1 L'innesco dell'apoptosi si verifica principalmente per mezzo di segnali che provengono da due vie distinte ma convergenti: LA VIA ESTRINSECA

(attivazione enxtracell) innescata dal legame di recettori di morte sulla superficie cell. I recettori di morte sono membri della famiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale TNFR che contengono un dominio citoplasmatico implicato nelle interazioni proteina-proteina detto dominio di morte, perch indispensabile per liberare segnali apoptotici. I recettori di morte meglio sonosciuto sono TNF di tipo 1 e una proteina chiamata Fas (CD95). Pathway Fas: Il legame di FasL (espresso ad es sulla superficie dei linfociti killer) al recettore di morte FasR (espresso sulla superficie della cell bersaglio) provoca l'oligomerizzazione del recettore (di solito trimerizzazione del recettore forma il recettore funzionante). I loro domini di morte citoplasmatici formano un sito di legame per proteine adattatrici FADD (Fasassociated death dominian) reclutandole; contengono anche loro domini di morte. Queste proteine adattatrici legano e aggregano molecole di procaspasi8 che vanno incontro a un reciprovoco clivaggio, passando alla forma attiva. La caspasi8 in grado sia di innescare la caspasi3,fondamentale per l'esecuzione del programma di morte, sia di tagliare la proteina Bid in 2; il frammento C-term di questa proteina (tBIB) la molecola attiva capace di traslocare sul mitocondrio dove attivia la via mitocondriale stimolando il rilascio da parte dei mitocondri del citocromo c che a sua volta attiva la caspasi9 che attiva la caspasi 3, caspasi effettrice dell'apoptosi. FLIP proteina che si lega alla procaspasi8 inibendo la sua attivazione. Alcuni virus e le cell normali producono FLIP e usano questo inibitore per proteggere le cell infettate e normali dall'apoptosi Fas-mediata LA VIA INTRINSECA (attivazione intracell) dipende dall'aumento della permeabilit mitocondriale e dal rilascio di molecole pro-apoptitiche nel citoplasma, senza coivolgimento di recettori di morte. In condizioni normali, fattori di crescita e altri segnali di sopravvivenza stimolano la produzione di membri antiapoptotoci appartenenti alla famiglia Bcl-2 (omologo a Ced-9 nel C.Elegans) (Bcl-2,Bcl-XL) che risiedono nelle membrane mitocondriali e all'interno del citoplasma. Quando le cell sono private dei segnali di sopravvivenza o sono sottoposte a uno stress, Bcl-2 e Bcl-XL vengono perse dalla membrana mitocondriale e sostituite da membri della famiglia a funzione proapototica (Bak, Bax, Bak, Bid). Riducendosi i livelli di Bcl-2 e Bcl-XL la permeabilit della membrana mitocondriale aumenta e vengono rilasciate diverse proteine in grado di attivare la cascata delle caspasi: CITOCROMO C, nel citosol lega una proteina Apaf-1 (fattore proapoptotico di attivazione delle proteasi, omologo a Ced-4 nel C.Elegans) ci induce un cambiamento conformazionale nella proteina che permette l'assemblaggio di altre 6 Apaf-1 formando un complesso omoeptamerico detto apoptosoma. Le molecole di Apaf-1 unite in questo complesso mostrano i loro domini CARD (dominio di reclutamento delle caspasi) che son in grado di legare le procaspasi9 che vengono attivate ed attivano a loro volta le caspasi3. Inibitori dell'apoptosi IAP (Inhibitor of Apoptotis Protein, XIAP, IAP-1/2, Surviniv, Livin)

possono legare le caspasi inibendone l'asttivita e promuovendone l'ubiquitinazione e la degradazione (limita l'attivit dell'apoptosoma associandosi e bloccando le caspasi9); ma le IAPs possono subire una regolazione negativa da parte di Smac/Diablo (Second Mitochondria-derived Activator of Caspases), una proteina normalmente residente nel mitocondrio e rilasciato nel citoplasma durante il processo apoptotico. IAP compete per lo stesso sito di legame di Smac sulla caspasi9. Le IAP vengono legate e neutralizzate da proteina proapoptotiche (per es. AIF, fattore inducente l'apoptosi). La riduzione dei livelli di Bcl-2 importante per l'innesco dell'apoptosi in quanto in grado di inibire il rilascio di citocromo c nel citosol e l'azione di Apaf-1. L'essenza della via intrinseca l'esistenza di un equilibrio tra molecole proapoptotiche, che regolano la permeabilit mitocondriale e il rilascio di induttori di morte normalmente sequestrati all'interno dei mitocondri. I mitocondri sono anche il punto di controllo principale dell'apoptosi innescata da vari stimoli, ad es raggi UV, agenti chemioterapici ed allontanamento di fattori di crescita e di citochine. Questi organelli attraverso il rilascio di citocromo c e di altri fattori pro e anti apoptotici coordinano sia l'attivazione delle caspasi che l'amplificazione dei segnali di morte. Il rilascio di citocromo c dallo spazio intermembrana avviene ad opera di Bax e Bak che inseguito all'induzione di morte oligomerizzano. La formazione degli oligomeri e la conseguente permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna, possono essere indotte da una classe particolare della famiglia di Bcl-2 detta BH-3 only proteins (proteine contenenti solo il dominio BH3), mentre risulta inibita dai fattori antiapoptotici della stessa famiglia. Subito dopo aver raggiunto il citoplasma, il citocromo c promuove l'assemblaggio di un clomplesso proteico (apoptosoma) che lega ed attiva 7 procaspasi9. Apaf-1, oltre a promuovere l'attivazione delle caspasi9, necessario anche per una piena attivit catalitica della stessa; infatti stata osservata una differenza tra l'attivit catalitica della caspasi9 libera e quella coniugata con Apaf-1. La caspasi9 matura proteolizza la procaspasi3, rendendola ttiva, e questa asua volta agisce sulle proteine bersaglio, innescando la cascata di eventi che portano all'esecuzione del programma di morte. La permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna ed il rilascio di cit c dallo spazio intermembrana, rappresentano eventi precoci che si verificano nel processo di morte cell programmata mediata dai mitocondri. Successivamente si verifica anche la permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna. L'alterazione dell'omeostasi mitocondriale determina uno squilibrio ossidativo caratterizzato da iperproduzione di ROS e diminuzione dei livelli intracell di antiossidanti, quali GSH. 2 Il controllo e la regolazione sono influenzati da membri della famiglia di proteine Bcl-2, che possono inibire o promuovere la morte della cellula.

3 La fase effettrice costituita da una cascata proteolitica, verso cui convergono i vari meccanismi di innesco. Le caspasi (omologhi di Ced-3 di C.Elegans) ''c'' sta per cisteina proteasi (presentano la cisteina nel loro sito attivo) ''aspasi'' fa riferimento alla loro peculiare capacit di tagliare i residui di acido aspartico a posteriori. La famiglia delle caspasi che comprende 10 membri pu essere suddivisa in iniziatrici (8,9) ed effettrici (3,6) Esistono sottoforma di pro-enzimi inattivi o zimogeni e per innescare l'apoptosi devono essere attivate da un clivaggio proteolitico. IL sito di clivaggio di una caspasi pu essere idrolizzato da altre caspasi ma anche da un' autocatalisi. Le caspasi iniziatrici operano il clivaggio di altre caspasi, quelle effettrici agiscono su molte componenti cellulari, clivano le proteine del citoscheletro e quelle della matrice nucleare, distruggendo il citoscheletro e portando alla frammentazione del nucleo. Nel nucleo i berdagli dell'attivazione delle caspasi comprendono proteine coinvolte nella trascrizione, nella replicazione e nella riparazione del DNA (l'attivazione della caspasi3 attiva una Dnasi citoplasmatica CAD, clivando un inibitore dell'enzima ICAD;questa CAD induce il caratteristico taglio internucleosimico del DNA. 4 Nelle prime fasi dell'apoptosi, le cell secernono fattori solubili che reclutano i fagociti. Ci consente una rapida eliminazione delle cell apoptotiche, prima che esse vadano in contro a necrosi secondaria al rilascio del loro contenuto cell (con il risultato di stimolare una risposta infiammatoria). Le cell apoptotiche possiedono sulla loro superficie fosfatidil serina che facilita il pronto riconoscimento da parte delle cell adiacianti o dei fagociti, permettendone la captazione e l'eliminazione. I macrofagi possono anche secernere sostanze che legano in modo specifico le cell apoptotiche, ma non quelle vive, opsonizzandole per la fagocitosi. Contrariamente ai marcatori presenti sulle cell apoptotiche le cell vitali sembrano evitare la fagocitosi da parte dei macrofagi attraverso l'espressione di alcune molecole di superficie (come CD13).