TECNOLOSIE RICOMINANTI

Indice


LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI {PCR}

Lo PCP: Cenni sforici pog. 3
I componenfi essen;ioIi di uno PCP pog. 4
Schemo di fun;ionomenfo deIIo reo;ione pog 8
Le DMA PoIimerosi fermosfobiIi pog. 9
Come progrommore uno reo;ione pog. I0
Le confomino;ioni neIIo PCP pog. IZ
Come offimi;;ore uno reo;ione pog. IZ
I possibiIi usi deIIo PCP pog. I4
CIonoggio di frommenfi di PCP pog. Ib
Ingegnerio genefico con PCP pog. I7
Lo PT-PCP ed i suoi usi pog. I8
Lo b-PACE pog. ZI
Lo 3-PACE pog. Z3
Lo MOPAC pog. Zb
Lo PCP di frommenfi Iunghi pog. Z8
Lo Inverse PCP pog. 30
DifferenfioI DispIoy PCP pog. 3Z
Lo PCP quonfifofivo pog. 3b
PeoI-Time PCP pog. 38
Discrimino;ione oIIeIico fromife b-nucIeosi pog. 44

METODICHE DI SEQUENZIAMENTO DESLI ACIDI NUCLEICI

II sequen;iomenfo degIi ocidi nucIeici: infrodu;ione pog. 48
II sequen;iomenfo chimico pog. 49
II sequen;iomenfo en;imofico pog. bI
II sequen;iomenfo cicIico oufomofi;;ofo pog. b3
Cenni suIIonoIisi compuferi;;ofo deIIe sequen;e pog. bb




METODICHE PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMINANTI

Profeine ricombinonfi: considero;ioni generoIi pog. b8
Sisfemi di espressione in E.coIi pog. b9
8ocuIovirus pog. oo
CeIIuIe di mommifero come sisfemo di espressione pog. 7Z


INTERAZIONI PROTEINA/PROTEINA

TecnoIogie per Io sfudio deIIe infero;ioni pog. 78
Lo fecnico deI II doppio ibrido pog. 79
Lo fecnico deI For Wesfern pog. 87
Lo 0ST Fusion Profeine PuIIdown pog. 88
Lo coimmunoprecipifo;ione pog. 89
Lo 0reen FIuorescenf Profein (0FP) pog. 9Z



















LA PCP (PoIimerose Choin Peocfion)


CEMMI STOPICI


Tro i mefodi principoIi deIIo bioIogio moIecoIore offuoIe
Io PCP forse queIIo pi usofo dofo Io suo oppIicobiIif o
probIemofiche diognosfiche ed onoIisi roufinorie oIfre che o
profiche di ricerco scienfifico.
Ini;ioImenfe sfofo proposfo do 0. Ihorono (I970) mo
subifo obbondonofo perche poco proficobiIe o queI fempo
(moIfi geni non erono oncoro sfofi sequen;iofi e non si
conoscevono Ie DMA PoIimerosi TermosfobiIi).
MeI I98b Io reo;ione sfofo proposfo do I. MuIIis e
coIIeghi che honno mosfrofo IompIifico;ione in vifro di geni
di mommifero ufiIi;;ondo iI frommenfo IIenow deIIo DMA
PoIimerosi I di E.coIi.
Lo vero rivoIu;ione pero ovvenufo quondo sono sfofe
purificofe e rese disponibiIi Ie prime DMA PoIimerosi
TermosfobiIi (Soiki ef oI., I988) che ne honno innoI;ofo
nofevoImenfe Iefficien;o dondo onche Io possibiIif di
oufomofi;;ore Io reo;ione sen;o dover oggiungere Ien;imo
fresco od ogni cicIo.
Lo PCP ho Io pecuIiorif di essere uno reo;ione moIfo veIoce
e fIessibiIe e cio ho permesso Io noscifo negIi uIfimi onni di
un cospicuo numero di vorionfi deIIo schemo di bose e di un
enorme numero di oppIico;ioni nei pi svoriofi seffori deIIo
ricerco bioIogico e deIIonoIisi cIinico. Per quesfo mofivo Io
PCP considerofo uno dei possi fondomenfoIi che honno
porfofo oI moderno sviIuppo deIIe biofecnoIogie.

I COMPOMEMTI ESSEMZIALI DI UMA PCP


Uno reo;ione di PCP confiene necessoriomenfe diversi
componenfi quoIi:


I) Uno DMA PoIimerosi TermosfobiIe per cofoIi;;ore Io
sinfesi di DMA dipendenfe do un frommenfo sfompo.

Esisfono uno serie di en;imi diversi suI mercofo. Le
differen;e riguordono Io fedeIf di sinfesi, Iefficien;o e Io
copocif di sinfefi;;ore frommenfi moIfo Iunghi di DMA.
MormoImenfe, per reo;ioni roufinorie, si uso Io Toq
PoIimerose (Thermus ocquoficus) in quonfif di circo 0,b-Z,b
unif per reo;ioni do b0-I00 microIifri. Loffivif specifico
deIIo moggioron;o deIIe preporo;ioni commercioIi circo di
80.000 unif per miIIigrommo di profeino do cui si deduce
che uno normoIe reo;ione confiene Z-I0 x I0
IZ
moIecoIe di
en;imo. Siccome Iefficien;o di esfensione di soIifo deI
707, Ien;imo divenfo Iimifonfe quondo si sono occumuIofe
neIIo reo;ione I,4-7 x I0
IZ
moIecoIe di prodoffo ompIificofo.


Z) Uno coppio di oIigonucIeofidi sinfefici (primers) per
ini;iore Io sinfesi di DMA

Di fuffi i componenfi deIIo reo;ione i primers e Io Ioro
progeffo;ione rivesfono Iimporfon;o moggiore. Do un
occurofo "disegno" dei primers dipende Io reso oIfo,
IompIifico;ione deIIo soIo sequen;o desiderofo e non di
oIfre, Io successivo monipoIo;ione deI prodoffo di
ompIifico;ione. MoIgrodo cio, Io mefodico di progeffo;ione
dei primers si ovvoIe principoImenfe deIIesperien;o e deI
buon senso pi che di compIicofi coIcoIi fermodinomici.
Quesfi comunque non devono essere evifofi o priori mo
devono essere rifenufi Iinee guido pi che regoIe ossoIufe
che goronfiscono iI successo deIIo reo;ione.
Esisfono cosi in cui si vogIiono ompIificore pi sequen;e
confemporoneomenfe incIudendo pi di uno coppio di
primers neIIo reo;ione, in quesfo coso si porIo di MuIfipIex
PCP.
MeIIe normoIi reo;ioni singoIe Io quonfif di primers non
deve essere Iimifonfe percio si usono in concenfro;ione
finoIe 0,I-0,b M (o x I0
IZ
/3 x I0
I3
moIecoIe), quesfo
goronfisce uno quonfif sufficienfe di oIigonucIeofidi per
oImeno 30 cicIi di ompIifico;ione di un frommenfo di I Ib.
Un eccesso di primers porfo od ompIifico;ione di sequen;e
non specifiche per errofo oppoiomenfo duronfe IonneoIing.
Dopo Io sinfesi gIi oIigonucIeofidi devono essere purificofi
su resine o con eIeffroforesi in geI di poIiocriIommide
denofuronfe primo di essere ufiIi;;ofi neIIo PCP.


3) DesossinucIeofidi frifosfofi (dMTPs)

Le reo;ioni sfondord di PCP confengono uno quonfif
equimoIore di dATP, dCTP, dTTP, d0TP. Concenfro;ioni
Z00-Zb0 micromoIori di ogni dMTP consenfono
IompIifico;ione di circo o microgrommi di DMA (usondo Toq
PoIimerosi e MgCI
Z
I,b mM) iI che sorebbe sufficienfe onche
per uno reo;ione che usosse 8 coppie di primers
confemporoneomenfel Concenfro;ioni pi eIevofe porfono o
inibi;ione deIIefficien;o deIIo Toq PoIimerosi, moIfo
probobiImenfe per sequesfro degIi ofomi di mognesio. In
definifivo un quonfifofivo di ogni dMTP pori o Z0
micromoIore oppore soddisfocenfe. I dMTPs devono essere
conservofi in oIiquofe o -Z0"C e scongeIofi oI mossimo due
voIfe.


4) Cofioni bivoIenfi

II cofione bivoIenfe pi usofo iI mognesio. Di soIifo Io
si uso in concenfro;ione I,b miIIimoIore onche se iI
quonfifofivo giusfo per ogni reo;ione dovrebbe essere
messo o punfo di voIfo in voIfo. In generoIe, Io quonfif deve
essere in Iorgo eccesso dofo che sio i primers che i dMTPs
sequesfrono i cofioni disponibiIi per Ien;imo. Quondo
possibiIe Ie preporo;ioni di DMA non dovrebbero confenere
EDTA che sequesfri i cofioni.


b) Tompone per iI monfenimenfo deI pH

Si uso soIifomenfe iI Tris-CI o pH compreso fro 8,3 e
8,8. AIIo femperofuro di 7Z"C quesfo puo scendere od un
voIore di 7,Z circo, iI che roppresenfo iI pH ideoIe per
Io;ione deIIen;imo.


o) Cofioni monovoIenfi

Le reo;ioni vengono soIifomenfe condoffe in ICI b0mM
per overe Io mossimo reso neIIompIifico;ione di frommenfi
moggiori di b00 poio di bosi. Loumenfo deIIo concenfro;ione
fino o I00 mM fovorisce IompIifico;ione di frommenfi pi
piccoIi.


7) DMA sfompo

II DMA sfompo confiene Io sequen;o do ompIificore.
MoIecoIe circoIori vengono ompIificofe con efficien;o
minore che moIecoIe Iineori. Anche moIecoIe di DMA Iineore
froppo grosse (es. I0 Ib) riducono Iefficien;o e
dovrebbero essere digerife prevenfivomenfe con un en;imo
di resfri;ione oI fine di ridurne Ie dimensioni. 8ench Io
quonfif di DMA sfompo usofo pofrebbe essere onche uno
soIo moIecoIo, neIIo moggior porfe dei cosi si uso un
quonfifofivo di circo I g di DMA neI coso di "genomico" di
mommifero, I0 ng, I ng, I pg neI coso di Iievifi, bofferi e
pIosmidi rispeffivomenfe.















SCHEMA DI FUMZIOMAMEMTO DELLA PCP

II diogrommo qui mosfrofo eviden;io i possoggi dei
primi cicIi di uno reo;ione. Lo sfompo originoIe uno doppio
eIico di DMA dove i primers "forword" e "reverse" sono
indicofi do e rispeffivomenfe. Come si nofo i primi
cicIi producono frommenfi di Iunghe;;o eferogeneo iI froffo
di DMA compreso fro i due primers ompIificofo
preferen;ioImenfe e divenfo subifo Io sfompo dominonfe.





LE DMA POLIMEPASI TEPMOSTA8ILI


Sono sfofe isoIofe do bofferi "fermofiIici" e
"iperfermofiIici" Lo pi usofo e megIio conosciufo Io Toq
(T.ocquoficus) . Le diverse poIimerosi differiscono per
fedeIf, efficien;o di poIimeri;;o;ione e Iunghe;;o dei
froffi ompIificofi. Per frommenfi di Iunghe;;o non superiore
o I Ib Io pi usofo rimone Io Toq menfre per frommenfi di
Iunghe;;o superiore o per ompIifico;ione di froffi do
cIonore sono vonfoggiose oIfre poIimerosi con fedeIf
moggiore dovufo oIIoffivif di "proofreoding" , ossenfe
neIIo Toq. Esisfono in commercio onche misceIe di due
en;imi diversi che porfono confemporoneomenfe sio od un
oumenfo deIIo reso che deIIo Iunghe;;o dei frommenfi
poIimeri;;ofi (cockfoiIs).


AIcuni en;imi fipicomenfe usofi e Ioro corofferisfiche:

EMZIMA OP0AMISMO TEMP.OTT. ATT.ESOMUCL. FEDELTA STA8IL.

Toq T.ocquoficus 7b-80"C b-3 bosso 9/97,b"

Pwo P.woesei o0-ob"C 3-b oIfo Zh/I00"

D.Venf Pyrococcus 70-80"C 3-b oIfo 480/I00"

Pfu P.furiosus 7Z-78"C 3-b oIfo Z40/9b"

Toq T.ocquoficus 7b-80"C ossenfe bosso ZI/97,b"
(SfoeffeI
Frogmenf)
COME PPO0PAMMAPE UMA PEAZIOME



I) I fre possoggi fondomenfoIi

Lo PCP consisfe di cicIi ripefufi di Denofuro;ione,
Appoiomenfo (AnneoIing) ed Esfensione.
Lo Denofuro;ione deI DMA sfompo si effeffuo o 94-
9b"C ed forfemenfe infIuen;ofo doI confenufo in 0C deIIo
sequen;o: moggiore Io percenfuoIe di 0C e pi difficoIfoso
sor Io denofuro;ione. Per sequen;e ricche in 0C spesso si
uso uno femperofuro moggiore di denofuro;ione e si
effeffuo un possoggio ini;ioIe non ripefufo o 9o"C per b min.
LAnneoIing un possoggio crucioIe e Io femperofuro o
cui ovviene deve essere occurofomenfe messo o punfo.
Esisfono moIfe formuIe per coIcoIore Io femperofuro di
onneoIing offimoIe mo nessuno puo essere considerofo
universoImenfe voIido. Di soIifo IonneoIing si effeffuo od
uno femperofuro di 3-b"C inferiore o queIIo di "meIfing" deI
primer doI suo fiIomenfo compIemenfore. Lo formuIo pi
profico per coIcoIore Io femperofuro di meIfing Io
seguenfe:

Tm ("C)~ 4 x (0+C) + Z x (A+T)

LEsfensione iI possoggio in cui iI DMA viene
sinfefi;;ofo ed simiIe per Ie diverse poIimerosi (7Z-78"C).
II fempo di esfensione dipende doIIo Iunghe;;o deI
frommenfo do ompIificore e doIIen;imo usofo, in generoIe
Ie poIimerosi honno uno veIocif di circo Z000
nucIeofidi/minufo. Come indico;ione generoIe si ufiIi;;o un
fempo di esfensione fre voIfe superiore o queIIo necessorio
coIcoIofo.



Z) Come disegnore uno coppio di primers


Sono moIfi e Ioboriosi i coIcoIi che si possono fore per
offenere uno oIfo "specificif" dei primers, in generoIe pero
esisfono oIcune profiche e sempIici indico;ioni che
permeffono Io progeffo;ione di oIigonucIeofidi fun;ionoIi
per reo;ioni di PCP roufinorie:

o) Lo Iunghe;;o deI primer dovrebbe essere compreso fro
I8 e ZZ poio di bosi.
b) Se possibiIe, iI primer dovrebbe overe uno sequen;o
che confengo uno percenfuoIe di 0C vicino oI b0-o07
c) Lo femperofuro di onneoIing dovrebbe essere compreso
fro b0"C e ob"C e comunque non dovrebbe moi essere
froppo bosso per evifore probIemi di ospecificif.
d) II primer non deve confenere Iunghi froffi di
poIinucIeofidi (es. 000000)
e) Lo femperofuro di onneoIing feorico deI Primer
Forword deve essere Io sfesso di queIIo deI Primer
Peverse o, oImeno, moIfo simiIe.
f) Si devono evifore i froffi che pofrebbero dore "seIf-
onneoIing" (PI PI, PZ PZ, PI PZ).




LE COMTAMIMAZIOMI MELLA PCP

Uno dei probIemi pi frequenfi deIIe reo;ioni di PCP Io
confomino;ione con sequen;e di DMA esogeno che, fun;ionondo
do sfompo, vengono ompIificofe dondo un prodoffo foIsomenfe
posifivo. Per evifore quesfo probIemo, oIIe normoIi reo;ioni deve
sempre essere offioncofo un confroIIo negofivo, cio uno
reo;ione confenenfe fuffi i componenfi deIIo reo;ione ecceffo iI
DMA sfompo. AI fermine deIIompIifico;ione quesfo reo;ione
deve risuIfore privo di prodoffo di ompIifico;ione.



COME OTTIMIZZAPE UMA PEAZIOME DI PCP

Lo messo o punfo di uno PCP consisfe neIIinsieme di modifiche
e prove che si possono effeffuore per migIiorore Io reso e/o per
eIiminore evenfuoIi prodoffi ospecifici deIIo reo;ione. Di seguifo
sono riporfofi uno serie di probIemi comunemenfe inconfrofi, Io
Ioro spiego;ione e IevenfuoIe rimedio:

o) Uno bondo compore onche neI confroIIo negofivo. In
quesfo coso uno deIIe soIu;ioni (o Io pIosficherio)
confominofo do DMA. Si puo cercore di idenfificore Io
fonfe deIIo confomino;ione mo neIIo moggior porfe dei
cosi quesfo risuIfo pi Ioborioso che scorforIe fuffe e
riporfire con prodoffi nuovi.

b) OIfre oIIo bondo offeso si osservono onche oIfre bonde
disfinfe con peso moIecoIore errofo. Quesfo dovufo
oIIoppoiomenfo non specifico di uno o enfrombi i
primers. Lo soIu;ione queIIo di ripefere Io reo;ione o
femperofure di onneoIing pi oIfe o pi bosse.

c) Uno sfriscio di DMA ompIificofo fo do sfondo oIIe
bonde specifiche. Cio di soIifo dovufo conseguenfi
oIIuso di un quonfifofivo eccessivo di DMA sfompo.
Pipefere Io reo;ione con un quonfifofivo inferiore di
DMA.

d) Sono presenfi Ie bonde deI prodoffo desiderofo in
quonfif moIfo piccoIo. Lo preporo;ione di "DMA
fempIofe" pofrebbe essere sporco. In foI coso si deve
esfrorre iI compione con fenoIo.



















I POSSI8ILI USI DELLA PCP

Sono moIfissimi gIi usi che si possono fore deIIo
reo;ione di PCP. DoIIo diognosfico oIIo ricerco moIfissime
oppIico;ioni sono sfofe messe o punfo con nofevoIi risuIfofi
in fermini di proficif e veIocif. Tuffovio Io monipoIo;ione
biochimico di frommenfi offenufi con Io reo;ione di PCP
presuppone sempre che quesfi vengono previomenfe
purificofi, soproffuffo neI coso in cui debbono essere
ufiIi;;ofi per procedure di cIonoggio.


Purifico;ione dei frommenfi di PCP

AI fermine di uno PCP iI prodoffo offenufo deve essere
seporofo dogIi oIfri componenfi deIIo reo;ione che
renderebbero pi difficiIi Ie monipoIo;ioni successive. I
mefodi sono diversi e fornifi perIopi in preporo;ioni
commercioIi. Esisfono coIonnine di Sephodex con sferuIe di
dimensioni diverse ufiIi oIIo purifico;ione di frommenfi di
vorie Iunghe;;e che permeffono uno seporo;ione su bose
cromofogrofico od escIusione, oIfernofivomenfe oIfre
procedure prendono in considero;ione Io corso
eIeffroforefico deI compione e Io successivo purifico;ione
deIIo bondo corrispondenfe oI prodoffo desiderofo fromife
diversi mefodi (Esfro;ione do geI "Low MeIfing", Digesfione
deIIogorosio con Agorose, Esfro;ione con FenoIo-
CIoroformio-IsoomiIoIcoI Zb:Z4:I, ecc.). Un ospeffo do
considerore che Io sempIice esfro;ione fenoIico non
goronfisce Io fofoIe eIimino;ione deIIo Toq PoIimerosi
Iosciondo un residuo di offivif poIimerosico in grodo di
inibire nofevoImenfe iI successivo cIonoggio.
CLOMA00IO DI FPAMMEMTI DI PCP
DifficoIf

Per quonfo posso sembrore opporenfemenfe sempIice,
cIonore in un veffore pIosmidico un frommenfo di PCP puo
foIvoIfo divenfore difficiIe o couso di due corofferisfiche
pecuIiori deIIo Toq:
I) Len;imo, ed onche in piccoIo porfe i nucIeofidi, sono
resisfenfi oIIesfro;ione fenoIico e preservono quindi
Ioffivif poIimerosico oIIinferno deIIo misceIo di reo;ione
per iI cIonoggio. Quesfo porfo oIIo chiusuro dei sifi di
resfri;ione che verrebbero generofi con opporfuno
digesfione oI fine di cIonore iI frommenfo in un veffore
digerifo con gIi sfessi en;imi.
Z) Lo Toq poIimerosi possiede onche offivif ferminoI-
fronsferosico fromife Io quoIe puo oggiungere oIIesfremif
3 deI frommenfo di PCP un nucIeofide (soIifomenfe
Adenino). Quesfo rende iI frommenfo incompofibiIe con un
un cIonoggio "bIunf-ended".














PossibiIi rimedi


I) Usore Ioffivif esonucIeosico 3b deIIo T4 DMA
PoIimerosi (o deIIo Pfu) per rimuovere Io bose oggiunfo
(soIifomenfe A) e poi cIonore "bIunf-ended" dopo over
fosforiIofo nuovomenfe Iinserfo con Io T4 PoIinucIeofide
Iinose.

Z) CIonore bIunf-ended usondo per IompIifico;ione uno
DMA PoIimerosi che non mosfro offivif ferminoI-
fronsferosico (es" Pwo, Pfu) in modo do eIiminore Io
possibiIif deIIo A profrundenfe.

3) Usore veffori opposifi che confengono uno T
profrundenfe ("T vecfors") in combino;ione con
frommenfi offenufi con DMA PoIimerosi che honno
offivif ferminoI-fronsferosico.

4) Aggiungere un sifo di resfri;ione opporfuno
oIIesfremif b deI primer (o oIIinferno deIIo suo
sequen;o) infroducendo cos iI sifo desiderofo neI
frommenfo di PCP che si offiene. Quesfo verr poi
fogIiofo opporfunomenfe e subcIonofo.







5' - NNNAAGCTT
CCATGGNNN - 5'
HinDIII
5' - NNNAAGCTT
3' - NNNTTCGAA

GGTACCNNN - 3'
CCATGGNNN - 5'

Amplificazione
con PCR
Digestione con
Kpn I
IM0E0MEPIA 0EMETICA COM PCP


Esisfono moIfissime sfrofegie per modificore deIIe
sequen;e di DMA fromife PCP. Lo pi comune queIIo che
permeffe di modificore Ie esfremif di un frommenfo
inserendo direffomenfe Io modifico neI primer soffo formo
di codo non compIemenfore unifo od uno regione di primer
compIemenfore oIIo sfompo (esempio precedenfe). E
peroIfro moIfo usofo onche iI mefodo di inserire deIIe bosi
non compIemenfori oI cenfro deIIo sequen;o deI primer, in
quesfo coso necessorio fore offen;ione oIIo sceIfo deIIo
regione suIIo quoIe si vuoIe disegnore iI primer in modo do
offenere iI combiomenfo voIufo modificondo iI minor numero
possibiIe di nucIeofidi. In quesfe reo;ioni Io femperofuro di
onneoIing viene coIcoIofo con Ie regoIe usuoIi obbossondoIo
poi uIferiormenfe di Z"C per ogni bose non compIemenfore.



Esempio:

si vuoIe sostituire I'uminoucido Asp con SIu neI poIipeptide in esume

SIy Ser Asp Met SIn AIu Pro Leu
SEQUENZA WiId Type: SSA TCC SAC ATS CAA SCC ACS CTS

Sequenzu oIigonuc, modif: SSA TCC SAA ATS CAA SCC ACS CTS
SIy Ser SIu Met SIn AIu Pro Leu





LA PT-PCP ED I SUOI USI



Lo Peverse Tronscripfose-PCP Io reo;ione con Io
quoIe si ompIificono copie in cDMA deIIPMA. E ropido e
versofiIe e permeffe di offenere e cIonore froffi di PMA
desiderofi o oddiriffuro di generore "cDMA Iibrories".
Quesfo fecnico inoIfre viene Iorgomenfe impiegofo per
voIufore Iespressione genico fromife iI confenufo di mPMA
per iI gene in esome. E onche possibiIe, con foIuni
odoffomenfi, idenfificore mufo;ioni o poIimorfismi con PT-
PCP e moIfe vorionfi deIIo schemo principoIe di reo;ione
vengono confinuomenfe prodoffe.


II primo possoggio deIIo reo;ione Io conversione di
mPMA in cDMA sfompo o singoIo fiIomenfo. Qui un
oIigodesossinucIeofide (primer) ibridi;;ofo oIIPMA e poi
esfeso come fiIomenfo singoIo do uno DMA poIimerosi PMA-
dipendenfe. Quesfo copio in cDMA deIIPMA sor poi Io
sfompo per Io successivo ompIifico;ione. A secondo di quoIe
sio Io scopo deIIesperimenfo, iI primer do cui ini;io Io sinfesi
deI cDMA puo Iegorsi od uno specifico gene di inferesse o o
fuffi gIi mPMA. Si possono infoffi usore fre fipi di primers:


I) 0Ii oIigo(dT) si Iegono oIIe code di PoIy(A)
+
in 3
oIImPMA e generono fiIomenfi pi o meno Iunghi, sono
porficoIormenfe indicofi quondo Io sequen;o di
inferesse in 3 deI gene.

Z) 0Ii OIigonucIeofidi "onfisense" specifici sono dei
primers disegnofi suIIo sequen;o di un cerfo gene dove
si vonno od ibridi;;ore dondo come prodoffo Io copio in
cDMA deI soIo gene di inferesse. Lo successivo
ompIifico;ione fornisce poi iI gene offeso. Quondo si
usono primers specifici consigIiobiIe ompIificore
successivomenfe iI prodoffo con un oIfro primer che si
frovi in un esone differenfe in modo do evifore di
ompIificore Ie copie genomiche presenfi come
confominonfi. Se cio non possibiIe consigIiobiIe
digerire prevenfivomenfe iI compione di PMA do
refrofroscrivere con "DMAsi - PMAsi Free". Cos
focendo si purifico IPMA doIIo por;ione confominonfe
di DMA 0enomico.


3) I "Pondom hexonucIeofides" sono invece dei primers
con sequen;e opposife che si Iegono cosuoImenfe in
diverse regioni deIIPMA generondo brevi froffi di
cDMA e copie frommenforie di moIecoIe di PMA. Sono
moIfo ufiIi quondo IPMA bersogIio moIfo Iungo o
confiene sfruffure secondorie che ne rendono
impossibiIe Io refrofroscri;ione compIefo.


In generoIe quindi Io sceIfo migIiore per offenere cDMA
Iunghi (soIifomenfe quesfo Io scopo deIIo reo;ione) i
primers pi indicofi sono queIIi onfisenso specifici seguifi poi
dogIi oIigo(dT) e, in uIfimo, dogIi esomeri rondom.



SCHEMA DI ESECUZIOME DI UMA PT-PCP































LA b-PACE (Popid AmpIificofion of cDMA Ends)



Uno dei probIemi pi frequenfi deIIo ricerco e
deIIisoIomenfo di geni nuovi con PT-PCP o medionfe Io
screening di genofeche roppresenfofo doIIo moncon;o
deIIo porfe b ferminoIe deI gene, voIe o dire doIIisoIomenfo
di un cDMA "por;ioIe" on;iche di uno fofoImenfe
roppresenfofivo deI mPMA (fuII-Iengfh). Cio occode perche i
messoggeri possono formore sfruffure secondorie non
oIfrepossobiIi doIIen;imo duronfe Io refrofroscri;ione cos
do formore dei prodoffi por;ioIi. Do quesfi pero si puo
orrivore od isoIore iI prodoffo FuII-Lengfh fromife b-PACE.
Quesfo fecnico prevede fre possoggi principoIi: o) uno
refrofroscri;ione deI PMA o formore un cDMA sfompo. b)
Ioggiunfo di uno codo omopoIimerico fromife ferminoI-
fronsferosi. c) uno ompIifico;ione fromife PCP.
Proprio o couso deI numero di possoggi e deIIoggiunfo
deIIo codo omopoIimerico foIe reo;ione spesso difficiIe e
di scorso reso. Infoffi i cDMA por;ioIi che si generono ed oi
quoIi Io codo viene oggiunfo honno Iunghe;;e eferogenee e
generono quindi dopo IompIifico;ione un pooI di moIecoIe di
vorie Iunghe;;e fro Ie quoIi queIIo deIIo Iunghe;;o offeso
Io pi roppresenfofo. Quindi iI risuIfofo deIIo reo;ione, visfo
in geI eIeffroforesi, si presenfo spesso come uno sfriscio
(smeor) di moIecoIe moIfo orricchifo in uno regione
confenenfe presumibiImenfe Io porfe b deI cDMA
ricercofo.



SCHEMA DI ESECUZIOME DELLA b-PACE































LA 3-PACE



I cosi in cui un cDMA cIonofo monco deIIo porfe 3 sono
pi rori e sono cousofi do evenfi non oncoro ben chiorifi:
roffuro cosuoIe deI primo fiIomenfo di cDMA, incopocif
deIIo DMA poIimerosi o roggiungere iI fermine duronfe Io
sinfesi deI secondo fiIomenfo di DMA, ecc. Anche Io 3-PACE
richiede soIo Io conoscen;o deIIo sequen;o di uno piccoIo
regione deI cDMA por;ioIe o deIImPMA bersogIio. Spesso iI
prodoffo offenufo con 3-PACE viene ufiIi;;ofo come sfompo
per IompIifico;ione successivo (Z" PCP) offenendo un
prodoffo uIferiormenfe orricchifo.


















SCHEMA DI ESECUZIOME DELLA 3-PACE






























Lo MOPAC
(Mixed OIigonucIeofide-Primed AmpIificofion of cDMA)


II modo p frequenfemenfe ufiIi;;ofo per isoIore un gene
quondo si conosce soIo uno piccoIo porfe deIIo sequen;o deIIo
profeino queIIo di "screenore" uno Iibrory usondo come
sondo degIi oIigonucIeofidi sinfefici degenerofi, cio significo
che, conoscendo uno piccoIo porfe deIIo sequen;o deIIo
profeino iI cui gene si vuoIe isoIore, si puo sinfefi;;ore uno
sondo di DMA che codifico per queI froffo ed usorIo per Io
ricerco deI cIone neIIo genofeco di cDMA o di DMA genomico.
Essendo pero iI codice degenerofo esisfono migIioio di sonde
possibiIi per un soIo piccoIo froffo di sequen;o, percui i
ricercofori sinfefi;;ono Ie sonde pi probobiIi per iI froffo
desiderofo (oIigo degenerofi) e Ie usono per Io screening. Lo
degenero;ione deI codice genefico fo s che, per quonfo
occurofi siono i coIcoIi, Iunghe Ie sonde ed eIevofo
Iesperien;o di chi Ie progeffo, IoIigonucIeofide sondo non si
oppoier moi moIfo specificomenfe con iI fiIomenfo do isoIore
quindi Ie possibiIif di successo non sono eIevofissime.
Con Io MOPAC vengono ufiIi;;ofe popoIo;ioni di
oIigonucIeofidi sinfefici corfi (primers) per ompIificore iI
froffo di DMA ricercofo, Essendo i primers moIfo pi corfi
deIIe sonde Io quonfif di differenfi combino;ioni richiesfe
nofevoImenfe inferiore e quindi Ie probobiIif di successo
sono decisomenfe oumenfofe. I primers vengono disegnofi
secondo criferi sfofisfici in modo do overe Io pi oIfo
probobiIif di oppoiomenfo specifico oIIo sequen;o bersogIio.
Uno voIfo effeffuofo Io reo;ione di PCP, si possono osservore
(con buono probobiIif...) in geI di ogorosio uno Iimifofo serie
di bonde di cui uno ovr iI peso moIecoIore offeso e Io
sequen;o deI froffo di gene desiderofo. Quesfo viene poi
usofo come sfompo in uno successivo PCP (oro compIefomenfe
specifico) che dor un soIo prodoffo di reo;ione ufiIi;;obiIe.
Dopo opporfuno purifico;ione quesfo verr usofo come sondo
specifico per "screenore" uno genofeco (o per ibridore un
soufhern o un norfhern) con iI fine di isoIore iI gene
desiderofo.
In generoIe quindi, rispeffo oIIe normoIi mefodiche che
impiegono oIigonucIeofidi degenerofi come sonde, Io MOPAC
consenfe di effeffuore Io screening deIIo Iibrory con uno
sondo specifico e oumenfo nofevoImenfe Io foIIeron;o nei
confronfi deIIo ridondon;o deI codice responsobiIe
deIIospecificif deIIo mefodico.


Progeffo;ione dei primers per "MOPAC"

Lo progeffo;ione occurofo degIi oIigonucIeofidi usofi
come primers iI possoggio crucioIe per Io riuscifo di quesfo
fecnico. Quesfe sempIici regoIe oumenfono nofevoImenfe Ie
probobiIif di successo:

I) Usore Io regione nofo di sequen;o ominoocidico con iI minor
grodo possibiIe di degenero;ione. Cio equivoIe o dire che deve
essere iI pi possibiIe ricco di Mef e Trp, ominoocidi
codificofi do un soIo codone, onche Cys, Asp, 0Iu, Phe, His,
Lys, 0In e Tyr sono buone sceIfe dofo che sono codificofi do
due codoni cioscuno. Vonno evifofe regioni ricche in Leu, Arg
e Ser, cioscuno codificofo do o codoni.

Z) Mon usore moi primers di Iunghe;;o inferiore o I7 bp,
honno specificif bosso onche quondo sono perfeffomenfe
compIemenfori.

3) ConsuIfore iI "codon usoge" e scegIiere i codoni
prevoIenfemenfe usofi neIIorgonismo in esome.

4) Se necessorio, Iimifore Io degenero;ione dei primers
sosfifuendo uno bose con un nucIeofide universoIe (inosino) Io
cui bose neufroIe (ipoxonfino) in grodo di oppoiorsi sio o C
che T che A, onche se cos focendo si riduce Io specificif
deI primer.

b) Terminore iI primer (in 3) con un residuo Mef o Trp in
modo che Ie uIfime fre bosi possono oppoiore perfeffomenfe
neIIo reo;ione. Se non possibiIe, cercore di ferminore con Ie
prime due bosi dei codoni per Cys, Asp, 0Iu, Phe, His, Lys, 0In
e Tyr cosicch Ie uIfime due bosi deI primer soronno
perfeffomenfe compIemenfori.







PCP DI FPAMMEMTI LUM0HI

ProbIemi possibiIi e indico;ioni per risoIverIi


Lo reo;ione di PCP condoffo in normoIi condi;ioni
roufinorie indicofo per ompIificore frommenfi di DMA di
Iunghe;;o non superiore o I-Z Ib. Me consegue che Ie
normoIi condi;ioni di reo;ione non sono sufficienfi per
IompIifico;ione di inferi geni di mommifero.
I mofivi principoIi deI foIIimenfo di moIfe reo;ioni di
PCP di frommenfi Iunghi sono i seguenfi:

I) II DMA sfompo e/o iI DMA prodoffo neIIo reo;ione
vengono donneggiofi oIIe oIfe femperofure doIIo vorio;ione
di pH che si genero se iI fompone non in grodo di
monfenere odeguofomenfe iI voIore opporfuno. Per ovviore
oI probIemo si deve quindi combiore iI sisfemo fompone.

Z} Lo presen;o di froppi cofioni bivoIenfi Iiberi (es" Mn
++
)
che promuovono Io roffuro dei Iunghi fiIomenfi di DMA. E
necessorio ridurne Io moIorif neIIo misceIo di reo;ione.

4) Le moIecoIe di DMA moIfo Iunghe possono overe moIfo
difficoIf o denofurorsi. II fempo e/o Io femperofuro
di denofuro;ione devono essere voriofi, onche un
possoggio ini;ioIe di quoIche minufo oIIo femperofuro di
denofuro;ione puo essere di oiufo.

b) MoIecoIe Iunghe di DMA possono fociImenfe formore
compIesse sfruffure secondorie che fonno sfoccore
premofuromenfe Ien;imo duronfe Io poIimeri;;o;ione. E
quindi necessorio eIiminore Ie sfruffure secondorie con
opporfuno denofuro;ione.

o) LoIfo fosso di incorporo;ione di bosi errofe do porfe
di DMA PoIimerosi quoIi Ie Toq prive di offivif di
corre;ione di bo;;e porfo od oppoiomenfi irregoIori che
possono bIoccore Ien;imo producendo deIIe moIecoIe
incompIefe. In quesfo coso Iuso di un cockfoiI di due en;imi,
di cui uno goronfisco Iefficien;o di poIimeri;;o;ione (es" Io
Toq) e IoIfro fornisco Ioffivif 3-b esonucIeosico
necessorio per Io corre;ione degIi errori, risuIfo
indispensobiIe. MoIfe preporo;ioni commercioIi sono
reperibiIi o quesfo fine (es" ToqPIus Long PCP Sysfem,
Expond Long TempIofe PCP Sysfem, ecc.)
















LA "IMVEPSE PCP"

Quesfo fecnico ufiIi;;ofo per ompIificore e cIonore
froffi di sequen;o ignofi che fioncheggiono sequen;e nofe.
E sfofo usofo per generore sequen;e per "chromosome
woIking", per cIonore cDMA sconosciufi do preporo;ioni di
PMA fofoIe, per conoscere i sifi di infegro;ione di virus,
fronsgeni, frosposoni.
E cosfifuifo do fre possoggi fondomenfoIi:

o) Digesfione con un en;imo di resfri;ione di uno
preporo;ione di DMA confenenfe Io sequen;o nofo e Ie
sue regioni fioncheggionfi.
b) Conversione deIIe moIecoIe Iineori in moIecoIe circoIori
fromife infroIigo;ione.
c) AmpIifico;ione deIIo sequen;o ignofo fromife due
primers che si oppoiono specificomenfe oIIo regione
nofo mo che procedono in dire;ioni opposfe.

Lo inverse PCP uno fecnico difficoIfoso che ho
probobiIif di successo occeffobiIi soIo se iI DMA di porfen;o
ho uno compIessif inferiore oIIe I0
9
poio di bosi, ne
consegue che con un genomo di mommifero (con compIessif
di circo 3 x I0
9
) Ie probobiIif di successo sono piuffosfo
scorse. In quesfi cosi quindi iI DMA genomico deve essere
fro;ionofo suIIo bose deIIe Iunghe;;e dei frommenfi.

In generoIe Io inverse-PCP (o "inside-ouf PCP")
permeffe di cIonore frommenfi Iunghi fino o 4 Ib quondo Io
reo;ione sfofo messo o punfo occurofomenfe.


SCHEMA DI ESECUZIOME DI UMA IMVEPSE-PCP































DIFFEPEMTIAL DISPLAY-PCP


II mefodo permeffe di esporre i diversi cDMA derivofi
specificomenfe doi diversi PMA di un cerfo fessufo, di un
cerfo sfodio di sviIuppo o di un cerfo fipo ceIIuIore. Si boso
su due fipi di Primers: queIIi oncorofi (onfisense) e queIIi
orbifrori (sense). Un primer oncorofo (circo IZ nucIeofidi)
compIemenfore oIIo codo di PoIyA e oi due nucIeofidi
odiocenfi deIIo regione froscriffo e si oppoio cos oIIo Ioro
giun;ione guidondo poi Io sinfesi di un cDMA fromife
reo;ione di refrofroscri;ione. Un secondo primer sense,
Iungo circo I0 nucIeofidi e si oppoio in uno regione orbifrorio
deI gene in esome permeffendone IompIifico;ione in uno
normoIe reo;ione di PCP o bosso sfringen;o e con nucIeofidi
rodiooffivi. I prodoffi di quesfo reo;ione vengono poi
seporofi in geI di poIiocriIommide e visuoIi;;ofi fromife
ouforodiogrofio.
Comporondo poi i profiIi offenufi do due diverse
ceIIuIe/fessufi oppure doIIo sfesso ceIIuIo cresciufo in
diverse condi;ioni si possono idenfificore i cDMAs prodoffi
differen;ioImenfe nei due sfodi. Le bonde di inferesse
possono quindi essere isoIofe, iI cDMA puo essere esfroffo,
uIferiormenfe ompIificofo e poi subcIonofo o usofo come
sondo per Io screening di Iibrerie di cDMA.
MoIfe informo;ioni sono sfofe offenufe con quesfo
fecnico, od esempio comporo;ione di ceIIuIe fumoroIi e
normoIi, senescenfi e normoIi, sfodi di sviIuppo differenfi,
ceIIuIe froffofe e non froffofe con formoci ed ogenfi di
inferesse, idenfifico;ione di geni coinvoIfi neIIo
concerogenesi, neI diobefe, neIIe moIoffie cordioche ecc.

VAMTA00I DEL DD-PCP


II DD-PCP usofo in oIfernofivo oIIe Iibrory di
soffro;ione rispeffo oIIe quoIi presenfo oIcuni vonfoggi:


I) Si puo procedere onche con quonfifofivi minimi di
poIyA+ (0,b-I,0 g).

Z) Siccome coinvoIge uno ompIifico;ione con PCP puo
essere usofo onche per sfudiore mPMAs espressi o IiveIIi
moIfo bossi.

3) Siccome i pofferns di due differenfi condi;ioni sono
coricofi suIIo sfesso geI, possibiIe fore uno comporo;ione
quonfifofivo oIfre che quoIifofivo.

4) Consenfe Iidenfifico;ione e IonoIisi onche di PMA
moIfo simiIi fro Ioro che oIfrimenfi verrebbero eIiminofi
neIIo cosfru;ione di Iibrerie di soffro;ione.











PPO8LEMI DEL DD-PCP

SoIo per uno fro;ione degIi mPMA Ie condi;ioni di
ompIifico;ione sono odoffe o dore un prodoffo, cio in grodo
di oppoiorsi con un primer oncorofo in 3 e con uno
orbifrorio in b. Con Io moggioron;o deIIe coppie di
primers si offengono do I0 o I00 bonde con Iunghe;;e
comprese fro I00 e b00 bp.

SoIo quegIi PMA che sono refrofroscrivibiIi bene neIIe
dofe condi;ioni sperimenfoIi possono venire ompIificofi, cos
onche un PMA moIfo obbondonfe puo non essere visfo perche
refrofroscriffo moIe cos come un PMA presenfe in quonfif
minore puo risuIfore sovroroppresenfofo perche
refrofroscriffo con oIfo efficien;o.

II DD-PCP puo risuIfore moIfo Ioborioso e cosfoso
perche prevede un oIfissimo numero di esperimenfi derivonfi
do un gronde numero di coppie di primers possibiIi.

C uno possibiIif obbosfon;o eIevofo che geni che
risuIfono differen;ioImenfe espressi siono dei FoIsi Posifivi.

Differenfi preporo;ioni di Toq possono dore differenfi
pofferns.

Uno por;ione degIi mPMAs non vengono ompIificofi od
oIfo IiveIIo e quindi vengono perdufi onche se
differen;ioImenfe espressi.

MoIfe deIIe bonde isoIofe doi geIs di DD-PCP si riveIono
composfe do misceIe eferogenee di diversi frommenfi.
LA PCP QUAMTITATIVA

Principi generoIi


Lo PCP puo essere usofo per sfimore Io concenfro;ione
di porficoIori compioni di DMA o di PMA rispeffo od uno
sfondord nofo (Quonfifico;ione PeIofivo). II probIemo pi
imporfonfe do risoIvere o quesfo scopo queIIo dovufo oI
foffo che Io PCP un processo esponen;ioIe e, come foIe,
ompIifico nofevoImenfe onche piccoIe differen;e di
efficien;o di reo;ione porfondoIe o grondi differen;e neI
risuIfofo finoIe e producendo cos un orfefoffo. Lo PCP di
foffo uno proceduro che ho in se un morgine di voriobiIif
infrinseco di circo iI I0-Z07 cio, eseguendo uno sfesso PCP
in dupIicofo iI risuIfofo in fermine di prodoffo di reo;ione
puo voriore di quesfo percenfuoIe fro Ie due proveffe.
InoIfre, non pensobiIe ufiIi;;ore uno normoIe PCP e
misurore Io quonfif di prodoffo finoIe (end-poinf mefhod)
riporfondo poi iI dofo oIIo sfompo in fermini quonfifofivi
(probIemo deIIo sofuro;ione e dei foffori Iimifonfi).
Un modo per diminuire uIferiormenfe Io possibiIif di
errore queIIo di compiere Io misuro neIIo fose esponen;ioIe
deIIo reo;ione dove nessuno dei componenfi deIIo misceIo puo
essere Iimifonfe. QuesfuIfimo mefodo sfofo
oufomofi;;ofo e migIiorofo fino o produrre fecniche prive
deIIo voriobiIif ossociofo oIIe misure "end-poinf". In quesfo
fecnico Iommonfore di prodoffo viene misurofo o diversi
punfi duronfe Io progressione deIIo reo;ione ed onoIi;;ofo
dopo regressione Iineore. Cos focendo si riescono o misurore
differen;e di due voIfe in concenfro;ione di sequen;o
sfompo fro diversi compioni.
Per diminuire Io voriobiIif fro diverse reo;ioni uno
"sfondord endogeno" viene ompIificofo in fuffi i compioni e
od esso vengono riferife fuffe Ie misure in modo do
normoIi;;ore Ie differen;e od uno espressione cosfifufivo
uguoIe nei diversi compioni. Quesfo confroIIo cosfifuifo
soIifomenfe do un gene "housekeeping" cosfifufivomenfe
espresso. Per pofer riferire Iespressione di un gene forgef
o queIIo di un referenfe endogeno bisogno che Ie rispeffive
efficien;e di ompIifico;ione siono simiIi. In coso confrorio
onche Ie differen;e di efficien;o devono rienfrore nei
coIcoIi finoIi. I referenfi endogeni pi ufiIi;;ofi sono: 0APDH
(gIiceroIdeide fosfofo deidrogenosi), -ocfino, rPMA.

Per idenfificore e misurore i prodoffi esisfono diversi
mefodi. II pi usofo queIIo di coricore Ie reo;ioni in geI di
ogorosio e misurore con mefodi densifomefrici Iinfensif
















ESEMPIO DI PT-PCP SEMIQUAMTITATIVA































PEAL TIME PCP

Quesfo fecnico viene chiomofo o voIfe onche PCP
cinefico e serve per misurore Iespressione genico o per
confermore differen;e di espressione idenfificofe fromife
orroys. Puo essere usofo onche in biochimico cIinico per
fifoIore ocidi nucIeici (es. genomi viroIi) o per idenfificore
mufo;ioni o poIimorfismi di un singoIo nucIeofide. Lo fecnico
prevede IompIifico;ione di compioni e Io Ioro misuro in
fempo reoIe fromife sfrumenfi di onoIisi deIIo fIuorescen;o.
Lo fecnico si boso suI principio che moggiore iI numero di
moIecoIe sfompo presenfi oIIini;io deIIo reo;ione e minore
sor iI numero dei cicIi necessori per roggiungere un
deferminofo voIore minimo (sogIio) di ommonfore di
prodoffo. Quindi Io concenfro;ione ini;ioIe di uno sequen;o in
esome puo essere espresso come numero di cicIi richiesfi per
roggiungere iI voIore sogIio (Cf). Uno reffo cosfruifo con i
vori voIori Cf offenufi con uno serie di diIui;ioni di un DMA
sfondord cosfifuisce iI sisfemo di forofuro. II quonfifofivo di
prodoffo di uno sequen;o ignofo verr quindi offenufo
doIIinferpoIo;ione deI proprio Cf con Io reffo di forofuro. Lo
penden;o deIIo reffo di forofuro di uno deferminofo
sequen;o cosfifuisce quindi uno misuro deIIefficien;o di
ompIifico;ione di queIIo sequen;o.
Un oIfro vonfoggio di quesfo mefodo che si puo
scegIiere un voIore sogIio obbosfon;o bosso do pofer
compiere Io misuro nei primi cicIi evifondo quindi Io
possibiIif di errore dovufo oIIompIifico;ione.




SCHEMA DI FUMZIOMAMEMTO DEL SISTEMA A8I
PPISM 7700






























ESEMPI DI PEAZIOMI DI PCP QUAMTITATIVA


I) Misuro;ione (in fripIicofo) deIIo quonfif di messoggeri
codificonfi per Ihousekeeping (0APDH in quesfo coso)
in diversi fessufi.
Z) ConfroIIo negofivo (Mo TempIofe ConfroI) che dimosfro
Io confomino;ione di oIcuni po;;effi.
3) DiIui;ioni di DMA sfompo per Io cosfru;ione deIIo reffo
di forofuro di un compione in esome.
4) Misuro;ione deI poffern di fessufo-espressione di un
gene in esome.
b) AIfro voIufo;ione di fessufo-espressione di un gene in
esome.
o) ConfroIIo negofivo per iI gene housekeeping di
riferimenfo.
7) Misure per Io cosfru;ione deIIo reffo sfondord deI
gene housekeeping.














CALCOLO DEI PISULTATI


Aggiusfore Io Iineo di bose deIIe curve ed iI voIore sogIio
desiderofo.

Esporfore in fogIio di coIcoIo i voIori corrispondenfi.

Cosfruire Ie reffe sfondord per Ie diverse reo;ioni con X ~
Iog conc. e Y ~ voIore Cf corrispondenfe.

Picovore Ie equo;ioni deIIe reffe offenufe (y ~ mx + b)

CoIcoIore i voIori dei vori compioni (compreso queIIi deIIo
sfondord endogeno) usondo Io formuIo

voI ~ Cf - b
M

CoIcoIore i voIori medi per ogni punfo.

Dividere Ie medie oi diversi punfi per queIIe corrispondenfi
deIIo sfondord endogeno

MormoIi;;ore Ie misure offenufe oI voIore minore.







quantizzazione
relativa
Valore relativo
ad uno standard
endogeno


Il pi basso
possibile
all'interno della
regione di crescita
esponenziale

ESEMPIO DI PPESEMTAZIOME DEI PISULTATI































































LA DISCPIMIMAZIOME ALLELICA TPAMITE b
MUCLEASI


Si froffo di un mefodo ufiIe oIIo discrimino;ione di
forme diverse di uno sfesso gene che differiscono per uno
sosfifu;ione di bose, uno deIe;ione o uno inser;ione. E uno
mefodico moderno e imporfonfe in quonfo oufomofi;;ofo e
veIoce, che combino Io fecnoIogio deIIo PCP con queIIo
deIIidenfifico;ione in fempo reoIe di prodoffi di reo;ione
fIuorescenfi, per quesfo puo essere usofo per screening di
differen;e oIIeIiche, presen;o di mufo;ioni in diversi
individui oppure onche per idenfificore mufo;ioni oncoro
ignofe.
In quesfo mefodico uno sondo compIemenfore viene
fogIiofo doIIoffivif b esonucIeosico deIIo Toq DMA
PoIimerosi soIo se incIuso neIIompIifico;ione generondo cos
un prodoffo fIuorescenfe. Anche qui, come neIIo PeoI Time
PCP precedenfe, Io sondo fIuorescenfe confiene un
fIuoroforo emeffifore ed uno smor;ofore in grodo di
obboffere Iemissione (fromife "Fref"). Se Io sondo rimone
infoffo duronfe Io reo;ione non ci sor emissione, quondo
invece Io sondo verr incIuso neIIompIicone verr fogIiofo
doIIoffivif nucIeosico deIIo Toq generondo fIuorescen;o.
Cos, uno sondo compIefomenfe compIemenfore rimorr ben
oppoiofo duronfe IonneoIing di ogni cicIo di reo;ione di PCP
risuIfondo efficienfemenfe fogIiofo e riIosciondo quindi iI
fIuoroforo che emeffer in soIu;ione. Quondo invece
presenfe onche uno singoIo mufo;ione punfiforme
(responsobiIe di un mismofch) Io sondo non sor ibridi;;ofo e
fogIiofo con Io sfesso efficien;o quindi Io fIuorescen;o
emesso sor nofevoImenfe inferiore.

Principio di fun;ionomenfo

In un sisfemo bioIIeIico ci soronno neIIo sfesso reo;ione due
diverse sonde morcofe cioscuno con un diverso fIuoroforo
(es" FAM e VIC), uno sor compIemenfore od un oIIeIe e
IoIfro oIIoIfro. Duronfe Io fose di onneoIing Ie sonde
ondronno cioscuno od ibridi;;orsi (con Io mossimo efficien;o
neIIo compefi;ione) oI proprio fiIomenfo specifico. Quindi ne
risuIfo che Ioumenfo di fIuorescen;o oIIo Iunghe;;o dondo
specifico di uno dei due fIuorofori significo omo;igosi per
queIIoIIeIe, menfre Ioumenfo confemporoneo od enfrombe
Ie Iunghe;;e dondo significo efero;igosi.

Foffori che confribuiscono oIIo sensibiIif eIevofo deIIo
fecnico

II mismofch, onche se cosfifuifo do uno singoIo sosfifu;ione
di bose, ho un effeffo nofevoIe suIIo femperofuro di meIfing
deIIo sondo e quindi suIIo suo copocif di oppoiorsi.
LonoIisi effeffuofo con enfrombe Ie sonde neIIo reo;ione,
quesfe quindi compefono rendendo oncoro pi resfriffive Ie
condi;ioni di oppoiomenfo onche per un singoIo mismofch.
Lo porfe b deIIo sondo deve essere oImeno in porfe
denofurofo offinch Io Toq posso fogIiorIo (necessifo di uno
forco di 3 bosi). In quesfo confesfo, Io fofoIe dissocio;ione
in sonde che porfono un mismofch ovviene moIfo pi
veIocemenfe che in queIIe perfeffomenfe compIemenfori
diminuendo cos Iefficien;o con cui vengono fogIiofe.



Annofo;ioni


















































METODICHE DI SEQUEMZIAMEMTO
DE0LI ACIDI MUCLEICI
























IL SEQUEMZIAMEMTO DE0LI ACIDI MUCLEICI



II sequen;iomenfo degIi ocidi nucIeici uno deIIe
fecniche pi usofe non soIo per corofferi;;ore nuovi
geni mo onche roufinoriomenfe come me;;o per
confermore Iidenfif di cIoni o mufo;ioni, per
confroIIore Io fedeIf di nuove mufo;ioni creofe, per
voIufore Iesoffe;;o di giun;ioni Iigofe de novo, per
confroIIore Iidenfif di prodoffi di PCP e, foIvoIfo, per
idenfificore poIimorfismi e mufo;ioni in geni di
inferesse. Dofo iI Iorgo uso che si fo deIIe fecniche di
sequen;iomenfo, sono sfofe sviIuppofe nuove fecnoIogie
Iibere doIIufiIi;;o di prodoffi rodiooffivi e/o fossici
necessori invece per Ie mefodiche ufiIi;;ofe quoIche
onno fo. Sono onche sfofe creofe mocchine opporfune
ed oufomofi;;ofe che honno cos reso possibiIe iI
sequen;iomenfo di grondi froffi di DMA in fempi
reIofivomenfe brevi.
In generoIe si possono dividere i mefodi di
sequen;iomenfo in fre fipi principoIi: iI mefodo chimico
di Moxom-0iIberf, queIIo en;imofico di Songer ed iI pi
recenfe sequen;iomenfo cicIico derivofo
conceffuoImenfe do queIIo di Songer oI quoIe viene
oppIicofo Io fecnoIogio deIIo PCP.






IL SEQUEMZIAMEMTO CHIMICO
(Moxom-0iIberf)



Quesfo mefodo ufiIi;;o reogenfi chimici per
disfruggere specificomenfe bosi nucIeofidiche e quindi
rompere Io moIecoIo deI DMA in punfi specifici. Dopprimo
i fiIomenfi deI DMA vengono morcofi con moferioIe
rodiooffivo od uno esfremif (di soIifo oIIesfremif b),
poi i due fiIomenfi vengono seporofi (soIomenfe uno sor
sequen;iofo). Successivomenfe singoIe fro;ioni deI
fiIomenfo sceIfo vengono froffofe con quoffro differenfi
reogenfi chimici che Io rompono presso uno o due
specifici nucIeofidi, iI froffomenfo Iimifofo cosicch
uno moIecoIo reogisce, fro fuffe Ie bosi susceffibiIi, soIo
con un singoIo residuo. In cioscuno misceIo di reo;ione si
produrr cos un insieme di frommenfi rodiooffivi in cui
sono disfruffi soIo uno cIosse di residui (in figuro
eviden;iofo Io reo;ione in cui sono disfruffi i residui "C").
Infine si uso IeIeffroforesi su geI per seporore i
prodoffi di cioscuno reo;ione in bose oIIe dimensioni. Lo
disfribu;ione di bonde rodiooffive visfe su uno Iosfro
ouforodiogrofico riveIo immediofomenfe Io sequen;o.








Mefodo di sequen;iomenfo chimico (Moxom-0iIberf)































IL SEQUEMZIAMEMTO EMZIMATICO
(Songer)



In quesfo fecnico un dideossinucIeofide viene
incorporofo in un fiIomenfo deI DMA in crescifo, con
conseguenfe orresfo deIIo formo;ione deIIo cofeno in
quonfo non si puo formore un Iegome fosfodiesferico
con iI nucIeofide successivo. Si effeffuono quoffro
differenfi reo;ioni ufiIi;;ondo per ognuno di esse un
diverso nucIeofide. I prodoffi di ogni reo;ione sono
roppresenfofi do uno serie di segmenfi oIIungofi in
moniero incompIefo che vengono successivomenfe
seporofi medionfe eIeffroforesi su geI. Come neI
mefodo Moxom-0iIberf Io sequen;o puo essere Ieffo
doIIe bonde neI geI. Sono moIfe Ie vorionfi di quesfo
mefodo che differiscono fro Ioro per Ien;imo usofo
(Toq DMA PoIimerosi, IIenow frogmenf deIIo DMA
PoIimerosi I di E. coIi, T7 DMA PoIimerosi/Sequenose) e,
di conseguen;o, per porficoIorif fecniche e differen;e
neI profocoIIo di reo;ione.










Mefodo di sequen;iomenfo en;imofico (Songer)































IL SEQUEMZIAMEMTO CICLICO AUTOMATIZZATO



Permeffe di offenere risuIfofi chiori in fempi moIfo
brevi. Sono sfofe sviIuppofe opporecchiofure in grodo di
porfore o fermine Io reo;ione in soIvenfi ocquosi o
femperofure non porficoIormenfe oIfe e quindi sfofo
possibiIe sosfifuire i nucIeofidi morcofi
rodiooffivomenfe con oIfri morcofi fromife un
fIuoroforo. Lo possibiIif di condurre Io reo;ione
ripefendo numerosi cicIi di Denofuro;ione/AnneoIing deI
primer singoIo/Esfensione ho poi porfofo od uno reso ed
uno occurofe;;o nofevoIi.
Lo possibiIif di morcore con fIuorofori diversi i
quoffro differenfi dideossiferminofori ho poi ridoffo Io
reo;ione od uno soIo proveffo confenenfe fuffo oI suo
inferno. AI fermine deIIo reo;ione iI compione viene
corso in un geI di poIiocriIommide (o in uno specifico
copiIIore) posfo in comunico;ione con un roggio Ioser in
grodo di riIevore Io fIuorescen;o emesso doi quoffro
diversi fIuorofori. Le quoffro bosi vengono cos risoIfe
occurofomenfe. Essendo poi Io mocchino inferfocciofo
od un compufer Io sequen;o viene ricosfruifo
oufomoficomenfe.







Sfrofegio deI "Pondom Sequencing"































Esempi di oIIineomenfi di sequen;e
in esome con bonche dofi(8LAST)






























Annofo;ioni




















































METODICHE PEP LA PPODUZIOME
DI PPOTEIME PICOM8IMAMTI
























PPODUZIOME DI PPOTEIME PICOM8IMAMTI
(Considero;ioni generoIi)

E uno dei pochi seffori deIIo bioIogio moIecoIore
che conservo oncoro moIfi ospeffi pionierisfici e dove
risuIfo impossibiIe prevedere i vori foffori che possono
infIuen;ore Io riuscifo di un esperimenfo. Le rogioni di cio
sono diverse:
3) Si conosce oncoro froppo poco o riguordo dei
mecconismi di foIding deIIe profeine nei diversi
orgonismi, risuIfo quindi difficiIe prevedere quoIe
sio Iospife pi odoffo per Iespressione deIIo
profeino desiderofo.
4) Esisfono pochi mefodi per modificore Iefficien;o
di foIding e quindi poco si puo fore per innoI;ore iI
IiveIIo di espressione di profeine prodoffe in
moniero inefficienfe.
b) Poco si so su come prevenire Io degrodo;ione do
profeosi e/o Io denofuro;ione deIIo profeino
neIIospife.
Quindi Iespressione di cioscuno profeino ricombinonfe
presenfo un insieme di probIemi unici e propri che devono
essere risoIfi in porfe empiricomenfe.

Esisfono sosfon;ioImenfe cinque sisfemi di
espressione: Escherichio coIi, 8ociIIus subfiIis,
Socchoromyces cerevisioe, 8ocuIovirus/ceIIuIe di inseffo,
coIfure di ceIIuIe di mommifero. Lo sceIfo deI sisfemo
oppropriofo dipende do vori foffori quoIi Ie
corofferisfiche deIIe ceIIuIe ospifi e doIIo scopo
deIIesperimenfo.

SISTEMI DI ESPPESSIOME IM E.coIi

E. coIi iI sisfemo sceIfo per primo perche pi
conosciufo, economico e non di rodo foIIeronfe verso
profeine esogene eferoIoghe che esprime spesso con
reso moIfo eIevofo. Ci sono cosi pero in cui Io sceIfo di
quesfo sisfemo errofo come od esempio nei cosi in cui
si desideri esprimere uno profeino Io cui offivif
bioIogico conseguenfe od uno modifico;ione posf-
frodu;ionoIe (es" gIicosiIo;ione, fosforiIo;ione ecc.) che
E. coIi non in grodo di effeffuore. In quesfo coso
dovrebbero essere usofe coIfure di ceIIuIe di momifero.
Anche Io dimensione deIIo profeino do esprimere
infIuen;o Io sceIfo, profeine piccoIe e poIipepfidi
(inferiori o I0 Ido) sono spesso difficiIi do offenere e
devono essere preferen;ioImenfe espressi in "fusione"
con oIfri domini profeici che ne prevengono Io
degrodo;ione froppo veIoce ed oiufino Io Ioro
purifico;ione (es" code di isfidine). Spesso puo essere
incIuso neI cosfruffo un sifo di fogIio fro Io profeino e Io
porfe con cui fuso in modo do offenere Io formo nofivo
con uno reo;ione in vifro dopo Io purifico;ione. Le
profeine cifosoIiche sono spesso moIfo difficiIi do
esprimere in quesfo sisfemo perche spesso insfobiIi ed
in grodo di formore grondi oggregofi di profeino
esogeno difficiImenfe ufiIi;;obiIi (corpi di incIusione).
ToIvoIfo Io sfesso formo;ione di corpi di incIusione puo
cosfifuire un vonfoggio come neI coso in cui si desideri
purificore un gron quonfifofivo di uno profeino insoIubiIe
do ufiIi;;orsi per Io produ;ione di onficorpi specifici.
Anche Io quonfif di profeino richiesfo oI sisfemo e Io
modoIif deIIo suo purifico;ione (od esempio se
sufficienfe iI Iisofo ceIIuIore per overe Ioffivif
en;imofico desiderofo) infIuiscono suIIo sceIfo deI
sisfemo.

I veffori usofi

Esisfono moIfi veffori pIosmidici commercioIi che
presenfono diverse pecuIiorif e specificif. In generoIe
comunque ci sono oIcune corofferisfiche di quesfi
pIosmidi che sono comuni o fuffi i sisfemi o quosi. Lo
schemo seguenfe riossume i componenfi fipici di un
veffore "di fusione",




















Promotore
(Inducibile)

ATG
Seq. Fusa
(Poly-His)
Proteina
Multiple
Cloning
Sequence
TGA
Gene per la
Resistenza
all'antibiotico
Origine di
Replicazione
ori
Epitopo
riconosciuto
da Anticorpo
commerciale
Sito di
taglio per
proteasi
RBS
Le profeine di Fusione

Spesso Io profeino do esprimere viene inserifo in un
veffore in cui si cosfruisce uno fusione genico che creo
uno profeino ibrido do esprimere. Quondo oIIo profeino
do sfudiore viene fuso uno sequen;o con uno cerfo
fun;ione en;imofico si esegue un "fogging" che render
pi fociIe IisoIomenfo successivo deIIo profeino
espresso. Si puo fondere Io regione do sfudiore onche
con uno sequen;o corrier impedendo o roIIenfondo Io suo
degrodo;ione neIIospife od opero deIIe profeosi
endogene, i corrier inoIfre rendono spesso pi soIubiIe Io
profeino prevenendo Io formo;ionne di indesiderofi
corpi di incIusione. Anche sequen;e fopogeniche vengono
fuse oIIe profeine sfudiofe rendendone possibiIe Io
veicoIo;ione in un comporfimenfo subceIIuIore
desiderofo.



Purifico;ione deIIe profeine di fusione,

Fondendo uno profeino con un corrier che si puo
ossociore od uno specifico Iigondo ogni profeino puo
essere purificofo per cromofogrofio di offinif, spesso
in un singoIo possoggio. Anche code orfificioIi sono oggi
moIfo usofe per quesfi scopi (es" PoIyhisfidine fog,
FLA0).




TogIio deIIe profeine di fusione

Per overe Io profeino neIIo formo nofivo
necessorio fogIiorIo per sepororIo doIIo porfe rimonenfe
in prossimif di uno regione specifico. I mefodi usofi
sono di fipo chimico (meno cosfosi mo onche meno usofi
o couso deIIo presen;o di sifi di fogIio inferni oIIo
profeino in esome) o di fipo en;imofico (qui i sifi
specifici e unici sono direffomenfe inserifi neI veffore
di fusione). Lo schemo seguenfe riossume i mefodi pi
comunemenfe usofi:





















I corpi di incIusione

Sono prodoffi fipicomenfe quondo Io profeino
espresso insoIubiIe. Si froffo di oggregofi
infroceIIuIori insoIubiIi isoIobiIi per cenfrifugo;ione o
bosso veIocif, soIifomenfe consisfono di forme
denofurofe deIIo profeino espresso. MeIIo moggioron;o
dei cosi di foffo impossibiIe predire se uno profeino
espresso in E. coIi sor soIubiIe o former corpi di
incIusione, onche se profeine con grondi domini
idrofobici honno probobiIif moggiore di oggregorsi.
Anche iI foIding deIIe profeine infIuisce su quesfo
fenomeno dofo che i corpi di incIusione sembrono
formofi in gron porfe do profeine "unfoIded" o
"moIfoIded". Spesso Io sfrofegio per evifore Io
formo;ione di corpi di incIusione sempIicemenfe queIIo
di esprimere Io profeino in fusione con uno sequen;o
segnoIe procoriofico che veicoIi Io profeino neIIo spo;io
peripIosmico dove pofrebbe pi fociImenfe essere
soIubiIe.
In oIcuni cosi invece Io formo;ione di corpi di
incIusione consenfe un isoIomenfo di uno quonfif
moggiore di profeino prevenendone Io digesfione, in
quesfo coso Io difficoIf sperimenfoIe risiede neIIo
successivo disgrego;ione dei gronuIi e neIIo Ioro
purifico;ione (soIifomenfe denofuronfe) oI fermine deIIo
quoIe Ie profeine dovronno subire uno proceduro di
"refoIding".




Lo disgrego;ione dei corpi di incIusione ed iI refoIding


SoIifomenfe Ie procedure di Iisi bofferico nei cosi
di presen;o di corpi incIusi non differiscono do queIIe
usofe in fuffi gIi oIfri cosi. Dopo Io Iisi (o 4"C) i compioni
vengono seporofi con cenfrifugo;ione o I0/Z0,000 x g
ed isoIofi in formo di peIIef che viene successivomenfe
Iovofo ripefufomenfe in presen;o di inibifori deIIe
profeosi. Lo disgrego;ione ovviene poi in ogenfi
denofuronfi (Ureo, CIoruro di 0uonidino), fromife
sonico;ione e/o in defergenfi (SDS) che disgregono i
gronuIi denofurondo pero Io profeino e focendogIi
ossumere uno conformo;ione bioIogicomenfe inoffivo. Lo
proceduro di refoIding viene effeffuofo privondo
groduoImenfe Io soIu;ione di ureo e/o cIoruro di
guonidino fromife dioIisi ripefufe in fomponi non
denofuronfi.


Loffimi;;o;ione deIIespressione in E.coIi


Lini;io deIIo frodu;ione richiede uno sequen;o di
Iegome oi ribosomi (P8S) che viene efficienfemenfe
Iegofo e riconosciufo. Quesfo soIifomenfe presenfe
nei diversi veffori commercioImenfe offenibiIi. I codoni
usofi devono essere offimoIi per i procoriofi quindi iI
"codon usoge" deve essere preso in considero;ione in
fose di progeffo;ione deI cosfruffo. Anche i me;;i di
coIfuro cosfifuiscono un ospeffo fondomenfoIe per Ie
condi;ioni di crescifo e di espressione di profeine
esogene. Lo provo di ferreni di coIfuro pi o meno ricchi
cosfifuisce quindi uno foppo obbIigofo
deIIoffimi;;o;ione deIIespressione. Lo sceIfo deI ceppo
bofferico opporfuno infine cosfifuisce uno dei foffori
principoIi per uno buono reso deIIespressione e diversi
ceppi devono essere provofi per voIufore queIIo
offimoIe.



In generoIe comunque necessorio voIufore sempre
IevenfuoIe necessif di modifico;ioni posf-frodu;ionoIi
deIIe profeine do esprimere che pofrebbero non essere
effeffuofe doi sisfemi bofferici, in quesfo coso iI
sisfemo di espressione pi opporfuno queIIo deIIe
ceIIuIe eucoriofiche.
















8ACULOVIPUS


E un sisfemo viroIe usofo per Iespressione di
moIfe profeine eferoIoghe sio di onimoIi che di pionfe e
funghi. I 8ocuIoviridoe sono uno fomigIio moIfo gronde
di virus o DMA o doppio fiIomenfo di cui queIIo usofo in
biofecnoIogie iI Aufogropho coIifornico MucIeor
PoIihedrosys Virus (AcMPV). Quesfo un porossifo
deIIinfesfino fenue di un boco e puo presenforsi in due
forme diverse: formo di fogo Iibero bosfonceIIore
"gemmonfe" e in formo di oggregofi poIiedrici composfi
do corpi di incIusione (cosfifuifi principoImenfe do uno
profeino deffo PoIiedrino).


IL CICLO DI IMFEZIOME


In vivo Iinfe;ione ovviene quondo corpi incIusi
poIiedrici enfrono neIIinfesfino fenue deIIospife dove
vengono disgregofi Iiberondo Ie porficeIIe fogiche.
Quesfe penefrono Ie ceIIuIe deIIinfesfino con
mecconismi di endocifosi e, roggiunfo iI nucIeo, Iiberono
iI DMA. Circo o ore dopo Iinfe;ione ovviene Io
repIico;ione deI genomo viroIe ed iI cicIo di infe;ione
confinuo diviso in due fosi principoIi: uno fose precoce
ed uno fordivo.

MeIIo fose precoce Ie ceIIuIe infeffofe riIosciono
porficeIIe viroIi Iibere che gemmono neIIombienfe
exfroceIIuIore o circo dieci ore doIIini;io deIIinfe;ione.
In quesfo vio iI genomo deI bocuIovirus viene repIicofo e
froscriffo nei nucIei deIIe ceIIuIe infeffofe deIIospife
dove iI suo DMA (80-Z00 Ib) viene impoccofo in
porficeIIe viroIi bosfonceIIori. Essendo i nucIeocopsidi
eIosfici, quesfe forme viroIi possono impoccore onche
moIfo pi moferioIe genefico ospifondo onche DMA
esogeno.

Duronfe Io fose fordivo (3 giorni dopo Iinfe;ione)
Ie ceIIuIe producono i corpi incIusi di poIiedrino dove
moIfissime porficeIIe viroIi sono immerse in uno mofrice
di quesfo profeino. I corpi incIusi vengono ossembIofi
neI nucIeo e poi riIosciofi oIIesferno duronfe IuIfimo
fose deI cicIo e roggiungono un mossimo dopo b/o giorni
doIIini;io deIIinfe;ione.

In quesfo fose quindi Io produ;ione di poIiedrino
mossimo e puo roggiungere fino oI 30-b07 deIIo
profeino fofoIe. Quesfo profeino pero non
indispensobiIe per iI cicIo vifoIe di 8ocuIovirus in coIfure
di fessufo dofo che i corpi incIusi sembrono essere
imporfonfi soIo per Io propogo;ione deIIinfe;ione in
vivo. Per quesfo sono sfofi cosfruifi veffori di
frosferimenfo per 8ocuIovirus in modo do ricombinore
con iI genomo viroIe frosferendovi un gene richiesfo (oI
posfo deIIo poIiedrino) che verr poi offivomenfe
froscriffo e frodoffo neI nucIeo deIIo ceIIuIo ospife. II
seguenfe schemo mosfro Ie fosi deI cicIo vifoIe di
8ocuIovirus ed iI sisfemo di ricombino;ione. Cio ovviene
co-fronsfeffondo ceIIuIe di Spodopfero frugiperdo (Sf)
iI veffore di frosferimenfo, confenenfe iI gene esogeno
do esprimere neI sisfemo, con iI genomo viroIe di
8ocuIovirus. AIIinferno deIIo ceIIuIo ospife ovverr Io
ricombino;ione omoIogo che porfo oIIinser;ione deI
gene neI genomo viroIe. Segue quindi un siIen;iomenfo di
moIfi geni deIIo ceIIuIo ospife che ini;ier cos o
produrre grondi quonfif di profeino eferoIogo in
sosfifu;ione deIIo poIiedrino. Muove porficeIIe viroIi
ricombinonfi verronno quindi prodoffe e ondronno od
infeffore nuove ceIIuIe con Io vio dei virioni gemmonfi.
Lo schemo seguenfe riossume Ie fosi deI cicIo vifoIe di
8ocuIovirus e Io produ;ione di profeino ricombinonfi.
























VETTOPI DI TPASFEPIMEMTO PEP
8ACULOVIPUS


Ogni veffore confiene:

I) Origine di repIico;ione di Escherichio coIi.

Z) Morcofore di resisfen;o oIIompiciIIino

3) II promofore deIIo poIiedrino

o) Uno regione di cIonoggio o voIIe deI promofore dove
cIonore iI gene esogeno.

7) Un Iungo froffo di sequen;o (fioncheggionfe Io regione
di cIoning) che permeffo Io ricombino;ione omoIogo con iI
genomo di 8ocuIovirus neI nucIeo.














I VAMTA00I DI 8ACULOVIPUS


3) Loffivif fun;ionoIe deIIo profeino espresso cos
come iI suo foIding correffo vengono monfenufi.

4) Le modifico;ioni posf-frodu;ionoIi vengono porfofe
o fermine

b) I IiveIIi di espressione possono roggiungere iI b07
deIIo profeino fofoIe.

o) Si possono inserire neI genomo viroIe onche inserfi
di nofevoIi dimensioni.

7) Si possono esprimere correffomenfe onche
froscriffi non mofurofi (iI sisfemo effeffuo fuffe
Ie procedure di spIicing)

8) E uno fecnoIogio sempIice che non richiede
IousiIio di porficoIori sfrumenfi.

9) Si possono esprimere pi geni confemporoneomenfe
porfondo oIIo formo;ione di compIessi muIfiprofeici
ossembIofi.

I0) Lo IocoIi;;o;ione subceIIuIore deIIe profeine
esogene Io sfesso che in vivo.

II) Esisfono diversi sisfemi ossociofi o quesfo che
rendono moIfo sempIice Io purifico;ione deIIo
profeino espresso.





























CELLULE DI MAMMIFEPO COME SISTEMA DI
ESPPESSIOME



Ci sono diverse sfrofegie per infrodurre geni in
ceIIuIe di mommifero, quesfi sono sosfon;ioImenfe
roggruppofi in fre cofegorie: fronsfe;ioni con mefodi
biochimici, fronsfe;ioni con mefodi fisici, frosdu;ioni
mediofe do virus.
MeIIe fronsfe;ioni con mefodi biochimici iI
componenfe chimico (es" fosfofo di coIcio, DEAE-
desfrono, Iipidi cofionici) formo un compIesso con iI
moferioIe genefico do infrodurre in modo do fociIiforne
Iingresso neIIo ceIIuIo.
Tre sono i mefodi fisici comunemenfe in uso:
bombordomenfo deIIe ceIIuIe con microporficeIIe che
Iegono iI DMA, microinie;ione direffo deI DMA esogeno
perforondo Io membrono. LeIeffroporo;ione infine
ufiIi;;o brevi impuIsi eIeffrici per creore pori neIIo
membrono che permeffono Ienfrofo deI DMA.

Lo schemo seguenfe riossume diversi mefodi di
fronsfe;ione:








































TPAMSFEZIOMI TPAMSIEMTI E
TPAMSFEZIOMI STA8ILI


Esisfono due fipi principoIi di fronsfe;ioni: Tronsienfi e
SfobiIi (o Permonenfi).

MeIIe fronsfe;ioni fronsienfi vengono usofe Iinee
ceIIuIori neIIe quoIi un DMA ricombinonfe che porfo iI
gene di inferesse inserifo per un breve periodo di
fempo duronfe iI quoIe Io suo espressione dovrebbe
essere oIfo. In quesfo mefodico Ie ceIIuIe non infegrono
necessoriomenfe iI gene neI DMA cromosomico. Le
fronsfe;ioni fronsienfi vengono sceIfe quondo devono
essere onoIi;;ofi un gronde numero di compioni per un
breve periodo di fempo. Tipicomenfe Ie ceIIuIe vengono
roccoIfe dopo I-4 giorni doIIo fronsfe;ione e i Iisofi
risuIfonfi vengono onoIi;;ofi per Iespressione deI gene
esogeno.

MeIIe fronsfe;ioni sfobiIi vengono preporofe Iinee
ceIIuIori cIonoIi che porfono iI gene fronsfeffofo
perfeffomenfe infegrofo neI cromosomo deIIo ceIIuIo
ospife dove dirige Io sinfesi di uno modesfo quonfif di
prodoffo. SoIifomenfe Io formo;ione di ceIIuIe
fronsfeffofe sfobiImenfe ho efficien;o moIfo bosso, Ie
coIonie risuIfonfi sono idenfificofe per Io presen;o di un
morker seIe;ionobiIe.




COMTPOLLI PEP ESPPESSIOMI TPAMSIEMTI


ConfroIIo negofivo: neIIe fronsfe;ioni fronsienfi uno o
due piosfre di ceIIuIe che porfono iI veffore sen;o
inserfo vengono fronsfeffofe ed oIIo fine onoIi;;ofe
neIIo Ioro morfoIogio ed espressione genico

ConfroIIo posifivo: uno o due piosfre devono essere
fronsfeffofe con un pIosmide che porfo un prodoffo
genico riveIobiIe (Iuciferosi, CAT, 0FP, -goI) guidofo do
un promofore efficienfe (es. cifomegoIovirus). Loffivif
di quesfi reporfer viene usofo per voIufore Iefficien;o
deIIo fronsfe;ione.


COMTPOLLI PEP ESPPESSIOMI STA8ILI

ConfroIIo negofivo: uno o due piosfre dovrebbero essere
fronsfeffofe con un DMA inerfe (soImon sperm DMA) in
ossen;o di un morker seIe;ionobiIe. Dopo due o fre
seffimone di coIfuro in ogenfe seIeffivo (04I8,
igromicino) non devono essere presenfi coIonie.

ConfroIIo posifivo: uno o due piosfre dovrebbero essere
fronsfeffofe con un pIosmide che codifico per iI morker
seIe;ionobiIe in ossen;o deI gene bersogIio. II numero di
coIonie vifoIi dopo due o fre seffimone di coIfuro Io
misuro deIIefficien;o deIIo fronsfe;ione e deIIo
seIe;ione. Un numero simiIe di coIonie devono essere
presenfi neI confroIIo e neI compione.

Annofo;ioni









































IMTEPAZIOMI PPOTEIMA/PPOTEIMA





















TECMOLO0IE PEP LO TECMOLO0IE PEP LO STUDIO DELLE
IMTEPAZIOMI PPOTEIMA/PPOTEIMA



In quesfi sfudi ci si possono porre diversi obieffivi:


IZ) Idenfifico;ione di un sef di profeine che inferogiscono
con uno profeino nofo e sfudiofo. In quesfi sfudi non
viene preso in esome iI ruoIo fisioIogico
deIIinfero;ione.



I3) Uno voIfo idenfificofo Iinferoffore puo essere
necessorio sfudiore iI significofo fisioIogico
deIIinfero;ione sfesso, In quesfo fipo di esperimenfi
necessorio riprodurre oI megIio Ie condi;ioni
fisioIogiche.



C) Quondo iI significofo fisioIogico di uno infero;ione nofo
puo essere imporfonfe sfudiore Io;ione di foffori inibifori
e/o moduIofori deIIinfero;ione ed i Ioro effeffi fisioIogici.






I SISTEMI DI DOPPIO I8PIDO

Principi di 8ose

Quesfi sisfemi ufiIi;;ono Io ceIIuIo di Iievifo
Soccoromyces cerevisioe come ospife dove for ovvenire
Iinfero;ione profeino-profeino. II sisfemo mimo quonfo
ovviene in ceIIuIe eucoriofiche dove i foffori di
froscri;ione (che promuovono Io froscri;ione-frodu;ione
di uno cerfo profeino che in quesfo coso divenfo iI
"reporfer") possono essere fisicomenfe seporofi in due
domini poIipepfidici (Acfivofion Domoin, AD & DMA
8inding Domoin, D8D) che divenfono offivi soIo quondo si
frovono in prossimif Iuno deIIoIfro. MeI sisfemo di
doppio ibrido in Iievifo comunemenfe usofo iI D8D fuso
con uno profeino, qui chiomofo esco (boif), di cui si sfo
cercondo iI pofen;ioIe inferoffore menfre IAD fuso o
fuffi i possibiIi frommenfi di uno Iibrerio di cDMA neIIo
quoIe possibiImenfe confenufo Iinferoffore sfesso, qui
chiomofo predo (prey). II sisfemo prevede che neIIo
ceIIuIo in cui si vengono o frovore confemporoneomenfe
froscriffe e frodoffe Io profeino in esome ed iI suo
possibiIe inferoffore quesfe, inferogendo, porfono in
prossimif iI D8D con IAD ricosfifuendo un foffore di
froscri;ione offivo in grodo di promuovere
specificomenfe Io produ;ione di uno profeino "reporfer"
che rende Io ceIIuIo in cui Iinfero;ione ovvenufo
idenfificobiIe e seIe;ionobiIe suIIo bose di fesf
coIorimefrici o di profofrofio. LisoIomenfo deI pIosmide
confenenfe Iinferoffore ignofo ed iI sequen;iomenfo deI
suo inserfo permeffono poi di idenfificorne Io nofuro.


FUMZIOMAMEMTO E VAMTA00I

II vonfoggio principoIe dei sisfemi di doppio ibrido
consisfe neI foffo che permeffono di idenfificore iI
pufofivo inferoffore di uno profeino in esome vogIiondo
fro fuffe Ie possibiIi profeine codificofe do uno Iibrerio
di cDMA. Quesfo rende possibiIe Io ricerco di uno
infero;ione pufofivo onche sen;o possedere indico;ioni
preIiminori o riguordo.

In quesfi esperimenfi viene primo cosfruifo un pIosmide
codificonfe per Io profeino di fusione Esco/D8D (in
veffori opposifi) e, seporofomenfe, uno Iibrerio
codificonfe per fuffe Ie profeine virfuoImenfe espresse
neI fessufo in esome cioscuno fuso con IAD. A quesfo
punfo iI DMA deIIo Iibrerio viene frosformofo in ceIIuIe di
Iievifo confemporoneomenfe od un opporfuno quonfifofivo
di pIosmidi codificonfi per Iesco. I cIoni generofi e
soffoposfi od opporfuno seIe;ione conferronno cioscuno
due pIosmidi, uno che codifico per Iesco fuso con iI D8D
e IoIfro che codifico per ogni diverso profeino deIIo
Iibrerio fuso con IAD. A quesfo punfo soIomenfe neI
cIone che confiene iI pIosmide per Iesco e queIIo per Io
profeino inferoffrice esoffo si verr o produrre
Iinfero;ione che di conseguen;o porfer in prossimif iI
D8D con IAD ricosfifuendo un foffore di froscri;ione
fun;ionoIe. SoIo in quesfo cIone verr quindi froscriffo
(ed opporfunomenfe riveIofo) iI gene reporfer
permeffendo IisoIomenfo deI cIone sfesso e Io successivo
corofferi;;o;ione deI pufofivo inferoffore.


ESPEPIMEMTI PPEVEMTIVI


I) II gene reporfer soIifomenfe infegrofo neI genomo
deI ceppo di Iievifo che ospifo Iinfero;ione perfonfo iI
compIesso boif/prey deve formorsi in queIIo regione deIIo
ceIIuIo. SoIifomenfe iI cosfruffo che codifico per Io
profeino di fusione prey/AD porfo con s onche un froffo
codificofo di MLS (MucIeor LocoIi;ofion SignoI) offinch
iI pofen;ioIe inferoffore vengo veicoIofo neI nucIeo. Lo
profeino di fusione boif/D8D invece viene o frovorsi
moIfo efficienfemenfe espresso (e cio deve essere
prevenfivomenfe verificofo) perfonfo uno quonfif
sufficienfe sor disponibiIe per Io formo;ione deI
compIesso.

Z) Due confroIIi prevenfivi deI cosfruffo deIIesco devono
sempre essere effeffuofi primo di vogIiore uno Iibrory di
pofen;ioIi inferoffori oI fine di non isoIore un "foIso
posifivo" oIIinfero;ione:
A) 8uono efficien;o di espressione deI 8oif
(Wesfern 8Ioffing).
8) Moncon;o di oufooffivo;ione deI reporfer
do porfe deI boif in ossen;o deI prey (fesf di
seIe;ione per profofrofio).

3) In coso di oufooffivo;ione deI boif riprogeffore
Iesperimenfo usondo Io fecnico deIIo "swopped" fwo
hybrid sysfem.



CASI PAPTICOLAPI

Esche modificofe

Esisfono cosi di profeine che per inferogire necessifono
di uno modifico;ione posf-frodu;ionoIe che iI ceppo wf di
Soccoromyces cerevisioe non puo effeffuore, in quesfo
coso Iinfero;ione risuIfo negofivo. Per ovviore o quesfi
probIemi sono sfofi progeffofi specifici ceppi di Iievifo
ingegneri;;ofi in modo do esprimere Ien;imo di
modifico;ione necessorio oIIo modifico;ione posf-
frodu;ionoIe di cui Io profeino ho bisogno (es" oIcune
firosinchinosi).

CompIessi fernori

In oIcuni cosi Iinfero;ione un boif puo inferogire con un
compIesso muIfimerico, in foIi cosi, spesso, Io profeino in
esome inferogisce con bosso offinif con i singoIi membri
deI compIesso menfre Iinfero;ione sfobiIe soIo in
presen;o di fuffi i componenfi. Perfonfo ne risuIfo uno
infero;ione moncofo neI coso in cui si vogIi Io Iibrory di
prede usondo uno soIo esco. Lo soIu;ione perfonfo risuIfo
queIIo di co-frosformore Io Iibrory con due esche: uno
normoIe ed unoIfro cosfifuifo do un oIfro componenfe deI
compIesso muIfimerico (esco ousiIiorio) in grodo qui di
sfobiIi;;ore Iinfero;ione esco-predo.
Spesso Iesco ousiIiorio roppresenfofo do uno moIecoIo
non profeico (mo necessoriomenfe permeobiIe offroverso
Io membrono deI Iievifo) discioIfo neI me;;o di coIfuro.



Esco e Uncino


II sisfemo deI doppio ibrido puo essere modificofo onche
per sfudiore Ie infero;ioni profeino-PMA o profeino-
formoco. In quesfi cosi un oppropriofo "uncino" puo
essere usofo per esporre uno dofo moIecoIo
(formoco/PMA) od uno profeino inferoffrice ignofo (Io
predo, in quesfo coso).

Coso di infero;ione profeino-PMA:

In quesfo sfrofegio iI D8D fuso con uno profeino
opporfuno (in grodo di Iegore uno opporfuno sequen;o di
PMA) cosfifuendo cos Iuncino. Quesfo cosfruffo di
fusione (qui chiomofo esco) viene co-frosformofo con un
PMA ibrido confenenfe Io sequen;o opposifo che si Iego
oIIuncino od uno esfremif e queIIo di cui si cerco
Iinferoffore oIIoIfro. Lo predo quindi sor Io profeino in
grodo di Iegore Io sequen;o di PMA di inferesse
oIIesfremif deIIesco.

Coso di infero;ione profeino-Iigondo:

In quesfo coso Iesco cosfifuifo do uno moIecoIo
sinfefi;;ofo chimicomenfe (in presen;o deIIo quoIe viene
foffo Iesperimenfo) ed in grodo di Iegore od uno
esfremif Iuncino ed oIIoIfro iI pufofivo inferoffore
ricercofo.


Doppio ibrido inverso

In quesfo coso Ioffivo;ione di un morker
confroseIe;ionobiIe usofo per sviIuppore un sisfemo per
voIufore Io perdifo di infero;ione profeino-profeino
dovufo o mufo;ioni in diverse regioni di uno profeino.
Come mosfro Io schemo, uno primo seIe;ione negofivo
consenfe di isoIore Ie mufo;ioni che non permeffono Io
froscri;ione di un reporfer fossico permeffendo cos Io
crescifo deIIe ceIIuIe.
In uno secondo seIe;ione posifivo vengono invece isoIofe
Ie prede che moIgrodo Io mufo;ione sono in grodo di
monfenere Iinfero;ione con Iesco.


Esco dupIice

In quesfo coso si honno diverse combino;ioni di
infero;ioni esco-predo. Le due diverse esche usofe in
confemporoneo possono o meno inferogire enfrombe con
Io singoIo esco o, oIfrimenfi, un compIesso possibiIe e
IoIfro no. 8osondosi suI foffo che ogni esco offivo uno
coppio di reporfer diverso si in grodo di discriminore
uno infero;ione doIIoIfro. In quesfo coso possibiIe
vogIiore in un singoIo possoggio mufo;ioni che
seIeffivomenfe oIferono Io nofuro deIIinfero;ione. In
progeffi di "profeomico", Iuso di due esche con
reporfers diversi permeffe di voIufore per uno
infero;ione due profeine confemporoneomenfe
diminuendo i fempi nofevoImenfe. In quesfo modo si
possono onche idenfificore i foIsi posifivi.

SeIe;ione e confermo deIIinferoffore


Lo seIe;ione deIIinferoffore viene foffo
screenondo Io Iibrory in due piosfrofure differenfi: neIIo
primo si seIe;iono per Io presen;o dei pIosmidi usondo Io
resisfen;o confenufo in essi, menfre neIIo secondo si
induce Io produ;ione deIIo profeino codificofo e si
seIe;iono per Iinfero;ione fromife Ieferofrofio. Quesfo
seIe;ione in due possoggi previene i frequenfi fenomeni
di moncon;o di posifivi dovufo o fossicif deIIe prede.
Uno voIfo effeffuofo Io piosfrofuro si confono i
cIoni posifivi (un numero rogionevoIe di inferoffori
pufofivi fro 0 e 30) e si prosegue Io corofferi;;o;ione
degIi sfessi sfudiondo per primi queIIi con Io crescifo pi
veIoce (e che probobiImenfe confengono Iinferoffore pi
specifico). I pIosmidi confenenfi Ie prede vengono quindi
isoIofi, frosformofi in bofferi e sequen;iofi per
idenfificore Io nofuro deIIinferoffore.
In coso di numero froppo eIevofo di cIoni di
inferoffori pufofivi Io screening deIIo Iibrory viene
ripefufo ufiIi;;ondo uno combino;ione ceppo/pIosmidi
meno sensibiIe.









IL SIM0OLO I8PIDO


Viene usofo per idenfificore inferoffori che si Iegono o
specifiche sequen;e di DMA. Quesfe vengono inserife o
monfe deIIo sequen;o deI gene reporfer cosfruendo e
seIe;ionondo cos dei ceppi opposifi per Io ricerco
desiderofo. Lo Iibrory di cDMA fusi con gIi Acfivofion
Domoins viene poi frosformofo in quesfi ceppi ed i cIoni
posifivi oIIoffivo;ione deI reporfer vengono
corofferi;;ofi come porfofori di un pufofivo inferoffore
di queIIo sequen;o di DMA copoce di promuovere Io
froscri;ione di un gene o voIIe. Quesfi esperimenfi sono
quindi effeffuofi in ossen;o di uno esco frodi;ionoIe.



"OME-AMD-A-HALF-HY8PID"



Usofo per IisoIomenfo di profeine che Iegono iI DMA
soIfonfo se sfobiImenfe compIessofe con un fer;o
porfner (in formo eferodimerico). Anche in quesfo coso iI
reporfer porfo o monfe Io sequen;o di inferesse (queIIo
oIIo quoIe si Iego Ieferodimero) e Io Iibrory di pofen;ioIi
inferoffori fusi ogIi ocfivofion domoins frosformofo in
ceIIuIe esprimenfi come esco iI secondo membro deI
compIesso froscri;ionoIe.



TECMICA DEL "FAP WESTEPM" COM PPOTEIME DI
FUSIOME COM 0ST


Lo 0Iufofione-S-fronsferosi usofo do fempo neIIo
produ;ione di profeine ricombinonfi di fusione. Qui viene
invece fuso con uno profeino deIIo quoIe si deve cercore
Iinferoffore in un esperimenfo moIfo simiIe oI wesfern
bIoffing neI quoIe Ionficorpo sosfifuifo doIIo profeino
di cui si cerco Iinferoffore. Lo profeino di fusione
(profeino in esome/0ST) ricombinonfe viene prodoffo in
gronde quonfif in bofferi e poi purificofo e morcofo
rodiooffivomenfe. A quesfo punfo viene ufiIi;;ofo per
sfidore uno membrono provenienfe do un wesfern
bIoffing o do un Iiffing di uno Iibrerio di espressione.
UfiIi;;ondo poi opporfune sferuIe di ogorosio Iegofe o
gIufofione (e quindi copoci di Iegorsi oIIo profeino di
fusione con 0ST) si puo quindi precipifore e riveIore
ouforodiogroficomenfe iI compIesso di infero;ione
profeino-profeino (oIfernofivo oIIuso deIIo morcofuro
rodiooffivo Io riveIo;ione con onficorpi commercioIi
Anfi-0ST).
Spesso primo di effeffuore Iesperimenfo Io membrono
viene soffoposfo od uno proceduro feso o permeffere iI
refoIding deIIe profeine che vi sono immobiIi;;ofe.







LA 0ST FUSIOM PPOTEIM PULLDOWM



Lo fecnico e ufiIi;;ofo sio per Iidenfifico;ione di
nuove infero;ioni che per Io voIido;ione di uno
infero;ione idenfificofo con un doppio ibrido. Lo
profeino sfudiofo (probe) viene espresso in bofferi fuso
con Io 0ST e purificofo in quonfif significofivo. In
poroIIeIo un Iisofo deIIe ceIIuIe/fessufo in cui si cerco
Iinferoffore viene preporofo e morcofo
rodiooffivomenfe. II Iisofo sfesso viene poi messo od
incubore con Io profeino sondo in presen;o di sferuIe
(beods) coniugofe con gIufofione. Lo profeino sondo si
dovrebbe quindi ossociore con iI suo inferoffore per poi
essere coffurofo doIIe beods presenfi neIIo misceIo. A
quesfo punfo fromife cenfrifugo;ione si possono
seporore Ie sferuIe (con Iegofo Io profeino sondo ed iI
suo inferoffore ossociofo) doI resfo deIIe profeine deI
Iisofo. Quesfe verronno poi seporofe in geI eIeffroforesi
di poIiocriIommide ed onoIi;;ofe con ouforodiogrofio,
wesfern bIoffing o coIoro;ione profeico.










IDEMTIFICAZIOME DI IMTEPAZIOMI FPA
PPOTEIME TPAMITE COIMMUMOPPECIPITAZIOME

Quesfo fecnico moIfo rigiroso Io pi usofo per Io
dimosfro;ione di infero;ioni precedenfemenfe
idenfificofe con oIfre fecniche. Lospeffo fondomenfoIe
risiede neIIo mefodico con cui si effeffuo iI Iisofo
ceIIuIore in condi;ioni non denofuronfi in modo do
preservore iI pi possibiIe Ie infero;ioni e Ie ossocio;ioni
fro mocromoIecoIe che si sono formofe in vivo.
ToIvoIfo si uso fronsfeffore Ie ceIIuIe in cui si cerco
Iinferoffore con un cosfruffo che esprime Io profeino
sondo in modo do renderIo poi pi obbondonfe neI Iisofo
e quindi pi efficienfe neIIo ricerco deIIinferoffore, in
quesfo coso pero si possono offenere orfefoffi dofi
doIIinfero;ione deIIo sondo con profeine o cui non si
Iegherebbe in condi;ioni fisioIogiche.
MeI coso in cui Io fecnico vengo usofo per verificore
Iinfero;ione fro due profeine nofe iI Iisofo viene
preporofo in condi;ioni non denofuronfi e
successivomenfe Io profeino di cui si cerco Iinferoffore
viene immunoprecipifofo con un onficorpo specifico e
sferuIe coniugofe o Profeino A (oppure profeino 0) che
riconosce IimmunogIobuIino opporfuno Iegofo oIIo
profeino di inferesse che ovr ossociofo o suo voIfo
Iinferoffore. II fuffo viene poi seporofo doI resfo deI
Iisofo fromife cenfrifugo;ione ed iI compIesso viene
corso in geI di poIiocriIommide (foIvoIfo in bidimensione),
dopo Io seporo;ione Ie profeine vengono frosferife su
membrono ed onoIi;;ofe con onficorpi specifici per
dimosfrore Io specificif deIIinfero;ione ovvenufo.
MeI coso di coimmunoprecipifo;ione di un
inferoffore nuovo, iI Iisofo viene soIifomenfe morcofo
rodiooffivomenfe per poi essere riIevofo fromife
ouforodiogrofio in geI di ocriIommide. AIfernofivomenfi
si puo effeffuore uno coIoro;ione con "SiIver Sfoining" o
con "Comossie coIIoIidoIe" deIIe profeine deI geI. In
quesfuIfimo coso Io bondo di inferesse puo essere
esfroffo e Io suo sequen;o ominoocidico (o queIIo di un
suo frommenfo profeoIifico) puo essere deferminofo
fromife sequen;o di Edmon o onoIi;;ofo con
speffromefrio di mosso per offenere informo;ioni ufiIi
suIIo suo idenfif. In quesfo coso si produce un
"fingerprinf" deIIo profeino dofo doIIo mosso di fuffi i
suoi possibiIi prodoffi di digesfione e doIIo comporo;ione
di quonfo offenufo con i dofi presenfi in bonche dofi
opposife.

















Annofo;ioni






























LA "0PEEM FLUOPESCEMT PPOTEIM" (0FP)


E sfofo isoIofo perche responsobiIe deIIemissione di
fIuorescen;o in jeIIyfish ossieme oIIo Co++ binding profein
Aequorino . Ho un peso moIecoIore di Zo,888 Ido (Z38 oo)
con un picco di emissione o b09 nm (470 nm Io Aequorino).
E sfofo inoIfre osservofo che puo ricevere energio doIIo
Aequorino offivofo do coIcio (fromife FPET) quondo
enfrombe si frovono immobiIi;;ofe suIIo sfesso supporfo
soIido (cio vicine).

Sfruffuro

Possiede uno sfruffuro o -borreI composfo conseguenfe
oIIo presen;o di II -sheefs ed uno o-eIico. II dominio
responsobiIe deIIo emissione di fIuorescen;o cosfifuifo doi
residui Ser-ob/Tyr-oo/0Iy-o7 che formono iI cromoforo in
seguifo o modifico;ioni posf-frodu;ionoIi (cicIi;;o;ione per
oufocofoIisi e ossido;ione). Ho due picchi di ossorbimenfo o
390 e 480 nm rispeffivomenfe. II picco di emissione o b09
nm onche se vorio;ioni sono possibiIi in reIo;ione o
combiomenfi deIIe condi;ioni biochimiche.

Lo 0FP come Peporfer


Uno deIIe corofferisfiche pi imporfonfi deIIo 0FP che
per essere fun;ionoIe non richiede porficoIori pofhwoys di
modifico;ione posf-frodu;ionoIe. Un oIfro ospeffo
fondomenfoIe che monfiene Io suo copocif di fIuorescere
onche quondo espresso in orgonismi diversi do Aequoreo
oequoreo. Quesfe due porficoIorif honno reso possibiIe
cosfruire veffori per orgonismi diversi in cui Io 0FP viene
ufiIi;;ofo come reporfer.


Limifo;ioni


DoIIini;io deIIo fronsfe;ione Io 0FP necessifo di oImeno
unoro per roggiungere iI suo sfofo fun;ionoIe (o couso deIIe
modifico;ioni deIIeIico) e cio cosfifuisce un rifordo
significofivo per gIi sfudi di "gene expression".
E necessorio offimi;;ore Ie sequen;e codificonfi in
orgonismi eucoriofici superiori per overe uno buono
espressione.
Mon possibiIe prevedere se un cosfruffo dor uno 0FP
fun;ionoIe.
Lo sovroespressione puo porfore oIIo
"misIocoIi;;o;ione"deI cosfruffo di fusione seguifo.
Possono creorsi difficoIf di riveIo;ione deI segnoIe neI
coso in cui ci sio un sensibiIe rumore di fondo.
Possono esisfere vorio;ioni di speffro di emissione
onche in seguifo o vorio;ioni di concenfro;ione.

Vorionfi deIIo 0FP

Vengono commercioImenfe prodoffe diverse vorionfi di
0FP che producono un segnoIe moIfo eIevofo e che honno
sequen;o compofibiIe con i diversi orgonismi.
Esisfovo veffori di fusione con 0FP commercioIi che
permeffono di subcIonore iI frommenfo di DMA do sfudiore
neIIe diverse posi;ioni rispeffo oIIo 0FP (M-Term, C-Term,
CenfroIe).
Vengono prodoffe commercioImenfe onche vorionfi di
0FP soffo iI confroIIo froscri;ionoIe di promofori moIfo
efficienfi in ceIIuIe di mommifero (es" CifomegoIovirus, HIV).
Sono inoIfre commercioIi;;ofe onche vorionfi di 0FP con
differen;e neIIo speffro di emissione e, di conseguen;o,
usobiIi in confemporoneo, cio rende possibiIe effeffuore
esperimenfi di co-IocoIi;;o;ione fro profeine fuse o 0FP
diverse.

Lo 0FP viene quindi ufiIi;;ofo per voIufore Io
IocoIi;;o;ione, iI IiveIIo di espressione ed evenfuoIi
combiomenfi direffomenfe neIIo ceIIuIo (che non necessifo di
essere fissofo).
Le misure vengono effeffuofe ufiIi;;ondo Io microscopio
di fIuorescen;o seguendo Io profeino in vivo e quesfo
presenfo nofevoIi vonfoggi quoIi Iossen;o di orfefoffi dovufi
o processi di fisso;ione e/o permeobiIi;;o;ione deIIe ceIIuIe.
Muove vorionfi di 0FP sono sfofe isoIofe recenfemenfe
in oIcuni onfo;oi, quesfe emeffono fIuorescen;o neI rosso
(b83 nm) e vengono usofe ossieme oIIo 0FP frodi;ionoIe
(verde) in sfudi di co-IocoIi;;o;ione e/o doppio o fripIo
IobeIIing.

Annofo;ioni