Laboratorio di Neurocitologia e Istologia

ANALISI DI IMMAGINE

G.C. Panzica
2005-2006

Cos un immagine?
una rappresentazione di oggetti che possiamo vedere con i nostri occhi o con mezzi di indagine (ad es. microscopio) La rappresentazione di qualsiasi oggetto dipende fortemente dal mezzo utilizzato per registrare limmagine. Le immagini viste attraverso i nostri occhi sono fondamentalmente diverse da quelle che vengono registrate ad esempio dagli occhi composti degli insetti.
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Le foto senza flash e con flash presentano colori molto diversi

CON FLASH

SENZA FLASH

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Image processing
In generale noi cerchiamo nellimmagine quello che vedono i nostri occhi
Forme, colori, profondit Per fare questo (cio rendere limmagine pi simile a quanto vediamo con gli occhi) possiamo manipolare le immagini Con la manipolazione possiamo per introdurre elementi che nellimmagine vera non esistono e quindi la rendiamo meno simile alloriginale.
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Immagini fotografiche e digitali

In generale si crede che le immagini da pellicola siano meno manipolabili di quelle elettroniche NON E VERO: la resa di una immagine da pellicola dipende da:
Il tipo di pellicola Il tipo di sviluppo Il tipo di carta su cui si stampa Oltre qualit della macchina foto, qualit dellingranditore, sviluppi
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E le foto digitali?
Le foto digitali sono pi facilmente manipolabili Le manipolazioni possono essere eseguite da tutti con appositi strumenti quali:
Computer Programmi di ritocco come Photoshop
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Perch farlo?
La manipolazione delle immagini (editing) si pu fare per svariati motivi:
Rendere limmagine migliore per poterla stampare (colori pi caldi, contrasto migliore, brillantezza) Estrarre dallimmagine particolari che vogliamo analizzare

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E per lanalisi quantitativa?

Lediting e limage processing servono ad estrarre dallimmagine le strutture che vogliano analizzare in modo da ottimizzare la conta Esiste unetica della manipolazione:
Non si devono introdurre artefatti che possano alterare i conteggi Tutte le manipolazione devono essere dichiarate Tutte le immagini che devono essere analizzate devono essere manipolate allo stesso modo Occorre essere in grado di produrre sempre limmagine originale
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Flusso di lavoro
Ottimizzare la ripresa delle immagini Identificare gli oggetti da analizzare quantitativamente Processare limmagine per estrarre le informazioni utili Analizzare quantitativamente limmagine Confrontare la congruenza del risultato con limmagine originaria
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Acquisizione delle immagini

Generalit
Il momento dellacquisizione dellimmagine fondamentale per i seguenti motivi:
Limmagine pu essere irripetibile (esperimento dinamico, ripresa di un preparato fluorescente) Le informazioni contenute nellimmagine non possono essere aumentate Il modo in cui viene ripresa limmagine pu condizionare profondamente le fasi successive

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Metodi di ripresa
Camere fotografiche tradizionali (pellicole) Telecamere analogiche Camere e telecamere digitali Scanners
Le caratteristiche di questi dispositivi influenzano in modo decisivo la qualit delle immagini. Le pellicole sono sempre meno usate anche perch successivamente le pellicole o le stampe devono essere digitalizzate
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Illuminazione
I difetti di illuminazione pi comuni sono
Ombre (cattiva focalizzazione del sistema ottico) Non omogeneit nel campo di illuminazione Sporcizia nel percorso ottico Instabilit dellilluminazione Tipo di sorgente luminosa (luce naturale, luce artificiale)

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Come correggere?
Ombre Centrare meglio il sistema ottico e verificare il diaframma. Pu essere necessario ricentrare la lampada

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Come correggere?
Non omogeneit nel campo di illuminazione Un difetto comune negli scanners che determina una scarsa affidabilit delle immagini riprese con questi apparecchi (soprattutto per analisi densitometriche). Si possono fare correzioni attraverso i programmi di ritocco, ma si perde la possibilit di usarle per analisi quantitative.
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Come correggere?

Sporcizia nel percorso ottico o nella telecamera

Spesso nel percorso ottico sono presenti polvere o altre impurezze che determinano sporco nellimmagine. Questi difetti spesso non sono eliminabili in quanto le impurezze possono essere in posizioni inaccessibili. Le impurezze sono per in posizioni fisse e possono essere eliminate in fase di ripresa con apposite utilities del software di acquisizione.
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Come correggere?

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Come correggere?

Sporcizia nel percorso ottico o nella telecamera

Il modo pi semplice quello di utilizzare una immagine di un campo vuoto per campionare i difetti e poi sottrarre il valore dei pixels dallimmagine che si vuole successivamente analizzare. Questo processo si chiama rimozione delle ombre.

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Come correggere?
Utilizzo di sorgenti particolarmente corrette

Transilluminatori per analisi quantitativa di gel possono essere una soluzione a basso costo ed affidabile

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Come correggere?

Questo tipo di sorgente pu anche essere utilizzata per la illuminazione per trasmissione di campioni da osservare con lo stereomicroscopio
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STRUMENTI DA UTILIZZARE
Telecamere - fotocamere - pellicole scanners - camera lucida Microscopio Sistema di archiviazione Programma di miglioramento dellimmagine e fotoritocco Programma di analisi quantitativa Analisi statistica dei risultati
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PROCESSAMENTO E QUANTIFICAZIONE DELLE IMMAGINI

Introduzione - 1
Linterpretazione dei fenomeni biologici necessita di una quantificazione dei dati. La variabilit degli oggetti biologici tale da imporre la necessit di analisi statistiche dei dati ottenuti Tecniche di indagine morfologica si prestano molto bene ad interpretazioni qualitative piuttosto che quantitative delle variazioni osservate
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Introduzione - 2
Variazioni nellaspetto normale di oggetti biologici Effetti delle condizioni sperimentali su specifiche propriet morfologiche degli oggetti (numero, grandezza, forma) Correlazioni tra morfologia e funzioni delle strutture in esame
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Introduzione - 3
La quantificazione di oggetti osservati al microscopio un lavoro lungo, impreciso e molto ripetitivo (quindi altamente soggetto ad errori). Lintroduzione dei calcolatori ha permesso di velocizzare ed automatizzare gran parte delle operazioni necessarie per misurare gli oggetti micro- o macroscopici.
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Stereologia
E una delle prime tecniche di conteggio che sono state utilizzate. Consente di calcolare parametri quali grandezza, volume, superficie, sulla base di alcuni assunti teorici (ad esempio tutti gli oggetti hanno la stessa forma) ed utilizza griglie e conteggi delle intersezioni Difetti: gli oggetti biologici non sono tutti uguali il campionamento limitato Vantaggi: Velocit nellacquisizione dei dati

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La griglia viene selezionata a seconda del tipo di conteggio che occorre fare. Per il calcolo di volumi si contano i punti che sono compresi nello spazio da valutare (ad esempio il nucleo). Per il calcolo delle superfici si conteggiano le intersezioni con i segmenti (ad esempio il reticolo granulare)

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Analisi di Immagine
Con questo termine si intende la descrizione in termini quantitatividegli oggetti contenuti in una immagine di tipo:
fotografico da microscopio da scanner

Lanalisi di immagine pu essere condotta con metodi semiautomatici oppure con metodi automatici.
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Analizzatori di Immagine meno evoluti

Disegno manuale dei contorni degli oggetti e calcolo (automatico da parte del programma) di parametri morfometrici:
area perimetro assi maggiori e minori fattori di forma
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Analizzatori manuali
Si basano su una tavoletta grafica che invia le coordinate delle regioni selezionate al programma di conteggio

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Analizzatori manuali

Descrizione degli oggetti in termini di coordinate.

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Analizzatori moderni
Scheda digitalizzatrice (trasforma il segnale analogico in digitale) Possibilit di processamento dellimmagine (digitale) per esaltarne le caratteristiche

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Schema di analizzatore digitale

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Stazione di Analisi di Immagine

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Analisi semiautomatica
Immagine originaria Selezione degli elementi con il mouse

Immagine contrastata

Tabella dei risultati

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Steps necessari per la analisi di immagine Acquisizione immagine (ottimizzazione telecamera, microscopio, sorgenti luminose) Processamento dellimmagine
riduzione del rumore aumento dei contrasti pulizia dellimmagine estrazione dei soggetti da misurare

Analisi dellimmagine
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Steps necessari per la analisi di immagine Acquisizione immagine (ottimizzazione telecamera, microscopio, sorgenti luminose)
Telecamere analogiche o digitali (pi costose) Centratura della luce per il sistema di ripresa Ripresa delle immagini da comparare nel pi breve tempo possibile (riduzione degli errori dovuti ad una diversa illuminazione)

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Steps necessari per la analisi di immagine

Processamento dellimmagine
riduzione del rumore aumento dei contrasti pulizia dellimmagine estrazione dei soggetti da misurare

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Analisi automatica
Processamento dellimmagine Isolamento delle strutture (erosione e dilatazione) Editing manuale Binarizzazione Conteggio

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Pulizia dellimmagine

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Filtraggio ed effetti speciali

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Erosione e Dilatazione

EROSION

ORIGINAL BINARY IMAGE

DILATION

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Selezione delle strutture da analizzare

ORIGINAL CONTRAST ENHANCED

C.E.+MEDIAN FILTER

LUT CHANGES

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Immagine originale - ICC per aromatasi

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Manipolazione per resa fotografica

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Estrazione oggetti da contare - corpi cellulari

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Binarizzazione dellimmagine

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Identificazione dei confini dei corpi cellulari

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Sovrapposizione per verificare la congruenza

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Tecniche di misurazione
Necessit della misurazione
Effetti tutto o nulla Modulazione degli effetti Raffronto di dati con analisi di tipo statistico

Come si calcolano i volumi? Come si calcola il numero delle cellule? Come si misura la densit? Come si misura il numero di granuli? Limiti delle misurazioni
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Calcolo dei volumi

Definizione del nucleo
Elementi anatomici Markers neurochimici

Uso di sezioni seriate Misura della superficie su ogni sezione ed integrazione dei valori tenendo conto della distanza delle sezioni
Indipendenza dal piano di sezione Possibilit di avere fette mancanti

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MISURA DEL VOLUME

F D E C B A A B C G

Vtot =

"

( A !G

SupA + SupB xdist) 2

Conteggio neuroni
Sezioni sottili
evidenziazione dei nucleoli conta nucleoli

Scelta della regione

Differenze regionali?
La densit delle cellule uguale in tutto il nucleo? Le cellule di glia possono essere differenziate?

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Estrazione di informazioni

Talvolta limmagine pu presentare diversi elementi che possono essere isolati con lutilizzo di filtri La sezione stata controcolorata con un colorante rosso Il filtro verde esalta le caratteristiche del tessuto Il filtro rosso elimina il tessuto ed esalta i granuli azzurri presenti nel campo
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Utilizzo filtri per isolare elementi dellimmagine

Foto originale

Filtro verde

Filtro rosso

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CALCOLO AREA FRAZIONARIA

PROBLEMA: Valutare la densit di immunoreattivit in una certa regione Occorre acquisire la sezione colorata con ICC ed una sezione adiacente colorata con il Nissl Sulla sezione colorata con il Nissl si identifica la struttura e si delinea il suo contorno Si riporta il contorno sulla sezione colorata con ICC Con la sogliatura si identificano le strutture immunoreattive Si misura il numero di pixels rossi nella regione e si confronta questo valore con il numero di pixels contenuti nellimmagine Il rapporto tra questi due valori larea frazionaria
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Area frazionaria

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Area frazionaria

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Area frazionaria

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16%

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DENSITOMETRIA

Densitometria
Scelta del ligando appropriato
Limitazioni per luso di alcuni composti marcati Disponibilit sul mercato Specie-specificit

Calibrazione dellautoradiogramma Fattori che influenzano la densit

Tecnica di analisi Luce

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Apparato per misure densitometriche

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Autoradiogrammi con scala di calibrazione

Curve di calibrazione
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Fig. 2. Densitometric analysis of Melatonin receptor in quail telencephalon. From the original image, the "cold" section image have been substracted (background subtraction). The resulting image has been analysed, through the calibration gray scale on the left. The histogram of the gray levels is also displayed.

HA NI HIS BAS NV NI

HA HIS NV

HIS HA HD HV E LPO

ICo MLd Imc Ipc

EW nIII Imc Ipc TeO nBOR

nIV IP

TeO

Tuber nBOR

B
HA Hp NV E

A
Hp NI

NI

TPO S

Cb Cb
POA

LPO

D
Hp NI TPO v S nST

INP Hp HL

nPrV TeO MnV R

nPrV nVI R

TPO

C
DLA OM

LA

GLv

Cb Ved Ved

CP TeO DLP T ROT GCt

TeO

MLd

ICo

EW nIII VMN

F
17 9 5

G
2 0.8

H
0.25 0.05

VMN vSCN

GLv

GLv vSCN

Recettore per la Melatonina

Recettore per la Melatonina Maschio Femmina Maschio Femmina

Luso di pseudocolori pu esaltare le differenze

Analisi quantitativa dopo ibridazione in situ

Limiti delle misurazioni

Ripetitibilit? Soggettivit delle misurazioni
Misurazioni eseguite da pi osservatori e media dei valori Criteri comuni per lidentificazione delle strutture

Disegno statistico corretto

Applicazione dellanalisi della varianza (ANOVA) Test di comparazione appropriati

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