05/06/2009

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Costruire le mappe
Eco-2

MAPPA DI RESTRIZIONE : Frammenti ordinati

Bam-1

Genoma umano
Pst-2 Bam-3 Pst-1

Bam-2 Eco-1

Procedimento: digestione enzimatica del DNA

Lezione 13

MAPPA GENETICA : Marcatori ordinati

Mappa genetica
[ vedi anche: Lezione 2, Lezione 13 ]

Procedimento: Analisi di linkage: Associazione tra marcatori

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Mappa genetica nelluomo

Procedimento 1. Assegnare i marcatori al giusto cromosoma 2. Misurare la frequenza di ricombinazione

Caratteri legati al sesso

Assegnazione abbastanza facile
Daltonismo (1911) Emofilia (Fattore VIII) Distrofia muscolare di Duchenne Becker Numerosi disturbi metabolici

3. Stabilire lordine e la distanza genetica tra marcatori

Problema: la ricombinazione rara tra marcatori vicini analizzare famiglie molto numerose
Genomica 1 - PL2009 Genomica 1 - PL2009

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Attribuire geni agli autosomi

Genetica delle cellule somatiche
Si fondono linee cellulari di due specie, utilizzando PEG o virus inattivati Inizialmente si forma un eterocarionte instabile

Mappaggio gene TK (cromosoma cromosoma 17) 17

Dopo molte divisioni cellulari librido mantiene solo pochi cromosomi umani

Genomica 1 - PL2009

Watson FIGURA 8.5

Watson FIGURA 11.2

Genomica 1 - PL2009

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Pannelli dibridi

Polimorfismi del DNA

Polimorfismi:
Variazioni presenti nella popolazione con una frequenza superiore a 1% polimorfismi pi rari sono di scarsa utilit pratica

Selezionate molte linee ibride, ciascuna con un set diverso di cromosomi umani Tutti gli ibridi con il gene umano TK mantenevano il cromosoma 17 Alcuni ibridi mantengono solo un cromosoma umano Disponibili pannelli di linee ibride che coprono tutto il genoma mappati ~ 200 geni umani gi negli anni 80

I geni sono facili da studiare, se danno un fenotipo visibile o propriet misurabili con opportuni saggi gruppi sanguigni, proteine del siero Marcatori muti richiedono analisi della sequenza di DNA a livello molecolare
Genomica 1 - PL2009

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Marcatori pi comuni
Marcatore
Gruppi sanguigni Isoforme di proteine del siero Tipi tissutali HLA RFLP

Caratteristiche dei marcatori

1. Alleli multipli si analizzano loci polimorfici (pi varianti, pi informazioni)

10

Anno
1910

Loci Commenti
~20 ~30 1 >105
Sistema AB0, Rh Non sempre si pu ottenere il genotipo (dominanza) Polimorfismo limitato Saggi specifici di mobilit in elettroforesi Altamente informativo (moltissimi alleli) Analisi laboriosa Poco informativi (due alleli) Facili da tipizzare Molti alleli altamente informativi Ideali per lanalisi di linkage Meno informativi Possibile tipizzazione in larga scala

1960

2. Distribuzione uniforme presenti in tutti i cromosomi, con frequenza abbastanza costante

1970 1975

3. Variet meglio avere a disposizione marcatori di tipi diversi: Geni, RFLP, microsatelliti

Microsatelliti

1989

>105

SNP

In corso

>106

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SNPs e RFLP
Sito EcoRI

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Polimorfismi di singoli nucleotidi (SNP) ~ 1,4 x 106 SNPs nel genoma umano

Marcatori muti (1 (1 )
Polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP (RFLP) )

GCCCAGCCGAATTCGTCCACAGCCTCTGCTCCGCC-TTG GCCCAGCCGAATTCGTCCACAGCCTC-GCTCCGCC-TTG GCCCAGCCGAATACGTCCACAGCCTCTGCTCCGCC-TTG GCCCAGCCGAATTCGTCCACAGCCTCTGCTGCGCC-TTG GCCCAGCCGAATTCGTCCACAGCCTCTGCTCCGCCCTTG

delezione SNP SNP inserzione

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphysm Lenzima non taglia la sequenza alterata Nel genoma umano, circa uno SNP su 10 da origine a RFLP
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Associazione RFLP malattia genetica

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I polimorfismi del DNA si ereditano come un normale carattere genetico

Watson et al., DNA ricombinante 2/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2008

1. 2. 3.

Figlio Padre Madre

11 | 13

RFLP diagnostico
Genomica 1 - PL2009

Polimorfismo non associato alla malattia

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Esempio
Watson FIGURA 11.4

15

Marcatori muti (2 (2 )
La risoluzione della mappa aumenta sfruttando le Sequenze Semplici Ripetute (SSR (SSR microsatelliti)
Padre malato, con mutazione dominante in un singolo gene (D) I figli malati hanno ereditato anche lallele M1, distante milioni di basi

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SSR nel genoma umano

17

Miglioramento della mappa

Maggior contributo dal CEPH CEPH, diretto da Jean Weissenbach Centre d'Etude du Polymorphisme Humain Marcatori: microsatelliti (CA)n

18

Trinucleotidi
[AAT/ATT]n, [AAG/CTT]n,, [AAC/GTT]n [ACC/GGT]n, [ACG/CGT]n,, [ACT/AGT]n [AGG/CCT]n,, [ATC/GAT]n, [CCG/CGG]n [CAG/CTG]n,,

Lunghezza della unit ripetitiva

Numero di copie nel genoma umano

1 2 3 4

120.000 140.000 37.500 105.000 56.000 49.000 27.000 35.500 27.500 27.500

La frequenza minore di altre brevi ripetizioni Espansioni di triplette (es. CAG, CGG) sono una causa importante di malattie genetiche nelluomo

5 6

DNA estratto da 517 individui, che rappresentano tre generazioni di 40 famiglie. Le analisi hanno coinvolto molti scienziati, che hanno lavorato sugli stessi campioni di DNA per lo pi di 8 famiglie VERSIONI RILASCIATE: 1) 2) 3) 1992 1994 1996 814 marcatori 2.066 5.264

7 8 9 10

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Trovare i microsatelliti CA
1. Vaglio di una libreria genomica di inserti ridotti (~ 1 Kb) con sonde di oligonucleotidi: es (CA)15 Sequenza completa dellinserto di DNA e delle regioni fiancheggianti Disegno di primer specifici per le regioni che fiancheggiano la zona con DNA ripetitivo (sequenze di DNA unico) Analisi mediante PCR ed elettroforesi del DNA genomico di numerosi individui

19

Verifica del polimorfismo

Non sempre le sequenze microsatelliti sono variabili

20

2.

3.

4.

Genomica 1 - PL2009

Genomica 1 - PL2009

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Processo automatizzato

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Risultati della corsa

22

5 individui analizzati corsie 1 5 del gel 16 loci tipizzati per individuo ogni SSR ha due alleli La lunghezza dellamplificato si pu stimare per confronto con un marcatore (M M)

4 gruppi di sequenze SSR da analizzare Per ogni gruppo si sfruttano 4 primer marcati con fluorescenza Prodotti di PCR separati nei sequenziatori automatici Campioni di ogni gruppo caricati ad intervalli di tempo 4 corse in ogni capillare
Genomica 1 - PL2009

Genomica 1 - PL2009

Concetti essenziali
In conclusione

5.870 marcatori distribuiti in 22 autosomi e 2 cromosomi sessuali - Densit media: 0,7 cM - Copertura di tutto il genoma - Dati consultabili per tutti

La mappa genetica ordina i marcatori in base al loro grado di associazione sul cromosoma (linkage). I marcatori genetici devono soddisfare questi requisiti:

Almeno due varianti alleliche (polimorfismi) Distribuzione uniforme in tutti i cromosomi

La genetica degli ibridi somatici ha permesso di mappare parecchi geni sugli autosomi. Con tecniche di analisi molecolare, si poi iniziato ad analizzare marcatori muti. Gli SNPs sono molto numerosi nel genoma umano e circa 1 su 10 produce un RFLP RFLP. Lanalisi di questi polimorfismi laboriosa, perch richiede una restrizione del DNA genomico, seguita da ibridazione con sequenze specifiche. Per costruire la mappa genetica umana alla risoluzione di 0,7 cM (5.870 marcatori), stata decisiva lanalisi di microsatelliti (CA)n condotta su larga scala con metodiche automatizzate.

APPLICAZIONI: associazione con tratti genetici interessanti lezione 13 LIMITI: i marcatori sono troppo distanti (~700 Kb) per completare una mappa fisica

Mappa genetica del cromosoma 4