Regolazione tramite microRNA

Questi microRNA sono codificati da un gene specifico, ma questi non é

l’unica fonte di micro-RNA nella cellula. Infatti una stessa sequenza di DNA
può essere trascritta seguendo entrambi i sensi di lettura, quindi si trova sia
un promotore a monte che un promotore a valle del gene, formando cosi un
RNA che per complementarietà di basi é a doppio filamento. La stessa cosa
succede a due sequenze che hanno tratti complementari e si trovano su due
loci genetici diversi, i quali si incontrano successivamente per produrre un
doppio filamento di RNA. Oppure, queste sequenze elfin ovvero ripetizioni
di sequenze in tandem disposte in ordine testa-coda con una sequenza 5’3’
a cui segue la stessa sequenza in 3’5’, formano un palindromo.

Queste vengono trascritte in una sola direzione, formando delle strutture a

forcina. Oppure la presenza di RNA-polimerasi RNA-dipendenti, che spesso
sono sintomatiche di infezioni virali, prendono gli RNA cellulari e li converte
in RNA a doppio filamento. La presenza di tanti RNA a doppi filamento
rappresentato un allarme nella cellula, perché indicano la presenza di DNA
egoista, ovvero DNA che pensa solo alla proprio duplicazione. Per cui la
cellula utilizzando sistemi già visti come Drosha, Dicer, e Argonauta, blocca
il DNA egoista non consentendogli di diffondere all’interno del genoma. Per
questo motivo i piccoli RNA sono una sorta di forma primordiale di sistema
immunitario, poiché si può pensare che si siano evoluti per difendere la
cellula da DNA invasore. Questo strumento di difesa é stato poi adattato per
regolare l’espressione genica. Drosha, Dicer, e Argonauta vengono infatti
utilizzati per regolare l’espressione di micro-RNA, i quali impattano la
regolazione genica.

La regolazione avviene a livello post-trascrizionale, dunque o per

degradazione del RNA-messaggero o per blocco traduzionale. A questi
sistemi di regolazione genica mediata da piccoli RNA si aggiunge anche la
regolazione dell’eterocromatizzazione del DNA. Dunque i piccoli RNA non
solo sono regolatori post-trascrizionali, ma contribuiscono a rimodellare la
cromatina, agendo da regolatori a livello trascrizionale. Essi sono processati
in venturimetri che si associazioni a proteina della famiglia Argonauta. DICER
taglia lo stem loop e produce un doppio filamento di 21-23 nucleotidi che
viene assemblato all’interno della proteina Argonauta, la quale esclude uno
dei due filamenti.

Questo avviene sempre ma ciò che può avvenire diversamente é che i piccoli
RNA si associano a proteine diverse rispetto a quelle che formano il
complesso dell RNA-inducing silencing complex. Per cui gli RNA si
associa sempre alla proteina Argonauta, ma quest’ultima può legare proteina
diverse. Formano un complesso che si chiama RITS (RNA-Induced
Trascriptional Silencing), il quale attraverso la complementarietà delle basi
identifica i siti che devono essere regolati, veicolando su di essi Iston-Metil-
Transferasi e proteine di rimodelledamento della cromatina che impattano
il codice istonico. Il piccolo RNA decide dove il RITS si siede, richiamando i
complessi di natura epilettica che abbiamo conosciuto, andando dunque a
rimodellare il locus genico. Esso va a silenziare le sequenze ripetute invertite,
che possono essere prodotte da un virus, o da un trans-gene che abbiamo
messo all’interno della cellula.

Questa capacita regolativa sulla cromatina dell’RNA si esprime in due modi:

o andando a riconoscere direttamente la sequenza di DNA o legandosi ad un
trascritto nascente, ovvero ad una polimerasi che sta lavorando, e
quest’ultima struttura poi si associano le proteine che modificano la
cromatina. Domanda: qual’é il modello migliore tra i due? Ovvero é più facile
che il micro-RNA si associ prima al DNA o al DNA nascente? E qual’é il
razionale? Ci sono ricercatori che sostengono chi una chi l’altra tesi.

Nell’esperimento di Fire e Mello in cui i due ricercatori introducono nelle

cellule del verme l’RNA a singolo filamento senso, quello antisenso, e quello
double-strand. Studi precedenti avevano già parlato dell’RNA interference,
ovvero che andando ad introdurre lunghe sequenze di RNA all’interno delle
cellule eucariotiche, queste spegnevano i geni. Questi esperimenti furono
condotti in Olanda con lo scopo di ottenere fiori dai colori intensi, andando a
far produrre alla cellula tanti enzimi per i pigmenti. Invece scoprirono che
andando a fornire alle cellule geni per questi enzimi, venivano prodotti fiori
bianchi, ovvero che avevano perso la capacita di sintetizzare quegli enzimi.
Questo venne spiegato dagli esperimenti di Fire e Mello, che indicarono che
quegli enzimi si inserivano nelle cellule creando delle ripetizioni spesso
invertite, il quale produceva RNA a doppio filamento, che a loro volta
producevano microRNA capaci di silenziare il gene mutogeno. Questo é
quello che succede anche per questo fungo filamentoso che si chiama
neurospora crassa che é una specie di cotone arancione, il cui colore si
scolorisce man mano che si aggiungono le sequenze di RNA. Oggi questa
tecnica di aggiungere micro frammenti di RNA é utilizzata moltissimo in
laboratorio come meccanismo per down-regolare i geni, andando a
silenziare quei geni per cui sono complementari.

Un’altra categoria di piccoli RNA si chiama piRNA, ovvero RNA associati ad

una proteina chiamata Piwi. I piRNA sono leggermente più lunghi dei micro
RNA, avendo circa 30 nucleotidi. Piwi appartiene sempre alla famiglia
Argonauta. La loro particolarità é l’essere molto espresse nella linea
germinale, ovvero durante la formazione di nuovi organismi, dove svolgono
l’importante compito di silenziare i trasposoni, evitando pericolose
mutazioni. Il sistema a Ping-Pong fa si che un trascritto sia associato ad
una proteina della famiglia Argonauta chiamata Ago3, la quale ha abilita di
taglio. Essa taglia in una posizione specifica la sequenza antisenso di un
determinato trasposone. Questo trascritto di antisenso che é stato tagliato
viene poi tagliato dalla proteina Piwi, producendo un trentimero. Questa
sequenza si associa poi ad una sequenza complementare senso, la quale
viene tagliata prima da Ago3 e poi da Piwi una trentina di basi a valle. In
questo modo, Ago3 e Piwi tagliano continuativamente sia sequenze senso
che antisenso originati dai loci transposonici, che in questo modo non hanno
modo di muoversi.

I piRNA sono anche in grado di rimodellare la cromatina. Per cui non solo
essi bloccano l’intermedio a RNA dei trasposoni ma consentono anche uno
spegnimento dei geni. L’inattivazione del cromosoma X é dipendente dalla
produzione di un RNA lungo non codificante, che viene trascritto dal
cromosoma X. Esso non diffonde dal nucleo ma trova sullo stesso
cromosoma X dei siti complementari, eterocromatizzandolo. Sappiamo infatti
che nei mammiferi uno dei cromosomi X nella femmina viene disattivato. Il
meccanismo che consente di silenziare solo uno dei due cromosomi, mentre
l’altro non viene invaso da queste sequenze di RNA é tuttora oggi molto
studiato. Esso é dovuta in parte alla partecipazione di Long Non-Coding
RNA ed in parte dall’utilizzo di microRNA. Questi vengono prodotti da un
focus genico chiamato “centro di un’attivazione degli X”. Questo locus
genico produce de RNA non-codificanti Xist e TsiX, che sono
complementari. Xist é il trascritto che inattiva il cromosoma X ed é solo
trascritto quando TsiX non viene trascritto, e vice versa.

La presenza di TsiX spegnendo la trascrizione di Xist salva il cromosoma

dall’inattivazione. Nelle fasi iniziali dello sviluppo c’é un onda di
demetilinazione del genoma, per cui la cellula ha la possibilità di riscrivere
quelli che sono i geni accessi e quelli che sono spenti. TsiX viene trascritto,
bloccando XisT, sia negli embrioni maschi che nelle femmine, producendo
cromosomi X decondensati. Successivamente, le stimolazioni a carico delle
cellule embrionali determinato la trascrizione di un altro locus chiamato Jpx.
Mentre nei maschi la continua produzione di TsiX viene resa ereditaria,
poiché il maschio eredità la copia di X attiva, che rimane tale, nelle femmine
la presenza di alte concentrazione di Jpx, andrà a rimuovere il silenziamento
di Xist su uno dei due cromosomi in modo casuale. Sull’altro cromosoma la
situazione e la stessa che nel maschio, TsiX é trascritto il che garantisce il
silenziamento di Xist. Il silenziamento Xist é garantito dalla presenza di sia
sequenze senso che antisenso, andando a formare RNA a doppio filamento,
che viene processato insieme a piccoli RNA che veicolano DNA-metil-
transferasi e Iston-Metil-Trasferasi sul gene Xist. La contemporanea
trascrizione di entrambi i geni é alla base dello spegnimento di uno dei due

cromosomi.
Sistema CRISPR-CAS

La cellula batterica ha sviluppato un sistema che la protegge da infezioni di virus (batteriofagi) con
cui è già stata a contatto. Funziona come il nostro sistema immunitario; la cellula batterica incontra

reinfezione.

Questa memoria è garantita dalla presenza di sequenze brevi, definite crispr (Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats).

Questi loci sono presenti nel genoma della maggior parte dei batteri: il 70% degli eubatteri e il 90%
degli archibatteri.

Organizzazione delle sequenze crispr

Presentano delle ripetizioni di frammenti del genoma fagico, quindi sequenze di origine
virale tutte diverse tra loro (sequenze spacer), intervallate da sequenze identiche (sequenze
repeats).
, ognuno specifico per
quel batteriofago
infezioni fagiche (si può arrivare fino a 300 in alcuni tipi di batteri).
ci dice anche con quale ordine il batterio è stato infettato.
Quindi la sequenza spacer più vicina a quella leader deriva dal genoma del virus che ha
infettato per ultimo; invece gli spacer che derivano dalle prime infezioni si localizzano più
lontano dalla sequenza leader.
La lunghezza dei repeats si aggira intorno ai 20-50 nucleotidi, mentre quella degli spacer
intorno ai 20-70 nucleotidi.
I repeats hanno la capacità di formare strutture ad ansa.
Il locus crispr è preceduto dalla sequenza leader, che funge da promotore e permette la
trascrizione del crispr in piccoli RNA.
A questo locus crispr, che costituisce la memoria delle cellule batteriche, sono associati in loci
genici differenti le proteine cas. (crispr associated protein)

Queste proteine hanno una struttura quaternaria, quindi sono multimeriche. In realtà le catene
polipeptidiche di queste proteine variano altro.

Esempio: la proteina cas di Escherichia coli è costituita da un unico polipeptide; un particolare

termofilo presenta un solo polipeptide ma diverso da quello di E. coli; nel pyrococcus furiosus la
proteina cas è invece multimerica.

È importante sapere che queste proteine sono delle nucleasi, cioè enzimi in grado di tagliare il
DNA su entrambi i filamenti.

Sito di taglio delle cas

Le proteine cas vengono veicolate sul DNA dal crisprRNA, ovvero quel piccolo RNA che si forma
per trascrizione del locus crispr. Questo trascritto presenta una sequenza omologa a quella presente
nel DNA; quindi la proteina cas si lega al crisprRNA, il quale posizionerà la nucleasi in base alla
propria omologia e identifica così il sito di taglio.

RICAPITOLANDO:

1.
.
2. Questo crispr viene trascritto e maturato, cioè tagliato a valle di ogni sequenza spacer;
quindi si formeranno questi crisprRNA maturi.
3. Nel momento in cui il batterio viene infettato dallo stesso batteriofago, il genoma virale
presenta omologia per questo crisprRNA maturo
4. A questo punto viene attivato il sistema crispr-cas.
5. il crisprRNA si associa alla proteina cas e la veicola sul DNA del batteriofago.
6. La cas, effettuando un taglio sul DNA virale, lo danneggia.
7. Il batterio ha evitato una nuova infezione virale.

Il sistema crispr-cas è un sistema di risposta immunitaria, che non passa attraverso gli anticorpi, ma
si basa sulla ricerca di sequenze omologhe presenti su piccoli RNA prodotti endogenamente dalla
cellula.

Questo sistema è utilizzato per modificare il genoma delle cellule, quindi per introdurre, eliminare o
alterare sequenze di DNA in posizioni specifiche. Possiamo riscrivere il genoma cellulare,
ingegnerizzandolo.
Tecniche di ingegneria

le cellule
ingegnerizzate. Inserendo i geni che codificano sia per le cas sia per i crisprRNA, possiamo
, in quelle cellule che vogliamo modificare. Quindi si attiva
il sistema crispr-cas, che taglierà il genoma.
Questo evento è visto dalla cellula come un danno e quindi agisce attraverso i sistemi di
riparazione, ovvero ricombinazione omologa o non omologa (nella ricombinazione non
omologa vi è un possibilità di introdurre degli errori).

Ad esempio: per silenziare una proteina mutata ,

possiamo utilizzare questa tecnica per modificare quel gene nello specifico. Una volta avvenuto il
taglio da parte della cas, la cellula di avvia i sistemi di riparazione e, così, abbiamo riparato la
mutazione che danneggiava la cellula.

Oppure, nel caso di una singola mutazione (beta talassemia) si può utilizzare la ricombinazione
omologa; in questo caso, si va a sostituire solo il nucleotide mutato, riconvertendolo in nucleotide
wild-type.

In ultimo, si può integrare nel genoma un gene, che può essere il GFP, che genera degli organismi
che esprimono fluorescenza.

ricombinazione omologa al

È possibile correggere delle mutazioni a carico di cellule specifiche. È necessario fornire le

proteine cas, i crisprRNA e delle sequenze di DNA che hanno omologia per il sito di taglio
(a monte e a valle del punto in cui la cas eseguirà il taglio); in re
crisprRNA non è completa, perché un solo nucleotide sarà diverso. La cellula riconosce
questo nucleotide diverso come un errore e attiva un sistema di riparo-omologia dipendente.
Alla fine, questo DNA riparato non presenterà più la mutazione che si voleva correggere.
Molti trials clinici utilizzano questo sistema, infatti le prime pubblicazioni a riguardo risalgono al
2016 e venivano già utilizzati per la beta talassemia, retinite pigmentosa, alcune forme di cancro.

Questo sistema può essere utilizzato sia ex vivo, sia in vivo; cioè possiamo prelevare delle cellule
dal paziente, modificarle .

Oppure si può veicolare il sistema crispr-cas in cellule specifiche; quindi inserire le componenti
llule di interesse (senza prelevarle)

Una curiosità

Esistono dei bambini crispr, ovvero è stato modificato il

genoma in fase embrionale di bambine, il cui padre è siero positivo, mentre la madre è siero
negativa. Questo esperimento serviva a proteggerle da infezione da HIV, editando il gene Ccr5.
e a questo

coronavirus). Questo spiega la resistenza innata al virus del HIV di alcuni pazienti, cioè il virus non
è in grado di infettarli a causa di una mutazione del Ccr5.

Gli embrioni di queste bambine sono stati trattati con il sistema crispr-cas, in modo da mutare
selettivamente il gene Ccr5, rendendole
hanno circa 3 anni e stanno bene, ma il reale problema di questa procedura è avere la certezza che
la sequenza che noi forniamo per il crisprRNA identifichi un solo locus, per evitare altri tipi di
danno. Infatti le bambine vengono costantemente monitorate per evitare effetti collaterali. Questo
sistema può essere utilizzato anche come terapia genica.

Espressione genica

L espressione genica può avvenire anche a livello post-traduzionale. Questo tipo

di modificazione permettono variazioni nella struttura di proteine (ad esempio i promotori) che
necessitano di una particolare conformazione, per garantire la propria affinità e un corretto
funzionamento.

Questi meccanismi di regolazione comprendono modificazioni di fosforilazione, acetilazione,

metilazione.

FOSFORILAZIONE

ACETILAZIONE
 METILAZIONE

Ad esempio, i fattori di trascrizione (RAS) dei glucocorticoidi sono funzionali solo se modificati
dopo la loro traduzione. A questi fattori viene aggiunta una coda terminale, con cui hanno la
possibilità di legare la membrana plasmatica e, quindi, svolgere il loro compito.

Oppure nella trasduzione delle map-chinasi, la proteina raf funziona solo se fosforilata.

Tutte le modifiche post-traduzionali

genica.

Anche la quantità di una determinata proteina

.

La quantità di un RNA dipende sia dalla sua produzione sia dalla degradazione.

Per le proteine questa dipende dalla velocità di sintesi, di traduzione e degradazione. La

degradazione delle proteine avviene attraverso il proteasoma e solo se queste vengono ubiquitinate.
Una proteina non va sempre degradata; esistono degli
enzimi, chiamati deubiqui naligasi, staccando
che quella proteina venga degradata.
Le proteine vengono degradate perché misfoldate (ripiegamento non corretto) o perché in eccesso.

Il misfolding viene riconosciuto perché le proteine (soprattutto le globulari) al loro interno

contengono i residui lipofilici (idrofobici); se non piegate nella maniera corretta questi possono
essere espos gono riconosciuti dalle protein-chinasi che li fosforilano.
La presenza di questi gruppi fosfato richiama ligasi, che le marca e li
manda al proteasoma.

Nel caso di proteine in eccesso, la proteina ubiquitinaligasi riconosce una sequenza esposta nel
citoplasma che normalmente è fosforilata. Nel momento in cui segnali esterni indicano che questa
proteina non è più necessaria, la chinasi viene bloccata (quindi la proteina non viene più fosforilata)
e vengono attivate le fosforilasi (che rimuovono i gruppi fosfato già presenti). A questo punto, la
mancanza del gruppo fosfato indica che quella proteina deve essere degradata. Viene legata al
teasoma.

La fosforilazione è quindi un elemento transiente che decide il destino della proteina; può sia
attivare sia bloccare la sua degradazione.

La localizzazione di molte proteine è definita da sequenze amminoacidiche che presentano

amminoterminale. Attraverso queste si capisce se sono proteine di membrana,
citoplasmatiche, dei cloroplasti o mitocondriali.

Invece, il primo amminoacido nella sequenza amminoacidica è importante per la stabilità della
proteina.

Ricordatevi che il primo amminoacido non sempre è la metionina. Sappiamo che la traduzione
inizia con il codone AUG, che codifica per metionina; quindi in una fase iniziale tutte le proteine
cominceranno con questo amminoacido. Successivamente, in alcuni polipeptidi viene rimosso
si, enzima che taglia e rimuove la metionina.

In base alla tipologia del primo amminoacido definitivo varia

a proteina e quindi allungano l a,
altri invece la rendono fortemente instabile e quindi