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Reymark Christoper Comilang

Matricola 777838

CORSO DI BIOTECNOLOGIE VEGETALI

ESERCITAZIONI IN LABORATORIO 2014-2015

ESERCITAZIONE 1

Data:10/11/2014

Espressione transiente in Nicotiana benthamiana del costrutto 35S::GUS in

presenza e assenza di un gene soppressore del silencing p19.
Usati 2 ceppi di Agrobacterium tumefaciens uno portante il plasmide binario
35S::GUS e uno portante 35S::P19.
Si vuole vedere leffetto leffetto della soppressione del silencing.
Cosa che ci si aspetta (ipotesi):
- esprime 35S::GUS -> poca colorazione dovuta al silencing;
- esprime 35S::P19 -> amplificazione dellespressione di GUS.
Materiali:
Infiltration medium 10 mM MgCl2
100 mM Acetosyringone

Protocollo:
Batteri posti in centrifugazione per 10-15 minuti. I Batteri vengono recuperati
rimuovendo il supernatante e risospesi in un Buffer(il medium di infiltrazione 10
mM MgCl2) di 5-6mL.
Dopo unultima centrifugazione si recupera il pellet e si procede ad unulteriore
sospensione in 4mL di medium di infiltrazione.
Il campione poi diluito 1:10 e 1:100 per ottenere un valore di
assorbanza=0.2 .
Le assorbanze ottenute dalle diluizioni sono le seguenti:
Diluizione 1:10 - A=0.2

Diluizione 1:100 - A=0.19

Si preparano ora i 5mL di soluzione per linfiltrazione:
4.5mL soluzione MgCl2 + 0.5 mL di soluzione di Agrobatterio che porta
costrutto 35S::GUS
Si prepara un seconda soluzione per infiltrazione,questa volta contenente il
ceppo di Agrobatterio con il costrutto 35S::P19.
Aggiunta di Acetosiringone 100 microM (da soluzione di Acetosiringone 100
mM) alla soluzione di infiltrazione (volume=5mL)e lasciare a riposo per 30
minuti:
si aggiungono ,quindi, 5 microL di Acetosiringone alla soluzione .
Dopo i 30 minuti, si procede allinfiltrazione in foglie di Nicotiana benthamiana .
CONCLUSIONI:
A) Foglie infettate con costrutto 35S::GUS:
Le foglie infettate presentano un basso effetto del silenziamento del gene GUS,
mostrando zone visibilmente di colorazione bluastra, andando contro lipotesi
di un silenziamento del gene GUS.
Si sa che in realt il silenziamento avviene, questo risultato pu essere
causato da diversi motivi quali infiltrazione non ottimale o silenziamento non
del tutto avvenuto al momento della estrazione delle foglie infette.
B) Foglie infettate con costrutto 35S::P19:
Le foglie presentano colorazione blu, ma non differiscono di molto in aspetto
dalle foglie infettate con il primo costrutto. Le foglie non mostrano
loverespressione del gene GUS che ci si aspettava.
Anche in questo caso la causa potrebbe essere uninfiltrazione non ottimale
oppure il gene P19 potrebbe non essersi espresso al momento dellestrazione
delle foglie infette. Quindi, la causa potrebbe essere laver dato poco tempo al
gene di esprimere.

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ESERCITAZIONE 2

Data:11/11/2014

ESPERIMENTO 1:

Staining con GUS in piante di tabacco transgeniche dove il gene GUS sotto il
controllo di diversi promotori
3 linee indipendenti infiltrate in condizioni di stress abiotico, in questo specifico
caso in condizioni di siccit, e in condizioni normali.
Materiali:
Linea 1 : gene GUS sotto il promotore 1kbAtMYB60pro:GUS
Linea 2: gene GUS sotto il promotore 256bpAtMYB60pro:GUS
Linea 3: gene GUS sotto il promotore ABRE/DREAtMYB60pro:GUS

Staining solution
50 mM sodium phosphate buffer, pH 7,
0.1% (v/v) Triton-X100,
0.5 mg ml-1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide X-glucoronic acid
0.5 mM K3 Fe(CN)6.
Destaining solution
70% (v/v) Ethano

Cosa ci si aspetta (ipotesi):

- Dalla Linea 1 ci si aspetta un attenuazione dellespressione del gene GUS o un
silenziamento completo in condizioni di siccit e in condizioni normali;
- Dalla Linea 2 sotto il promotore minimo ci si aspetta un espressione molto
debole in condizioni di siccit;
- Dalla Linea 3 sotto controllo del promotore chimerico ABRE/DREA ci si aspetta
una overespressione in condizioni di siccit e una situazione simile al
promotore minimo in condizioni normali.
Protocollo:
Si fanno 2 saggi:

1)Condizioni Normali
2)Condizioni di Siccit

Due le piante usate la Linea 2(promotore minimo) e Linea 3(promotore

chimerico ABRE/DREA).
Viene staccata una foglia da ciascuna pianta e lasciata sul bancone per un
periodo di 1 ora e 30 minuti per simulare le condizioni di siccit.
Viene tagliato un disco fogliare dalle foglie messe ad essiccare e poste in 1 mL
di Staining solution in tubo Eppendorf.
Si hanno quindi :
a) Un disco fogliare posto ad essiccazione da pianta con promotore minimo;
b) Un disco fogliare da pianta con promotore chimerico ABRE/DREA.
A queste Eppendorf si accoppiano dischi fogliari staccati a fresco dalle
rispettive piante:
a) Un disco fogliare ottenuto a fresco dalla pianta con promotore minimo;
b) Un disco Fogliare ottenuto a fresco dalla pianta con promotore chimerico
ABRE/DREA.
I tubi Eppendorf sono poi incubati a 37C per una notte.
RISULTATI:

Fresco(controllo)

Essiccato(1h30min)

Promotore minimo
256

Presenza di pochi
spot blu

Aumento degli spot blu

minimo

Promotore
chimerico
ABRE/DREA

Presenza di pochi
spot blu

Assenza di
upregolazione del
gene GUS

CONCLUSIONI:
A) Dischi fogliari prelevati da pianta con Promotore minimo 256:
Il risultato ottenuto quello che ci si aspettava nel caso di un promotore
debole come il promotore minimo 256. Lespressione del gene GUS infatti
praticamente simile nei due saggi effettuati.

B) Dischi fogliari prelevati da pianta con Promotore Chimerico

ABRE/DREA:
Il risultato mostra una contraddizione con le ipotesi di un upregolazione in
condizioni di siccit e una downregolazione in condizioni normali. Infatti, i dischi
fogliari non presentano sostanziali differenze.
Una possibile spiegazione di questyo fenomeno che la pianta fosse gi in
condizioni di stress, e quindi avesse gi iniziato ad esprimere il gene GUS nelle
condizioni di normalit, mostrando quindi nessuna differenza tra condizioni di
siccit e di normalit.

ESPERIMENTO 2:
Selezione di piante Transgeniche Arabidopsis tramite luso di erbicida BASTA.
Le piante transgeniche sono state trasformate con un transgene che conferisce
resistenza allerbicida.
4 lineedi di Arabidopsis da selezionare e da indicarne il genotipo a selezione
effettuata.
Si stima il numero di piantine allinterno di una vaschetta targata linea #4
contenente le piantine da selezionare:
Tra le 2800-3000 piantine.
Materiali:
Piante transgeniche Arabidopsis
Erbicida BASTA
Protocollo:
Le piantine vengono spruzzate con lerbicida BASTA.

RISULTATI:
Dalle 3000 piantine di partenza si arriva a 64 piantine selezionate (il 2.1 %
delle piantine sopravvive).

CONCLUSIONI:
Solo il 2.1 % delle piantine sopravvissuto alla selezione con erbicida BASTA.
Non tutte le piantine nella vaschetta hanno ottenuto il transgene. Questo fa
pensare che il genotipo di queste piantine sia il genotipo di una generazione
T1, ossia le piantine trasformate che poi saranno utilizzate per creare altre
generazioni di piante transgeniche.

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ESERCITAZIONE 3

Data:17/11/2014

Esperimento di Trasformazione:

Floral dip of Arabidopsis plants

Trasformazione di piante Arabidopsis tramite il metodo di floral dip.

Le piante utilizzate sono mutanti abi1-1 ,mutanti signaling ABA.
Questa mutazione interrompe il segnale ABA, abi1-1 sempre legato alle
chinasi impedendo lattivazione degli effettori che poi porteranno alle risposte
al segnale.
Mutanti aba1-1 sono piante con fioritura precoce nei giorni corti e lABA un
regolatore negtivo della fioritura durante i giorni corti.
Obiettivo della trasformazione:

Trovare ed Identificare un gene soppressore dei mutanti abi1-1.

Il costrutto utilizzato inserisce nel genoma di Arabidopsis resistenza a BASTA e
una sequenza costituita da 4 Promotori 35S. Questa sequenza aumenta
lespressione dei geni al quale adiacente, pu lavorare sia a monte che a
valle del gene.
Dopo trasformazione si cercano piante con fenotipo diversi dal mutante abi1-1
nei giorni corti.

Materiali:
Infiltration medium: 5.0% (w/v) sucrose 0.05% (v/v) Silwet L-77
Plant Material : Arabidopsis abi1-1 mutants (Landsberg erecta background)

Protocollo:
Coltura di Agrobatteri divise in due Falcon tubes e messe a centrifugazione per
20 minuti.
Le cellule sono risospese in medium di infiltrazione di Saccarosio 5% (50 mL)
in un contenitore al quale aggiunto Silwet ad una concentrazione finzale di
0.05% (v/v)=0.05 mL.
Le piante vengono impregnatecon il medium di infiltrazione per 3-5 secondi,
vengono poi poste al buio per tutta la notte allinterno di sacchi di plastica per
mantenere lumidit.