Applicazioni delle colture cellulari

Cos un tumore ?
Una proliferazione incontrollata di cellule atipiche Conseguenza di unalterazione a livello del codice genetico Differenza tra le cellule normali e quelle tumorali Aspetto istologicamente diverso Funzione afinalistica Comportamento moltiplicazione indefinita, infiltrazione tessuti circostanti, ripetizione a distanza (metastasi), cachessia neoplastica.

Carcinogenesi
Danni ripetuti e molteplici che colpiscono la cellula, se la cellula non in grado di riparare il danno pu insorgere un tumore maligno Interazioni complesse tra agenti cancerogeni, suscettibilit individuale e diminuzione delle difese organiche La possibilit di individuare tali mutazioni in anticipo consente di prevenire il cancro

I 15 tipi di tumore pi diffusi al mondo nei maschi

I 15 tipi di tumore pi diffusi nel mondo nelle donne

Fattori di rischio 1.Fattori di rischio generali 2. Fattori di rischio specifici

Fattori di rischio
Tra i fattori di rischio generali:
1. Et (il rischio aumenta con let) 2. Razza 3. Sesso (ormoni) 4. Geografia 5. Dieta 6. Familiarit (genetici) 7. Ambiente

Fattori di rischio specifici

1. 2. 3. 4. 5. 6. Virus Batteri Radiazioni ionizzanti Fumo (tabacco) Alcol Intossicazioni

Si stima che il 70% dei tumori potrebbe essere evitato.

La cellula neoplastica
Il fenotipo morfologico di una cellula maligna quello di una cellula diversa, ma non totalmente diversa o aberrante; la microscopia elettronica non riuscita a dimostrare differenze eclatanti, se non la occasionale presenza di virus.

Il fenotipo maligno pu essere caratterizzato da:

1)Comportamento in coltura Immortalit: crescono in modo indefinito in netto contrasto con le cellule normali che possono replicarsi esclusivamente un numero finito e definito di volte-numero di Hayflick. Perdita della dipendenza dallancoraggio: le cellule normali crescono se ancorate ad una superficie; le cellule trasformate crescono bene anche in un mezzo semifluido come lagar molle Perdita della inibizione da contatto: le cellule normali crescono fino a formare un monostrato compatto. Le cellule trasformate continuano a crescere le une sulle altre in maniera del tutto disordinata Diminuita necessit di fattori di crescita: generalmente se li producono da sole

I meccanismi della invasione locale

Quasi tutti i tumori benigni si accrescono come masse coese che si espandono (spesso incapsulati) La crescita delle neoplasie maligne, invece, si accompagna ad una progressiva infiltrazione, invasione e distruzione del tessuto circostante I carcinomi in situ mostrano le caratteristiche citologiche di malignit fatta eccezione per linvasione della membrana basale Dopo la capacit di dare metastasi, linvasivit la pi tipica delle caratteristiche che differenziano i tumori maligni da quelli benigni

I meccanismi della metastasi

Le metastasi identificano in modo inequivocabile un tumore come maligno,in quanto le neoplasie benigne non danno metastasi Con poche eccezioni, tutti i cancri possono metastatizzare (gliomi, carcinoma basocellulare della cute, altamente invasivi ma non metastatizzano) In generale, pi il tumore aggressivo, cresce rapidamente e presenta elevate dimensioni, pi probabile che metastatizzi o che abbia gi metastatizzato Esistono per numerose eccezioni. Talvolta tumori piccoli, ben differenziati e a lenta crescita danno metastasi diffuse, mentre tumori che crescono rapidamente possono rimanere localizzati per anni

Sedi di impianto delle metastasi

Sede del tumore primario Mammella e prostata Polmone compreso Colon-retto Testicolo Ovaio Sede di impianto delle metastasi ossa Ogni distretto, encefalo Fegato-polmone Polmone, fegato Cavit addominale, peritoneo e diaframma

La valutazione della potenziale cancerogenicit di agenti per luomo avviene attraverso diversi tipi di studi: Epidemiologici - Si indaga su popolazioni esposte in confronto con gruppi di controllo sicuramente non esposti, o con indici medi della popolazione. Questi studi spesso non portano a conclusioni statisticamente certe e anche quando non emergono differenze tra esposti e non esposti, non possono escludere che la sostanza indagata sia effettivamente cancerogena, ma semplicemente che non stata rilevata una differenza significativa di rischio di cancro tra il gruppo degli esposti e i termini di riferimento. Sperimentali - Si tratta del risultato di studi effettuati su animali da laboratorio e/o in vitro, con metodiche molto diverse, che hanno comunque come risultato una osservazione di casi di tumore su un gruppo di cavie o cellule in vitro esposte in confronto con un gruppo di cavie dello stesso tipo non esposte.

In vitro studies of asbestiform fibrous minerals related to the development of lung disease and cancer

Asbestos
inorganic mineral silicates properties

high tensile strength

heat resistance

sub-grouped

serpentine
crysotile

amphibole
amosite crocidolite anthophillite tremolite actinolite

Le fibre minerali naturali

Decreto legislativo n. 257 del 25 luglio 2006

Amphibole

Anthophyllite

Amosite

Tremolite

Actinolite

Serpentine

Crocidolite

Chrysotile

Utilizzo delle fibre

Harmful effects of asbestos fibers

Patologie legate allamianto

Fibre di amianto Carcinoma polmonare Asbes tosi

Placche pleuriche Mesotelioma

Over the last few years, the awareness of possible health hazards not related to professional exposure to asbestos, but related instead to the back ground of such fibers generated both natural and anthropic events, has been increasing.

CASES OF ENVIRONMENTAL POLLUTION BY MINERAL FIBERS NOT CLASSIFIED AS ASBESTOS ARE BECOMING MORE FREQUENT, IN ITALY AND FOREINGN COUNTRIES, AND NATURAL AND SYNTHETIC FIBERS ARE BECOMING A GROUP OF SUBSTANCES OF POTENTIAL TOXICOLOGICAL AND PUBLIC HEALTH CONCERN.

500 MINERAL SPECIES

low levels of cytotoxicity

high levels of cytotoxicity causing a wide variety of respiratory diseases ranging from inflammation and fibrosis to cancer

THE RISK OF DEVELOPING BREATHABLE MINERAL-RELATED LUNG DISEASES OR CANCER VARIES BETWEEN FIBRE TYPES, BECAUSE OF THE VARIOUS PHYSIOCHEMICAL PROPERTIES:

fibre dimensions

fibre structure surface charge ability to generate reactive oxygen species biopersistance

UNDERSTANDING how asbestos-like fibers interact with target cells of diseases (i.e. epithelial, mesothelial, macrophage and fibroblastic cells) how these events contribute to the pathogenesis of diseases are critical to designing preventive and therapeutic approaches to lung and pleural disorders

In an epidemiological study on mortality from malignant pleural neoplasms in Italy, it was found that some subjects who resided in Biancavilla were diagnosed with malignant pleural mesothelioma. These residents had never any relevant exposure to asbestos during their professional life.

A possible cause for fibrous mineral exposure of Biancavilla population was the stone quarries present in Monte Calvario. The materials extracted from the quarries are widely used in the local building industry and contain large quantities of fibrous amphibole.

Approvazione CNMMN dellIMA come nuovo anfibolo approvato in data 31/01/2000 con il numero 2000/49

FLUOROEDENITE
Il caso Biancavilla

Fluoro-edenite prismatica Formula ideale NaCa2Mg5(Si7Al)O22F2

BIANCAVILLA (SICILY, ITALY)

Il caso Biancavilla

Biancavilla (CT)

Visione satellitare Sicilia

Cava di Monte Calvario (Biancavilla, CT)

The quarries of Monte Calvario

Monte Calvario

Biancavilla

Fluoro-edenite
Ideal formula: NaCa2Mg5(Si7Al)O22F2 Length of the fibres: 12-40 m Diameters of the fibres: 0.4-1 m

Fluoro-edenite
aciculare prismatica Fluoro-edenite del Monte Calvario

asbestiforme

Cytological examination

WESTERN ALPS
(PIEMONTE, ITALY)
In the veins of serpentine rocks, the asbestiform minerals, carlosturanite, balangeroite, antigorite, diopside, olivine, brugnatellite, brucite and the crysotile, tremolite, and actinolite asbestos were found, probably involved in lung disease risk or development.

The harmfulness of chrysotile is known, whereas nothing is recognized about fibrous antigorite, that has very similar chemical composition to chrysotile but fairly different in atomic arrangements.

Balangero (Turin)

Balangeroite

AIMS
to understand how asbestos-like fluoro-edenite

and/or antigorite fibres interact with target cells of lung diseases to understand how these events contribute to the pathogenesis of fibre-associated and malignant diseases to evaluate the possible use of some parameters as a biomarker of fibrous minerals exposure

Human lung fibroblasts

Fluoro-edenite 5, 50 and 100 g/ml 24, 48 and 72 hrs

Mouse monocyte-macrophage J774

Human alveolar epithelial A549

chemical formula [(Na0.307K0.157)0.464(Ca1.505Na0.495)2.0 (VIAl0.104Fe3+0.333Fe2+0.162Mg4.255Ti0. 00 Mn0.063)4.980(Si7.520IVAl0.480)8.000O2 062 (F Cl ) ]

Examined biofunctional parameters

cell viability MTT test

cytotoxicity

LDH determination ROS determination NO determination COMET test

oxidative stress

DNA damage

E un saggio colorimetrico che sfrutta la capacit delle deidrogenasi mitocondriali di scindere lanello tetrazolico della molecola di MTT (sale di tetrazolio) di colore giallo per dare un sale di formazano violetto. La quantit di formazano prodotta viene misurata allo spettrofotometro ed proporzionale al numero di cellule vive. Per poter eseguire il saggio le cellule vengono cresciute su di una piastra multi-pozzetto e trattate con concentrazioni crescenti della sostanza da analizzare in triplicato per un tempo predeterminato. Al termine del trattamento, la soluzione contenente lMTT viene aggiunta alle cellule. Dopo circa tre ore, tempo necessario affinch si formi il sale di formazano, viene misurata lassorbanza a 550 nm. I dati cos ottenuti vengono normalizzati rispetto al controllo ed utilizzati per costruire le curve dose-risposta.

MTT

Saggio colorimetrico basato sul reagente MTT

Assorbimento delle molecole di MTT da parte delle cellule in esame Metabolizzazione dellMTT a livello mitocondriale da parte degli enzimi deidrogenasi dipendenti da NADH Formazione e precipitazione dei cristalli di Formazano che sono insolubili in soluzioni acquose
MTT
(sale di tetrazolio)
N N N+ N N CH 3 S CH 3 N N S CH 3

NADH
NH

Formazano

NAD+

CH 3

SAGGIO MTT
Sospensione cellulare + MTT Incubazione (3 4 ore) a 37 C

Misurazione dellassorbanza dei campioni tramite ELISA Reader con filtro da 550 nm

Solubilizzazione dei sali di formazano tramite Isopropanolo 0,1N HCl o DMSO

Test di citotossicit: saggio MTT

COLTURA CELLULARE + MTT INCUBAZIONE (3 4 h) a 37C METABOLIZZAZIONE DEI SALI DI TETRAZOLIO

1) Aggiunta del sale di tetrazolio alle cellule trattate 2) Nelle cellule attive metabolicamente il sale di colore giallo ridotto a cristalli insolubili di colore blu 3) Il valore dell assorbanza direttamente proporzionale alla concentrazione di cellule vitali

LETTURA SPETTROFOTOMETRICA

MTT assay
Fibroblasts
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

% viability

% viability

50 40 30 20 10 0

% viability

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

100 90 80 70 60

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

Monocyte-macrophage J774
100 90 80 70

% viability

% viability

% viability

60 50 40 30 20 10 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

Alveolar epithelial A549

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc. Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.
Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/m Croc. 100 g/ml Croc.

100 90 80 70

100 90 80 70

100 90 80 70

% viability

% viability

% viability

60 50 40 30 20 10 0

60 50 40 30 20 10 0

60 50 40 30 20 10 0

Determinazione della lattico deidrogenasi

La quantit di lattico deidrogenasi (LDH), rilasciata nel terreno di coltura, rispetto alla quantit di LDH totale, misurata spettrofotometricamente nelle cellule di controllo e in quelle trattate ad una lunghezza donda di 340 nm, analizzando lossidazione del NADH durante la trasformazione del lattato-piruvato

Ossidazione del NADH durante la trasformazione lattato-piruvato

LDH release
90 80 70 60

% release

% release

50 40 30 20 10 0

50 40 30 20 10 0

% release

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

Fibroblasts
90 80 70 60

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

Monocyte-macrophage J774
90 80 70 60

% release

50 40 30 20 10 0

% release

50 40 30 20 10 0

% release

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

90 80 70 60

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

90 80 70 60

% release

% release

% release

50 40 30 20 10 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc

Alveolar epithelial A549

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Control 5g/ml FE 50g/ml FE 100g/ml FE 5g/ml Croc. 50g/ml Croc. 100g/ml Croc.

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

Lo stress ossidativo
costituisce uno dei fattori di rischio emergenti per la salute; non esibisce una propria sintomatologia; non d luogo ad un vero e proprio quadro clinico; non fornisce al medico elementi tali da suggerire un adeguato approfondimento diagnostico. Il medico, per una serie di ragioni, non sempre informato sullargomento; lanalista di laboratorio non generalmente attrezzato per lesecuzione di test mirati alla valutazione dello stress ossidativo.

Lo stress ossidativo una condizione patologica che viene a determinarsi nellorganismo umano quando la produzione di specie chimiche reattive non pi adeguatamente controllata dai sistemi di difesa antiossidanti.

I radicali liberi
sono atomi o raggruppamenti di atomi aventi in uno degli orbitali esterni delle specie che li costituiscono uno o pi elettroni spaiati, indipendentemente dalla carica espressa.

Vengono classificati sulla base della natura dellatomo al quale appartiene lorbitale con lelettrone spaiato.

Specie chimiche radicaliche

Ne

Latomo di Ne Solo elettroni appaiati Atomo (stabile)

Latomo di O Due elettroni spaiati

Il radicale idrossile (HO.) Un elettrone spaiato Radicali liberi dellossigeno (instabili)

I radicali liberi, al contrario degli atomi, possiedono sempre elettroni spaiati

Anione superossido

sono responsabili della lipoperossidazione e di alterazioni aspecifiche della permeabilit delle membrane plasmatiche; possono reagire con le proteine denaturandole ed anche intercalarsi con gli acidi nucleici

cancerogenesi

Specie reattive dellossigeno (ROS)

endogeni generati nel corso della normale attivit metabolica cellulare, esogeni generati da agenti (fisici, chimici e biologici).

Specie reattive dellazoto (RNS)

di maggiore rilevanza biomedica comprendono variet sia radicaliche (ossido nitrico, NO* e biossido nitrico, NO2*) che non radicaliche (acido nitroso, HNO2 e perossinitrito).

Anione perossinitrito

H2O2 + NO2- ONOO- + H2O

Sintesi schematica dellossido nitrico a partire dalla L-arginina

Biodisponibilit dellossido nitrico e malattie

(NOS, ossido nitrico sintetasi, ONOO-, perossinitrito)

Diverse specie chimiche reattive sono implicate nella patogenesi dello STRESS OSSIDATIVO
Specie chimica
Ozono Anione superossido Ossigeno singoletto Perossido di idrogeno Radicale ossidrile Radicale alchilico (Alchill-)perossil radicale (Alchil)idroperossido Semichinone (dal Coenz. Q) Fenossile (dalla vitamina E)

Formula
O3 O2
1

Classe
Non radicale Radicale Radicale (?) Non radicale Radicale Radicale Radicale Non radicale Radicale Radicale

Specie chimica
Ossido nitrico Acido nitroso Tetrossido nitrico Triossido nitrico Perossinitrito Acido perossinitroso Catione nitronio (Alchil)perossinitrito Acido ipocloroso Tiile

Formula
NO HNO2 N2 O 4 N2 O 3 ONOOONOOH NO2+ ROONO HOClO -S

Classe
Radicale Non radicale Non radicale Non radicale Non radicale Non radicale Non radicale Non radicale Non radicale Radicale

O 2*

H2O2 HO R ROO ROOH Q E-O

Le specie reattive di rilevante interesse biologico sono centrate su pochi elementi (O, N, C, Cl, S)

Un organismo umano di 70 kg utilizza normalmente 3,5 ml di ossigeno al minuto per kg di peso e se si assume che circa l1% dellossigeno viene convertito a radicale superossido, vengono prodotti circa 1,72 kg di radicale superossido allanno.

Per ogni 1012 molecole di ossigeno che entrano nella cellula ogni giorno 1/100 danneggia proteine 1/200 il DNA.

Le specie reattive pi conosciute

- O2- anione superossido: prodotto da cellule del sistema immunitario che aggrediscono i microrganismi e nel corso del normale metabolismo cellulare; gioca un ruolo cruciale nella formazione di altre specie radicaliche come il perossido di idrogeno, il radicale idrossile, lossigeno singoletto;

- OH radicale idrossile: possiede il pi elevato potenziale di elettro-riduzione (2310 mV) ed in grado di attaccare tutte le strutture biochimiche basilari come lipidi, polipeptidi, proteine e le basi del DNA; - 1O2 ossigeno singoletto coinvolto nellossidazione del colesterolo; - ROO radicale perossile: possiede un elevato potenziale standard di riduzione (> 1000 mV) ed coinvolto nella fasi di propagazione delle reazioni a catena radicaliche di perossidazione lipidica; - LOO radicale lipoperossido: prodotto dellossidazione lipidica; - NO2- biossido di azoto radicale anione: pu innescare reazioni di perossidazione lipidica; - OONO- perossinitrito: causa ossidazione diretta di proteine e del DNA; - H2O2 perossido didrogeno o acqua ossigenata: chimicamente non rappresenta un radicale libero, e sebbene non possegga un potenziale di pericolosit al pari di altre specie radicaliche pu, nondimeno, causare un danneggiamento ossidativo nelle cellule.

Lacqua ossigenata una specie dannosa in quanto capace di ossidare composti sulfidrici come i residui di metionina nelle proteine e, a concentrazioni basse, pu portare alla lisi degli eritrociti umani. La pericolosit dellacqua ossigenata non dovuta ad un suo attacco diretto a livello dei componenti cellulari, bens allinterazione con le forme ridotte di alcuni metallo-ioni come il ferro bivalente o il rame monovalente, che porta alla formazione dellidrossi radicale e dello ione ossidrilico.
Reazione di Fenton

Step nelle reazioni radicaliche a catena:

1.inizio:
suoi legami covalenti per effetto della somministrazione di energia per es. termica o radiante con generazione di due nuove specie chimiche, ciascuna con un elettrone spaiato), interazione con i metalli di transizione (lelettrone generato dallossidazione di un metallo di transizione in forma ionica, per es. Fe2+ a Fe3+ o da Cu+ a Cu2+, spezza un legame covalente di una molecola bersaglio, generando cos un radicale libero ed un anione) o

scissione omolitica (divisione di una molecola a livello di uno dei

decomposizione degli azocomposti;

2.propagazione: riarragiamento; 3.termine:

trasferimento, addizione, frammentazione o

combinazione o disproporzione.

Fonti metaboliche primarie di radicali liberi: la membrana plasmatica; i mitocondri; i perossisomi; il reticolo endoplasmatico liscio (microsomi); il citosol.

Gli antiossidanti

possono essere classificati secondo diversi criteri: sulla base dellorigine in endogeni ed esogeni; sulla base della natura chimica in enzimatici e non enzimatici; sulla base della solubilit in liposolubili ed idrosolubili; sulla base del meccanismo di azione prevalente in antiossidanti preventivi, scavenger, agenti di riparo e agenti di adattamento.

Meccanismo dazione degli antiossidanti

Inquinanti, fumo, radiazioni, metalli pesanti, farmaci, alcool, ischemia-riperfusione, Antiossidan Bloccano la ti formazione dei
preventivi Specie Chimiche Reattive radicali Bloccano la reazione di inizio Antiossidan ti scavenger Attacco di biomolecole (glicidi, lipidi, proteine, ecc) Bloccano la reazione di propagazione Reazioni radicaliche a catena

Antiossidanti di riparo e de novo

Riparano il danno e Danno ossidativo ricostituiscono le membrane

Invecchiamento , malattie

Il sistema di difesa antiossidante regolarmente distribuito nellorganismo sia a livello extracellulare che a livello intracellulare.

Enzimi antiossidanti Superossido dismutasi Catalasi Glutatione Perossidasi Glutatione Transferasi

Molecole antiossidanti Vitamina E Vitamina C Coenzima Q10 Acido urico Carotenoidi Glutatione

Il potenziale di riduzione una misura della reattivit di un antiossidante come donatore di idrogeno o di elettroni in condizioni standard
Potenziali di riduzione di alcuni polifenoli e antiossidanti naturali della dieta

Antiossidante
Ascorbato (vitamina C) Epigallocatechina gallato -tocoferolo (vitamina E) Teaflavina Acido caffeico epicatechina

Potenziale di riduzione* (mV)

282 430 500 510 540 570

*potenziali di riduzione standard a pH 7, 20C

Cause di aumentata produzione di specie reattive

Fattori ambientali (radiazioni, inquinamento)

Stati fisiologici (gravidanza)

Stile di vita (alimentazione, alcool, fumo di sigaretta, esercizio

incongruo)

Fattori psicologici (stress psico-emotivo?) Malattie (traumi, infiammazioni, infezioni, patologie da

ischemia-riperfusione, neoplasie)

Fattori iatrogeni (farmacoterapia, radioterapia, raggi X)

Cause di riduzione delle difese antiossidanti

Fattori genetici Fattori ambientali Ridotta assunzione di antiossidanti (ipovitaminosi, diete
monotone, sindromi da malassorbimento, malattia celiaca)

Ridotta capacit di utilizzazione di antiossidanti

(deficit dei meccanismi di captazione o di trasporto)

Fattori iatrogeni (assunzione di farmaci)

Stress ossidativo Possiamo quindi definire lo stress ossidativo come una particolare forma di stress chimico indotto dalla presenza di una quantit eccessiva di specie reattive per unaumentata produzione delle stesse e/o per una ridotta capacit di smaltirne le quantit.
Ossidanti Antiossidanti

Lo stress ossidativo la conseguenza di uno squilibrio tra processi proossidanti e processi antiossidanti
Radiazioni, farmaci, metalli pesanti Fumo di sigaretta, alcool, inquinamento Esercizio fisico inadeguato, sedentariet Infezioni ed altre malattie Ridotta assunzione e/o diminuita sintesi e/o ridotta capacit di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti

Specie reattive
Danno cellulare

Difese antiossidanti
Danno tissutale

Danno dorgano

Danno sistemico

Malattie cardiovascolari

Demenza, M. di Parkinson

Invecchiamento precoce

Infiammazioni, tumori

Altre malattie

Le specie chimiche reattive possono essere sia la causa che leffetto dello STRESS OSSIDATIVO

Lorganizzazione mondiale della Sanit raccomanda una dieta con cinque pasti giornalieri, che comprende:

15% proteine 60% carboidrati 25% lipidi

specie reattive dellossigeno

DCFH-DA diffuses through the cell membrane and is enzymatically hydrolyzed by intracellular esterases to monofluorescent DCFH in the presence of ROS. The intensity of fluorescence is parallel to the levels of intracellular ROS.

ROS

ROS determination
Control
40000 35000

Fibroblasts
40000 35000

5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

I.F./mg protein

I.F./mg protein

30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

I.F./mg protein

30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

Monocyte-macrophage J774
35000 30000 25000

I.F./mg protein

I.F./mg protein

25000 20000 15000 10000 5000 0

I.F./mg protein

20000 15000 10000 5000 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

40000 35000 30000

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

Alveolar epithelial A549

40000 35000 30000

I.F./mg protein

I.F./mg protein

25000 20000 15000 10000 5000 0

I.F./mg protein

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

Control
40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

Analisi colorimetrica dei nitriti

La determinazione dei nitriti eseguita con il metodo spettrofotometrico al reattivo di Griess, metodo molto sensibile, capace di rivelare piccole quantit di nitriti. Lo ione NO2- pu essere determinato per via fotometrica, poich reagendo con il reattivo di Griess, forma un azocomposto che mostra estese coniugazioni e pertanto assorbe nel visibile, presentando un massimo di assorbimento a 520 nm. In ambiente acido lo ione nitrito viene fatto reagire con il reattivo di Griess, formato da una miscela di acido Solfanilico (oppure Solfanilammide) e N-(1-naftil)-etilendiammina. La solfanilammide in ambiente acido viene diazotata dallo ione nitrito. Successivamente il diazocomposto viene copulato con la N-(1-naftil)etilendiammina formando un colorante azoico che presenta un massimo di assorbimento intorno a 520 nm.

Determinazione dei nitriti

Fluoro-edenite 5, 50 and 100 g/ml 96 ore

Monocyte-macrophage J774

Griess assay

Immunocytochemistry

iNOS expression on J774 treated with fluoro-edenite for 96 hrs

Control 2,5 Optical Density 2 1,5 1 0,5 0 FE 50 g/ml FE 100 g/ml

Control

FE 50 g/ml

FE 100 g/ml

NO production on J774 treated with fluoro-edenite for 96 hrs

Control
18 16 14 NO (M) 12 10 8 6 4 2 0

FE 50 g/ml FE 100 g/ml

* *

Nel 1984 Ostling e Johanson furono i primi a sviluppare un metodo per lindagine al fine di rilevare i danni indotti al DNA su singole cellule utilizzando lelettroforesi su gel di agarosio. Questa tecnica che prende il nome di elettroforesi su gel a singola cellula (SCGE) o pi comunemente Comet Assay (test della cometa), permette lo studio del danno primario al DNA rilevato come rotture a singolo o doppio filamento, siti alcalo-labili e cross-link in cellule eucariotiche in vitro e in vivo in diversi tessuti di diversi organismi (uomo e roditori, pesci, molluschi, uccelli, organismi vegetali, etc).

Elettroforesi
E una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa; nel primo caso il processo detto cataforesi, nel secondo anaforesi.

 L elettroforesi senza dubbio una delle tecniche maggiormente utilizzate nei laboratori di biologia molecolare, che permette la separazione la visualizzazione e la purificazione di molecole di interesse biologico quali acidi nucleici e proteine. Tale separazione resa possibile e dal peso molecolare e dalla carica elettrica di cui sono dotate le particelle, ioni o macromolecole. Tali particelle poste in un campo elettrico generatosi dalla d.d.p. applicata a due elettrodi, si muoveranno in direzione dell'elettrodo di carica opposta, quelle cariche positivamente verso il polo negativo e viceversa. Gli acidi nucleici migrano sempre verso il polo positivo per la presenza nella loro molecola di cariche negative dei gruppi fosfato (PO4-- ).

Lelettroforesi pu avvenire su vari supporti Quelli maggiormente utilizzati sono: 1- Carta (elettroforesi delle globuline del sangue) 2- Fase liquida (allinterno di capillari) 3- Gel

Supporto elettivo nei laboratori di biologia molecolare costituito dal gel, che rispetto agli altri supporti presenta diversi vantaggi:

ELETTROFORESI SU GEL

1)il gel non contiene cariche in quanto non sono presenti gruppi ionizzanti; 2) possibile avere gel con maglie di grandezza variabile (in base alla concentrazione della matrice da usare), per tale motivo si effettua una separazione non solo in base alla carica ma anche in base al peso molecolare; 3) si possono facilmente recuperare i campioni dopo la separazione elettroforetica.
I gel maggiormente utilizzati nei laboratori di biologia molecolare sono costituiti da : - poliacrilamide (PAGE), - agarosio.

Usualmente per la separazione di molecole : -a pi basso peso molecolare si usa come supporto del gel l'acrilamide (<500 bp) -a pi alto peso molecolare si usa come supporto l'agarosio (da 500 bp a 20 Kb) I gel possono essere neutri o denaturanti a seconda che essi permettano la migrazione di doppie o singole eliche. La denaturazione di solito permessa grazie all'aggiunta di agenti quali la formamide, urea, ecc.

% DEL GEL RISOLUZIONE KB

0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2

In entrambi i supporti acrilamide o agarosio, si assembla il sistema su un apparecchio per elettroforesi o CELLA ELETTROFORETICA. Esistono in commercio un gran numero e modelli di celle elettroforetiche, di varia: - forma - grandezza - verticali - orizzontali ORIZZONTALE

VERTICALE

Il sistema collegato ad un alimentatore in grado di creare il campo elettrico. Grazie al campo elettrico generatosi la miscela di frammenti comincer a migrare verso il polo positivo in base al loro diverso peso molecolare: quelle pi pesanti (a maggior PM) migreranno pi lentamente rispetto a quelle pi leggere (a minor PM), che a loro volta migreranno pi velocemente.
DNA

Il risultato della corsa elettroforetica consister in una serie di bande. Sul gel si depone anche una miscela di frammenti a PM noto (MARKER) che servir per il calcolo della lunghezza in basi delle bande incognite.

Elettroforesi di DNA

I gel sono fatti di agarosio o di poliacrilammide I campioni di DNA vengono caricati ed e applicata una differenza di potenziale Il DNA, carico negativamente, migra verso lelettrodo + I frammenti di DNA piu piccoli migrano piu velocemente

Elettroforesi di Proteine
Piu complessa dellelettroforesi di DNA
Proteine diverse hanno cariche diverse Le proteine variano molto per forma

Generalmente il gel e di poliacrilammide

Perche usare gel di poliacrilammide per separare le proteine?

I gel di poliacrilammide hanno una trama piu compatta I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu piccole del DNA
Amminoacido medio = 110 Da Paio di nucleotidi medio = 649 Da

1 kilobase di DNA = 650 kDa 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa

Southern blot: per lanalisi del DNA.

(sonda = DNA o RNA). (sonda = DNA o RNA). (sonda = anticorpo).

Northern blot: per lanalisi dellRNA. Western blot: per lanalisi delle proteine.

Comet test o elettroforesi su gel di agarosio di una singola cellula danno al DNA, apoptosi, riparazione del DNA. Biomarker per lo stress ossidativo

Lestrema sensibilit del Comet assay e la capacit che ha di misurare il danno al DNA a livello di ciascuna cellula, lo hanno reso uno strumento mediante il quale risulta estremamente rapida la valutazione della genotossicit di agenti fisici o chimici. La capacit di registrare il danno in un numero alto di cellule d forza statistica al metodo e, allo stesso tempo, permette di rilevare leterogeneit di risposta in una popolazione di cellule.

Il Comet assay si basa sulla capacit del DNA di migrare, in presenza di un campo elettrico, fuori dalla cellula. Il DNA di cellule danneggiate, visualizzato al microscopio, appare come una cometa con la testa (regione nucleare) e una coda determinata dai frammenti o filamenti di DNA che migrano pi velocemente nella direzione dellanodo; il DNA non danneggiato migra invece molto poco e rimane prevalentemente ai confini del nucleo.

Il Comet assay si articola in diverse fasi principali:

Preparazione delle cellule su vetrini da microscopia immerse in agarosio Lisi delle cellule per rompere le membrane e liberare il DNA Unwinding del DNA (srotolamento del DNA) tramite buffer alcalino di elettroforesi (pH>13) Elettroforesi Neutralizzazione degli alcali Colorazione del DNA e visualizzazione dei vetrini al microscopio a fluorescenza

Lo scopo della visualizzazione dei campioni al microscopio a fluorescenza la quantificazione del numero di cellule che presentano il DNA frammentato rispetto a quelle con nucleo intatto, e la quantificazione del danno genetico subito attraverso misurazioni di determinati parametri strutturali della cometa stessa. testa - superficie occupata dal nucleo; coda superficie DNA migrato; densit - rapporto tra il numero di pixel e la superficie dellimmagine.

Questi parametri vengono elaborati dal software consentendo di procedere allanalisi quantitativa e la scelta dei valori da attribuire fondamentale e pu risultare estremamente variabile a seconda delle condizioni sperimentali adottate. Le misure necessarie a determinare lentit del danno genotossico subito vengono effettuate su n. 50 immagini prese random tra 100 cellule. Sulla base di queste misure vengono calcolate:

% di DNA migrato tail moment % DNA migrato x lunghezza coda (tail) tail moment olive % DNA migrato x distanza tra la testa e il centro di massa del DNA nella coda

Saggio della Comet

Il test della cometa in grado di stabilire se un agente induce la formazione di danni al DNA, ma non permette di determinare l'entit del danno o la porzione di genoma che lo ha subito. Per questo, per avere dei risultati sperimentali pi specifici, deve essere accompagnato da altri test di mutagenesi.

Test della Comet

A) la lunghezza della coda (TL); lintensit della coda (TI); larea della coda (TA).

B) la lunghezza della testa (HT); lintensit della testa (HI); la superficie della testa (HA). Questi parametri sono stati usati per determinare il livello del
danno al DNA come: percentuale di DNA frammentato (TDNA) momento della coda (TMOM)

Alveolar epithelial A549

2500

2000

control

TMOM

1500

1000

500

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

5 g/ml
80

50 g/ml
TDNA

70 60 50 40 30 20 10 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

100 g/ml

Fibroblasts
80 70 60

Monocyte-macrophage J774
80

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc. 100 g/ml FE

70 60

TDNA

TDNA

50 40 30 20 10 0

50 40 30 20 10 0

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

2500

2500

2000

TMOM

1000

TMOM

1500

500

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

2000

1500

1000

500

Control 5 g/ml FE 50 g/ml FE 100 g/ml FE 5 g/ml Croc. 50 g/ml Croc. 100 g/ml Croc.

Infiammazione e cancro
While acute inflammation is a part of the defense response, chronic inflammation can lead to cancer, diabetes, cardiovascular, pulmonary, and neurological diseases. Several pro-inflammatory gene products have been identified that mediate a critical role in suppression of apoptosis, proliferation, angiogenesis, invasion, and metastasis. Among these gene products are TNF and members of its superfamily, IL1 , IL-1 , IL-6, IL-8, IL-18, chemokines, MMP-9, VEGF, COX-2, and 5-LOX. The expression of all these genes are mainly regulated by the transcription factor NF-kB, which is constitutively active in most tumors and is induced by carcinogens (such as cigarette smoke), tumor promoters, carcinogenic viral proteins, and -irradiation.

Ambiente extracellulare e

NF-kB

NIK: NF-kB inducing kinase MEKK1: mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase kinase1 IRAK: interleukin-1 receptor associated kinase TRAF: tumour necrosis factor alpha receptor associated factors PKC: protein kinase C

J774 monocyte-macrophage cell line

COX-2

18 16 14 12

Control Fluoro-edenite 5 g/ml Fluoro-edenite 50 g/ml Fluoro-edenite 100 g/ml

*

* * * * * * *

A.D.U.

10 8 6 4 2 0

PGE2
*

80 70 60

Control Fluoro-edenite 5 g/ml Fluoro-edenite 50 g/ml Fluoro-edenite 100 g/ml

* * * * * *

pg/mg protein

24 h

48 h

72 h

96 h

50 40 30 20 10 0
24 h

* * * * * *

48 h

72 h

96 h

Fluoro-edenite induces functional modifications and affect some biochemical parameters, playing an essential role in the development and progression of cancer, in lung cells in a concentration- and time-dependent manner. The sequence of the damage seems to be as follows: at increasing fluoro-edenite concentrations, and/or treatment times, the increase in ROS production, with upregulation of iNOS or NO., could trigger significant DNA damage in fibroblasts, A549 and J774 cells, concomitantly with a drop in cell metabolism, an increase in LDH release and COX-2 and PGE2 production.

Inhaled fluoro-edenite fibers can induce mesothelioma

This is a typical example of nonoccupational exposure of an environmental nature caused by natural fluoro-edenite fibrous amphiboles

ANTIGORITE
from serpentine rock outcropping at Blue Lake near St. Jacques

(AOSTA, ITALY)

Chemical formula: (Mg11.05Fe0.53Al0.21)12.00(Si7.98Al0.02)8.00O20(OH)16 Met-5A

J774

Met-5A
100

MTT assay

*
80

% viability

60 40 20 0

* *

J774
C 5 50 100
100 80

Antigorite

% viability

60 40 20 0

* *
C 5 50 100

Antigorite

LDH release
Met-5A
60

* * *

% release

40

20

J774
0

50 Antigorite

100
60

% release

40

20

*
0

50

100

Antigorite

Reactive oxygen species production

Met-5A
4000

I.F./mg protein

3000

2000

*
1000

J774
C 5 50 100
4000

Antigorite
I.F./mg protein
3000

2000

1000

0
C 5 50 Antigorite 100

Nitric oxide production

Met-5A
40

30

* * *

nM/10 cells

20

10

J774
C 5 50 Antigorite 100
40

30

nM/10 cells

*
20

*
10

50 Antigorite

100

Met-5A
40

PGE2 production

30 pg/ml

20

*
10

0 C 5 50 Antigorite 100
40

J774

30

pg/ml

20

10

*
C 5 50

*
100

Antigorite

 These results surely confirm that mesothelial cells and macrophages exposed to antigorite generate ROS and NO and may undergo oxidative stress. Both ROS and NO can induce inflammatory reactions and/or cell transformation in adjacent tissues. This is confirmed by PGE2 results. In our experimental conditions, the results show a more evident pro-inflammatory effect induced by fibrous antigorite on mesothelial cells than on the macrophages cells.

The results of this study revealed significant biochemical changes in mesothelial Met-5A and monocyte-macrophage J774 cells after antigorite treatment and suggested that these changes may directly or indirectly be responsible for eliciting of antigorite-mediated host pathological or neoplastic responses.

CONCLUSIONS
mineralogical characterization of rocks mined from specific deposits helps determine the presence, form, abundance and morphology of potential toxicants, and can be used to develop predictive models of mineral deposit types where such components may be present.

in vitro toxicity tests of well-characterized ore can help the understanding of toxicity effects of potential toxicants upon exposure present in rocks, soils, dusts and water as a result of natural erosion and weathering of mineral deposits and host rocks. the in vitro investigation is important in order to determine the degree of cell damage induced by the environmental exposure to single breathable inorganic fibres.

Our results have been helpful in revealing the properties of some asbestiform fibers important in toxicity, inflammation and disease, and provided information on the reactivity in fibrous mineral-induced biological and pathological responses.

Opere previste per la messa in sicurezza dellarea di cava del Monte Calvario Legge 241/90

Presenza contemporanea di Fe2+ e Fe3+

Fluoro-edenite 19
2+ 3+ (Na0.307K0.157)0.464(Ca1.05Na0.555Mg0.131)1.997(VIAl0.200 Fe3+ Fe Fe Fe2+0. 0.180 0.180 0.180 Mg4.322Ti0.060Mn0.59)4.931(Si7.679IVAl0.317)7.996O22(F1.970Cl0.020 ) . 1801.990

2+ Fe Fe 0. (Na0.307K0.157)0.464(Ca1.505Na0.495)2.000( Al0.104 Fe Fe Mg4.255Ti0.062Mn0.063)4.980(Si7.520IVAl0.480)8.000O22(F162 Cl0.020)1.990. 1.970 VI 3+ 2+ 0.333 0.333 0.162

Fluoro-edenite 3+ 27

La fluoro-edenite 19 ha un contenuto totale di ferro pi basso rispetto alla 27

Proveniente dalla Val di Susa

TREMOLITE

Ca2(Mg,Fe2+)5[Si8O22](OH)2

Formula chimica

Utilizzata come fibra di riferimento

Proteine da stress hsp

Indotte 73 kDa (solo in cellule sottoposte a stress) Fattori ambientali
Shock termico Metalli pesanti di transizione Inibitori del metabolismo energetico Analoghi degli amminoacidi Agenti chemioterapici

Costitutive 72 kDa (in condizione di crescita normale)

Stati patologici Infezioni virali Febbre Infiammazioni Ischemia Lesioni da ossidanti Neoplasie Fattori cellulari normali Ciclo di divisione cellulare Fattori di crescita Sviluppo e differenziamento

Sono state ritrovate anche nellambiente extracellulare assumendo un importante ruolo nellinduzione delle risposte immunitarie

Proteine da stress
Descritte inizialmente come proteine da shock termico; Cellule di Drosophila sottoposte a temperature crescenti determinano un incremento della concentrazione di una proteina di P.M. 70000 (da 35 a 37C); Tale proteina stata contraddistinta con la sigla HSP70 (heat shock protein).

HEAT SHOCK PROTEIN HSP

Sono state classificate in sei famiglie, essenzialmente sulla base del peso molecolare: hsp100 (100-110 kDa), hsp90 (83-90 kDa), hsp70 (66-78 kDa), hsp60, hsp40 e le small hsp (15-30 kDa). Esse si trovano in diversi compartimenti cellulari dove sono deputate a svolgere specifiche funzioni. Il loro ruolo legato al mantenimento della struttura delle proteine secondo quattro aspetti principali: a)assicurano il raggiungimento e il mantenimento del corretto stato conformazionale delle catene polipeptidiche appena sintetizzate; b)dirigono lassemblaggio di complessi multienzimatici; c)aiutano al mantenimento o alla creazione di uno stato di parziale denaturazione delle proteine, favorendone cos il trasporto attraverso le membrane dei mitocondri o dei plastidi; d)stabilizzano le proteine danneggiate formatesi a seguito di stress chimici o fisici facilitandone la rinaturazione e/o la degradazione.

HSP70

Le proteine Hsp70 si ritrovano in tutte le specie e la loro funzione quella di favorire lassemblaggio di complessi multimerici proteici e, come chaperones molecolari, di facilitare il folding intracellulare delle proteine. Sono costituite da due domini funzionali; un dominio carbossiterminale (circa 25 kDa) contenente il sito di legame per il polipeptide ed un dominio amminoterminale (circa 40 kDa) contenente il sito di legame per ADP/ATP e che ha attivit ATPasica. Funzionano come monomeri o come dimeri, riconoscendo porzioni di 7-8 residui amminoacidici.

HSP70 e apoptosi

HSP70 POTREBBERO SVOLGERE UN RUOLO CHIAVE NEL MEDIARE RISPOSTE IMMUNITARIE CELLULARI

OBIETTIVI
Determinare in vitro gli effetti di diverse fibre asbestiformi: Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 Tremolite (fibra di riferimento)

Cellule mesoteliali Met-5A Cellule monocito-macrofagiche J774

 Valutare lo stress ossidativo indotto dalle fibre asbestiformi a diverso contenuto di ferro

Verificare la possibilit di utilizzare lespressione delle HSP70 come biomarker per le esposizioni alle fibre

Arricchimento preventivo delle fibre anfiboliche rispetto al materiale originale

Sedimentazione gravimetrica

Analisi Western blot Determinazione delle Specie Reattive dellOssigeno

2-7-diclorodiidrofluoresceina-diacetato (DCFH-DA)

Determinazione del rilascio di NO3

Analisi colorimetrica (reattivo di Griess)

Determinazione del rilascio di LDH

spettrofotometricamente analizzando la riduzione del NADH durante la trasformazione del lattato in piruvato

Determinazione della vitalit cellulare

MTT

Cose un Western blot?

Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo.

A cosa serve il Western blot?

Quale la proteina che mi interessa?
SDS-PAGE (non certo) Western blot (certo)
Si basa sul confronto di peso molecolare

Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo

A cosa serve il Western blot?

Quanta proteina di interesse ce?
Proteina di interesse Bande non specifiche

100 80 60 40 20 0 1 100 10000

[proteina], pg

Densita' media (intensita')

Pg di Proteina

Fasi di un Western blot

Prima fase: elettroforesi su gel. (Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico) Terza fase: saturazione o blocking. (La saturazione e usata per prevenire le interazioni non specifiche tra lanticorpo e la membrana)

Fasi di un Western blot

Quarta fase: legame dellanticorpo primario. (Lanticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) Quinta fase: legame dellanticorpo secondario. (Lanticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP, fosfatasi alcalina; o HRP, perossidasi di rafano), riconosce specificamente lanticorpo primario, gia legato alla proteina sulla membrana) Sesta fase: rivelazione o detection. (Lenzima coniugato allanticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

Western blot
HRP

substrato

HRP

luce

Anticorpo primario

Anticorpo secondario

Rivelazione

Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce

pg proteina

Anticorpi policlonali
Produzione Immunizzazione ripetuta dellanimale con lantigene (peptide, proteina purificata o ricombinante) Il sangue e prelevato nel momento di picco di produzione dellanticorpo ed e purificato il siero Il pool degli anticorpi riconosce molti epitopi dellantigene usato per limmunizzazione

Anticorpi monoclonali
riconoscono solo un epitopo

Incubazione con anticorpo secondario

 Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) Substrati Chemioluminescenti

Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato Emettono luce se convertiti dallenzima Possono essere visualizzati su lastre radiografiche

Marcatura radioattiva Anticorpi secondari biotinilati

Espressione di HSP70 in cellule J774

Tre moli te 5 g/ ml Tre moli te 50 g/ ml Tre moli te 100 m/ nl Fluo roaden ite.1 9 5 g/ ml Fluo roaden ite.1 9 50 g/ ml Fluo roaden ite.1 9 100 g/ ml Fluo roaden ite 27 5 g/ ml Fluo roaden ite 27 50 g/ ml Fluo ro aden ite 27 100 g/ ml

Cont rollo

10

Hsp70 70 kDa -tubulina 50 kDa

7 6 5 A. D. U. 4 3 2 1 0 C 5 50 100 Concentrazione (g/ml)
Controllo Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 T remolite

* ^ * ^

* ^

Espressione di HSP70 in cellule Met-5A

C o n t r o l l o Trem olite 5 g/ml Trem olite 50 g/ml Trem olite 100 g/ml Fluor oadenit e.19 5 g/ml Fluor oadenit e.19 50 g/ml Fluor oadenit e.19 100 g/ml Fluor oadenit e 27 5 g/ml Fluor oadenit e 27 50 g/ml Fluor oadenit e 27 100 g/ml

10

Hsp70 70 kDa -tubulina 50 kDa

7 6 5 A. D. U. 4 3 2 1 0 C 5 50 100 Concentrazione (g/ml)

Controllo Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 T remolite

* ^ *

* ^

Livelli di produzione di NO3-

5A
30 25 20

J774
Controllo Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 Tremolite

Met* ^
30 25 20
M/L
Controllo Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 Tremolite

* ^ *^

M/L

15 10 5 0 C

15 10 5 0

* ^

50

100

50

100

Concentrazione (g/ml)

Concentrazione (g/ml)

Produzione ROS

J774
7000 6000 5000 I. F. /mg di proteine 4000 3000 2000 1000 0 C 5 50 100 Concentrazione (g/ml)
Controllo Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 Tremolite

Met-5A
7000

*^ *^
I. F. /mg.di proteine

6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

Controllo Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 Tremolite

*^ *^ * ^

50

100

Concentrazione (g/ml)

indicatore di rottura di membrana cellulare e di necrosi cellulare

Rilascio di LDH

J774
160 140 120
% rilascio

Met-5A
160 140 120 % rilascio 100 80 60 40 20 0 C 5 50 100 Controllo Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 Tremolite

Controllo Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 Tremolite

* ^

* ^

100 80 60 40 20 0
C 5 50 100 Conce ntrazione (g/ml)

* ^

* ^

Concentrazione (g/ml)

Vitalit cellulare

5A
160 140 120
% vitalit

J774
Controllo Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 Tremolite

Met160 140

*^

*^
% vitalit

120 100 80 60 40 20 0

Controllo Fluoro-edenite 19 Fluoro-edenite 27 Tremolite

100 80 60 40 20 0
C 5 50 100 Concentrazione (g/ml)

*^

*^

50

100

Concentrazione (g/ml)

CONCLUSIONI
i minerali fibrosi inducono produzione di proteine da stress HSP70; le fibre di fluoro-edenite producono un maggiore incremento dei livelli di espressione di HSP70 rispetto alle fibre di tremolite; le fibre di fluoro-edenite che hanno un contenuto maggiore di ferro danno luogo ad una maggiore produzione di specie reattive dellossigeno;

 le fibre di fluoro-edenite con un minor contenuto di ferro inducono una maggiore produzione di specie reattive dellazoto; la tremolite che ha un contenuto di ferro minore rispetto alle due fibre di fluoro-edenite induce una minore produzione di specie reattive dellossigeno e dellazoto e di HSP70; le due fibre di fluoro-edenite influenzano maggiormente la vitalit cellulare rispetto alla tremolite.

Oncosoppressori
I geni oncosoppressori - o pi precisamente le proteine da essi codificate assolvono ad una grande variet di funzioni, generalmente in contrasto con le funzionalit espresse dagli oncogeni. Se gli oncogeni infatti, nella maggioranza dei casi, presiedono a tutti i meccanismi di accrescimento e proliferazione cellulare, gli oncosoppressori si pongono come limite a tali funzioni. Le funzioni degli oncosoppressori possono essere: 1. Repressione di geni essenziali per la prosecuzione del ciclo cellulare. Se tali geni non sono espressi, la cellula non sar in grado di progredire verso la mitosi. 2. Interruzione del ciclo cellulare in caso di DNA danneggiato. Finch in una cellula presente DNA danneggiato non riparato, essa non in grado di dividersi. Solo se il DNA viene riparato, la cellula pu proseguire con il ciclo. 3. Avvio dell'apoptosi. Se il danno non pu essere riparato, nella cellula viene avviata l'apoptosi, un processo di morte cellulare programmata che rimuove il rischio che tale cellula possa nuocere all'organismo. 4. Soppressione di metastasi. Diverse proteine coinvolte nell'adesione cellulare sono in grado di impedire alle cellule tumorali di disseminarsi nell'organismo e di ripristinare l'inibizione da contatto.

La proteina del retinoblastoma

Rb e pRB una proteina soppressore tumorale che stata trovata non funzionante in numerosi tipi di cancro. Rb fu cos chiamata perch fu scoperto che il retinoblastoma (un cancro della retina) si sviluppava quando entrambi gli alleli del gene RB1 (il gene che codifica la proteina Rb) era inattivato da una mutazione. La "p" nella sigla pRB sta invece ad indicare che solitamente presente nella cellula come fosfoproteina. La normale funzione di Rb di bloccare la cellula in uno stadio del ciclo cellulare prevenendone errate o dannose divisioni. Cos, quando Rb difettosa, alcune cellule mutate possono continuare a dividersi indisturbate dando origine ad un tumore.

 Rb inibisce la progressione del ciclo cellulare quando defosforilata, mentre lo promuove quando fosforilata. Rb attivata quando la cellula sta finendo la mitosi (fase M) attraverso una fosfatasi che lo defosforila, permettendogli di legare E2F. Quando invece giunto il momento per la cellula di entrare in fase S, un complesso di chinasi ciclina-dipendente (CDK) e ciclina fosforilano Rb, facendolo staccare da E2F. La prima fosforilazione fatta dal complesso Ciclina D/CDK4,6 ed seguita da quella del complesso Ciclina E/CDK2. Rb rimane fosforilata durante le fasi S, G2 ed M. La fosforilazione di Rb permette la dissociazione di E2F-DP da Rb, rendendo il fattore di trascrizione attivo. Quando E2F libero attiva la trascrizione di geni che codificano per cicline (come le Cicline E e A), che faranno procedere il ciclo cellulare attivando le CDK specifiche, ed anche per proteine chiamate Antigene nucleare delle cellule in proliferazione, o PCNA, che aumenta la velocit di duplicazione del DNA e la sua riparazione, aiutando la DNA polimerasi a legare il DNA.

a)

b)

Le cicline implicate in questo evento sono soprattutto le classi D1, D2, D3, della ciclina-D, la quale viene prodotta durante la fase G1, ma nella fase S non pi possibile ritrovarla. La ciclina-D, si lega alla CDK4, il complesso risultante, determina la iperfosforilazione del RB ed il rilascio del fattore di trascrizione E2F. Il fattore di trascrizione E2F viene rilasciato e favorisce l'entrata della cellula nel ciclo cellulare.

Segnali di trasduzione indotti da materiali fibrosi in colture di cellule epiteliali umane alveolari

La trasduzione del segnale

Schema generale dei meccanismi di trasduzione del segnale

Cascata di trasduzione del segnale

La trasduzione del Tipi di recettori segnale

Classificazione dei recettori impegnati nei meccanismi di trasduzione del segnale

La trasduzione del Recettori accoppiati a proteine G segnale

Meccanismi di azione di recettori associati a proteine G (GPCRC)

Il sistema della fosfolipasi C

I recettori accoppiati a proteine Gq (es. 1 adrenergico, muscarinico M3) attivano la fosfolipasi C (PLC). La PLC catalizza la formazione di inositolo trifosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG). IP3 fa mobilizzare calcio dai depositi intracellulari responsabile di diversi effetti quali, ad esempio, contrazione, secrezione, attivazione di enzimi. Il DAG promuove lattivazione della protein chinasi C (PKC) la quale fosforila diverse proteine controllando molte funzioni cellulari.

Le Fosfolipasi C
Meccanismi di azione

Idrolisi del PIP2 da parte della fosfolipasi C-

Le Fosfolipasi C
Meccanismi di azione

Le Fosfolipasi C
Organizzazione strutturale delle isoforme della PLC

Dendogramma dellorganizzazione strutturale delle isoforme della PLC

Le Fosfolipasi C
Domini delle isoforme della PLC

Bacterical PLC (Bacillus cereus)

Mammalian PLC 1 Domini strutturali della PLC 1

Le fosfolipasi C1
Regolazione dellattivit catalitica

Gs Gi Gq G12

Meccanismi di attivazione della PLC 1 a livello citoplasmatico

Meccanismi di regolazione della PLC 1 nucleare

Fluoro-edenite 19, 27, crocidolite e tremolite Fluoro-edenite 19 50% di

Fe2+

< %Fe

tot

(Na0.307K0.157)0.464(Ca1.505Na0.495)2.000(VIAl0.104Fe3+0.333Fe2+0.162Mg4.255Ti0.062Mn0.063)4.980(Si7.520IVAl0.480)8.000O22(F1.970Cl0.020)1.990

Fluoro-edenite 27 Fe2+ >%Fe tot

0 1.990

30% di

(Na0.256K0.164)0.420(Ca1.311Na0.555Mg0.131)1.997(VIAl0.200Fe3+0.180Fe2+0.180Mg4.322Ti0.060Mn0.059)4.931(Si7.679IVAl0.317)7.996O22(F1.970Cl0.02

) Tremolite 17% di Fe3+ Crocidolite 54% di Fe3+

83% di Fe 2+ 46% di Fe 2+

Finalit della ricerca

Analizzare su cellule epiteliali alveolari A549 lespressione della PLC 1 e 1 dopo trattamento con fluoro-edenite Stabilire se 19 il e 27 basso o alto

contenuto di ferro totale, presente rispettivamente nelle fibre di fluoro-edenite 19 e 27, pu influenzare la produzione di Determinare se lesposizione delle citochine pro-infiammatorie cellule epiteliali polmonari alla fluoro-edenite pu indurre un aumento di citochine connesso con Comparare le risposte biologiche lattivazione della PLC della fluoro-edenite con quelle

Materiali e metodi

A549 al microscopio ottico

A549 al microscopio ottico a fluorescenza

Le cellule A549 sono state trattate con le fibre sperimentali alla concentrazione di 50 g/ml per 48 Lespressione della PLC 1 e 1 ore stata valutata mediante analisi Western blot e Le concentrazioni delle citochine immunofluorescenza pro- infiammatorie IL-1, IL-6 e TNF- sono state

Risultati
Espressione della PLC 1 e PLC 1 in cellule A549

Immunofluorescenza in cellule A549

(PLC 1) (PLC 1)

Risultati

Controllo Controllo

Tremolite

Fluoro-edenite 19 Tremolite Fluoro-edenite 19

Fluoro-edenite 27

Crocidolite Fluoro-edenite 27 Crocidolite

Saggio E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

i pozzetti sono rivestiti di anticorpo primario caricamento campione aggiunta di anticorpo secondario incubazione a temperatura ambiente aggiunta di substrato

lettura allo spettrofotometro

Risultati
Concentrazione delle citochine pro-infiammatorie

Risultati
Concentrazione delle citochine pro-infiammatorie

I nostri dati dimostrano:

un espressione aumentata sia di PLC 1 che 1 in cellule A549 trattate con le 4 fibre amianto lespressione della PLC 1 e 1 non collegata con la quantit totale di ferro presente in ciascuna lespressione fibra della PLC 1 aumentata in quelle fibre dove presente una quantit elevata di ferro ferroso

%Fe2+

i livelli di IL-1, IL-6 e TNF- sono pi alti in cellule A549 trattate rispetto a quelle non trattate laumento di citochine correlato positivamente con la quantit totale di ferro presente in ogni fibra, ma non con la quantit di la fluoro-edenite 27 rispetto alla 19 ferro ferroso o ferrico stimola una elevata secrezione di IL-1, IL-6 e TNF- il rilascio di citochine e l'espressione di PLC non sono rigorosamente collegati tutte le fibre promuovono la formazione di cellule giganti multinucleate

Questo il primo studio che

confronta gli effetti della fluoro-edenite 19 e 27 con quelli di tremolite e crocidolite e

valuta

lespressione di PLC 1 e 1 in cellule A549 in rapporto alla quantit di ferro totale e di ione ferroso/ferrico presente

Le fosfolipasi C 1 e 1 e le citochine IL-1, IL-6 e TNF- svolgono un ruolo fondamentale nella risposta biologica alla fluoro-edenite e alle Lesposizione a queste altre fibre damianto fibre pu rappresentare un alto