Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche

VIRUS di EPSTEIN BAR

Prof. Oliviero E. Varnier

www.microbiologia.unige.it

2014

Microbiologia – DISC
EBV

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 CENNI STORICI

! Nel 1961 un chirurgo che lavorava in

Uganda, Denis Burkitt, presentò i risultati
delle sue ricerche allo staff della Middlesex
Hospital Medical School in Inghilterra.

! Riferì che l’incidenza di un particolare tipo di

tumore in bambini africani presentava una
distribuzione geografica in rapporto alle
piogge e alla temperatura.

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 CENNI STORICI
! Tale malattia, che colpisce circa 8 bambini su 100,000 in
alcune zone dell’Africa e della Nuova Guinea, presto fu
conosciuta come linfoma di Burkitt.

! L’influenza del clima sull’incidenza del tumore suggeriva che un

fattore biologico ancora sconosciuto doveva essere coinvolto.

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 CENNI STORICI
! Tre ricercatori, M.A. Epstein, Y.M. Barr and B.G. Achong, tentarono di
individuare i possibili virus oncogeni in campioni di tessuto neoplastico inviati
dall’Uganda in Inghilterra.
! Nel 1964 riuscirono ad individuare l’agente eziologico utilizzando il
microscopio elettronico: si trattava di un nuovo virus appartenente alla
famiglia ‘herpesviridae’.

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 CRONOLOGIA

! 1958 prima descrizione del linfoma di Burkitt nella zona

malarica dell’Africa.

! 1964 Epstein e Barr ottengono linee cellulari di linfoma di

Burkitt; prima descrizione di un herpes virus infettante
tali cellule.

! 1968 EBV viene riconosciuto come agente eziologico

della mononucleosi infettiva.

! 1969 dimostrazione della capacità di EBV di trasformare

linfociti in coltura; EBV può immortalizzare cellule in
coltura e causare tumori in primati non umani.

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 INTRODUZIONE B-91

! Il virus EB (da Epstein e Barr, che per primi l’hanno

isolato) è un herpesvirus ubiquitario responsabile
della mononucleosi infettiva e, in tempi recenti,
ritenuto uno dei fattori a rischio dello sviluppo del
linfoma di Burkitt, del carcinoma nasofaringeo e di
altre sindromi linfoproliferaive in soggetti immuno-
compromessi.
! L’EBV è un potente mitogeno per le cellule B, che
immortalizza in vitro.

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 Proprietà del virus B-91

! EBV è un gamma-herpesvirus con una morfologia simile a

quella degli altri herpesvirus umani e un DNA virale di 184 kbp.
! Lo spettro d’ospite e il tropismo di tessuto di EBV sono
determinati dalla limitata distribuzione del recettore cellulare,
che è il recettore per il componente C3d del complemento (CR2
o CD21) e da un corecettore costituito dalle molecole di classe
II del sistema HLA.
! Tali recettori sono espressi sulle cellule B dell’uomo e dei
primati e sulle cellule epiteliali dell’orofaringe e del nasofaringe.
! Dopo 4-6 settimane di incubazione elevati titoli virali sono
osservabili nei lavaggi orofaringei e nella saliva.
! La produzione di elevate quantità di virus è la conseguenza di
attiva replicazione di EBV nei linfociti B (considerati il bersaglio
elettivo), che infiltrano la mucosa orofaringea.
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 Proprietà del virus B-91

! L’infezione da EBV presenta due decorsi:

! un’infezione di tipo latente e
! una infezione di tipo replicativo.
! EBV, una volta entrato in un linfocita B quiescente, va incontro a
latenza prima di iniziare un ciclo litico, mantenendosi in forma
episomale circolare con proprietà simili al DNA cromosomale.
! I linfociti B infettati vanno quindi incontro a immortalizzazione,
proliferando continuamente ed esprimono un limitato numero di geni
virali, tra cui:
! 6 proteine nucleari della famiglia EBNA (EBV Nuclear Antigens)
! 3 proteine di membrana LMP (Latent Membrane Protein).
! A seconda del tipo di cellula infettata (linfociti B normali, cellule del
linfoma di Burkitt, cellule del carcinoma nasofaringeo) la fase di
latenza di EBV presenta caratteristiche differenti in relazione al tipo
di proteine che vengono espresse.

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 Proprietà del virus B-91

L’attivazione del programma litico in vivo inizia quando,

tramite mecanismi non ancora chiariti, vengono espressi:

! due geni precocissimi E (immediate early) designati

BZLF1 e BRLF1, che codificano per proteine nucleari ad
attività trascrizionale che regolano l’espressione di geni
virali recoci (E, early) e di geni cellulari utili alla sintesi del
DNA virale.

! L’attivazione dei geni precoci è seguita da un’attiva sintesi

del DNA virale, all’espressione dei geni codificanti per le
proteine tardive (L, late) e dall’assemblaggio dei virioni.

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 Meccanismi patogenetici B-92
! L’infezione da EBV è molto diffusa ed è trasmessa attraverso la
saliva e le secrezioni faringee, direttamente o tramite lo scambio di
utensili: bicchieri, posate, spazzolini ecc.

! Nei bambini l’infezione presenta un decorso subclinico inapparente,

mentre nei giovani adulti “malattia del bacio” può presentare un
decorso subclinico a diversi livelli di gravità.

! I linfociti B infettati da EBV vanno incontro ad attiva proliferazione

in assenza di apoptosi, che viene inibita da alcune proteine virali.

! La proliferazione policlonale di linfociti B si accompagna a

un’elevata produzione di immunoglobuline, tra cui IgM

! L’ingrossamento dei linfonodi, della milza e del fegato, tipico della

mononucleosi infettiva, è causato dalla proliferazione massiva sia
delle cellule B infette sia delle cellule T attivate.

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 Meccanismi patogenetici

! La linfocitosi, che si osserva nel sangue periferico a partire

dalla 2° settimana dall’infezione, è dovuta all’attivazione e
alla proliferazione dei linfociti T, che appaiono come linfociti
atipici.
! La risoluzione della malattia si osserva in seguito alla
completa eliminazione delle cellule B infettate produttivamente
da parte dei linfociti T citotossici, che riconoscono i peptidi
virali esposti sui linfociti B.

! Tuttavia, una piccola percentuale di linfociti B memoria

esprimenti gli antigeni EBNA non viene eliminata e
rappresenta la sede di latenza di EBV, che persisterà per tutta
la vita del paziente e darà avvio alla fase di riattivazione in
seguito a stimoli opportuni.

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 EPIDEMIOLOGIA

! Quasi tutta la popolazione (90-95%) è infettata da EBV e

questi soggetti, sebbene spesso asintomatici, liberano il virus
occasionalmente per tutta la loro vita.
! Il virus viene trasmesso per contatto intimo.
! L’infezione è associata con fattori socioeconomici e nei paesi
in via di sviluppo, la sieropositività si osserva più
precocemente che nei paesi industrializzati.
! Fino all’80% degli studenti che iniziano il college negli USA è
sieropositiva e molti dei studenti negativi diventeranno positivi
durante il college.
! Il virus può essere trasmesso anche con le trasfusioni di
sangue.

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Mononucleosi Infettiva

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 MONONUCLEOSI INFETTIVA B-93

! Come già osservato per altre infezioni primarie causate da

herpesvirus, anche nel caso di EBV la maggior parte delle
infezioni primarie presenta un decorso asintomatico.
! Le manifestazione cliniche della mononucleosi infettiva, che
compaiono dopo 30-40 giorni dal contagio, sono rappresen-
tate da:
! malessere generale, astenia, rialzo febbrile, faringite
accompagnata da linfoadenopatia cervicale ed epato-
splenomegalia.
! Raramente fatale nei soggetti sani, l’infezione può essere
accompagnata da complicanze soprattutto di natura neurolo-
gica, che comprendono la sindrome di Guillain-Barré e una
meningoencefalite asettica.
! La malattia dura dalle 2 alle 4 settimane, ma in alcuni
individui possono perdurare per alcuni mesi febbricola e
miastenia. 15 di 29
 TUMORI CAUSATI DAL VIRUS di EPSTEIN-BARR

•  Linfoma di Burkitt - circoscritto all’Africa Centrale

- eziologia multifattoriale
- l’infezione da EBV è necessaria ma
non è sufficiente

•  Carcinoma nasofaringeo - in alcune regioni della Cina

•  Linfomi B - in pazienti immunosoppressi

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 EBV e il Linfoma di Burkitt (BL)

HIV
MALARIA EVENTO
EBV
B-cell B-cell
GENETICO
B-cell B-cell B-cell
B-cell B-cell
Attivazione
B-cell BL
Attivazione policlonale B-cell policlonale B-cell B-cell
e immuno-
soppressione
Traslocazioni
Iniziazione Pool allargato cromosomiche

MALNUTRIZIONE
c-myc da 8 al locus delle catene pesanti in 14
c-myc da 8 al locus delle catene leggere in 2 o 22

RISULTATO: super espressione di c-myc

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 MORFOLOGIA
Il tipico virione erpetico è costituito da
quattro componenti strutturali:

§  NUCLEO (core, Ø 75 nm):

ð  contiene una molecola di DNA
lineare a doppia elica (ds)‫‏‬

§  CAPSIDE PROTEICO (Ø 90-110 nm):

ð  di forma icosaedrica circonda il core
ð  costituito da 162 capsomeri prismatici

§  TEGUMENTO (20-40 nm di spessore):

ð  zona amorfa ed asimmetrica di materiale proteico disposta attorno
al capside
§  PERICAPSIDE:
ð  membrana esterna di natura fosfolipidica di origine cellulare
arricchita di glicoproteine virus-specifiche che sporgono dalla
superficie (spikes)‫‏‬ di 29
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 EBV: ANTIGENI

! Antigeni precoci: sono proteine non strutturali, la cui

sintesi non dipende dalla replicazione del DNA virale.

! Antigeni tardivi: sono i componenti strutturali del

capside virale (antigeni del capside) e dell’involucro virale
(pericapside). Sono prodotti in abbondanza nelle cellule con
infezione virale produttiva.

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 REPLICAZIONE VIRALE 1

Il processo che conduce alla replicazione

inizia con l’interazione delle glicoproteine virali
gp350/220 con uno specifico recettore
cellulare di membrana: CR2/CD21 recettore
della frazione C3d del complemento

Una penetrazione efficiente richiede la presen-

za di altre proteine accessorie: gp25, gp 42/38
e gp85, che mediano l’interazione con le mole-
cole MHCII (co-recettori)‫‏‬

Dopo la fusione il nucleocapside si libera del

pericapside e rimane avvolto dal tegumento.
Viene rilasciato all’interno del citoplasma

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REPLICAZIONE VIRALE

EBV aderisce alle cellule legando il

recettore del componente C3d del
sistema del complemento (CD21). Il
legame è mediato dalla glicoproteina
virale gp350/220, che è coinvolta
nella penetrazione del virus. Mole-
cole gp350/220 multiple cross-
legano CD21 determinando il
patching e in seguito il capping dei
complessi ligando-recettore.
Quindi il virus penetra nella cellula
per fusione dell’involucro con la
membrana plasmatica.
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 DIAGNOSI

nei casi di mononucleosi infettiva la diagnosi viene effettuata in

base alla caratteristica triade di sintomi (il quadro clinico permane
per un periodo di 1-4 settimane dalla comparsa)‫‏‬
1) Febbre 2) Faringite 3) Linfoadenopatia
e dalla presenza di anticorpi eterofili
! Test di Paul-Bunnel positivo
(Mono Test, test di emoagglutinazione di emazie ovine o equine)
•  risultati falsi positivi 3% dei casi
•  risultati falsi negativi 10-15% dei casi

In caso di Mono Test negativo si procede con una diagnosi di

conferma/differenziale (per distinguere l’infezione da EBV da
mononucleosi di altra origine)‫‏‬
! Diagnosi sierologica indiretta
! Diagnosi diretta
! isolamento del virus

! identificazione del DNA virale

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 DIAGNOSI INDIRETTA 1
RICERCA DI ANTICORPI DIRETTI VERSO:
!  VCA (Viral Capsid Antigens) antigeni capsidici
! gp110 e gp350 del pericapside e del nucleocapside
! IgM: compaiono precocemente e scompaiono dopo 4-6 settimane
! IgG: compaiono nella fase acuta con un picco dopo 2-4 settimane e declinano
lentamente persistendo per tutta la vita

!  EA (Early Antigens) antigeni precoci:

! Precocissimi: BZLF1
! Precoci: BALF2, BHRF1, BMRF1 e BSMLF1)‫‏‬
! IgG: prodotte durante le fasi iniziali dell’infezione sia in fase acuta che cronica

!  EBNA (Epstein Barr Nuclear Antigens) antigeni nucleari

! IgG: compaiono diverse settimane o mesi dopo l’infezione e persistono

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Tabella 38.2 Profi lo sierologico delle infezioni da EBV B-95

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 DIAGNOSI INDIRETTA 2

VCA VCA EA EBNA

IgM IgG IgG IgG

Infezione acuta ♦
♦
♦

Infezione cronica ♦
♦

Infezione pregressa ♦
♦

sintomi
Riattivazione ♦
⇑
♦

VCA-IgG

EBNA-IgG

EA-IgG
VCA-IgM
1 2 3 4 5 6 mesi
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 DIAGNOSI DIRETTA

ISOLAMENTO DEL VIRUS

! EBV infetta e immortalizzare linfociti umani in coltura
! Esame indaginoso non utilizzato in diagnostica

IDENTIFICAZIONE DEL DNA VIRALE

! mediante PCR in campioni di saliva, sangue intero, tessuto linfoide

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 VACCINO
! L’allestimento di un vaccino verso EBV risulterebbe di utilità per diversi
gruppi di persone sieronegative:
!  pazienti che devono essere sottoposti a trapianto di midollo o di
organo solido
!  individui che vivono in aree geografiche a rischio di elevata incidenza
di linfoma di Burkitt o di carcinoma nasofaringeo
! Diversi studi sperimentali sono ancora in corso per valutare la sicurezza e
l’efficacia di alcuni vaccini:
! per prevenire l’infezione primaria
! contro la proteina gp220/350, capace di indurre risposta
immunitaria sia umorale che citotossica (dati preliminari hanno
evidenziato la comparsa di Ab neutralizzanti nei soggetti a cui era
stato somministrato il vaccino)‫‏‬
! per generare una risposta immunitaria terapeutica via CTL
! contro il peptide sintetico parte dell’antigene EBNA 3A
! contro la proteina LMP 2 (espressa dal virus ricombinante
Ankara)‫‏‬
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 TERAPIA

! Mononucleosi infettiva
! acicloguanosina a dosi elevate (substrato della deossinucleoside kinasi virale e
inibitore della DNA polimerasi): beneficio marginale
! inibisce la replicazione virale
! riduce l’eliminazione del virus
! non ha nessuna efficacia sui sintomi della malattia (causati dalla RI dell’ospite)‫‏‬
! corticosteroidi: nei pazienti con complicanze gravi
! Linfoma di Burkitt
! chemioterapia (il linfoma si presenta con localizzazione multifocale)‫‏‬
! resezione chirurgica e radioterapia (riduzione della massa tumorale)‫‏‬
! Carcinoma nasofaringeo
! ablazione chirurgica della lesione in associazione ad applicazioni di
radioterapia
!   PTLD
! riduzione della terapia immunosoppressiva
! chemioterapia (antracicline, mifepristone e acido retinico)
! infusione di linfociti T citotossici EBV-specifici autologhi (prevenzione)‫‏‬
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! fine

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