Cinetica Enzimatica

• Fattori che influenzano le velocità

• Substrato, prodotto, inibitore, attivatore, pH, forza
ionica, temperatura
• Analisi al variare dei fattori
• Meccanismo cinetico di catalisi
• Ipotesi sul complesso e sull’intermedio
• Costanti cinetiche – concentraz. fisiologiche
• Regolazione
• Gruppi coinvolti
• Modello per la reazione
 ENZIMI

SONO PROTEINE CON PESO

MOLECOLARE CHE VARIA DA 12.000
FINO A OLTRE UN MILIONE
UNICA ECCEZIONE ALCUNI RNA CATALITICI

ALCUNI HANNO BISOGNO DI COFATTORI – GRUPPO PROSTETICO :

-IONI INORGANICI Fe2+ , Mg2+ , Mn2+ , Zn2+ , . . . .
-MOLECOLE ORGANICHE - COENZIMI
 Alcuni enzimi che contengono
come cofattori elementi inorganici
Citocromo ossidasi
Fe2+ o Fe3+ Catalasi
Perossidasi
Cu2+ Citocromo ossidasi
Zn2+ Anidrasi carbonica
Alcol deidrogenasi
Mg2+ Esochinasi
Glucosio-6-fosfatasi
Piruvato chinasi
Mn2+ Arginasi
Ribonucleotide reduttasi
K+ Piruvato kinasi
Ni2+ Ureasi
Mo Dinitrogenasi
Se Glutatione perossidasi
 Alcuni coenzimi servono come trasportatori
temporanei di specifici atomi o gruppi funzionali

Coenzima Esempi di gruppi chimici Precursore nella dieta dei

trasferiti mammiferi
Tiamina pirofospato Aldeidi Tiamina (vitamina B1)

Flavin adenin dinucleotide Elettroni Riboflavina (vitamina B2)

Nicotinamide adenina Ione idruro (:H-) Acido nicotinico (niacina)

dinucleotide
Coenzima A Gruppi acilici Acido pantotenico e altre
molecole
Piridossal fosfato Gruppi amminici Piridossina (vitamina B6)

5’-deossiadenosil- Atomi di H e gruppi alchilici Vitamina B12

cobalamina (coenzima B12)
Biocitina CO2 Biotina

Tetraidrofolato Gruppi a un atomo di Folato

carbonio
Acido lipoico Elettroni e gruppi alcilici Non necessario nella dieta
• Un enzima cataliticamente attivo con tutti i suoi coenzimi o ioni
metallici va sotto il nome di OLOENZIMA
• La parte proteica di un enzima viene detta APOENZIMA o
APOPROTEINA
Classificazione internazionale degli enzimi

N. Classe Tipo di reazione catalizzata

1 - Ossidoreduttasi Trasferimento di elettroni

2 - Trasferasi Reazioni di trasferimento di gruppi

3 - Idrolasi Reazioni di idrolisi (trasferimento di gruppi funzionali all’acqua)

4 - Liasi Addizione di gruppi a legami doppi o formazione di doppi

legami mediante la rimozione di gruppi

5 - Isomerasi Trasferimento di gruppi all’interno di molecole formando

isomeri

6 - Ligasi Formazione di legami C-C, C-S, C-O, C-N mediante reazioni di

condensazione accoppiata alla scissione di ATP
 Legame di un substrato al sito
attivo di un enzima

Substrato

Residui importanti
Del sito catalitico
 Diagramma della coordinata di
reazione per una reazione chimica
Stato di transizione (‡)
Energia libera, G

GS‡ P
GP‡ S

S G°’
Stato P
basale Stato
basale
Coordinata della reazione
N.B.:Nei sistemi biologici la variazione di energia libera standard è calcolata a pH 7,0
La relazione tra K’eq e G°’
G°’ = - RT ln(K’eq)
K’eq G°’ (kJ/mole)
10-6 34,2
10-5 28,5
10-4 22,8
10-3 17,1
10-2 11,4
10-1 5,7
1 0
101 -5,7
102 -11,4
103 -17,1
Diagramma della coordinata di reazione della reazione
S  P non catalizzata e catalizzata da un enzima

Stato di transizione (‡)

Energia libera, G

Gnon
‡
cat.
‡
Gcat.
‡

S ES EP
P

Coordinata della reazione

E+S ES EP E+P
L’aumento della velocità prodotto da alcuni enzimi

Anidrasi carbonica 107

Fosfoglucomutasi 1012
Succinil-CoA-trasferasi 1013
Ureasi 1014

Energia di legame, che si libera

dalle interazioni enzima-substrato
 Gruppi catalitici specifici contribuiscono alla catalisi

• Catalisi acido-basica
generale
• Catalisi covalente
• Catalisi da ioni Prima tappa della razione catalizzata dalla
metallici Chimitripsina, tappa di acilazione
 Cinetica Enzimatica
• Fattori che influenzano le velocità
• Substrato, prodotto, inibitore, attivatore, pH, forza
ionica, temperatura
• Analisi al variare dei fattori
• Meccanismo cinetico di catalisi
• Ipotesi sul complesso e sull’intermedio
• Costanti cinetiche – concentraz. fisiologiche
• Regolazione
• Gruppi coinvolti
• Modello per la reazione
 Reazioni catalizzate da enzimi

v = velocità iniziali di reazione

v v
senza enzima (catalizzatore)

con enzima (catalizzatore)

[S] [S]

k1 d [ P] v  f ([S ]) ?
S P v  k 1[S]
k -1
dt
 Reazioni catalizzate da enzimi

4[E]

v=[P]/t1
[P]

3[E]
2[E]
[E]

t1 t2 Tempo di saggio [E]

k1
S P
k -1
 Formazione del complesso enzima substrato

S P
S
S
S S ER P ER
ER ER
S

S
S
S
S S
k1 k2 k3
E+S ES EP E+P
k-1 k-2 k-3
 Approccio del rapido
equilibrio
in un sistema ad un substrato

k1 k2 k3
E+S ES EP E+P
k-1 k-2 k-3

k1 k2
E+S ES E+P
k-1 k-2

k1 k2
E+S ES E+P
k-1
 k1 k2
[E]  [S]
[ES] 
E+S ES E+P KS
k-1
[E]  [S]
k2
v Ks
v  k 2  [ES] 
[ET] [E]  [E]  [S]
Ks

[ET ]  [E ]  [ES] [S]

v
 Ks
k 2  [ET] 1  [S]
Ks
k  1 [E]  [S]
KS  
k1 [ES]

Equazione di Henri-Michaelis-Menten
v k 2  [ES]
 v [S]
[ET] [E ]  [ES] 
V max Ks  [S]
APROCCIO DELLO STATO STAZIONARIO
[S]
k1 k2 v v [S]
 Km 
k 2[ET ] 1  [S] V max Km  [S]
E+S ES E+P Km
k-1 Vmax

v  k 2  [ES] v 1.0
\\
0.8
[ET ]  [E ]  [ES]
0.6

v k 2  [ES] 0.5 Vmax 0.4


[ET] [E ]  [ES] 0.2

0.0 \\
d [ES] 0 2 4 6 8 10 100
 k 1  [E][S]  k  1[ES]  k 2[ES]  0 [S]
dt Km
k 1[S] [S] 1 Km 1 1
[ES]   [E] [ES]   [E]   
( k  1  k 2) Km v V max [S] V max
k 1 k2 Grafico dei doppi reciproci
Km  8
k1 1/v 7
6
5
[S] 4
k2[E] 1/Vmax 3
v K m
 2

[ET ] [E]  [S] [E] 1

0
-2 0 2 4 6 8
Km -1/Km 1/[S]
 Enzimi multisubstrato
E+A EA EP P+E Meccanismo sequenziale
+ + + +
B B Q Q A B P Q

E EA EAB EPQ EQ E
EB + A EAB EPQ P + EQ

EA A + E + Q EQ Meccanismo PING PONG

A P B Q

E EA E* EQ E
E*P P + E* + B E*B
 INIBIZIONE ENZIMATICA

Inibitore competitivo Inibitore incompetitivo

k1 k2 k1 k2
E+S ES E+P E+S ES E+P
k-1 k-1
+I +I
KI KI

EI ESI
Inibitore non competitivo
k1 k2
E+S ES E+P
k-1
+I +I
KI KI
k1
EI + S ESI
k-1
 Formazione del complesso enzima
inibitore competitivo

I P
S
S
I S ER P ER
ER ER
S

S I
S

I ER
 Formazione del complesso enzima
inibitore non competitivo

I P
S
S
I S ER P ER
ER ER
S

S I
S

ER S ER

I I
 Formazione del complesso enzima
inibitore incompetitivo

I P
S
S
I S ER P ER
ER ER
S

S I
S

S ER
I
 INIBIZIONE ENZIMATICA
Inibitore competitivo Inibitore non competitivo Inibitore incompetitivo
k1 k2 k1 k2 k1 k2
E+S ES E+P E+S ES E+P E+S ES E+P
k-1 k-1 k-1
+I +I +I +I
KI KI KI KI
k1
EI EI+S ESI ESI
k-1
I =KI I aumenta I aumenta
8 8 8
1/v I =0 1/v I =0 1/v I =0
6 6 6
1/Vmaxapp 1/Vmaxapp
4 4 4
1/Vmax
2 2 2

-2 0 2 4 6 8 -2 0 2 4 6 8 -2 0 2 4 6

-1/Km app. 1/[S] -1/Km 1/[S] 1/[S]

-1/Km app.
 Regolazione dell’attività enzimatica
- Enzimi allosterici -
k1 k2
S ET ET E + nS E(S)n E + nP
k-1

1.0
v [ S ]n
 0.8

ER ET V max K '[ S ] n
S 0.6

0.4

0.2

0.0
0 2 4 6 8 10

S
S ER ER S ER ER S
 ET ER
ER ER
EETT EET T
ER
Aspartato transcarbamilasi
ET (ATCasi)

ET ER
S S ER ER
EETT EET T
ER
ET

ET ER
S S S ER ER S
E
ETT EET T
ER
ET

ET ER
S S S ER ER S
E
ETT EET T
ET ER

S
S

S S

ET ER
S E
ETT EET T
S S ER ER S
ET ER

S
S
 Effetto del pH sulle attività
enzimatiche e sulla stabilità
1

0.5
pKa1 pKa2

0
3 4 5 6 7 8

pH
 Effetto della temperatura sulle
attività enzimatiche e sulla stabilità
v

V max  k 2  [ET ]

Ea

k  Ae RT

10 20 30 40 50 60

Temp. (°C)
 Effetto della temperatura
Equazione di Arrhenius - energia di attivazione

logk
Ea
pendenza  
2.3  R

1
Ea Ea 1
k  Ae

RT log k     log A
2 .3  R T
T