "atto in
virologia -nc!e questo !a questa emagglutinina e allora se io devo "are una rea#ione di inibi#ione
dellemagglutina#ione lo posso "are solo per quei virus c!e !anno questa capacit. e questa capacit. di agglutinare le
ema#ia Cquesta & lemagglutin#ioneD & appannaggio di quei virus c!e !anno questi antigeni. $erc!% se io cerco di
emagglutinare un 3inovirus, il 3inovirus appartiene ai $icornaviridae, quindi & un virus nudo e non !a emagglutinine.
Vi ricordate qual & il recettore c!e usa per penetrare allinterno delle cellule ? il virus del ra""reddore comune il
3inovirus. +on !a n% emagglutinina n% neuraminidasi0 'i avete "atti +o0 *l $oliovirus, nessuno vi !a "atto un
cenno ';nterovirus G1, no +iente ; come "accio 'asciamo perdere0
-llora ritorniamo a quelli c!e !anno lemagglutinina, quindi una diagnostica possibile & quella di andare a neutrali##are
questa capacit. c!e !anno questi virus. ,uindi dobbiamo mettere il virus in i globuli rossi, se il virus agglutina i globuli
rossi, bene e questo & un dato di "atto perc!% !a lemagglutinina c!e agglutina i globuli rossi ma a questo punto non !o
capito niente. $er cui se & una rea#ione indiretta, giusto *o devo avere il siero del pa#iente. *l siero del pa#iente
potrebbe avere gli anticorpi antiHemagglutinina perc!%, vi ripeto, questi antigeni, emagglutinina e neuraminidasi, si
trovano in delle (((((((((( di questi virus c!e ci sono allesterno del pericapside e quindi sono le prime cose a
contatto con il sistema immunitario competente e c!e cerca di neutrali##are questo virus, quindi "ormer. anticorpi
neutrali##anti. *o cerco questi anticorpi neutrali##anti nel siero del pa#iente, come 9"ruttando la capacit. c!e !anno
questi0 io c!o gi. il virus in laboratorio, c!o le mie ema#ie, non le mie, c!o le ema#ie (((((( il virus, "accio
questa miscela virus ema#ia e aggiungo il siero del pa#iente ovviamente "ar: delle ((((((((((((((((( .
9e il siero del pa#iente contiene anticorpi neutrali##anti mi dovr. ((((((((((( agglutina#ione, & c!iaro
<ra vi "ar: vedere delle immagini, magari ci torneremo sopra. -llora ora lo vediamo qui in dettaglio questo
meccanismo e poi ci sono anc!e delle immagini c!e vi possono aiutare, non vi preoccupate. 2a oltre a neutrali##are0
e allora questa rea#ione & appannaggio solo di alcune classi di virus ma ce ne sono altre, ad esempio, ci sono dei virus
c!e a contatto con delle cellule in coltura, perc!% voi sapete c!e il virus si moltiplica esclusivamente nelle cellule perc!%
& un parassita intracellulare obbligato e quindi & c!iaro c!e non lo posso coltivare nei terreni c!e si usano in
batteriologia c!e sono dei veleni amor"i sen#a cellule, giusto $erc!% c& agar, sostan#e nutrienti e cos1 via0 devo
usare un substrato di cellule viventi, in per"etta salute tra laltro. ,uindi queste cellule coltivate in vitro se io metto un
virus c!e !a una capacit. di "ormare un e""etto citopatico, si c!iama. ;C$, & un e""etto citopatico e signi"ica c!e se il
virus penetra in questa cellula in qualc!e maniera la modi"ica anc!e mor"ologicamente. ,uindi se era una cellula, per
esempio, "ibroblastica, sono delle cellule allungate e io le in"etto con un virus citomegalico, vi "accio questesempio
perc!% sicuramente mi seguite meglio. Vi ricordate c!e il virus citomegalico c!e si c!iama in questa maniera perc!%
IcitoJ vuol dire cellula e ImegaloJ grosso e virus, o5 9igni"ica c!e questo nome gli & stato dato proprio dalle""etto
citopatico c!e provoca sulle cellule in coltura, vi ricordate le cellule a occ!io di civetta 4a qualc!e parte c& scritto
cos1, a occ!io di gu"o, a occ!io di civetta. $erc!% queste cellule si ingrossano, si "ormano delle grosse inclusioni. ,uindi
questi virus, tipo l)erpes, per esempio, l)98 pu: "ormare dei sinci#i bellissimi, lo stesso virus respiratorio sinci#iale
pu: "ormare dei sinci#i. ,uindi diciamo c!e ogni virus crea un danno alle cellule in coltura c!e se non "ossero state
in"ettate allora avrebbero un aspetto e c!e se invece sono in"ettate cambiano completamente mor"ologia. *ntanto si
vanno arrotondando e poi siccome queste cellule c!e si usano per "are questa diagnosi sono delle cellule in linea
continua, queste cellule vengono coltivate in delle "iacc!e particolari per colture cellulari e si possono osservare al
microscopio c!e & un invertoscopio. 'avete sentito sicuramente in biologia, in microbiologia. 'invertoscopio & un
microscopio al contrario dove la luce non viene dal basso ma viene dallalto.
-llora voi potete addirittura mettere lintera "iacca, sono delle "iacc!e di plastica con un tappo dove c& un terreno
liquido ricco di nutrienti per coprire questo strato di cellule c!e poi se noi dobbiamo inoculare con un )erpes, il liquido
di una vescicola c!e & stata presa o dal volto o dai genitali dobbiamo vedere se c& in e""etti questo virus, lo
aggiungiamo a queste cellule, se la mor"ologia di queste cellule cambia, e ora vi "accio vedere degli esempi c!e !o delle
belle immagini, quella & la presen#a delle""etto citopatico del virus ma non & su""iciente c!e io possa dire & tale virus
perc!% vedo solo una diversa mor"ologia cellulare. $er potere dire &, intanto mi da unindica#ione, mi dice c!e c& il
virus. $oi io queste cellule le posso anc!e trattare con degli anticorpi monoclonali "luorescenti, per esempio. ; allora
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metti c!e lanticorpo monoclonare & contro il citomegalo virus, questa cellula in"ettata dal citomegalo virus assume una
colora#ione particolare c!e allora io dico &0 mentre se io metto il monoclonale per l)erpes, l)erpes di tipo 1 o di
tipo 2 o 3, quello c!e volete, non succede nulla quindi non c& "luorescen#a. ; allora io dico bene, allora sicuramente
siamo di "ronte a unin"e#ione citomegalica. ,uindi gi. !o avuto lindica#ione della mor"ologia particolare di queste
cellule, citomegacellule, va bene Arosse, sembra c!e abbiano due occ!ioni, poi in pi/ gli aggiungo lanticorpo
monoclonale c!e pu: essere "luorescente e allora vedo la "luorescen#a o c!e mi da unaltra0 di solito &
unimmuno"luorescen#a.
,uindi vedete la neutrali##a#ione deve essere quellanticorpo c!e io cerco c!e mi va a neutrali##are o queste""etto,
perc!% ovviamente io "ar: dei controlli. Controllo con il virus sicuramente di cellule sicuramente in"ette, controllo delle
mie cellule c!e !o coltivato con la vescicola e poi vedo la di""eren#a. ? c!iaro c!e uno sar. negativo e laltro sar.
positivo, giusto 9e c& il virus, se non c& sono tutte due negative. $erc!% "acciamo sempre dei controlli positivi e
controlli negativi. * controlli sicuramente (((((((((( ma quelli servono per comparare il risultato ed essere certi del
dato c!e si d..
3itorniamo a noi, quindi & inibi#ione dellemoagglituina#ione per quei virus c!e !anno lemagglutinina, inibi#ione per
e""etto citopatico, ;C$ sta per e""etto citopatico, per quei virus c!e danno (((((((((((((((( . ((((((((((
((((((((((( locali##a#ione ma poi per essere certi dellinibi#ione delle""etto citopatico devo ulteriormente ri"armi a
unimmuno"luorescen#a o un test0 sono poco usati per evitare di usare radioattivi si tende oggi a non "are pi/ un test
3*- in nessun settore dellanalitica per evitare di ulteriormente inquinare lambiente con radioisotopi. ; poi per
esempio i test immunoen#imatici ;'*9- di cui abbiamo parlato ampiamente laltra volta ed & limmunoblot, di cui
abbiamo parlato anc!e laltra volta, vi ricordate -llora ora vediamo pi/ nel dettaglio, ecco lemagglutina#ione &
lagglutina#ione dei globuli rossi da parte di virus, ma da quali virus ,uelli c!e !anno lemagglutinina altrimenti non
possono agglutinare. ; allora vedete, c!e cosa c& 3edblood quelli sono gli anticorpi, quello & il virus, si "ormano
questi ponti di legame "ra gli anticorpi e il virus e avviene unagglutina#ione c!e ((((((((((.
4iamo per scontato il "atto c!e il virus e i globuli rossi e c!e quei dati virus con i globuli rossi agglutinano. +ella
nostra miscela quindi dobbiamo avere le dilui#ioni scalari del siero in esame c!e non sappiamo se !a questi "attori,
questi anticorpi inibenti lemagglutina#ione. -bbiamo una quantit. standard di virus c!e emagglutinano. Cio& il virus
non & del pa#iente, il virus ce l!o io in laboratorio e so c!e ne devo mettere un tot e poi abbiamo0 quindi mettiamo
una quantit. standard di virus e la sospensione di globuli rossi. <vviamente nel siero abbiamo detto dilui#ioni scalari
me se guardate sotto anc!e se limmagine & un po0 nella parte, se guardate in questa parte della diapositiva, vedete
qua ci sono le varie dilui#ioni del siero e in particolare qui c& una dilui#ione 2 4 8 1K K4 128. ,ueste sono dilui#ioni
a raddoppio del siero c!e vogliamo esaminare. ; allora vedete un po alla "ine io devo dire a te medico c!e vieni da me
in laboratorio ti devo dire quanti anticorpi !a questo e come lo esprimo 4evo dare un titolo, il titolo signi"ica c!e
corrisponde alla quantit. di quella cosa. Bn titolo di anticorpi corrisponde a un valore c!e si dice & alto, & basso. ,uesto
& il titolo, non & il titolo nobiliare ma & il titolo0 quindi ogni titola#ione virale o anticorpale equivale a un numero e il
numero in questo caso & il titolo degli anticorpi emagglutinanti, la pi/ alta dilui#ione di questo siero signi"ica c!e
contiene meno, man mano c!e lo diluisci, c!e contiene meno anticorpi agglutinanti, giusto ,uindi & la pi/ alta
dilui#ione del siero capace di prevenire lemagglutina#ione, questo & il titolo c!e poi si da, vi & c!iaro 9e non vi &
c!iaro lo ripetiamo.
-llora, vieni tu nel mio laboratorio e vuoi "atto un titolo anticorpale di anticorpi antiagglutinanti allora io devo sapere
ma scusami c!e cosa testo 7u mi dici !o avuto una "orma simil in"luen#ale, non so bene ecc e allora io cosa penso
$enso ai virus c!e !anno lemagglutinina, se penso ai virus c!e !anno lemagglutinina se tu !ai avuto uno di questi
virus, un parain"luen#a, un parvovirus avrai nel tuo organismo gli anticorpi quindi io vado a cercare i tuoi anticorpi.
+on cerco altro, prendo il tuo siero e cerco gli anticorpi, tu mi dai il tuo siero e te ne vai dal laboratorio. -llora io ti
dovr: dare un titolo a questo siero, ti devo dire il tuo siero !a un milione di unit. emagglutinanti0 c!a dieci unit.
emagglutinanti0 non ne !a, ti sei sbagliata. <5 ,uando io !o a disposi#ione questo siero, questo siero dovr.0 cosa
cerco nel siero sono gli anticorpi antiagglutinanti ma io per vedere tutto questo devo avere a disposi#ione qualcosa c!e
agglutina, giusto C!i & c!e agglutina -bbiamo detto i globuli rossi e i virus. ,uindi io !o il virus della parain"luen#a,
il virus dellin"luen#a e mi "accio questa sorta di0 e!m0 mi preparo tutte queste provette, poi preparo il tuo siero e lo
voglio testare sia contro il virus in"luen#ale, sia contro il virus parain"luen#ale. 2e lo voglio testare contro diversi virus
ma mettiamo c!e per "are le cose pi/ semplici voglio cercare il virus dellin"luen#a, voglio sapere se tu !ai un titolo di
anticorpi emagglutinanti contro il virus dellin"luen#a perc!% se ti "accio pi/ ci con"ondiamo, "acciamo uno solo. -llora
io !o nel mio laboratorio in una provetta, congelato il virus in"luen#ale. *n unaltra provetta, nel "rigori"ero in questo
caso perc!% non lo posso congelare e scongelare perc!% si spaccano i globuli, c!o i globuli rossi. -llora prendo dal
congelatore il virus c!e so gi. quanto ne !o per ml e allora "accio una bella miscela in questi po##etti, una micropiastra
con tanti po##etti e metto tot virus, tot globuli rossi e tot siero tuo. *l tuo siero per: non lo saggio cos1 com&, "accio
tante dilui#ioni. ,uindi per ogni dilui#ione del tuo siero "ar: un po##etto, allora se il tuo siero c!a gli anticorpi
lagglutina#ione c!e "a 2e la inibisce lagglutina#ione, no $erc!% & un siero c!e contiene anticorpi antiagglutinanti e
quindi vuol dire c!e ti sei beccata lin"luen#a e io lo sto vedendo con questa rea#ione, mentre se tu non ti sei beccata
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lin"luen#a e io metto l1 il virus in"luen#ale, !o messo le ema#ie, sto mettendo il tuo siero. *l tuo siero non contiene
niente, queste ema#ie c!e "anno -gglutinano, se no non agglutinano e allora vedete c!e la di""eren#a "ra il bottoncino e
il non bottoncino, o5 ora $erc!% io sono pronta a ripeterlo anc!e trenta volte, giusto per a""liggervi. Vi & c!iaro
;cco qua cera questimmagine c!e era pure meglio per la mia spiega#ione comunque questo & un riassunto delle
puntate precedenti, guardate qui gli anticorpi, gli anticorpi dal siero del pa#iente abbiamo detto ((((((((((( i virus.
Vedete c!e lanticorpo reagisce col virus quindi saturando0 questi antigeni virali c!e sono le agglutinine, lema si
c!iama nello speci"ico emaglutinina per questo motivo perc!% agglutina i globuli rossi se no lavrebbero c!iamata in
unaltra maniera. +eutrali##a gli anticorpi o neutrali##a il virus quindi non si pu: avere lagglutina#ione. $osso andare
avanti
,uesto & l C!emo"ol mE>ovirusD la stessa cosaL siero del pa#iente addi#ionato allemagglutinina del virus in"luen#ale,
questo & lesempio c!e abbiamo "atto poco "a e quindi positivo per lemagglutina#ione perc!% c& stata una rea#ione "ra
lanticorpo e il virus, negativo vuol dire c!e non cera lanticorpo speci"ico. 'a presen#a di anticorpi speci"ici
antiemagglutinina, attivit. derivante dei globuli rossi & inibita. 9e invece in assen#a di anticorpi speci"ici
antiemagglutinina lattivit. derivante dei globuli rossi & rilevabile. 38C sono 3ed 8lood Cell. 3icerca di anticorpi
neutrali##anti, test di neutrali##a#ione per virus ad esempio $olio, ecco questesempio "orse non & cal#ante visto c!e mi
avete detto c!e il virus $olio non lavete studiato0 in questo caso quindi c!e cosa neutrali##iamo *l virus $olio & un
$icornavirus, quindi ce n!a emagglutinine Ce n!a o non ce n!a Ve lo ricordate com& "atto, per esempio, il virus
dellepatite - $ure quello & un $icornavirus. *l 3inovirus c!e & il virus del ra""reddore, sono dei virus nudi non !anno
pericapside, quindi queste agglutinine di solito c!i ce l!anno Ce l!anno quei virus c!e !anno il pericapside, avevamo
detto <rt!o, $ara0 giusto ,uindi io qua il virus $olio c!e cosa gli posso neutrali##are Ali posso mai "are una
rea#ione di emagglutinoinibi#ione per scoprire se !a gli anticorpi +o, non avrebbe senso.
; allora c!e cosa posso neutrali##are invece dellemagglutina#ione, le""etto citopatico e quindi i virus c!e danno un
e""etto citopatico, quindi c!e coltivati su delle cellule danno questo cambiamento visibilissimo della mor"ologia
cellulare possono essere0 questo pu: essere s"ruttato per "are diagnosi. ,uindi andiamo a neutrali##are, in questo caso,
non pi/ lemagglutina#ione ma andiamo a neutrali##are le""etto citopatico.
,ualc!e cellula vera0 (((((((((((((((((( . ,ui ci sono le "iasc!e, queste "iasc!ette, in queste "iasc!e si coltivano
le cellule, vedete quel liquido ((((((((((( , quello & un liquido, un terreno di coltura per le cellule perc!% &
abbastan#a ricco di diversi componenti.
;cco, per esempio, vedete in questimmagine & un po s"ocata si per: rende lidea. +ella parte superiore dellimmagine
c& mostrato come & possibile osservare al microscopio invertito o invertoscopio c!e dir si voglia, quella "iasca c!e
abbiamo visto prima, poi si osserva0 non & colorata, quindi per questo !a questa sorta di colorino marroncino, & stato
"atto apposta il contrasto per "arvelo vedere. +on sono colorate queste cellule, quindi si vedono i contorni, vedete c!e i
contorni delle cellule & lo stesso tipo di cellula prima dellin"e#ione virale e sotto dopo lin"e#ione virale. Vedete c!e le
cellule0 -llora sopra abbiamo uno strato di cellule, sotto vedete le stesse cellule, vedete c!e sono pi/ scure c!e sono
arrotondate e c!e ci sono delle #one in cui si sono gi. staccate le cellule dal supporto della plastica. ,uesta & una
plastica dove crescono0 & una plastica particolare c!e !a una particolare carica ionica e dove queste cellule possono
aderire pi/ "acilmente. ? particolarmente trattata, ovviamente tutto & sterile, altrimenti se ci "osse unin"e#ione batterica
non si capirebbe pi/ nulla. ,uindi questo c!e vedete qua, ed & realmente quello c!e si vede al microscopio & la
tras"orma#ione mor"ologica di un monostrato di cellule in seguito a in"e#ione con il virus. <ra qua c!e virus !anno
usato non lo vedo0 Bn ((((((((((((((( a! quindi proprio ci siamo, era quello c!e vi volevo dire e siamo qua.
-llora in queste immagini quelle specie di macc!ie rosa c!e vedete sarebbero le cellule. $ositivo o negativo, c!e cosa
signi"ica 9tiamo cercando di neutrali##are0 allora io c!o, al solito, il siero del pa#iente, questo siero del pa#iente con
c!i lo metto a contatto Con il virus, "accio una bella miscela. 'i tengo a contatto per almeno unoretta, per cui il virus
se c&, lanticorpo si lega al virus. $oi piglio questa miscela e la metto sulle cellule, se le cellule mi si in"ettano signi"ica
c!e non cerano anticorpi, giusto ? al contrario, se si in"ettano non cerano gli anticorpi neutrali##anti. 9e invece le
cellule c!e "anno +on si in"ettano, c!e cosa signi"ica C!e ci sono gli anticorpi c!e !anno neutrali##ato il virus e
quindi non gli !anno "atto espletare questa sua capacit. di "ormare un e""etto citopatico. ? c!iaro
*l $olio l!o maneggiato molte volte, intanto perc!% sono vaccinata0 ((((((((((( ci sono delle prote#ioni
particolari, ci sono delle stan#e particolari in cui non si lavora su un bancone, si lavora in delle cabine sterili. 9ono delle
cabine appunto verticali dove ci sono una serie di "iltri c!e prendono laria e la "iltrano continuamente, sia per
proteggere il materiale, sia per proteggere loperatore. 2a ci sono delle cabine dove si pu: "are ricerca, per esempio, per
l)*V & c!iaro c!e devi avere particolari0 allora ci sono, c&0 queste cabine con questi "iltri tu non li vedi i "iltri, senti
solo questo "lusso daria continuo, poi c!anno davanti un cristallo molto spesso, due "ori in questo cristallo, ci sono dei
guanti, dei guanti lung!i "in qua. ,uindi tu metti il braccio, in"ili questo guanto, metti laltro braccio. 2etti gi. i guanti
per i "atti tuoi e poi ci metti ((((((((((( e lavori sotto questa cappa, poi questa cappa dove lavori, di lato c& una
sorta di sca""ale, diciamo cos1, dove tu in questo sca""ale puoi intanto prendere il materiale da "uori, per esempio a me
serviva il terreno c!e devo coltivare l)*V, devo vedere se in"ettava delle cellule lin"oidi, per esempio dei lin"ociti 7.
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C& una linea molto comune c!e si c!iama Mur5at. 9ono dei lin"ociti derivati da un lin"oma umano. <ra tu sai benissimo
c!e l)*V si replica dove su lin"ociti, soprattutto si replica sui lin"ociti. *n"etta pure i macro"agi e si replica pure sui
macro"agi ma pre"eren#ialmente sul macro"ago tende a integrarsi, giusto 2entre per replicarsi pre"erisce replicarsi sui
lin"ociti 7, si integra anc!e l1 per carit. per: tende di pi/ a0 quindi se devo vedere se si moltiplica io uso delle cellule
7. 9iccome ci sono delle colture cellulari di cellule 7, ci sono di tante cose, ora se abbiamo il tempo se parliamo se no
continuiamo poi la c!iacc!ierata perc!% se vi interessa...
9e io !o bisogno quindi della "iasca, di una "iasca pulita, del terreno. 'e metto in questa sorta di armadietto,
questarmadietto dentro gira su un perno. 9ai quegli armadi da cucina c!e tu li "ai girare e ce l!ai sempre a
disposi#ione ;ccoN $i/ o meno quelle (((((((( . ,uindi tu prima di in"ilare le braccia ti prepari tutto quello c!e ti
serve, il materiale dentro questa sorta di armadio, c!iudi lo sportello, ((((( sotto la cappa, apri laltro sportello dove
c& sotto la cappa e tiri "uori le tue "iasc!e, il terreno, tutto quello c!e ti serve, quello c!e !ai messo prima, le pipette, le
provette0 quindi sei protetto. +on solo ma queste stan#e dove si trovano queste cappe particolari c!e sono ((((((((
1, 2 e 3, cio& a seconda di quello c!e maneggi. 9e maneggi cose molto pericolose devi andare nella cabina pi/0 c!e !a
questi requisiti di prote#ione sia delloperatore c!e del materiale c!e stai maneggiando. 2entre se tu maneggi, c!e so, la
8rucella oppure, c!e ne so, il $olio0 io il $olio lo maneggio molto cos1 perc!%0 ora non ce labbiamo pi/ perc!% ce
l!anno "atto distruggere una decina di anni "a. 7utti i laboratori sono stati invitati a distruggere il virus $olio perc!% si
era pensato c!e non cera pi/ la $oliomielite, an#i oggi tendono pure a non vaccinare pi/, sbagliatissimo secondo me.
7ra laltro c& un vaccino virus ucciso c!e & il vaccino di 9al5 c!e & innocuo e quindi si pu: usare0 pensate c!e io
sono stata vaccinata con il vaccino di ((((((((((((( c!e era un vaccino a virus vivo, #ucc!erino, goccina, #ucc!erino
e0 ci sono stati dei problemi per alcuni con quel tipo di0 perc!%0
9iccome stiamo parlando di un $olio, come si piglia unin"e#ione poliomielitica ;satto & un enterovirus e quindi se io
piglio quello nel braccio & quello a virus ucciso ma se io prendo un virus vivo devo "are lo stesso percorso del virus
in"ettante. *n"atti limmunit. c!e dava la vaccina#ione di 9abin non aveva nulla a c!e "are con limmunit. c!e da quello
di 9al5 per: siccome in quello di 9abin c!e era a virus vivi, questo virus c!e era vivo e attenuato quindi aveva perso la
capacit. neurotropa, si moltiplicava lo stesso nellintestino. *l problema "u c!e a distan#a di 48 ore le "eci di queste
persone c!e erano state vaccinate ((((((( con il vaccino di 9abin si ritrovavano dei virus virulenti non pi/ attenuati e
quindi una distra#ione igienica, soprattutto in un bambino & possibile, poteva intanto in"ettare gli altri abitanti della casa
o un "ratellino o una sorellina. 9uccesse qualcosa del genere, in"atti, proprio perc!% successe una cosa del genere si
scopr1 la pericolosit., ripeto, era quella c!e questo virus "aceva tutto questo percorso e si rinvigoriva, da attenuato c!e
era, perc!% si attenuava con non so 24 o 2O passaggi in colture di cellule, perdeva il potere neurotropo, quello & il
problema perc!% il virus ad un certo punto va a colpire le corna anteriori del midollo spinale (((((((((( pi/ o meno a
seconda dove colpisce la paralisi pu: essere degli arti in"eriori, degli arti superiori, poi pu: essere bulbare e a quel punto
muori pure. ,uindi questo vaccino vivo era stato attenuato con questi passaggi in colture cellulari. *l problema "u c!e
nelle "eci si ritrov: questo virus, nelle "eci delle persone c!e erano state vaccinate e quindi potevano essere "onte di
in"e#ione per altri. <ggi non si "a pi/, si "a il vaccino di 9al5 e si "a la punturina sottocute ed & un virus ucciso col
"ormolo o col calore,,, no col "ormolo credo c!e sia stato ucciso. ,uindi & pi/ sicura perc!% non ci pu: essere una
riattiva#ione perc!% essendo ucciso il virus c!e cosa uccide di questo virus )anno ucciso la sua capacit. di replicarsi e
!anno ucciso la sua capacit., dellacido nucleico c!e nello speci"ico & un 3+- positivo a "ungere da messaggero e
innescare la replica#ione virale. ,uindi non c& questa possibilit. nel 9al5, non si pu: riattivare una cosa morta. $er cui
c!e cosa "un#iona Pun#iona come evocatore di una risposta immune il capside perc!% pericapside non ne !anno, il
capside di questo virus. ? c!iaro
3itorniamo a noi, quindi questo virus0 virus c!e tra laltro e!m0 nei paesi industriali##ati, non voglio usare altre
parole, & scomparsa questa malattia per: pare c!e ci siano dei "ocolai non nei paesi industriali##ati ma nei paesi del
ter#o mondo. <ra con tutta questa circola#ione umana c!e cabbiamo oggi e questa grande accoglien#a c!e abbiamo
oggi, perc!% noi siamo molto accoglienti e accogliamo tutto ci accogliamo pure queste cose. ,uindi dobbiamo stare un
po cos1 con gli occ!i sbarrati, stare un po pi/ attenti a vedere ((((((( sentinella. $erc!% se ci siamo importati la
si"ilide gra#ie a0 c!i ce l!a portata la si"ilide 'a si"ilide "ino a dieci anni "a cavevamo qualc!e caso di si"ilide ((((
((((( c!e continuava a essere positivo. <ra la si"ilide !a avuto un revival meraviglioso, stupendo. *n pi/ ci siamo
ritrovati ad avere ancora qua da noi non ci sono stati casi diagnosticati ma in *talia in altri posti si, quellultima
)aemop!ilus ducreEi non cera, non esisteva da noi era appannaggio di -merica del 9ud, di #one del continente
a"ricano ma vi rendete conto c!e0 ci siamo beccati, giusto per non lasciare nessuno "uori, ci siamo ribeccati, c& stato
un altro revival di tubercolosi c!e & endemica nello 9ri 'an5a, & endemica in *ndia, & endemica in quei paesi. ,uindi &
c!iaro c!e tutta questa circola#ione c!e ci arricc!isce moltissimo, ci arricc!isce soprattutto dal punto di vista culturale
sicuramente ma non riarricc!isce dal punto di vista delle malattie e "a parte del gioco, quindi ci sono i pro e ci sono i
contro. 8isogna tenerli in giusta considera#ione.
-ndiamo avanti, qui vi "a vedere assenti e""etto citopatico, anticorpi neutrali##anti, se sono presenti gli anticorpi
neutrali##anti e assenti ovviamente le""etto citopatico. 9e invece gli anticorpi neutrali##anti sono assenti ci sar.
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le""etto citopatico perc!% il virus !a tutta la sua capacit. di "un#ionare e di distruggere le cellule, le cellule vedete c!e
!anno un aspetto diverso nei due sc!emi. '1 sono cellule sane, l1 sono cellule in"ettate. ,uelle cose blu sarebbero i
nuclei delle cellule, non sono i virus. ,ua vi "a vedere come (((((((((( titola#ione di anticorpi neutrali##anti "acendo
una dilui#ione scalare del siero. -llora abbiamo parlato, abbiamo accennato a queste (((((((((( per: ora le vediamo
un po pi/ nello speci"ico (((((((((((.
;ssendo i virus, lo sapete, parassiti endocellulari obbligati per poterne ottenere la moltiplica#ione in laboratorio &
necessario disporre di cellule viventi, o in animali da laboratorio ma oggi si tende a lavorare pi/ in vitro c!e in vivo. *n
vivo non si lavora neanc!e pi/ da nessuna parte, intanto perc!% & costosissimo, gli altri motivi a me sono sconosciuti,
solo perc!% & costosissimo. *ntanto perc!% lanimale da laboratorio pu: essere utile per "are degli esperimenti perc!%
altrimenti non ci sarebbe nessun progresso poi daltronde sono dei topini e dei ratti c!e vengono coltivati da certe ditte
appositamente per "are gli esperimenti. *o sono una c!e li adora gli animali, non c!e li ama, c!e li adora gli animali.
9icuramente non "arei mai un esperimento su un cane o su un gatto ma su topi0 ne !o amma##ati nella mia vita
migliaia, ratti non li conto e non vi dico. 9e volete "are di me unassassina, "ate pure. $er: se c& una necessit., ecco
certo non & c!e possiamo testarlo sugli altri esseri viventi, l. sarei assassina. 9e io potessi testare un "armaco, una
qualsiasi altra cosa su un altro essere vivente sarei una pa##a. $er: se io lo "accio su un topino c!e & coltivato ad !oc,
c!e & "atto crescere, "atto moltiplicare0 anc!e perc!% ogni topino costa trenta euro non & c!e costa niente perc!% sono
topi particolari, devono essere ben nutriti, devono essere sen#a in"e#ioni e quindi gli animali da laboratorio per "are c!e
cosa Paccio ricerca ma se devo "are diagnostica non mi rivolgo allanimale da laboratorio, o5 'a diagnostica si "a in
colture cellulari in vitro. *n vitro signi"ica c!e "acciamo coltivare delle cellule in vitro, ora vediamo come le "acciamo
coltivare. Auardate le cellule possono crescere in quelle bottigliette c!e vi !o "atto vedere prima o adese oppure in
sospensione. 'e cellule in sospensione c!e non !anno capacit. di adesione sono le cellule di origine ematica e le cellule
c!e vi dicevo di cui parlavo0 linea cellulare Mur5at di origine da un lin"oma sono cellule c!e crescono in sospensione.
Bna cellula in sospensione c!e aspetto !a secondo voi 9ia c!e sia "ibroblasta, sia c!e sia0 se io la tengo in un liquido
in sospensione & s"erica. ,uindi la cellula in sospensione & sempre s"erica poi quando vanno ad aderire, quelle c!e
possono aderire, quelle c!e !anno capacit. di aderire e sono quelle c!e non sono di deriva#ione dal sangue umano e
allora assumono questo aspetto((((((((((. 9opra sono le cellule epiteliali, endoteliali e poi i "ibroblasti c!e sono
quelle a""usolate, quelle sotto sono le cellule neuronali. ; queste si osservano al microscopio invertito, ecco qua vi "a
vedere le cellule di origine nervosa, epiteliale c!e "anno parte del tessuto solido crescono per adesione, quelle in
sospensione sono le cellule di origine ematopoietica c!e vivono in un ambiente "luido e !anno capacit. di0 si sono
adattate a vivere0 e sono sempre tonde. <ra vi "accio vedere degli esempi, questi sono delle cellule adese endoteliali
viste con un ingrandimento maggiore. ,ueste al microscopio ottico perc!% queste sono colorate, poi queste sono le
"amose cellule di Mur5at c!e sono ((((((((((( dai lin"ociti 7 e con sospensione, vedete c!e sono tondeggianti. ,uesti
sono i terreni di coltura, c!e cosa devono contenere per mantenere le cellule in vita )anno acidi, sali minerali in pi/
vanno aggiunti a parte questi "attori nutrienti, si deve tenere conto dellambiente "isico e dellambiente c!imico, del p),
della temperatura c!e deve essere a 3G QC, ci sono degli incubatori c!e mantengono la temperatura, ci sono degli
(((((((((((( a C< c!e mantengono anc!e un certo grado di anidride carbonica c!e serve anc!e come tampone per
il p) cellulare. Contengono il siero "etale bovino, il siero "etale bovino si usa perc!% contiene tanti "attori di crescita e
alcuni dei quali "avoriscono anc!e ladesione delle cellule al supporto di plastica. $oi ancora si aggiungono degli
antibiotici c!e servono per evitare le in"e#ioni da parte dei batteri.
Ci sono due tipi di colture cellulariL le colture primarie e le linee cellulari continue.
'e colture cellulari primarie sono universalmente riconosciute come il migliore sistema colturale in quanto replicano lo
spettro pi/ ampio di virus e in quanto si avvicinano di pi/ alle cellule in vivo. $erc!% sono cellule diploidi e perc!%, per
esempio, come si ottengono 9e io voglio ottenere una coltura primaria io di solito lo "acevo sempre dal topino0 io
prendo un topino, prima lo anesteti##o con0 poi dopodic!& ((((((((((((((((non va in anestesia, passa
dallanestesia alla morte, per cui non sente niente. $er cui io posso prendermi queste cellule, per esempio, del tessuto
muscolare. 2i servono le singole cellule, quindi io devo trattare questo pe##o di tessuto con delle sostan#e tipo la
tripsina, le((((((((((((((( c!e scindono i legami tra una cellula e laltra e alla "ine di tutto questo processo c!e dura
un paio dore, & un processo c!imico ovviamente, avr: le singole cellule separate. ,ueste cellule sono cellule normali
con un corredo diploide e quindi queste sono colture primarie. ,ueste colture primarie servono perc!%, ad esempio,
alcuni virus tipo il virus citomegalico cresce solo su coltura primaria, nelle linee cellulari continue non cresce. 9i
possono anc!e comprare perc!% c& una banca di cellule, una banca mondiale c!e serve sia in ;uropa c!e in -merica e
si scambiano pure queste linee cellulari, sia primarie c!e non. ,uindi si possono comprare ma costano una enormit..
-llora il problema delle colture primarie & c!e vivono non pi/ di 1O @ 20 passaggi. *o queste cellule le prendo le metto
in un monostrato ma un po me le congelo per la prossima volta perc!% se no poi c!e "accio sempre la stessa cosa Bn
poc!ino mi servono, le altre me le congelo. <ra quante volte io posso scongelarle e metterle in coltura 9e io le metto in
coltura e non le in"etto posso e!m0 si c!iama passaggio, posso "are un ulteriore passaggio. ,uindi le (((((((((( le
tolgo dalla plastica e da quelle (((((((((((((((((((((((((((( perc!% poi si moltiplic!eranno da una bottiglia
almeno ne "accio due. 'a capacit. di replica#ione di queste0 4a un passaggio0 da una bottiglia se ne "anno due e cos1
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via. ,uesto "atto si pu: "are per un numero limitatissimo di volte perc!% poi vanno incontro ad apoptosi e morte. ,uesto
le colture primarie, le colture invece in linea continua sono delle cellule di origine tumorale c!e si moltiplicano un
numero di volte inde"inito, immaginate c!e abbiamo in laboratorio le cellule )e @ 'a c!e sono state prelevate da un
carcinoma del collo dellutero di una signora c!e si c!iamava )elena 'ambert, )e @ 'a sta per questo. 9ono
"amosissime sono scritte in tutti i libri. ,uindi queste cellule sono state prelevate da questo carcinoma del collo
dellutero c!e aveva questa donna nel 1FO2, ancora oggi, sono passati sessantadue anni, sono nei laboratori di tutto il
mondo ed & una linea cellulare. $erc!% & una linea di origine tumorale. ,uindi queste cellule !anno perso linibi#ione da
contatto, si moltiplicano alla grande perc!% essendo cellule tumorali !anno perso tutti i "reni inibitori e si moltiplicano,
non "anno neppure il monostrato "anno i pluristrati, cio& tu le vedi c!e a un certo punto se non le passi entro un certo
limite, se le tieni un giorno in pi/ in coltura si "ormano delle montagnette di cellule. ,uindi non & pi/ un monostrato ma
"ormano dei pluristrati. 'e pi/ "amose sono le )e @ 'a, le cellule velo, le cellule )82. ,ueste sono pi/ "acili da gestire
ma se si replicano il numero di cellule & pi/ limitato qua bisogna tenere conto del tropismo virale. *l concetto di
tropismo virale sicuramente ce lavete, se non ce lavete ve lo dico in due parole. )anno una""init. per alcune colture e
per altre no. $er esempio il virus epatitico !a una""init. di tropismo per una cellula epatica e non per una cellula
nervosa. *l $olio virus, invece, !a una""init. per la cellula nervosa. C!e poi a seconda di quello c!e io devo studiare, o
devo anali##are, devo avere a disposi#ione quella data cellula c!e !a il recettore giusto per potere replicare quel virus e
non un altro, va bene ,uindi bisogna tenere conto del tropismo cellulare e del tropismo virale c!e poi sono la c!iave e
la serratura di questo meccanismo.
'o leggi tu c!e mi brucia la gola
I'a coltura primaria & una coltura preparata indirettamente da(((((((((((((((((((, le cellule sono in grado di
compiere un numero "inito di divisioni cellulari in vitro dopo dei quali va incontro ad apoptosi, "enomeno c!e avviene
indipendentemente dalla presen#a di metaboliti ((((((((((((((. * vantaggiL le cellule isolate ri"lettono una maggiore
probabilit. di a""init. bioc!imic!e delle cellule. Ali svantaggi c!e !anno una vita limitata.
'a linea cellulare continua (((((((((((((((((J
< indotta, la possiamo indurre noi con delle sostan#e c!imic!e. $rendiamo una linea primaria e la tras"ormiamo,
mettiamo un virus oncogeno e la tras"ormiamo e da linea primaria mi diventa linea cellulare.
I4eriva#ioneL la coltura primaria da tumori o da manipola#ioni genetic!e di colture primarie particolare. 'e cellule
tras"ormate presentano delle caratteristic!e simili alle cellule cancerose. * vantaggiL le cellule clonali, "acili da
coltivare((((((((((((((((
9vantaggiL non riproducono esattamente lambiente "isiologico (((((((((((((((J
,ueste sono due. Vedete quella specie di montagnetta, quelle sono le cellule tumorali e quelle la no.
'a coltura primaria a breve termine, vedete 4ieci duplica#ioni. 'a coltura pi/ a lungo termine ma sempre primaria
oltre le sessanta duplica#ioni non va.
'a linea cellulare & immortale. ,uesta & quella c!e dicevo io la )e @ 'a (((((((((((((((
Vedete le )e @ 'a (((((((((((((((((
,uesta banca dati c!e si trova in -merica c!e !a tutta questa teca di cellule di varia natura, di varia origine e queste
sono le )e @ 'a !uman carcinoma. 'e cellule epiteliali del carcinoma della cervice in una donna di 31 anni0 ,uesti
sono tutti dati c!e !anno in questa sorta di catalogo di banca mondiale. )anno tutti i dati delle cellule c!e "anno pagare
((((((((((((( trasporto in g!iaccio secco,costano unenormit.. - parte c!e viaggiano in aereo. ,ueste sono le )e @
'a come si vedono al microscopio invertito, queste sono le piastre per le colture cellulari, ci sono le bottiglie c!e
abbiamo gi. visto ma ci sono diversi altri sistemi c!e0
Vedete quel vetrino in "ondo 9ono dei vetrini con delle camerette, poi spacc!i la cameretta e il vetrino lo devi
osservare al microscopio ottico e non invertito. $erc!% il microscopio invertito non !a il potere di risolu#ione del
microscopio ottico, !a un potere di risolu#ione molto pi/ basso.
,ua vi "a vedere una serie di e""etti citopatici, (((((((((((((((((( virus, qua un )98, questo qui & un e""etto
citopatico, "orma#ione di sinci#i, 398 in alto e morbillo a destra. ,uesti sono tutti nuclei di cellule. ,uesto qua & un
altro sinci#io, questammasso di cellule. 'e cellule singole sono queste qua, vedete 'aspetto & completamente diverso.
; qua pure, queste sono le singole cellule e questa & la "orma#ione ((((((((((((((((((. ,uesta & una in"e#ione da
((((((((((, le cellule erano "ibrobastic!e, vedete c!e sono allungate, "usi"ormi. 'e cellule in"ettate assumono un
aspetto tondeggiante, vedete - un certo punto si distaccano, essendo cellule adese, a un certo punto si staccano dal
bordo della plastica e si "ormano le placc!e (((((((((((((((((.
,ueste sono le "orma#ioni di sinci#i causati dal virus del morbillo ((((((((((((((((((((( perc!% cerano cellule
in"ettate da morbillo, aggiungendo questi globuli rossi, essendo il morbillo un $aramE>ovirus !a lemagglutinina,
quindi le cellule in"ettate da questo virus se io aggiungo globuli rossi si agglutinano, se poi io lavo i globuli rossi non si
muovono da l1, dal monostrato cellulare. $er esempio tu !ai una coltura e vuoi vedere se nel siero del pa#iente ci sono
9
gli anticorpi, tu lo puoi applicare0 ,uesta non & una tecnica, questa & una cosa c!e & stata "atta diciamo per la ricerca
perc!% se no tu ti dovresti cimentare0 il virus con (((((((((((((((((((( in"ettato per essere pi/ certi c!e si
trattasse di un virus, vediamo se & un virus emagglutinante, mettiamogli degli anticorpi. $erc!% se un virus
emagglutinante !a lemagglutinina, noi aggiungiamo gli anticorpi ((((((((((((((((((((((((
,uesta & una dimostra#ione di cellula in"ettata da quei virus c!e !anno la capacit. emagglutinante ma non & solo il virus
perc!% la cellula0 intanto questi virus tu lo sai come escono dalla cellula Auarda ti devi ricordare una cosa, ti ricordi
((((((( la gemma#ione 7i ricordi c!e cosa "anno questi virus 7utti i virus c!e !anno il pericapside ((((((((( prima
di uscire gemmando nella membrana della cellula c!e !anno in"ettato (((((((((( pensa a questa cellula c!e gli !anno
messo sulla membrana cellulare )anno messo lemagglutinina e la neuraminidasi del pericapside & c!iaro c!e se io gli
aggiungo0 vedo c!e c& un virus emagglutinante.
,uesto & un sinci#io da )*V, questa & unimmuno"luorescen#a di un citomegalovirus. 9i pu: dire c!e le cellule in"ettate
da un citomegalovirus sono essere trattate con anticorpi monoclinali "luorescenti e poi osservati al microscopio
(((((((((((((((((
Auarda c!e bella, questa qua & bellissima, questa & una colora#ione di (((((((((((((((( . Auarda c!e bella quella
cellula grossa, citomegalica. ,uesto & e""etto citopatico del citomegalo virus, vedete locc!io di civetta ? bellissima
questa, questa & una delle "otogra"ie pi/ belle in assoluto. +on & c!iarissimo c!e questa & una cellula in"ettata da un
citomegalo virus Auardate una cellula non in"ettata. Auardate c!e pure questa & in"ettata e diventer. enorme quanto
questa e poi esploder.. ;splodono ed esce la progenie virale, migliaia di virus nuovi . ,ueste sono le "iasc!e dove si
coltivano le cellule. ,uesta & unaltra coltura di cellule c!e sono state in"ettate da un -denovirus, li !anno usato una
molteplicit. di in"e#ione pi/ bassa, l1 una molteplicit. di in"e#ione pi/ alta. 'a molteplicit. di in"e#ione & un valore c!e
si da per quante cellule ((((((((((
$er ogni cellula metti dieci unit. "ormanti placc!e o dieci unit. emagglutinanti, & un modo di titolare i virus. 2entre
dove c& scritto 01 signi"ica c!e ci stai mettendo ogni dieci cellule0
,ueste sono cellule "ibroblastic!e in"ettate dal virus dell)erpes simple> e questo & un pe##o delle placc!e, e questi
sono una serie di virus c!e (((((((((((( in colture cellulare e sono l (((((((((((((((( , la varicella #oster ,
(((((((((((((((( il morbillo, (((((((((((((lin"luen#a, la parain"luen#a, la parotite e virus respiratori sinci#iali.
7utti questi danno e""etto citopatico. ,uesto poi si potrebbe "are diagnosi della microscopia elettronica ma sarebbe una
cosa piuttosto (((((((((( e in"atti si "a solo per "are ricerca. ,uesto & un ((((((((((((di )*V, vedete come "uoriesce
dalla cellula Vedete il (((((((( della membrana c!e si sta spe##ando ((((((((((((((((((. ,uesto & il problema del
costo elevatissimo e poi ci vuole (((((((((((((((( per usare un microscopio elettronico. $erc!% il microscopio
elettronico si piglia0 & grande quanto da li alla porta "ino li in "ondo.
,uesta & unimmuno"luorescen#a diretta, questa & una cellula in"ettata e messa in eviden#a con anticorpi monoclonali
contro quel dato virus e quindi & diretta perc!% (((((((((((((((((((
? una vescicola dei genitali. 9ono cellule del pa#iente c!e !ai prelevato dal vivo le messe sul vetrino e le !ai colorate.