Lezione 3: Frazionamento cellulare e purificazione delle proteine.

Per studiare una proteina ne abbiamo bisogno di una quantità considerevole, che spesso non corrisponde
ai livelli fisiologici con la quale la proteina X è espressa nell’organismo.

Per esprimere dunque la proteina usufruiamo di piccole industrie di biomolecole che sono le cellule.
Mettiamo dei meccanismi di espressione controllata per una sola espressione (per una specifica proteina)
rispetto ad altre proteine espresse da un organismo e realizziamo il costrutto per farla esprimere.

Dopodiché passiamo alle fasi successive che prevedono in primo luogo l’estrazione della proteina,
l’isolamento della proteina e lo studio e la caratterizzazione.

Dobbiamo conoscere un protocollo di purificazione.

 1) Scelta della fonte: Noi abbiamo scelto come organismo di espressione (il quale ospita il vettore che
codifica per la proteina di interesse) E. Coli. (Un organismo con struttura genetica molto semplice,
facile da modificare)

Ovviamente scegliere un organismo semplice non è un approccio universale.

L’organismo ospite che viene scelto per la produzione di una determinata proteina deve soddisfare alcune
caratteristiche.

Come organismo ospite possono essere usati i batteri, alcuni lieviti e alcune piante.

Perché scegliere un organismo piuttosto che un altro? Un motivo è badare alle modifiche post-traduzionali
(Molte proteine in seguito alla loro espressione, per raggiungere la loro conformazione e il loro
funzionamento vengono sottoposte a modifiche chimiche all’interno della cellula, mediante il legame
covalente di strutture oligosaccaridiche).

Quindi la scelta dell’organismo dipende dal tipo di studio che vogliamo condurre.

2) Distruzione di cellule: Dopodiché si passa ai protocolli di distruzione delle cellule e solubilizzazione

delle proteine in opportuno tampone.

2a) Tutto ciò che effettuiamo deve essere effettuato in un mezzo, ovvero il tampone che non deve limitarsi
a fissare determinati valori di pH. Nell’ambito biochimico il tampone deve contenere altre componenti:

i)Un antiossidante. (Una delle variabili che tiene insieme le strutture proteiche sono proprio i ponti
disolfuro e bisogna preservarli se vogliamo preservare il corretto funzionamento della proteina)

Per cui la presenza di opportuni antiossidanti aiuta a mantenere intatta la struttura tridimensionale della
proteina.
In generale bisogna avere un controllo dello stato redox del mezzo in cui stiamo operando: sia per
preservare i ponti disolfuro, sia per poterli rompere. (Modulazione)

ii) Inibitori delle proteasi: La maggior parte degli organismi possiedono delle proteasi (le proteasi servono
ad idrolizzare le proteine – proteasi specifiche e non). Per evitare che il nostro trascritto venga idrolizzato
appunto dalle proteasi presenti all’interno della cellula si fa uso di inibitori. Questi inibitori spesso sono
miscele di agenti chelanti (che sono in grado di legare il metallo che costituisce la proteasi ed inibirla) ecc.

iii) Substrati enzimatici e cofattori.

2b) Scelta del metodo di rottura: Nel momento in cui andiamo a distruggere una cellula, ovviamente
facciamo un qualcosa di traumatico. La cellula corre ai ripari, scatenando delle reazioni. I processi di rottura
delle cellule dunque devono essere meno traumatici possibili, oppure più veloci possibili, in maniera tale da
minimizzare gli effetti di risposta cellulare. Ad esempio se un organismo viene sottoposto a riscaldamento,
inizia a produrre proteine che proteggono la cellula da sbalzi termici. (quindi non troverò più la proteina
desiderata tipo Nana, ma altro)

I metodi di rottura sono essenzialmente di 2 tipi:

 Meccanici:

i) Omogeneizzazione: Si utilizzano tipo frullatori ad immersione (non adatto per batteri o lieviti)

ii) Frantumazione con abrasivi: Metodo molto soft che prevede l’uso di provette che possiedono all’interno
sfere abrasive di vetro. La coltura viene messa in queste provette e si procede con degli stantuffi in maniera
meccanica.

iii) Presse: Sistemi che ci permettono di convogliare il liquido contenente le colture cellulari in opportuni
tubicini , dove, in seguito all’utilizzo di elevate pressioni otteniamo la distruzione delle cellule.

iv) Sonicazione: Sfrutta onde sonore ad alta frequenza , con una sonda del sonicatore. Le cellule vengono
distrutte dalle onde sonore (urto). (ciò che utilizziamo in laboratorio)
  Metodi non meccanici:

i) Lisi della parete cellulare: Si utilizza un enzima che ha l’effetto di idrolizzare il peptidoglicano della
parete e la parete si rompe. Grazie alla lisi possiamo preservare una struttura cellulare complessa.

ii) Shock osmotico: Le pareti sono semipermeabili – se utilizziamo soluzioni con determinate concentrazioni
saline all’esterno, andiamo a variare la forza ionica del mezzo nel quale sospendiamo le cellule. Così
facendo possiamo causare lo shock osmotico.

iii) Congelamento e scongelamento.

iv) Utilizzo di detergenti per dissolvere la membrana cellulare.

3) Dosaggio della proteina:

Dopo aver scelto il tampone adatto e dopo aver rotto la cellula, a questo punto io avrò una soluzione
acquosa che contiene il materiale proteico estratto dalla cellula.

La misura della concentrazione proteica delle proteine può avvenire in vario modo:

 Misura diretta.
 Misura indiretta.

Normalmente in laboratorio, avendo a che fare con miscele eterogenee e complesse, utilizziamo dei saggi
colorimetrici opportuni che prevedono l’utilizzo di coloranti che reagiscono specificamente con una
proteina dando delle degradazioni di colore che sono direttamente proporzionali alla concentrazione della
proteina. Per cui in seguito alla costruzione di una retta standard fatta con una soluzione a concentrazione
nota, si fanno delle soluzioni dei nostri campioni e andandone a leggere l’assorbanza possiamo estrapolare
la concentrazione.
Il colore blu indicherà un’alta concentrazione, mentre il colore azzurro una bassa concentrazione.

(tutto ciò verrà approfondito in futuro)

Dunque, rotte le cellule, facciamo una STIMA della concentrazione e si può procedere allo step successivo:
il frazionamento.

4) Metodi di frazionamento: Sono quella serie di procedure che vengono applicate alla nostra
soluzione, che ci permettono di avere il prodotto finale che ci interessa (cioè la nostra proteina di
interesse) con un certo grado di purezza. (il quale non sarà mai del 100%)

I metodi di frazionamento sono classificati in base alle proprietà chimico-fisiche di un polimero complesso
quali sono le proteine. Il contributo di tutti gli amminoacidi ad una catena lunga può creare un oggetto che
dal punto di vista delle proprietà chimico-fisiche è estremamente complesso. Per cui conoscere le proprietà
chimico-fisiche della proteina di interesse ci permette di purificarla ed isolarla dal resto del materiale che
non ci serve.

Selezionando opportunamente alcune di queste proprietà chimico-fisiche da utilizzare per il frazionamento

della molecola, è possibile sviluppare un protocollo che mi permette la purificazione della proteina di
interesse.
4a) METODI CHE SI BASANO SULLA SOLUBILITA’ :

Sulla superficie delle proteine ci sono gruppi ionizzabili, gruppi acidi e basici, gruppi polari ed idrofobici che
tendono a interagire tra di loro (interazione di carica). Nel momento in cui altero le cariche , posso alterare
la solubilità di una proteina piuttosto che di un’altra. Vedremo che proteine diverse, hanno in determinate
condizioni valori di solubilità completamente diversi.
Quando la forza ionica sale, agli inizi, la solubilità sale con essa per cui abbiamo questi due fenomeni che
sono il salting-in e il salting-out.

Salting in: Il nostro tampone deve contenere il sale. La quantità non deve essere alta. Se lo fosse
andremmo incontro al salting-out.

Salting out: L’attività del solvente risulta ridotta, le interazioni proteina-proteina diventano più forti delle
interazioni proteina-solvente e quindi la proteina aggrega e precipita.

Dunque la presenza del sale vi è utile per mantenere la solubilità della proteina, ma può essere utilizzata
per la precipitazione.
Quando si vuole separare una proteina del materiale proteico rispetto al resto dell’estratto cellulare si
utilizzano dei protocolli di precipitazione in solventi organici. L’effetto del solvente organico è quella di far
variare la costante dielettrica del mezzo. Variando la costante dielettrica posso far variare la solubilità.

La solubilità varia dunque utilizzando solventi organici che siano MISCIBILI con l’acqua. Noi non vogliamo
creare un sistema eterogeneo ma un unico sistema nel quale la costante dielettrica vari e le proteine
precipitano. (per questo come solventi organici si utilizzano etanolo, metanolo, acetone ecc.)
Precipitazione isoelettrica: Al variare della concentrazione del sale abbiamo diverse curve di precipitazione.

La precipitazione è data dal minimo della curva. Questo vuole dire che c’è una forte correlazione tra la forza
ionica e il pH.

4. EFFETTO DELLA TEMPERATURA

Prevede un aumento di temperatura, in seguito al quale si ha la perdita della struttura tridimensionale della
proteina. Le proteine denaturate aggregano e precipitano.

Per cui la temperatura e il pH sono quelle variabili che possono essere utilizzate per poter purificare
adeguatamente una proteina.

I protocolli non sono tutti uguali ed universali, ma dipendono strettamente dal tipo di
organismo che stiamo trattando e dal tipo di proteina che vogliamo purificare.