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SVILUPPO DEL FOLLICOLO OVARICO NELLA BOVINA

D. Robbe*, M. DOttavio*, L. Valentini**, R. L. Sciorsci**
* Dipartimento di Scienze Veterinarie ed Agroalimentari, Universit di Teramo ** Dipartimento di produzione animale, Universit di Bari Pubblicato su Obiettivi e Documenti Veterinari n5 Maggio 2002

La bovina una specie poliestrale continua, cio presenta cicli sessuali continui senza apparenti interferenze ascrivibili alla stagione, al fotoperiodo o al clima. Il ciclo estrale in tale specie ha una durata media di 21 giorni e si divide nelle seguenti fasi: proestro, estro, metaestro e diestro; la lunghezza del ciclo estrale dipende dal numero di ondate follicolari. Nella bovina, funzionalmente il ciclo estrale pu essere suddiviso in due fasi: una follicolinica, sotto il controllo degli estrogeni (E) ed una luteinica, sotto il controllo del progesterone (P4). Nell'ipofisi anteriore, da parte delle cellule basofile o gonadotrope, sono sintetizzate le gonadotropine, FSH (Follicle Stimulating Hormone) e LH (Luteinizing Hormone), con struttura glicoproteica.

Figura 1: Teoria Due cellule, due ormoni per il controllo della steroidogenesi follicolare, (Van Voorthis, 1999).

Tali gonadotropine endogene sono prodotte a livello di adenoipofisi, sotto stimolo di un deca-peptide, il GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone), secreto dall'ipotalamo. L'ormone luteinizzante determina la maturazione e la rottura del follicolo, ed avvia lo sviluppo del corpo luteo (CL). Lormone follicolo stimolante stimola la crescita del follicolo nellovaio e la produzione di estrogeni. A livello ipotalamico e ipofisario gli estrogeni hanno un'azione di feedback negativo sulla liberazione tonica di gonadotropine, mentre attivano il centro fasico per la liberazione preovulatoria dellLH (Stumpf e coll.,1991). La secrezione basale o tonica di GnRH, e di conseguenza di gonadotropine, di tipo pulsatile, specialmente per quanto riguarda lLH, con emissioni intermittenti ad intervalli di circa un'ora. Tale secrezione basale di LH importante per laccrescimento follicolare. Durante la fase estrale, si verifica la secrezione fasica dellLH, con valori di circa 40 ng/ml, o picco preovulatorio dellLH, responsabile dellovulazione.
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Tale picco ha una durata di 8-10 ore. LH e FSH sono prodotti dalle stesse cellule ed immagazzinati dentro granuli secretori allinterno del citoplasma. Lo stoccaggio dellFSH scarso e di breve durata: viene liberato in modo regolare nel corso del ciclo, contrariamente allLH, il cui immagazzinamento prolungato per essere liberato in grande quantit durante il picco preovulatorio (Ennuyer, 2001). I recettori per lLH sono presenti a livello di follicolo e di CL, nel follicolo a livello di granulosa e di teca interna. I recettori per lFSH si trovano a livello di granulosa. Gli ormoni steroidei sono sintetizzati a partire dal colesterolo; lazione dellLH sulla produzione di androgeni da parte delle cellule della teca, insieme all'azione dell' FSH nella sintesi di E da parte delle cellule della granulosa, alla base della teoria due-cellule, due-ormoni per il controllo della steroidogenesi follicolare (Figura 1). Le cellule della granulosa sono incapaci di produrre androgeni come substrato per l'aromatasi, in quanto sono carenti di citocromo P450c17, quindi dipendono dalle cellule della teca per tale substrato. In questo modo la steroidogenesi follicolare dipende da due cellule (teca e granulosa) e due ormoni(LH e FSH) per la secrezione di estradiolo (Van Voorthis,1999). Il follicolo maturo produce elevate quantit di estrogeni, che a loro volta provocano la liberazione di gonadotropine, in particolare di LH, da parte delladenoipofisi; il picco preovulatorio di LH determina la deiescenza del follicolo e, quindi, lovulazione. Subito dopo lo scoppio del follicolo, si ha una proliferazione delle cellule tecali (teca interna) ed una trasformazione delle cellule della granulosa. Inizialmente si sviluppa il corpo emorragico, presente dal giorno 1 al giorno 5 (Hanzen e coll., 2000). Gradualmente si trasforma in CL, una particolare struttura endocrina, il cui prodotto di secrezione il P4. Nei cicli con 2 ondate di crescita follicolare, la regressione del CL inizia intorno al 16 giorno; nei cicli con 3 ondate, invece, intorno al 18-19 giorno (Ginther e coll., 1989). Un quadro sulle concentrazioni periferiche ormonali durante il ciclo estrale della bovina riportato nella Figura 2.

Figura 2: Concentrazioni periferiche degli ormoni durante il ciclo estrale della bovina (Woolumus e Peter, 1994).

FOLLICOLOGENESI E SVILUPPO FOLLICOLARE

La follicologenesi rappresenta un meccanismo fisiologico dagli aspetti molteplici, non completamente conosciuti e di difficile indagine. A differenza di quanto si per lungo tempo creduto, la follicologenesi, nel suo insieme, si rivelata sempre pi un processo dinamico e lineare, assimilabile forse alla stessa gametogenesi maschile e dotata, comunque, di ritmi e frequenze certamente pi intensi della cadenza dei cicli estrali (Godke e coll., 1990). Ancora oggi, desta perplessit e stupore lapparente anti-economicit di un processo naturale che prevede il coinvolgimento di un numero elevatissimo di follicoli primordiali (da 500 a 1.000/ciclo) per esitare nella completa maturazione e liberazione terminale di uno solo o pochissimi gameti. Ad arrestare lo sviluppo del 99,9% dei follicoli ovarici interviene, infatti, un meccanismo precoce ed altamente efficiente, chiamato atresia follicolare, determinante perch dei circa 150.000 follicoli primordiali presenti nella bovina alla nascita, ne pervenga a deiescenza al massimo qualche centinaio nel corso dellintera carriera riproduttiva. La diminuzione dei follicoli primordiali avviene come risultato di 2 processi: entrata nella fase di crescita follicolare o atresia. Alcuni follicoli possono anche rimanere allo stadio primordiale e non mostrare segni di crescita o atresia. Alla nascita, una femmina gi presenta il completo capitale follicolare, nessun nuovo follicolo si forma dopo la nascita. Lorganizzazione del pool ovarico di follicoli primordiali, costituiti da un singolo oocita circondato da epitelio pavimentoso semplice, si realizza durante lo sviluppo embrionale (Aria, 1992). Questi follicoli primordiali rappresentano la riserva di cellule germinali, da cui si svilupperanno i follicoli destinati ad accrescersi. Nel complesso meccanismo dello sviluppo follicolare, un ruolo importante sembra essere svolto dai neurotrasmettitori contenuti nei nervi ovarici (Mayerhofer e coll., 1997); le strutture nervose dellapparato genitale femminile di molti mammiferi contengono, oltre ai neurotrasmettitori tradizionali, acetilcolina e noradrenalina o norepinefrina (NE), neuropeptidi ritenuti trasmettitori e/o modulatori dellimpulso nervoso (Kaleczyc e coll., 1994; La Mura e coll., 1994); in particolare, la NE ed il peptide intestinale vasoattivo (VIP) promuovono laccrescimento follicolare, inducendo la formazione dei recettori per lFSH sui follicoli neoformati. I neurotrasmettitori agiscono sulla steroidogenesi ovarica, mentre entrambi stimolano la secrezione di P4 e di androgeni, soltanto il VIP stimola la produzione di estradiolo. La NE interviene, inoltre, nella contrazione della muscolatura liscia della parete follicolare (Stefenson e coll., 1981), contribuendo, cos, allovulazione. I peptidi oppioidi possono inibire il rilascio di NE dalle terminazioni nervose simpatiche (Waterfield e coll.,1977). Altri neurotrasmettitori, quali ad esempio, il neuropeptide Y (NPY), sembrano avere un ruolo nel controllo del flusso sanguigno a livello ovarico. Bench NPY non sembri partecipare direttamente nel processo ovulatorio, potrebbe contribuirvi modulando la risposta delle cellule della granulosa alle gonadotropine ed alle catecolamine (Dissen e Ojeda, 1999). Le catecolamine stimolano il rilascio di P4 dalle cellule della granulosa e di testosterone dalle cellule della teca (Ernfors e coll., 1990).
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Parte delle fibre nervose contenenti NPY presenti nell'ovaio di donna, suino e ratto, circondano i follicoli oofori. probabile che tali fibre influenzino indirettamente la deiescenza follicolare, determinando la contrazione del microcircolo locale e/o regolando la secrezione di NE da parte delle terminazioni nervose circostanti. Lamina possiede, infatti, un netto effetto ovulatorio (Jorgensen e coll., 1991). stata dimostrata lesistenza di una neuro-connessione bi-direzionale ipotalamo-ovarica; lelettrostimolazione dellarea ipotalamica anteriore in ratti privi di ipofisi e di ghiandole surrenali, aumenta la secrezione di ormoni steroidei a livello ovarico. Al contrario, inducendo delle lesioni a livello della stessa area ipotalamica, si verificano alterazioni ipsilaterali nella concentrazione ovarica di VIP e dei recettori per il GnRH (Dissen e Ojeda, 1999). In generale, possiamo distinguere una follicologenesi basale (gonadotropinoindipendente), praticamente continua ed una follicologenesi tonica (gonadotropinodipendente) pi o meno intermittente, alla quale accedono solo follicoli di definite dimensioni (di diametro > 4 mm nella bovina). Questi ultimi, a loro volta, si differenzieranno in follicoli destinati a regressione pi o meno precoce e follicoli evolutivi (dominanti ovulatori e dominanti anovulatori). Per quanto concerne i primi stadi della follicologenesi, si reputa che siano indicativamente necessari circa 40 gg per il passaggio dalla dimensione preantrale a quella preovulatoria (Aria, 1992). La differenziazione follicolare in ratti neonati, quando le ovaie sono insensibili alle gonadotropine, dipende dal diretto controllo neurogenico (Malamed e coll., 1992). Nella fase gonadotropino-indipendente, le cellule della teca interna del follicolo acquisiscono recettori per lLH, mentre le cellule della granulosa conseguono recettori per lFSH. In tal modo, diventano capaci di rispondere ad una stimolazione gonadotropa e di sintetizzare E (Ennuyer, 2001). I follicoli primordiali si formano quasi con certezza senza linfluenza della stimolazione gonadotropinica. Questo primo periodo della follicologenesi ancora in parte sconosciuto, ed sotto il controllo di fattori intraovarici ed intrafollicolari. Il secondo periodo dello sviluppo follicolare dipende essenzialmente dalle gonadotropine ipofisarie.

DOMINANZA FOLLICOLARE
Lo sviluppo follicolare procede attraverso stadi di reclutamento, selezione e dominanza (Ireland e Roche, 1987). Il reclutamento un processo attraverso il quale un pool (o coorte) di follicoli comincia a maturare in un ambiente con sufficiente contenuto di gonadotropine ipofisarie. La selezione il processo attraverso cui un singolo follicolo reclutato scelto e gradualmente diventa pi grande degli altri, per sfuggire temporaneamente allatresia, acquisendo il potenziale ovulatorio. La dominanza il mezzo attraverso cui il follicolo selezionato spinge i follicoli subordinati a regredire e inibisce il reclutamento di un nuovo pool di follicoli. Nel corso dello sviluppo, il follicolo destinato ad ovulare va incontro ad una specifica sequenza di modificazioni recettoriali, che ne condizionano il graduale incremento di sensibilit agli stimoli gonadotropi, con particolare riferimento allLH.
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Si ritiene che in un primo tempo il follicolo primordiale, insensibile alle gonadotropine, proceda verosimilmente in modo spontaneo verso lo stadio preantrale precoce, fintanto che, superato un primo filtro selettivo (o reclutamento), connesso forse a variazioni dellFSH, inizia ad elaborare recettori (Rc) per lLH, a livello tecale, e per lFSH e per gli estrogeni a livello della granulosa. La presenza dei recettori conferisce al follicolo la sensibilit alla secrezione tonica di gonadotropine che ne condizionano lacquisizione di propriet steroidogeniche sempre maggiori, avviandolo alla formazione dellantro. La biosintesi locale di E e la conseguente saturazione dei Rc follicolari innesca un meccanismo a cascata di autosensibilizzazione, basato sulla sintesi locale di nuovi Rc per lFSH nella granulosa e di altri Rc per lLH sia nella teca che nella granulosa (Aria, 1992). Durante il ciclo estrale della bovina, lo sviluppo follicolare progredisce a ondate (Ireland e Roche, 1983). Una ondata follicolare consiste nell' insorgenza ogni 7 gg circa sull'ovaio di un gruppo di follicoli di 1-2 mm di diametro, sotto l'azione dellFSH. I primi studi sullesistenza delle ondate follicolari nella bovina risalgono agli anni '60, ad opera di Rajakoski e Bane (Garcia e coll., 1999). La crescita follicolare nella bovina avviene in 2 o 3 ondate. Cicli con 3 ondate sono pi frequenti nelle manze; quelli con 2 ondate sono riscontrati essenzialmente nelle bovine adulte (Ennuyer, 2001). Durante ciascuna ondata, un gruppo di follicoli (normalmente da 3 a 5 follicoli, con diametro di 4-5 mm) si sviluppa; in genere, un solo follicolo selezionato per diventare dominante (Ginther e coll., 1996; Sartori e coll., 1998); occasionalmente, 2 follicoli possono essere selezionati durante una fase follicolare, dando origine al fenomeno noto come co-dominanza (Fricke e Wiltbank, 1999). Il follicolo dominante inibisce lulteriore sviluppo degli altri (subordinati), che vanno in atresia. Il follicolo dominante dellultima ondata di ciascun ciclo estrale diventa il follicolo ovulatorio (Kastelic e Ginther,1991). Generalmente tale follicolo che non riesce ad ovulare e diventa una cisti (Peter e coll.,1992). Il processo di dominanza causa una singola ovulazione, che caratteristica della specie bovina. I fattori che portano alla dominanza di un follicolo e il meccanismo che sopprime la crescita dei follicoli subordinati, non sono ancora del tutto conosciuti. Tutti i follicoli che non abbiano superato le fasi di reclutamento e selezione non procedono nel loro sviluppo e sono destinati ad un processo involutivo definito atresia (Greenwald e Roy, 1994). Recentemente stato ipotizzato che il controllo anormale dellapoptosi a livello del follicolo, in particolare la riduzione della frequenza di tale processo, pu risultare in una cisti follicolare (Isobe e Yoshimura, 2000). Quindi, il controllo dellapoptosi potrebbe essere essenziale per ridurre lincidenza di tale patologia ovarica.

INNERVAZIONE OVARICA Le ovaie dei mammiferi sono innervate da fibre di neuroni sensitivi e simpatici del sistema nervoso periferico e da un piccolo numero di fibre parasimpatiche; linnervazione avviene prima del termine della follicologenesi (Dissen e coll.,1993), la densit delle fibre, poi, aumenta e raggiunge la concentrazione pi elevata nella pubert. Mentre le fibre dei neuroni sensitivi contengono sostanza P (SP) ed il peptide correlato al gene per la calcitonina (CGRP) (Calka e coll., 1988), le fibre dei neuroni del simpatico utilizzano NE, NPY e VIP come neurotrasmettitori. Il VIP contenuto anche nelle fibre dei neuroni sensitivi (McNeill e Burden, 1987). La NE ed i peptidi agiscono a livello di recettori associati con ladenilato ciclasi; tali recettori sono presenti nellovaio allinizio della follicologenesi (Advis e coll., 1989) e prima che i follicoli neoformati acquisiscano i recettori per lFSH. Il VIP induce la formazione di cAMP e stimola lattivit aromatasica nelle ovaie fetali e/o neonatali che non sono ancora sensibili alle gonadotropine (George e Ojeda, 1987). Diversi studi hanno evidenziato il ruolo dellinnervazione simpatica nella regolazione della steroidogenesi ovarica, nellovulazione e nella crescita follicolare (Morales e coll., 1993). Secondo le esperienze di Hirshfield (1992), i primi follicoli che iniziano ad accrescersi sono quelli localizzati in prossimit dellilo ovarico che, nel ratto, la prima regione ad essere innervata (Malamed e coll., 1992). Il controllo nervoso delle ovaie coinvolge non solo neuroni del sistema nervoso periferico, ma anche neuroni del cervello, come evidenziato dalla recente dimostrazione che i neuroni ipotalamici secernenti ossitocina sono sinapticamente connessi con le ovaie. Si pensa che le fibre contenenti SP e CGRP siano coinvolte nella regolazione del flusso ematico a livello ovarico, dato che innervano soprattutto i vasi; tali fibre, inoltre, potrebbero inviare al Sistema Nervoso Centrale informazioni concernenti lo stadio di sviluppo di ciascun follicolo. Linnervazione simpatica ovarica esercita una influenza positiva sulla crescita follicolare. Ci stato dimostrato in esperimenti effettuati sui ratti (Dissen e Ojeda,1999). A tali animali sono stati somministrati anticorpi rivolti verso il fattore di crescita dei nervi (NGF); tale fattore sintetizzato dallovaio in via di sviluppo, ed essenziale per la sopravvivenza dei neuroni simpatici periferici. Bloccare lazione dellNGF durante lo sviluppo dellinnervazione ovarica efficace nel prevenire linnervazione simpatica dellovaio, di conseguenza, gli animali trattati hanno mostrato una stentata crescita follicolare. LNGF stato il primo fattore neurotrofico ad essere identificato e caratterizzato (Levi-Montalcini, 1987), sia nel Sistema Nervoso Centrale che nei tessuti periferici innervati da fibre di neuroni sensitivi e simpatici. In seguito, sono state identificate altre neurotrofine (BDNF, NT-3, NT-4 e NT-5). Questi fattori sono importanti per lo sviluppo e la sopravvivenza delle fibre nervose, le loro azioni biologiche sono mediate da recettori transmembrana per la tirosina-kinasi. Tali fattori ed i loro recettori sono presenti in diversi tessuti ed inoltre sono coinvolti nel controllo della follicologenesi (Lara e coll., 1990).

Considerando che i neuroni sono presenti in numero limitato e che le pareti di tutti i nuovi follicoli antrali reclutati sono innervate (Stefenson e coll., 1981), si ipotizza un meccanismo estremamente efficace nel regolare linnervazione follicolare. In studi effettuati su follicoli antrali di pecora, stata analizzata la produzione dellNGF, in vitro (Gioia, 1996; Mattioli e coll.,1999). I risultati ottenuti indicano che il fattore di crescita dei nervi viene prodotto e si accumula nel liquido follicolare solo in presenza di entrambe le gonadotropine, LH e FSH, e solo da follicoli di una certa dimensione (> 3 mm di diametro) e dotati, quindi, di recettori sia per lLH che per l'FSH. Dissen e coll. (1996) hanno dimostrato che lovulazione preceduta da una notevole attivazione del gene per lNGF nelle cellule della parete follicolare; ci ha suggerito un probabile ruolo di tale fattore nel meccanismo che regola lovulazione. La produzione dellNGF rappresenta un possibile meccanismo attraverso cui i follicoli in crescita vengono innervati. La sintesi di tale fattore condizionata da un determinato ambiente gonadotropinico; qualsiasi modificazione di tale ambiente ormonale in grado di alterare la sintesi ed il rilascio dei fattori gonadotropici e, di conseguenza, il grado dinnervazione del follicolo. Per quanto riguarda la produzione dellNGF, non si esclude una cooperazione tra le cellule della granulosa, provviste di recettori per lFSH, e le cellule della teca, dotate di recettori per lLH. Linnervazione simpatica amplifica leffetto delle gonadotropine (Dyer e Erikson, 1985). La stimolazione adrenergica, in associazione con lLH, induce la maturazione delloocita (Mattioli e coll., 1995 ). La stimolazione adrenergica, inoltre, induce un aumento dei livelli di AMP ciclico; tale aumento transitorio stato dimostrato verificarsi nel citoplasma delloocita immediatamente prima della ripresa della maturazione delloocita stesso (Mattioli e coll.,1994).

Figura 3: Innervazione simpatica dellovaio ( Dissen e Ojieda, 1999).

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Le ovaie della bovina e della pecora presentano uninnervazione adrenergica molto sviluppata rispetto alle altre specie animali; le fibre nervose sono localizzate soprattutto nella teca esterna dei follicoli, dove sono distribuite parallelamente alla superficie follicolare. Le ovaie dei mammiferi sono innervate da 2 nervi principali; il primo il nervo che prende origine al plesso ovarico o OPN (Ovarian Plexus Nerve) e che corre lungo larteria ovarica per raggiungere lo stroma ovarico. Il secondo nervo, nel ratto, il nervo ovarico superiore o SON (Superior Ovarian Nerve), che si distribuisce a livello dei follicoli ovarici; nella donna il nervo ipogastrico, che trae origine dal plesso ipogastrico superiore; esso si divide in piccoli fasci che corrono lungo il legamento largo per raggiungere lovaio. I nervi ovarici originano dai gangli celiaco e mesenterico e dai nervi splancnici lombari, i quali hanno origine in gangli situati lungo laorta in vicinanza delle arterie renali. La componente simpatica dellinnervazione ovarica origina dalla catena gangliare, che si estende dalla IIa vertebra toracica alla IVa lombare; dalla catena gangliare simpatica originano fibre che si portano nei gangli celiaco e mesenterico (Figura 3). Le fibre postgangliari innervano poi lovaio attraverso uno dei 2 nervi ovarici (Dissen e Ojeda, 1999); Riboni e coll., (1998) riportano che la denervazione simpatica indotta chimicamente, attraverso la somministrazione di guanetidina, farmaco ad attivit simpaticolitica, in cavie neonate, determina un aumento del numero medio di follicoli nelle ovaie degli animali denervati ed un incremento dei follicoli atresici. Il sezionamento unilaterale del SON in ratti di 16 gg di et determina una riduzione significativa del numero degli ovuli nellovaio privato dellinnervazione ed una ovulazione compensatoria nellovaio innervato (Morales e coll.,1993). Lincremento degli ovuli nellovaio non privato dellinnervazione, potrebbe dipendere da un possibile aumento del tono simpatico. La successiva somministrazione di gonadotropine non ripristina lovulazione nellovaio denervato (Morales e coll., 1998). Ratti di 18 o 21 gg di et, denervati chimicamente, e trattati con PMSG (Pregnant Mares Serum Gonadotropin) e HCG (Human Chorionic Gonadotropin), ovulano; lovulazione non si verifica se la guanetidina somministrata in ratti di 15 giorni di et (Flores e coll., 1998). Ci indica che linnervazione svolge differenti funzioni durante i diversi stadi dello sviluppo. In un recente studio sono stati analizzati gli effetti del sezionamento uni o bilaterale del SON in ratti prepuberi, sulla crescita follicolare (Moran e coll., 2000); i risultati ottenuti indicano che linnervazione simpatica dellovaio (via SON), modula la regolazione della differenziazione e crescita follicolare. Il sezionamento unilaterale del SON determina una rilevante differenza nella concentrazione di NE tra lovaio innervato e quello privato dellinnervazione (Chavez e coll., 1994). Ferruz e coll. (1991) hanno suggerito che il rilascio di NE da parte delle terminazioni nervose, a livello ovarico, pu essere regolato dalle gonadotropine. Studi in vitro hanno dimostrato che il VIP determina un aumento del numero dei recettori per lFSH (Mayerhofer e coll., 1997), e che il sezionamento del SON e dell'OPN determina una rilevante riduzione della concentrazione ovarica di VIP (Advis e coll.,1989). Quindi, laumentato numero di follicoli atresici in animali con interruzione uni o bilaterale del SON, pu essere spiegato dalla diminuzione dei recettori per lFSH, come conseguenza della denervazione.
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 stato dimostrato, nella bovina, che la localizzazione del centro nervoso per ovaio ed ovidotto , per quanto riguarda il simpatico, sito a livello di plesso ipogastrico (Flieger e coll., 1984). La resezione del nervo ipogastrico, infatti, riduce in modo significativo la concentrazione di NE a livello di utero ed ovaio e non in altri organi (Kulkarni e coll., 1976).

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