COSTRUZIONE DEL PLASMIDE pARA-R

RELAZIONE DI LABORATORIO SVOLTA DAL 27/05 AL 03/06

GRUPPO 1: Natalini, Marconi, Capeci

INTRODUZIONE
Con questo esperimento dobbiamo ottenere un plasmide ricombinante che abbia
determinate caratteristiche partendo da due plasmidi iniziali.
Sfruttando il processo di digestione degli enzimi di restrizione otterremo le sequenze
desiderate, in seguito le uniremo con un processo di ligazione e infine controlleremo
i risultati dell’esperimento tramite l’elettroforesi.

DIGESTIONE DEI plasmidi pKAN-R E pARA

SCOPO DELL'ESPERIMENTO: produrre i frammenti di DNA,partendo da plasmidi
pKAN-R e pARA , che saranno uniti per creare il plasmide ricombinante, pARA-R.
Per farlo useremo enzimi di restrizione (BamHI e HindIII) per tagliare due plasmidi
che genereranno i frammenti di DNA. Questo processo è detto digestione e la
lunghezza dei frammenti sarà poi determinata dall'elettroforesi.

MATERIALI E SOSTANZE UTILIZZATE

● Provette contenenti:
tampone di restrizione (2.5xB)
plasmide pKAN-R (K)
plasmide pARA (A)
enzimi di restrizione BamHI e HindIII
acqua distillata
● Micropipetta P-20
● Puntali per micropipetta
● Recipiente per puntali usati
● 4 eppendorf da 1.5 ml
● Pennarello
● Microcentrifuga
● Bagnetto ad acqua
PROCEDIMENTO
1. Etichettare ogni eppendorf in base al loro contenuto con l’utilizzo di un
pennarello: K+, K-, A+ e A-
2. Aggiungere i seguenti reagenti alle eppendorf tramite la micropipetta P-20.
(utilizzare un puntale nuovo per ogni reagente aggiunto, in modo da evitare
contaminazioni).

componenti provetta provetta provetta provetta

K+ K– A+ A–
Punto 4a: tampone di restrizione 8,0 μL 8,0 μL 8,0 μL 8,0 μL
(2.5xB)
Punto 4b: plasmide pKAN-R (K) 8,0 μL 8,0 μL
Punto 4c: plasmide pARA (A) 8,0 μL 8,0 μL
Punto 4d: BamHI e HindIII (RE) 4,0 μL 4,0 μL
Punto 4e: acqua distillata (dH2O) 4,0 μL 4,0 μL

1. Prelevare 8.0 µl di tampone di restrizione (2.5xB) e aggiungerli in eppendorf

K+, K-, A+ e A-
2. Prelevare 8.0 µl di plasmide pKAN-R (K) e aggiungerli in eppendorf K+ e K-
3. Prelevare 8.0 µl di plasmide pARA (A) e aggiungerli in eppendorf A+ e A-
4. Prelevare 4.0 µl di enzimi di restrizione BamHI e HindIII (RE) e aggiungerli in
eppendorf K+ e A+
5. Prelevare 4.0 µl di acqua distillata e aggiungerli in K- e A-
6. Posizionare le quattro eppendorf preparate nella centrifuga in modo tale che
tutti i pesi siano equilibrati fra loro ed avviarla; tenerla in funzione per pochi
secondi così da raccogliere i reagenti sul fondo di ogni provetta
7. Immergere le eppendorf appena centrifugate nel bagno termostatico a 37°C
per almeno un'ora
8. Dopo l'incubazione, posizionare le eppendorf in freezer a -20°C
COSTRUZIONE DEL PLASMIDE pARA-R

SCOPO DELL’ESPERIMENTO: unire, tramite un processo di ligazione, i frammenti

di DNA prodotti nell’esperimento precedente. Il processo darà come risultato diversi
plasmidi, ma quello che ci interessa conterrà il gene per la resistenza all'ampicillina
(ampR), il gene che darà la proteina di colore rosso fluorescente (rfp), il promotore
inducibile (pBAD), la sequenza attivante dell'arabinosio (araC) e la sequenza ori per
l'inizio della replicazione del DNA.
Il plasmide di DNA ricombinante che dobbiamo produrre è il pARA-R.

MATERIALI E SOSTANZE UTILIZZATE

● Provette contenenti: digestione del pKAN-R (K+)
digestione del pARA (A+)
tampone di ligasi 5x (5xB)
DNA ligasi (LIG)
acqua distillata (dH2O)
● Bagnetto ad acqua
● Micropipetta P-20
● Puntali per micropipetta
● Recipiente per puntali usati
● Microcentrifuga

PROCEDIMENTO
1. Porre le provette A+ e K+ nel bagnetto ad acqua a 70°C per 30 minuti
2. Estrarre i tubi dal bagnetto ad acqua ed eseguire una breve centrifugazione
 3. All'interno della soluzione della provetta LIG, contenente 4,0 μL di DNA
ligasi, aggiungere le seguenti componenti tramite l’utilizzo della
micropipetta:
● 8.0 µl di A+
● 8.0 µl di K+
● 6.0 µl di 5xB
● 4.0 µl di acqua distillata
(utilizzare un puntale nuovo per ogni reagente aggiunto, in modo da evitare
contaminazioni)
4. Dopo aver aggiunto l’acqua distillata, aspirare e pipettare delicatamente la
soluzione dentro e fuori il puntale per mescolare i reagenti
5. Centrifugare la provetta LIG per qualche secondo
6. Incubare l'eppendorf LIG a temperatura ambiente (25°C) per almeno un’ora,
mentre le due eppenodorf A+ e K+ saranno incubate a -20°C

VERIFICA DELLE REAZIONI DI RESTRIZIONE E LIGAZIONE

MEDIANTE ELETTROFORESI SU GEL
SCOPO DELL’ESPERIMENTO: utilizzare l'elettroforesi su gel per esaminare i
risultati delle reazioni di restrizione e di ligazione eseguiti negli esperimenti
precedenti. Le dimensioni dei frammenti di DNA possono essere determinate
paragonandole al DNA ladder , una serie di frammenti a dimensione nota.

MATERIALI E SOSTANZE UTILIZZATE

● Provette contenenti: pKAN-R non digerito (K-)
pKAN-R digerito (K+)
pARA non digerito (A-)
pARA digerito (A+)
plasmide ligato (LIG)
colorante di caricamento (LD)
acqua distillata
DNA ladder (M)
● 5 eppendorf da 1.5 mL
● Pennarello indelebile
● Micropipetta p-20 con puntali
● Contenitore per puntali usati
● Microcentrifuga
● Vaschetta per Elettroforesi con gel di agarosio
 ● Marcatore di Peso Molecolare

PROCEDIMENTO

1. Etichettare ogni eppendorf pulita in base al suo contenuto tramite l’utilizzo di

un pennarello: geK-, geK+, geA-, geA+ e geLIG
2. Aggiungere i seguenti reagenti alle eppendorf tramite la micropipetta P-20.
(utilizzare un puntale nuovo per ogni reagente aggiunto, in modo da evitare
contaminazioni)

provetta provetta provetta provetta geLIG

geK– geK+ geA– geA+
Punti 4 e 5: H2O distillata (dH2O) 8,0 μL 8,0 μL 8,0 μL 8,0 μL 6,0 μL

Punto 6: Colorante di caricamento 4,0 μL 4,0 μL 4,0 μL 4,0 μL 4,0 μL

(LD)
Punto 7: pKAN-R (K–) non digerito 8,0 μL

Punto 7: pKAN-R (K+) digerito 8,0 μL

Punto 7: pARA (A–) non digerito 8,0 μL

Punto 7: pARA (A+) digerito 8,0 μL

Punto 8: Plasmide ligato (LIG) 10,0 μL

Inserire:
● 8.0 µl di acqua distillata alle eppendorf geK-, geK+, geA- e geA+
● 6.0 µl di acqua distillata all'eppendorf geLIG
● 4.0 µl di colorante (LD) alle eppendorf geK-, geK+, geA-, geA+ e geLIG
● 8.0 µl di K- all'eppendorf geK-, di K+ all'eppendorf geK+, di A- all'eppendorf
geA-, e di A+ all'eppendorf geA+
● 10.0 µl di LIG alla provetta geLIG

3. Caricare la microcentrifuga e centrifugare brevemente le 5 provette, così da

raccogliere i reagenti in fondo
4. Caricare nei pozzetti del gel preparato precedentemente 20 µl di ogni reagente nel
seguente modo: DNA ladder (M), geK-, geK+, geA-, geA+ e geLIG.
ATTENZIONE: Non forare il gel o diventerà inutilizzabile. Premere
delicatamente lo stantuffo per rilasciare lentamente il campione. Per evitare di
far entrare l'aria nel buffer, non andare oltre il primo punto di arresto. Il
campione si depositerà nel pozzetto.
5. Quando tutti i campioni sono stati caricati, chiudere saldamente il coperchio sulla
vaschetta e collegare i cavi elettrici all'alimentatore.
6. Accendere l'alimentatore
7. Dopo due o tre minuti, controllate se il colorante viola si sta muovendo verso
l’elettrodo positivo.
Nel frattempo calcolare la lunghezza del frammento da ottenere, per confrontarlo
successivamente con il risultato ottenuto con l’elettroforesi e per riuscire a capire in
che provetta è contenuto il plasmide pARA-R.
Sappiamo che per costruire il plasmide ci occorrono: la proteina rfp, il promotore
pBAD, la sequenza ori, il gene ampR e il gene araC.
Al vettore di espressione pARA sottraiamo la sequenza compresa tra HindIII e
BamHI che misura 377 bp, qui metteremo la sequenza pBAD-rfp (comprendente le
sequenze rfp e pBAD) che misura 807 bp, quindi il plasmide finale pARA-R deve
avere lunghezza di 5302 bp.

CONCLUSIONE: Al nostro gruppo l'elettroforesi finale non ha dato i risultati sperati,

ma confrontando le nostre previsioni con l’elettroforesi corretta abbiamo capito che il
plasmide pARA-R si trova nella provetta geK+

Immagine dell’elettroforesi su cui abbiamo basato i nostri risultati