Lezione 2: PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI

Corsivo= Parte dedicata ad esempi / laboratorio

Perché è importante avere una proteina ricombinante?

 Ottenere grandi quantità di una specifica proteina

• “Costringere” una cellula a sintetizzare una proteina esogena per
osservarne l’effetto
• Alterare la struttura/funzione di una proteina ed osservare l’effetto su
una specifica cellula
Produzione
Nel momento in cui noi vogliamo andare ad esprimere e studiare una certa proteina, abbiamo la necessità
di “inserirla” in un ospite (tramite un gene che codifica per quella proteina) che sia molto facile da
manipolare in laboratorio.

Abbiamo inoltre bisogno che l’ospite esprima un’elevata quantità della proteina di interesse e che aggiunga
delle caratteristiche necessarie per poterla isolare da tutto il resto.

(La proteina che stiamo studiando, Nana, è spesso presente nel genoma di Coli, ma a livelli basali – prodotta
in basse quantità – quantità irrisoria rispetto a quella di cui noi abbiamo bisogno per studiarla. Dunque si
stimola il batterio a produrne un’elevata quantità e la si marca con una sorta di “bandierina/TAG” – in
modo tale che noi possiamo isolare solo Nana dall’intero pool proteico – Questa fase è chiamata fase di
purificazione. Fino ad ora, noi abbiamo selezionato un clone che conteneva già il gene che codificava per
questa proteina – abbiamo allestito delle crescite , facendo funzionare le nostre cellule batteriche come
fabbriche per produrre un’elevata quantità di proteina e le abbiamo conservate. La prossima esperienza
lisiamo le cellule – ovvero le rompiamo – in modo tale da recuperare tutto il pool proteico di Coli. Faremo un
dosaggio per vedere quanto ne abbiamo recuperata e la volta successiva la purificheremo).

 SCELTA DELLA CELLULA OSPITE:

Così come nelle fasi di clonaggio era importante per noi scegliere il gene che codifica la proteina ed un
vettore che abbia dei siti di restrizione che non andavano a tagliare nel nostro gene dando un gene tronco,
nella fase di espressione è importante scegliere LA CELLULA OSPITE, all’interno della quale andiamo ad
inserire il nostro gene. (poiché non tutte le proteine possono essere espresse in Coli)
Esistono una serie di organismi ospiti che possono essere utilizzati e sono:

 Procariotici : Facili da manipolare e crescono rapidamente. In alcuni casi però fungono nella fase di
clonaggio ma non in quella di espressione – c’è la necessità quindi di passare ad organismi
superiori.

I vantaggi di selezionare come organismo ospite una CELLULA BATTERICA sono:

i. Quello di una crescita rapida, poiché crescono facilmente in laboratorio.

ii. Hanno dei tempi di duplicazione molto brevi che ci permettono di avere elevate quantità di cellule
batteriche, e quindi elevate quantità di proteina di interesse (Coli ad esempio si replica ogni
20min).
iii. I terreni necessari per far crescere le cellule batteriche costano poco rispetto ai terreni necessari
per far crescere cellule eucariotiche. (Le cellule eucariotiche spesso necessitano di sangue, di
determinati additivi che hanno un costo elevato).
iv. Proteina ricombinante secreta nel mezzo di coltura.

(Svantaggi:)

i. Se vogliamo esprimere delle proteine che non presentano modifiche post-traduzionali (ad
esempio la glicosilazione) gli organismi procariotici vanno bene. (tutti i batteri non
effettuano modifiche post-traduzionali)

Se invece vogliamo esprimere proteine che presentano queste modifiche, per lo step di clonaggio le cellule
batteriche vanno bene, ma per lo step successivo è necessario cambiare l’ospite e quindi passare ad
organismi superiori.

ii. [In alcuni casi si cerca di ovviare a questo problema, producendo lo stesso la proteina nella
cellula batterica e poi dopo si fanno delle glicosilazioni accessorie in vitro - facendole noi il
laboratorio. Spesso ciò non riesce poiché è necessaria quella glicosilazione durante la
produzione della proteina , perché rende la proteina foldata nella maniera corretta – dando
la giusta conformazione – proteina attiva.
Supponiamo che non sappiamo che la proteina sia glicosilata, non conosciamo nulla sulla proteina… è una
proteina X e provo ad esprimerla in Coli. Vedo che la mia proteina non si produce nella frazione solubile.
(dopo la lisi si centrifuga – il surnatante contiene tutte le proteine che si sono foldate correttamente e
dunque si trovano in soluzione – mentre il pellet oltre ad avere residui di membrana , detriti cellulari,
porzioni di cellule che non si sono rotte bene , presenta anche i corpi di inclusione – I corpi di inclusione
raccolgono tutto ciò che nella mia cellula non è “andato a buon fine” , ovvero scarti e proteine che non si
sono foldate completamente)

Quando una proteina non assume la sua conformazione corretta, non riesce a stare in soluzione e precipita
nei CORPI DI INCLUSIONE

Spesso, dunque, si va a lavorare sulle proteine precipitate, in modo tale da aggiungere ciò che è necessario
per farla stare in soluzione – ad esempio si può operare sullo strato fosfolipidico ecc.]

iii. Molto spesso capita che le proteine vengono prodotte in alte quantità che risultano essere
tossiche per la cellula batterica e quindi il batterio muore. Per questo motivo è necessario
effettuare uno scale-up, ovvero un organismo che riesca a supportare la produzione della
proteina di interesse.

 Eucariotici:

Dunque per eliminare tutti i problemi connessi con l’espressione in precarioti, passo ad un organismo più
complesso. Gli eucarioti restano gli ospiti preferiti per esprimere una proteina più complessa.
L’organismo procariotico che viene preferito nella fase di clonaggio e di espressione è Coli. E’ l’organismo
modello e conosciamo bene il metabolismo e riusciamo ad evitare che una proteina vada nei corpi di
inclusione ecc.
  SCELTA DEL VETTORE DI ESPRESSIONE:

Durante la fase di clonaggio ho scelto il mio gene, ho scelto il mio vettore (andando a vedere la resistenza
del vettore, quali erano gli enzimi di restrizione che tagliavano e se i siti di taglio erano contenuti all’interno
del mio gene). Ho studiato la fase di ligasi, ho unito inserto e vettore e infine ho trasformato le mie cellule.

Le caratteristiche di un vettore di clonaggio sono:

i. Avere un’origine di replicazione autonoma

ii. Un marcatore
iii. Una resistenza ad un antibiotico
iv. Conoscere gli enzimi del polylinker (Qui ho bisogno solo che si esprima un determinato
gene – una specifica sequenza nucleotidica – che ho elevate copie della sequenza
nucleotidica)
v. Conoscere i siti di restrizione

Anche in un vettore di ESPRESSIONE, devo avere:

i. Sempre un’origine di replicazione autonoma

ii. Un marcatore
iii. Sempre una resistenza ad un antibiotico (è fondamentale per selezionare la mia cellula
ricombinante rispetto a tutte le altre)
iv. Polylinker – ma sono ad uno step in avanti rispetto alla duplicazione: Qui ho bisogno che venga
prodotto un gene che mi dia dopo un RNA messaggero ( il quale deve contenere informazioni
necessarie per la sintesi proteica) la proteina di interesse.

(Angela dice che alcune cose verranno comprese meglio con il corso della Duilio)
I vettori di espressione che vengono utilizzati presentano una regione sul trascritto che prende il nome di
PROMOTORE. Il promotore è una regione tra -10 e -35 coppie di basi sul nostro trascritto che viene
riconosciuta dalla RNA Polimerasi e ci porta la trascrizione del RNA messaggero.

Si distinguono dei promotori forti ,dei promotori deboli, dei promotori inducibili e dei promotori costitutivi.

I promotori costitutivi sono quelli che sono presenti normalmente nelle cellule (non li inseriamo noi)

I promotori inducibili sono quelli che inseriamo noi con il nostro vettore.

In laboratorio abbiamo utilizzato l’IPTG - induttore molecolare (accende l’espressione della nostra proteina
di interesse). Se non avessimo utilizzato un vettore che mi consentiva di inserire un promotore inducibile ,
avremmo espresso la proteina sin dall’inizio nella cellula. Ci saremmo dovuti dunque accontentare di ciò che
Coli riusciva a produrre.

L’aggiunta invece di un promotore forte ed inducibile permette all’operatore di controllare ciò che avviene
all’interno della cellula e dire alla cellula in quale momento esprimere la proteina di interesse. (per averne
dunque elevate quantità)

Questo ci permette di evitare il problema della tossicità delle proteine prodotte sin da subito nelle cellule.
Conoscendo la curva di crescita e il metabolismo del nostro batterio, siamo in grado di prevedere quando la
colonia è in condizioni ottimali per esprimere la proteina di interesse. (L’induttore si aggiunge nella fase
esponenziale)
Passare ad un vettore di espressione è importante perché ci serve sia ad inserire le sequenze necessarie per
il riconoscimento del RNA polimerasi e quindi avere l’RNA messaggero, sia per avere le sequenze necessarie
per il riconoscimento da parte dei ribosomi (dove si producono le proteine) del RNA messaggero, sia per
regolare l’espressione della nostra proteina.

Nella fase di clonaggio noi non andiamo a regolare il numero di copie di gene che Coli produce.

Mentre la fase di espressione richiede molta energia da parte della cellula batterica, quindi è importante
che venga modulata (meccanismo regolato)

Noi induciamo in laboratorio a 0.5 OD (per E.Coli) e non più tardi. Più avanti di 0.5 OD le cellule sono già
cresciute , sono già troppo avanti metabolicamente e se andiamo ad indurre , le cellule possiamo trovarle in
fase di morte. Al contrario se induciamo troppo presto, prima di 0.5 OD , Coli si sovraccarica troppo. Non
riesce a produrre le sue proteine , over-esprime la nostra proteina e muore.
Il promotore utilizzato da noi in laboratorio è della seria LAC, il quale presenta un promotore regolato dal
LATTOSIO.

Ci sono una serie di vettori che presentano specifici promotori perché in alcuni casi alcuni sono tossici per
determinate cellule.

*(Minuto 38.50 – 42.20 - lezione 13.10.21 - Spiegazione poco chiara che riguarda il programma di strutture
e funzioni)
Il promotore tac è un promotore sintetico che è stato prodotto il laboratori e presenta la fusione di più
promotori insieme.
Questo sistema di espressione è lo stesso utilizzato in laboratorio. Noi abbiamo una RNA polimerasi inattiva
perché sul promotore è posizionato un inibitore che impedisce alla polimerasi di poter codificare l’RNA
messaggero. Arriva l’IPTG, il repressore si stacca , la polimerasi si lega e ci trascrive il gene di interesse.

Vettori della serie pET presentano questa tipo di regolazione del promotore. I vettori della serie pET non ci
danno inizialmente un’inibizione totale. (inibizione non completa – proteina ricombinante che si esprime
comunque in poche quantità all’inizio)
Il vettore di espressione, inoltre, aggiunge alla proteina un tag. L’uso dei tag ci permette di isolare e
purificare la proteina di interesse. Nel caso di Nana, come tag, abbiamo una codina di 6 istidine.

Ogni vettore quindi aggiunge tag diverse a seconda della sua natura.

Quando io produco la mia proteina , non voglio cambiare ospite/vettore. Vogliamo bypassare il problema
della proteina che non si produce in maniera ottimale. Se noi andassimo all’interno del citoplasma, magari
ci sono delle condizioni redox che fanno sì che la mia proteina non assuma una giusta conformazione.
La cellula di Coli presenta sia un periplasma che un citoplasma. Questi due hanno quasi la stessa
composizione, ma hanno diversi potenziali Redox. Di norma la mia proteina viene prodotta e tradotta nel
citoplasma. Supponiamo che non si folda correttamente e va nei corpi di inclusione.

Guardando e tenendo conto del potenziale del periplasma e se è affine all’INTORNO IN CUI LA MIA
PROTEINA VIENE PRODOTTA, ritorno al vettore e inserisco una piccola sequenza chiamata peptide segnale
che fa sì che l’RNA messaggero venga prodotto nel citoplasma… la sintesi proteica inizia nel citoplasma…ma
si conclude nel periplasma! (Nel periplasma ,magari, trovo un intorno più comodo per poter favorire il
FOLDING della nostra proteina) (Evitiamo i corpi di inclusione)

Ciò è ottimo perché quando effettuo la lisi, rompo solo la membrana esterna , perché so che la mai proteina
si trova lì. (senza rompere l’interno della cellula) - (Evitiamo così anche lo scale-up)

La prima cosa che facciamo prima di tentare di cambiare il vettore, prima di tentare di far andare la
proteina nel periplasma, è quella di “dire” a Coli di duplicarsi più lentamente abbassando la temperatura.
(espressioni a temperature più basse di 37°C – per Coli - cercando di produrre proteine più solubili –
foldate)
Facciamo uno screening di temperatura e di concentrazione di induttore da aggiungere (primo step che si fa
in laboratorio)

Se l’abbassamento della temperatura non dovesse bastare, allora introduciamo all’interno del batterio dei
“macchinari” che aiutano il folding delle proteine. Ovvero introduciamo degli chaperon (DnaK , GroEl,
GroES) – ACCOMPAGNATORI che accolgono la proteina non foldata e cercano di darle la giusta
conformazione – rilasciando la proteina quando è foldata.