IPERTROFIA, IPERPLASIA, METAPLASIA

IPERTROFIA: aumento del volume di un tessuto per aumentato volume cellulare.

IPERPLASIA: aumento del volume di un tessuto per aumentato numero di cellule.
METAPLASIA: sostituzione di un tipo di cellule con una determinata differenziazione con altro tipo cellulare
(riprogrammazione dell'espressione genica).
DISPLASIA: L'alterazione che ha sempre un significato patologico, è la displasia. Per displasia si intende un'alterazione
sia della morfologia delle singole cellule che compongono un tessuto, sia della sua organizzazione architettonica.
ANAPLASIA: scarso o assente differenziazione cellulare con alterata organizzazione tissutale

I parametri utilizzati per lo studio e la classificazione delle displasie sono:

 pleomorfismo: diversità di forma, eterogeneità delle cellule che compongono il tessuto

 anomalie nucleari: anomalie per esempio di colorazione (nuclei ipocromici o ipercromici che si colorano di
meno o di più del normale con l'ematossilina);
 mitosi atipiche: ad esempio la presenza di mitosi in porzioni del tessuto dove non dovrebbero essere (ad
esempio nell'epidermide le mitosi dovrebbero essere presenti solamente nello strato basale e, mano a mano
che le cellule si differenziano verso lo strato corneo, perdono la capacità di dividersi; quindi ad esempio
l'anomalia può essere il riscontro di mitosi negli strati superficiali). Possono inoltre essere presenti mitosi
morfologicamente alterate: ad esempio mitosi tripolari, dove anziché generarsi due poli del fuso mitotico se
ne formano tre; fenomeni di replicazione del nucleo senza successiva divisione cellulare, le cellule risultano
poi polinucleate o si possono generare cellule tetraploidi.
 polarità: alterazione dell'organizzazione cellulare nei diversi strati tissutali, ad esempio cellule appiattite
poste nello strato sottostante alle cellule cilindriche perdendo quindi la polarità di organizzazione tissutale.
1. T: size or direct extent of the primary tumour
a. Tx: tumour cannot be assessed
b. Tis: carcinoma in situ
c. T0: no evidence of tumour
d. T1, T2, T3, T4: size and/or extension of the primary tumor
2. N: degree of spread to regional lymph nodes
a. Nx: lymph nodes cannot be assessed
b. N0: no regional lymph nodes metastasis
c. N1: regional lymph node metastasis present; at some sites, tumour spread to closest or small number
of regional lymph nodes
d. N2: tumour spread to an extent between N1 and N3 (N2 is not used at all sites)
e. N3: tumour spread to more distant or numerous regional lymph nodes (N3 is not used at all sites)
3. M: presence of distant metastasis
a. M0: no distant metastasis
b. M1: metastasis to distant organs (beyond regional lymph nodes)[2]
4. The Mx designation was removed from the 7th edition of the AJCC/UICC system, but referred to cancers that
could not be evaluated for distant metastasis.
5. Other parameters
a. G (1–4): the grade of the cancer cells (i.e. they are "low grade" if they appear similar to normal cells,
and "high grade" if they appear poorly differentiated)
b. S (0–3): elevation of serum tumor markers
c. R (0–2): the completeness of the operation (resection-boundaries free of cancer cells or not)
d. L (0–1): invasion into lymphatic vessels
e. V (0–2): invasion into vein (no, microscopic, macroscopic)
f. C (1–5): a modifier of the certainty (quality) of the last mentioned parameter (has been removed in
the TNM 8th edition)
6. Prefix modifiers
a. c: stage is determined from evidence acquired before treatment (including clinical examination,
imaging, endoscopy, biopsy, surgical exploration). The c-prefix is implicit in absence of the p-prefix.
b. p: stage given by histopathologic examination of a surgical specimen
 c. y: stage assessed after chemotherapy and/or radiation therapy; in other words, the individual
had neoadjuvant therapy.
d. r: stage for a recurrent tumor in an individual that had some period of time free from the disease.
e. a: stage determined at autopsy.
f. u: stage determined by ultrasonography or endosonography. Clinicians often use this modifier
although it is not an officially defined one
g. For the T, N and M parameters exist subclassifications for some cancer-types (e.g. T1a, Tis, N1i)
UICC Stage and AJCC Progn

PATOGENESI MOLECOLARE
 Gain of Function: colpiscono i proto-oncogèni/oncogèni
o Geni proliferativi
 Loss of Function: oncosoppressori

Glutatione o Tioredossina limitano i danni da specie reattive dell’ossigeno, antiossidanti.

Gli errori replicativi vengono invece corretti a livelli diversi il più importante dei quali è il meccanismo di riparo del
DNA (riparo post replicativo).
Fattori concomitanti nell’insorgenza dei tumori:
1. Vecchiaia
2. Fattori chimici e fisici (ambiente)
3. Ereditarietà (5-10%)
4. Patogeni infettivi

ECCEZIONI AI TUMORI CHE VANNO DI PARI PASSO CON L’ETÀ

 1. TUMORI PEDIATRICI (le leucemie pediatriche, i neuroblastomi dell’età pediatrica);
2. CARCINOMA DEL TESTICOLO che ha un picco di incidenza intorno ai 30-35 anni di età;
3. LINFOMA DI HODGKIN, che ha un andamento bimodale con un picco intorno ai 25 anni e un altro verso ai
40 anni; ciò è dovuto al fatto che molti casi sono legati all’infezione da virus di Epstein-Barr, che è trasmesso
con due picchi (uno in età pediatrica e uno in età adolescenziale) e che ha una latenza di circa 15 anni prima di
dare malattia;
4. OSTEOSARCOMA, tumore maligno delle ossa di origine mesenchimale, che ha un picco di incidenza in
corrispondenza dell’adolescenza, quando le ossa lunghe subiscono il loro più veloce accrescimento.

Studi hanno dimostrato che entro i cent’anni è praticamente sicuro avere un adenocarcinoma prostatico.

AGENTI CHIMICI
1. Asbesto
a. Mesotelioma pleurico
b. Latenza clinica di 30 anni
2. Aflatossine
a. Carcinoma epatocellulare
b. Tossine di Aspergillus Flavus
c. Contaminato derrate alimentari in silos
3. Benzene
a. Linfomi Hodgkin
4. Cromo esavalente
a. Carcinomi polmonari
5. Ossido di etilene
a. Leucemie
b. Sterilizzazione strumenti chirurgici e agente maturante frutta
6. Cloruro di vinile monomero
a. Angiosarcoma epatico
7. Fumo di sigaretta
a. Carcinomi squamosi e carcinomi a piccole cellule/microcitomi polmonari

UV
1. 400 ai 100 nm
2. Causano danni a dimeri di pirimidine
3. Carcinoma basocellulare/basalioma, carcinoma squamo-cellulare, melanoma
a. Il basalioma è maligno ma non tende a dare metastasi
b. Squamosi più aggressivi del basalioma
c. Melanoma più aggressivo di tutti
d. Importante la pigmentazione
i. Rischio inversamente proporzionale alla pigmentazione
4. Mutazioni con perdita di funzione nel gene MC1R (recettore della melanocortina 1)
a. Controlla la risposta fisiologica dei melanociti al MSH
b. Questi soggetti hanno un’alta frequenza di polimorfismo MC1R, mutazioni che diminuiscono la
risposta del recettore al MSH
c. Quindi è prodotta meno melanina ed è meno attivato il pathway di risposta al danneggiamento del
DNA a causa dell’irraggiamento UV
5. UV-A
a. + Lunghezza d’onda (+ penetrazione)
b. – Energia
c. 80% raggiungono il suolo
d. I più pericolosi perché penetrano nell’epidermide e raggiungono gli strati basali e melanociti
6. UV-B e -C
a. – Lunghezza d’onda
b. + Energia
c. C filtrate, B 10% raggiungono il suolo

Radiazioni ionizzanti
Definizione: radiazioni elettromagnetiche (anche particolate) - che hanno un'energia maggiore delle radiazioni UV - e
che pertanto possono causare ionizzazione della materia, cosa che invece non succede con gli ultravioletti.
Radiazioni ionizzanti sono i raggi α, β, γ e i raggi X.
Alcuni esempi rilevanti in oncologia:
1. Fall-out radioattivi
2. L’isotopo più rilevante dal punto di vista medico è il 137Cs che si accumula soprattutto, ma
non esclusivamente, a livello della tiroide e dell'osso.
3. Altro esempio di rilevanza pratica è il 222Rn: isotopo radioattivo gassoso dato dal
decadimento dell'uranio che si trova naturalmente nell'ambiente, tende a
depositarsi nelle zone declivi dell'ambiente, come cantine e taverne, oppure si
trova anche in alcune zone montuose e può risultare un problema per gli
operai che eseguono scavi per creare tunnel. Il radon viene inalato e causa
soprattutto tumori polmonari. Le misurazioni del radon sono effettuate dall'Arpav, quindi si
può richiedere a questo ente una misurazione del radon nella propria area. L'altro problema
legato al radon è che oltre ad essere presente nell'aria è anche disciolto nell'acqua di falda
quindi un altro meccanismo di assunzione del radon nelle zone a rischio è farsi una doccia
calda perché con il calore dell'acqua il radon diviene gassoso e viene inalato.1

Ereditarietà dei tumori

1. Retinoblastoma ereditario
a. Tumori oculari
b. Forma ereditaria e sporadica
2. Colon
3. Mammella
4. Carcinomi midollari tiroide
a. Dalle cellule parafolicolari
5. Xeroderma Pigmentosum, XP
a. Mutazioni negli enzimi per riparazione di DNA danneggiato da UV
6. Atassia teleangectasia, AT
a. Deficit enzima chiave meccanismi riparazione DNA, chinasi ATM
7. Li-Fraumeni
a. Mutazione p53

Eziologia virale o batterica

L’unico fattore eziologico tumorale noto di origine batterica è l’Helicobacter pylori.
Origine virale:
1. Virus epatici, HCV-HBV
a. Vaccinazione possibile contro HBV
b. Interferone e ribavirina per HCV o Sofosbuvir (90% li cura)
2. HHV-8
a. sarcoma di Kaposi
3. Virus di Epstain Barr,
a. PEV
4. HTLV-1, leucemia acuta a cellule T dell’adulto
5. HPV

Prevenzione primaria e secondaria

Prevenzione Primaria: si previene l’insorgenza rimuovendo il fattore di rischio o causale.
Es. Vaccinazioni anti-HPV o anti-HBV.
Prevenzione secondaria: evidenziare il tumore prima che sia clinicamente apparente.
Es. Marcatori tumorali o imaging radiologico.
Pap Test
Usato come prevenzione per il carcinoma della cervice uterina.
Metodica citologica, NON ISTOLOGICA.
Sono colorazioni su cellule spalmate della cervice che poi vengono osservate in microscopia.
Si valuta:
1. la displasia di queste cellule, quanto queste siano simili a cellule normali della cervice uterina
2. la vicinanza tra di esse
3. le anomalie nucleari
4. la risposta alla colorazione
Come fa il patologo a distinguere una situazione grave da una situazione meno grave, che tipo di esame usa?
Tramite Grading CIN (Cervical Intraepitelial Neoplasia) di 3 gradi a seconda di quante cellule displastiche identifica e
della loro diversa morfologia.
1
CIN 1 è il basso grado ovvero vi sono poche cellule displastiche; CIN 3 è il grado con più cellule displastiche.
Attualmente oltre a questa analisi citologica si esegue un test di tipo genetico con cui si va a tipizzare HPV.
Tutti i tipi di HPV sono potenzialmente oncogeni?
Di HPV ne esistono centinaia di tipi e solo alcuni hanno un significato rilevante nella patologia oncologica.
Ci sono in tutto 13 tipi di HPV ad alto rischio neoplastico per la cervice uterina, alcuni di essi sono più frequenti nelle
nostre aree geografiche altri meno. È stato sviluppato un vaccino quadrivalente, attualmente in uso, prodotto
sintetizzando, con metodiche di DNA ricombinante, la proteina capsidica L1 per i quattro tipi di papilloma più rilevanti
dal punto di vista oncologico e più frequenti nelle nostre aree: 6, 11, 16 e 18 (16 e 18 sono i più implicati nella patologia
della cervice uterina).
QUESTO TUMORE HA CONOSCIUTO UNA DRASTICA RIDUZIONE DELLA MORTALITÀ GRAZIE AL
PAP TEST
Come viene trasmesso l’HPV?
Screening per gli esposti:
- Trasmissione sessuale
- Superfici contaminate
NB. Nell’uomo può causare cancro al pene
.

Screening mammografico
È una pratica utile?
Meno efficace perché è una semplice radiografia dove si appiattisce il più possibile la struttura. È stato eliminato
in America perché non incide sulla mortalità del cancro alla mammella.
Viene identificata massa → Analisi bioptica con ago (doloroso)

Cancro all’ovaio
1. Identificazione: nel 70% dei casi lesioni già metastatiche
2. No marcatori efficaci.
3. Molto invasivo per il peritoneo.
4. CA125: marcatore sierologico né sensibile né specifico.
5. Alta mortalità → No strumenti diagnosi precoce.
Iperplasia prostatica benigna
1. Penetranza dopo i 100 anni → 100%
2. Minzione difficile
3. Maggior frequenza di riempimento
Cancro alla prostata
1. Insorgenza lobi periferici
2. Possibili disturbi della minzione
3. Analisi
a. Esplorazione rettale
b. Sonda ecografica rettale
PSA → Marcatore sierologico per cellule prostatiche.
Alti livelli di PSA possono segnare un cancro, ma non sempre, infatti può essere prodotto in:
- Iperplasia prostatica
- Insulti meccanici

1. Si usa per valutare follow-up ed efficacia della terapia in occidente

2. Marcatore poco efficace
3. Fornisce troppi falsi positivi
4. Gli adenocarcinomi più anaplastici non producono PSA
Prelievo bioptico: grosso ago per numerosi carotaggi alla cieca seguendo uno schema. METODICA INVASIVA CON
EFFETTI COLLATERALI
Gleason Score: modalità di gradazione istologica per i tumori prostatici

Screening cancro colon-retto

Primo approccio
- Ricerca di sangue nelle feci tramite STICK
- Molti falsi positivi
Secondo approccio
1. Ricerca endoscopica
a. Possibili perforazioni
 b. Indagine dolorosa
c. Sedazione profonda
d. Si possono prelevare masse

CLASSIFICAZIONE ONCOGENI
1° classe: Fattori di crescita
2° classe: Recettori dei fattori di crescita
3° classe: Molecole adattatrici
4° classe: Fattori di trascrizione
5° classe: proteine anti-apoptotiche

Parametri per l’analisi di un tumore

Tempo di sintesi TS
Tempo di durata della fase S.

Tempo di durata del ciclo cellulare TC

Tempo di raddoppiamento potenziale della massa tumorale Tpot

misura virtuale che sta ad indicare il tempo di raddoppiamento che la massa tumorale
avrebbe in assenza di fenomeni di perdita cellulare.
Si può stimare all’interno di un preparato istologico quante cellule necrotiche sono
presenti, e da quello estrapolare il dato relativo a quanto rapidamente crescerebbe il tumore
in assenza di morte cellulare.
Quindi, per il tempo di raddoppio effettivo siamo nell’ordine di grandezza delle settimane;
al contrario, per il tempo di raddoppio potenziale siamo nell’ordine dei giorni. Ciò significa
che l’aspetto di perdita cellulare ha un ruolo molto rilevante nel contenimento della crescita
dei tumori solidi.

Tempo di raddoppiamento effettivo della massa tumorale

Il tempo di raddoppiamento effettivo (TD) può variare notevolmente in neoplasie di tipo
diverso: si va dalle 90 settimane stimate per la casistica di tumore del colon retto, alle 4
settimane stimate per i linfomi ad alto grado (poco differenziati, con alto indice mitotico).
Le metastasi di un tumore solitamente hanno un tempo di raddoppiamento più basso
rispetto alla massa tumorale originaria, cioè crescono più rapidamente.
L’aspetto di perdita cellulare ha un ruolo molto rilevante nel contenimento della crescita
dei tumori solidi.

1) CHOP, viene utilizzato nei linfomi non Hodgkin. CHOP contiene ciclofosfamide (un derivato del gas
mostarda), idrossidaunorubicina (intercalante del DNA), vincristina (un veleno del fuso), e infine il
prednisone (è un corticosteroide di sintesi, analogo del cortisone, induce apoptosi in cellule di derivazione
linfocitaria). Il protocollo CHOP permette, ad oggi, una guarigione dell’80-90% nei pazienti affetti da linfoma
di non Hodgkin, rivelandosi estremamente efficace nella cura della patologia, pur presentando comunque
diversi effetti collaterali.
2) ABVD, particolarmente efficace contro neoplasie ematologiche come il linfoma di Hodgkin, contiene
doxorubicina, bleomicina, vinblastina, dacarbazina, che funzionano sia sul fuso mitotico che direttamente a
livello del DNA.
 3) FOLFOX, attualmente molto utilizzato nella terapia del cancro colon-rettale ma anche come terapia adiuvante
(ovvero quella terapia che viene eseguita per adiuvare l’intervento chirurgico), è una triplice terapia: contiene
fluorouracile, che è un analogo delle pirimidine, il leucovorin, che è un antifolico e l’oxiplatino, che è un
platino derivato, ovvero un alchilante in grado di formare di legami covalenti con il DNA.

ONCOGENI

ONCOGENI NEL CICLO CELLULARE

Possono essere trovati in qualsiasi punto della trasduzione del segnale.

L’orologio del ciclo cellulare integra diversi input:

- Vie mitogeniche dei fattori di crescita
- Meccanismi per il controllo dell’integrità del DNA

- Segnali e fattori di crescita antimitotici, il signalling negativo

Comprende gli effetti di TGF-beta
- Interazione con la matrice extracellulare e cellule di altro tipo
Comprende i recettori integrinici
- Monitoraggio dello stato metabolico della cellula

L’integrazione dei diversi input avviene a livello dei complessi ciclina-chinasi.

Complessi Ciclina-Chinasi sono regolatori positivi del ciclo.

Domanda: Di cosa è resonsabile l’apparato motore?

L’apparato motore, quello che quindi regola le scelte, elabora tutti i segnali e decide se far uscire la cellula dalla fase di
quiescenza, G0.
Domanda: La fase di quiescenza è sempre reversibile?

Nei neuroni la fase di quiescenza è irreversibile. In altre cellule è profonda ma reversibile.

Es. Epatociti.

Per le cellule tumorali ci sono due diversi meccanismi per l’aumento dell’indice mitotico:
 - Accorciare le fasi del ciclo

- Convertire le cellule quiescenti in ciclanti.

Domanda: Cosa è il restriction point?

Il restriction point è una fase del ciclo cellulare al di là della quale le cellule devono per forza progredire nella
proliferazione, anche in assenza di fattori.
Complessi ciclina-chinasi: timing-specifici.

Regolazione: ciclina
- Chinasi espresse più uniformemente

Nei quadri oncologici, solitamente, si trovano molto più spesso alterazioni a carico delle cicline che non delle chinasi.
Alcune cicline sono poi anche regolate in base alla loro localizzazione intracellulare: in alcune forme di tumore ci sono
alterazioni della localizzazione di alcuni enzimi come p27.
Domanda: Qual è il punto cruciale in cui si esplica la regolazione del ciclo cellulare e quale il principale
meccanismo di regolazione?
Rb
Superamento restriction point G1-S: Rb (repressore trascrizionale).
Rb reprime DP-1 ed E2F.
La repressione si esplica tramite rimodellamento cromatinico, mediato da reclutamento di HDAC, deacetilasi istoniche
che rimuovono acetili dalle code degli istoni.
Rimuovere acetili dagli istoni favorisce l’addensamento della cromatina in corrispondenza dei promotori.
Domanda: Cosa significa avere il checkpoint cellulare attivo? Come si supera?
Si supera in seguito ad attivazione dei complessi ciclina D e CDK 4-6; le chinasi si attivano e fosforilano geni bersagli,
tra cui Rb che, iperfosforilato, porta al suo distacco da DP-1 ed E2F.
Domanda: Cosa accade una volta che fosforiliamo Rb?
Avviene la disinibizione di due attivatori trascrizionali, DP-1 ed E2F, che portano ad una cascata trascrizionale
attivatrice per l’attivazione della fasi successive:
- Timidina Chinasi e Diidrofolato Reduttasi servono per la sintesi dei nucleotidi
- DNA polimerasi alfa permette il priming per replicazione del DNA
- Istone H2A è necessario per l’assemblaggio dei cromosomi
- Cicline E ed A servono per le fasi successive del ciclo

INIBITORI DEL CICLO

INK
- Enzimi che riconoscono chinasi cdk della fase G1
- Azione CICLO SPECIFICA SU TRANSIZIONE G1-S
Fattori
1. p15
a. Risposta a TGF-β che trasmette un segnale di tipo antiproliferativo agli epiteli normali facendo
aumentare l’espressione di p15
2. p16
a. Ruolo fondamentale nell’induzione della senescenza cellulare ed è frequentemente alterata da
mutazioni o per silenziamento epigenetico in diversi tipi di tumore
3. P18
a. Coinvolta in processi di differenziazione cellulare fisiologica
KIP
1. P21
a. Target di p53
2. P27
a. Target di TGF-β come p15
b. Controlla più fasi del ciclo
3. P57

DEREGOLAZIONE TUMORALE
Frequente aumento dell’attività dei regolatori positivi del ciclo, soprattutto cicline e cdc25.

Retrovirus e protooncogeni patogenici

1. Retrovirus altamente trasformanti

a. Azione oncogena per protooncogeni nel loro genoma
b. V-onc
2. Retrovirus cronici
a. Genoma normale
b. No sequenze oncogeniche
c. Non si conoscono virus di questo tipo nell’uomo, ma sono frequent in altre specie
Al momento, non sono noti esempi di retrovirus né acutamente, né cronicamente trasformanti.

HTLV1
- LEUCEMIA A CELLULE T DELL’ADULTO
- Non acutamente trasformante
- Nemmeno cronicamente
- Produce diverse proteine virali tra cui TAX
- Attivatore di attivatori cellulari trascrizionali
- Attiva NF-kB

MECCANISMI NON VIRALI DI ATTIVAZIONE DEI PROTO-ONCOGENI

I meccanismi di attivazione non virale sono tre:
1. Mutazioni puntiformi
2. Amplificazione genica
3. Traslocazione cromosomica

Mutazioni puntiformi
Potenziali oncogeni devono essere attivati dalle mutazioni con mutazioni gain of function.
Non si tratta di un meccanismo scontato, perché la maggior parte delle mutazioni puntiformi normalmente portano ad
una riduzione della funzione del gene mutato: sono quindi mutazioni loss of function.
Un esempio tipico di questo tipo di attivazione da mutazione puntiforme è quello della proteina Ras. La mutazione
puntiforme è caratteristica degli oncosopressori nonostante Ras sia un oncogene
 Ras è una piccola G
protein monomerica
Il meccanismo dei recettori tirosi
che trasduce segnali
chinasici consiste in un’iniziale
diversi, tra cui quelli
dimerizzazione, a cui segue un’a
più importanti
fosforilazione del recettore su sp
vengono attivati dai
residui tirosinici.
recettori tirosin
chinasici.

L’auto-fosforilazione
funge da punto di
L’esempio più importante di queste
attacco per proteine
proteine adattatrici sono Shc, Grb2 e Sos,
adattatrici che
che sono poi in grado di attivare Ras.
contengono domini
SH2.

SOS converte GDP in

GTP.

Ras attiva diverse vie di trasduzione a

valle, tra le quali la principale è la via La via di Ras ha un
Raf-MAPK, che va ad attivare i fattori effetto essenzialmente
trascrizionali Fox e Jun, i quali, tra i vari mitogenico.
target, hanno anche la ciclina D1.

Ras presenta la
proprietà Ras, come tutte le Questo circuito è controllato dall
proteine G, passa
intrinseca di dallo stato attivo a
GAPs (GTPase Activating Protei
GEFs (GTP Exchange Factors).
idrolizzare il quello inattivo a
Le GAPs servono a spegnere in
seconda che sia legato
GTP, passando rispettivamente a GTP aumentando l’attività GTPasica i
così allo stato o GDP. di Ras di migliaia di volte.
inattivo.

Le GEF sono, invece, in grado di attivare

il circuito scambiando il nucleotide, Le mutazioni si
tolgono cioè il GDP da Ras e lo trovano su GAP
sostituiscono con GTP.
 Ras

Il recettore tirosin-
Il recettore tirosin- Il recettore tirosin-
chinasico
chinasico viene chinasico
autofosforila su
attivato. dimerizza.
residui tirosinici.

Grb2 si lega a Shc

Shc si lega ai
Sos si attacca a tramite domini SH2
residui tramite
Grb2. su un residuo
domini SH2.
fosforilato.

Sos converte il
GDP di Ras in
GTP.
 Nel nostro genoma esistono tre
N-ras è espresso soprattutto in cellule
diversi geni Ras: H-ras, K-ras e N-
neuronali.
ras.

In neoplasie come il melanoma,

Nelle neoplasie pancreatiche esocrine
neoplasie vescicali e renali la
la mutazione di K-ras è molto
mutazione di Ras è molto più rara
frequente (90%)
(10%)

Nelle neoplasie polmonari K-ras è

Nelle neoplasie del colon retto e
mutato in circa 1/3 dei casi (35%). I
nelle neoplasie uterine è presente una
tumori polmonari che presentano K-
percentuale intermedia di mutazione
ras mutato sono quelli tipici dei
di K-ras (45%)
fumatori.

Raf presenta tre isoforme: A-raf, B-

raf, C-raf; è la proteina epistatica a
Nel melanoma Ras è mutato
Ras, quindi quella subito a valle.
raramente (15%), però, in questo tipo
Questo è indice dell’importanza
di tumore è molto frequente la
dell’intero pathway di Ras. Le
mutazione di B-raf (50%).
mutazioni puntiformi di B-raf sono in
genere localizzate sul codone 600.

Cosa provoca la mutazione in Ras?

Le mutazioni nei geni Ras possono portare alla produzione di proteine Ras
permanentemente attive. Ciò può causare segnalazioni indesiderate e
iperattive all'interno della cellula, anche in assenza di segnali in ingresso.
Mutazioni che attivano in modo permanente Ras si riscontrano nel 20-25%
di tutti i tumori umani e fino al 90% in alcuni tipi di tumore, ad esempio
pancreatici.
Ras attivata si lega a raf (serina/treonina chinasi), attivandola. Raf fosforila
 Loss of Function, l’opposto di Ras e la sua semplicità
Nelle mutazioni con perdita di funzione degli oncosoppressori, la
situazione è diversa, in quanto le mutazioni sono sparpagliate lungo tutto
il gene. Ciò avviene poiché è più semplice ridurre la funzione di una
proteina che aumentarla. y
Per quel che concerne la pratica, è molto più semplice diagnosticare una
mutazione gain of function perché gli hotspots sono limitati ed è, quindi,
sufficiente sequenziare le specifiche porzioni del gene coinvolte. In una
mutazione loss of function è, invece, necessario sequenziare l’intero gene
e così facendo aumentano i costi e il tempo necessario alla diagnosi.
Un esempio opposto rispetto a Ras sono le mutazioni nelle neoplasie
ereditarie della mammella che riguardano i geni brca1 e brca2. Questi
geni sono enormi e le mutazioni non presentano alcun tipo di hotspot e
sono disperse lungo tutto il gene.

Amplificazione genica
- Gene presente in più copie.
- Ori attivate più volte con amplificazione.
- Le copie sono extracromosomiche
- I frammenti genomici extracromosomici si chiamo DOUBLE MINUTES.
a. Possono integrarsi in maniera stocastica in una porzione qualsiasi del genoma cellulare.
- Le sequenze integrate si chiamano Homogenous staining regions
a. Con le colorazioni, appaiono colorate omogeneamente
- Sia i DB che le HSR possono essere evidenziate con analisi citogenetica come il bandeggio cromosomico
- L’analisi usata più di frequente è la FISH
a. Interfasica: qualunque prelievo
b. Metafasi: più complessa e costosa
 Due esempi di amplificazione molto importanti sono quella di erbB2, soprattutto in neoplasie mammarie, ma anche
ovariche e del tratto gastrointestinale, e quella di N-myc nei neuroblastomi pediatrici.

Amplificazione di n-myc

Nell’immagine in questione sono rappresentate due popolazioni di pazienti:

 pazienti con < 10 copie N-myc

N-myc è amplificato in 1/3 dei neuroblastomi pediatrici (30%), che sono

tumori di derivazione neuronale.
 pazienti con > 10 copie di N-myc

Tumori:
- Microcitomi polmonari
- Neuroblastomi
- Astrocitomi
- Retiblastomi
*Rari
L’amplificazione di N-myc non è unica dei neuroblastomi
- microcitomi polmonari (SCLC= small cell lung cancer)
- astrocitomi
- retinoblastomi.
N-myc è un fattore trascrizionale con diversi domini
 domini transattivatori: per la funzione di attivatore trascrizionale.
 regione C-terminale: eliche basiche, necessarie per il legame con il DNA, in particolare a livello della
sequenza consenso CACGTG, piccolo modulo contenuto in molti promotori.

È stato stimato che myc controlli ca. il 10% dei geni. In realtà l’effetto di up-regolazione trascrizionale non è
elevatissimo: myc risulta essere un fine modulatore dell'espressione genica.
Ha azione diversa in base al partner con cui si lega.
Myc-max.
1. Eterodimero: recluta HAT che permettono di aprire la cromatina.

2. +Ciclina D2-CDK4, fa partire la fase G1

3. Degradazione di p27 (KIP)
a. Tramite Cks1, Cul1
b. Obiettivo degradazione inibitore del ciclo
Max-Mad:
1. Eterodimero inibitorio sulla trascrizione
2. Recluta HDAC.
Myc-Max
1. Iperfosforilazione dominio carbossiterminale RNA polimerasi
2. Arresto della trascrizione perché non riesce a staccarsi dal punto di inizio senza il meccanismo di promoter
clearance. Questo processo è mediato dall’iperfosforilazione del CTD della RNA polimerasi II.
a. Tramite TFII-H
Myc-Miz
1. Reprime p15 e p21, inibitori del ciclo
Myc → Facilitata entrata nel ciclo cellulare
Over-espressione Myc → Simile ad assenza di Rb
NB +D2/CDK4 iperfosforilazione Rb e suo distacco da DP1 ed E2F
Overespressione di Myc → Insensibilità a stimoli anti-proliferativi

Amplificazione di Her2
Neoplasia epiteliali, soprattutto TUMORI DELLA MAMMELLA.
Recettore tirosin-chinasico della FAMIGLIA EGF.
Her1-4 conosciuti.
Her2 non è stato identificato il ligando. Per gli altri → EGF e TGF-α
Eterodimeri con altri membri della famiglia.
Vie attivate da HER2
- Ras, Raf, MAPK → mitogenico

- PI3K-Akt → Pro-survival, resistenza apoptosi

Possono controllare p27 tramite Akt e MAPK, degradandolo tramite l’ultimo e sequestrandolo nel citoplasma tramite il
primo.
Gli effetti su p27 vengono valutati tramite l’istochimica.
Distinzione tumore in base al grading:
1. Alto grado:
a. Poco differenziati, possibilmente anaplastici
b. p27 nel citoplasma
c. Akt fosforilata
2. Basso grado:
a. Ben differenziato
b. p27 ancora espressa
Her2 costituisce 1/3 circa dei tumori mammari e sono un’entità a se stante.
Sono tumori più aggressivi con prognosi peggiore.
Ridotta espressione di due marcatori di differenziazione:
1. Recettore per gli estrogeni ER
2. Recettori per i progestinici PR
Le cellule mammarie proliferano sotto stimolo estrogenico e vanno in APOPTOSI per STIMOLI PROGESTINICI.
Pazienti ER+ possono essere trattati con farmaci anti-estrogenici.
- TAMOXIFEN
La loro presenza è un parametro valutabile con IMMUNOISTOCHIMICA.
L’AMPLIFICAZIONE è un MARCATORE PREDITTIVO per la risposta di Herceptin, Trastuzumab.
- Anticorpo umanizzato, porzione ab topo, porzione Fc umana

L'anticorpo monoclonale funziona in diversi modi, partendo dal legame con Her2 e dalla sua inibizione:
1. Impedisce dimerizzazione
2. Blocca il clivaggio di Her2
a. Clivaggio → Attivazione
3. Endocitosi recettore e degradazione endosomiale
4. ADCC
La presenza di Her2 è un fattore predittivo per la risposta ad Herceptin.
Si fa una immunoistochimica per decidere se somministrare il farmaco:
- IHC0 nessuna positività
- IHC+ poche cellule
- IHC2+
- IHC3+ cellule molto positive e segnale in membrana
Solo i 3+ sono adatti al farmaco.
Immunoistochimica → so solo che è overespresso in membrana
Quindi → FISH (metodica confermatoria)
In alcuni centri si fa anche FISH, dato che l’immunoistochimica non permette di stabilire direttamente se il gene è
amplificato, ma solo se Her2 è overespresso in membrana.
Indicazioni terapeutiche al momento riservate alle pazienti metastatiche.
Her2 viene amplificato in ampliconi.
Se viene amplificato con GRB7 e MLN64, che attivano vie di trasduzione parallele, gli altri geni non vengono inibiti
dall’anticorpo.
Grandezza amplicone → + alta probabilità di amplificazione di altri geni
A livello diagnostico ancora nessuna distinzione.
TUMORI E TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE
IL LINFOMA DI BURKITT

Cellule B, sviluppato in forma solida:

- Linfonodi
- Milza
- MALT
TRASLOCAZIONE CROMOSOMI 8-14
c-Myc + Gene Enhancer della catena pesante delle Ig (IgH)
A monte IgH, a valle c-Myc
I LINFOMI FOLLICOLARI
TRASLOCAZIONE 14-18
Bcl-2 + IgH
Bcl-2 è un gene antiapoptotico.

I LINFOMI A CELLULE MANTELLARI

Cyc-D + IgH

TRASLOCAZIONE 11-14
Cyc-D1 è proliferativa.
TIPOLOGIE DI LINFOMI

Linfoma di Hodgkin
Diffusione per contiguità.
Insorgenza generalmente a livello mediastinico e diffusione limitrofa.
I non-hodgkin hanno diffusione saltatoria.
Linofmi non-hodgkin masse linfociti neoplastici tutti uguali con antigeni di superficie caratterstici.
Hodgkin:
1. Cellule diverse binucleate
2. Numerose cellule infiammatorie
3. Macrofagi
4. Linfociti
5. Fibroblasti
Analisi dei dati (le tabelle riportate non sono quelle della lezione)
Terapie per linfomi (non-hodgkin?)

La Terapia
In genere si utilizza la chemioterapia secondo il protocollo CHOP:
 1) C: ciclofosfamide;
2) H: Hidrossi-doxorubicina (adriamicina);
3) O: oncovin (vincristina);
4) P: prednisone (corticosteroide);

Rituximab associabile a CHOP per colpire CD20.

CD20 è espresso nella maggior parte della popolazione non-Hodgkin.
Rituximab sia per non-Hodgkin che per linfomi follicolari e leucemia linfatica cronica.
CD20 è un antigene di superficie espresso nelle prime fasi del processo di differenziazione delle cellule B e poi
mantenuto nelle fasi successive.

Il meccanismo d’azione del Rituximab vede la compresenza di varie modalità che agiscono sul linfocita B CD20
positivo:
- Azione del complemento
- Reclutamento delle cellule del sistema immunitario (ADCC)
- Meccanismi diretti legati al binding del
CD20 da parte dell’anticorpo

Rituximab → uccidere linfociti B

CHOP → antiproliferativo

Il farmaco è stato poi perfezionato e oggi sono

presenti anche altri farmaci con il medesimo
effetto:
- Tositumomab;
- Obinutuzumab;
- Ofatumumab che è anticorpo
monoclonale tutto umano con la proprietà
di legare una porzione del recettore CD20
più vicino alla membrana (tutti gli altri
legano in porzioni più superficiali) e in
questo modo facilita l’azione del
complemento aumentando la potenza di
uccisione delle cellule per lisi.

Leucemia mieloide cronica CML

- Fenotipo simile ai granulociti.
- Dura 3-5 anni
- Insorge dai 65 in poi.

La t(9,22) è patognomonica.
Il breakpoint presenta 2 geni: abl e bcr.

DIAGNOSI
È piuttosto semplice e si articola in vari steps
1. Striscio di sangue periferico
o Granulocitosi fenotipo anomalo
o Basofilia più frequente
o Eosinofilia
o Eccesso di cellule con fenotipo intermedio
2. Analisi citogenetica
o Ricerca cromosoma philadelphia
3. Diagnosi molecolare
4. RNA ibrido Abl-Bcr
o Meglio l’RNA che il DNA perché siccome i breakpoitn sono sparpagliati lungo bcr, risulta più rapido
studiare il trascritto maturo
Breakpoint è localizzato in una regione del gene ma è molto diversificato e quindi ci possono essere diversi prodotti di
traslocazione.
Principali prodotti di traslocazione
- p210, più frequente nella CML
- p185
- p230

Dal punto di vista clinico la CML ha un andamento cronico BIFASICO:

1. Fase cronica
a. Accumulo di molte cellule granulocitarie tumorali
b. Elevato grado di differenziazione
c. La traslocazione si trova in cellule del midollo
d. Probabilmente dà granulociti per vantaggio selettivo ma resta anche nelle altre cellule differenziate
2. Fase acuta → Crisi blastica
a. Accumulo di cellule poco differenziate
b. Accumulo di alterazioni genetiche che bloccano il processo differenziativo
SIGNA LLING

1. Fosforilazione Bcr
a. Grb2, Sos, Gab →
i. CASCATA RAS, RAF, MAPK
ii. CASCATA PI3K
2. Fosforilazione Abl
a. STAT →
i. Fattori di trascrizione per BCLX
b. Inibizione di Bcl2 e Bclx

Terapia
- Imatinib
- Dasatinib
- Nilotinib
Cellule addicted: se viene tolta la traslocazione muoiono.
Non-Addicted: non muoiono se viene tolta la traslocazione.

Viene diagnosticata e curata in fase cronica

- Il paziente guarisce con remissione citogenetica completa
- Deve prendere il farmaco per tutta la vita

L’imatinib inibisce altre due componenti recettoriali-chinasiche

- Il c-kit: recettore per stem cell factor
- Il recettore per il PDGF

Alcuni pazienzi recidivano dopo l’imatinib per mutazioni puntiformi.

ACUTE PROMYELOCYTIC LEUKEMIA APL

Traslocazione 15-17.
1. Geni PML e RAR α.
2. PML: repressore trascrizionale.
a. blocca la proliferazione cellulare
3. RAR α: recettore α dell’acido retinoico.
a. Pro-differenziativo
4. I retinoidi, come l’acido retinoico e simili, hanno in genere un effetto di tipo differenziativo.
5. La traslocazione genera due prodotti
a. Una piccola con funzione sconosciuta RAR α-PML
b. Una grande che funziona PML-RAR α
i. Inibitore transdominante delle proteine PML e RAR α normali
ii. Forma dimeri inattivi con le proteine funzionanti
Effetti
- Aumento proliferazione
 - Blocco differenziativo

TERAPIA FARMACOLOGICA
ATRA (all trans retinoic acid)
- Colpisce la componente RAR α traslocata
o Sopravvivenza a 5 anni 80%
- Combinato con chemioterapici convenzionali
- Triossido di arsenico
Terapia farmacologica mirata
Viene utilizzata per altri tipi di neoplasie → vario successo
Necessari
- Druggable target
o Molecola da poter inibire
 Es. recettori e chinasi
o Funziona con inibitori della farnesilazione di Ras
- Oncogene Addiction
o Driver mutation: rilevanti a mantenere il fenotipo neoplastico
Regolatori positivi e negativi del ciclo nelle cellule tumorali
- Ciclina E utilizzata come marcatore prognostico in alcuni tumori
o Es. Neoplasie mammarie
- CDK4 mutazione puntiforme attivatoria
o Legame di p16 inibito
- CDC25 aumentata espressione
- Ciclina D1
- P21/p27 raramente mutati
- p15/p16 mutazioni inattivatorie
o Es. silenziamento epigenetico
- Nei tumori si trova spesso pattern di inattivazione reciproco Rb e p16, dato che sono epistatiche l’una rispetto
all’altra
o p16 inibisce le chinasi che inibiscono Rb
o Mutazione germinale di p16 predispone all’insrogenza di melanomi ereditari

TUMOR SUPPRESSOR GENES (ONCOSOPPRESSORI)

Mutazioni Loss of Function
Mutazioni recessive
Eccezioni:
- Aploinsufficienza
o Emergenza del fenotipo per difetto quantitativo di produzione dell’oncosoppressore
- Mutazione p53
o Trans-dominante
o Non solo non funziona, ma inibisce la p53 wild-type
Come fanno questi geni oncosoppressori a sopprimere lo sviluppo del tumore?
Ci sono due meccanismi fondamentali:
1. Gatekeeper
a. Funzione inibitoria sull’entrata nel ciclo cellulare
b. Molto più pericolosa
2. Caretaker
a. Che attivano la cascata di morte per controllare

P53
Gatekeeper
1. p21
o Antimitotico
2. Bax
o Proapoptotico
Carekeeper
 1. La sua mutazione è dominante negativo, andando a inattivare quello sano.
2. Tetramero
3. Poco espresso in cellule normali
4. Livelli fisiogilici di espressione bassi
a. Regolato a feedback negativo
b. +p53 → MDM2 → porta a degradazione di p53

ATM: IMPEDISCE LA DEGRADAZIONE DI P53

- Fosforila p53 su Ser
- Interrompe il circuito di feedback negativo
- Danno → ATM → +p53
p14ARF → Inibizione MDM2 dissociandolo da p53

P53 controlla
1. proteine che controllano l’entrata in ciclo (la P21 : Cdk inibitore)
2. proteine che controllano l’apoptosi (BAX)
3. proteine intervengono nell’attivazione delle vie di riparazione del DNA (GADD45).

Quindi questi sono i 3 “bracci d’azione” di p53:

 braccio anti-mitotico (1) gatekeeper
 braccio pro-apototico (2) gatekeeper
 braccio di riparo del DNA.(3) caretaker
Altri attivatori p53
1. Stress ossidativo
2. Espressione oncogeni
a. Ras attivato in modo anomalo
3. Telomer attrition
a. Erosione telomerica
 DOMINI DI P53

Mutazione p53 nel cancro della cervice uterina per via delle proteine oncogeniche, dato che E6 sopprime p53 ed E7
sopprime Rb.
Il caso della cervice uterina è emblematico per l’infrequenza della mutazione di p53, qui la ragione è ben chiara ed è
legata al fatto che il virus che causa questa neoplasia è codificano per delle proteine oncogeniche (E6, E7), esse si
comportano da oncogeni perché inibiscono oncosoppressori cellulari, E6 p53 ed E7 RB.
Forme mutanti → RESISTENTI ALLA DEGRADAZIONE DI MDM2
- Legano di meno MDM2
- Emivita molto più lunga
- Tetrameri funzionalmente inattivi
- Accumulo paradosso di p53
Senescenza cellulare
1. la quiescenza è un arresto replicativo reversibile.
2. la cellula senescente invece è quiescente e rimane tale anche se soggetta a fattori di crescita mitogenici.
a. non è reversibile.
Marcatori per senescenza:
- Senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal
- Accumulo di inibitori del ciclo
- Morfologia della cromatina
o SAHF, senescence-associated heterochromatin foci
o Aggregati eterocromatinici
Basi molecolari della senescenza
Qual è la base molecolare del limite del potenziale replicativo alla base della senescenza cellulare?
Lunghezza delle estremità telomeriche dei cromosomi
1. Sequenza ripetitiva, esanucleotide ripetuto centinaia-migliaia di volte
2. Perdita continua delle estremità telomeriche tra 2 e 4 kb
Perché avviene questo accorciamento?
Il nostro apparato non è in grado di replicare le porzioni terminali del cromosoma –
Difetto intrinseco
Perdiamo 50 basi a ogni replicazione.
Possiamo contrastare l’erosione con un apparato enzimatico
1) hTERT
a. HUMAN TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE
b. subunità catalitica che sintetizza le estremità telomeriche ripetitive
esanucleotidiche (TTAGGG
c. stampo una molecola di RNA che è (2)
d. hTERT è una trascrittasi inversa, perché è una DNA polimerasi RNA
dipendente.
2) hTR
a. HUMAN TELOMERASE RNA COMPONENT
 b. contiene l’esanucleotide complementare a TTAGGG, quindi la polimerasi lo utilizza come stampo
e sintetizza tante volte questo esanucleotide ricostruendo la parte erosa del telomero.

USCITA DAL COMPARTIMENTO STAMINALE → attività telomerasica spenta → numero di replicazioni limitate
Nella patologia tumorale abbiamo riattivazione di telomerasi, quindi hTERT è riespressa.
IL TUMORE AGGIRA IL LIMITE DEFINITO DAL POTENZIALE REPLICATIVO RIESPRIMENTO
TELOMERASI
I tumori DEVONO riattivare la telomerasi per progredire e non andare in senescenza.
Inserendo hTERT costitutivamente attivo in delle cellule, si
IMMORTALIZZANO → potenziale replicativo illimitato
Immortalizzato non significa tumore, è solo UNO dei tratti. Passaggio necessario,
non sufficiente.

Espressione di hTERT
1. c-Myc e GF fanno esprimere hTERT
2. p53 e Menin reprimono hTERT
Fattore prognostico MOLTO NEGATIVO.

L’attività telomerasica è riattivata nell’80-85% dei tumori; una domanda

sorge spontanea: “Cosa succede negli altri tumori avanzati, che hanno raggiunto un fenotipo metastatico?”
Overespressa ALT, alternative lengthening of telomeres.
- Usa la ricombinazione omologa per risintetizzare estremità telomeriche mancanti.
Frequente in tumori quali i neuroblastomi (25% dei casi) e gli osteosarcomi (50% dei casi).
- Lunghezza media 10 kb

- Ripetizioni TTAGGG
- Filamento 3’ protrude
o Sporgenze asimmetriche
- Sei proteine associate ai repeats telomerici → COMPLESSO SHELTERIN
- Telomero aspetto non lineare
- Pseudocircolarizzazione del tolomero
o La porzione 3’ ritorna indietro e va ad appaiarsi con una sequenza a monte
Il fatto che tale filamento (indicato in rosso in figura) vada ad appaiarsi con una porzione di DNA a doppio
filamento che gli sta a valle (si definisce “invasione di strands”) genera due strutture:
1. T LOOP → ANSA TELOMERO
2. D LOOP → FILAMENTO SINGOLO SPIAZZATO
Nascondono la fine del cromosoma perché non sia visto come un free-end, un’estremità libera di DNA.
Erosione → viene a mancare struttura pseudocircolare → nessun omologo con cui appaiarsi a monte → estremità libera

- Risposta al danno al DNA

- Senescenza/Apoptosi

MECCANISMO DI RIPARO DELLO STRAND-BRAEAK

Estremità libere riconosciute da MRN, composto da 3 subinità
1. MRE11
2. RAD50
3. NBS1
Può reclutare altre nucleasi (ARTEMIS), o da solo, degradare.
ATTIVITà ESONUCLEASICA: taglia il punto in cui il DNA si era frammentato.
ATM → APPARATO SENSORE DEL DANNO
ATM Attiva due vie di riparazione:
1. NHEJ, non-homologous end joining
a. Recluta proteine (Ku70, Ku80) che legano le estremità libere di
DNA
b. Reclutano DNA-PKC
c. DNA-PKC proteina chinasi attivata dal legame al DNA
d. BERSAGLI
i. XRCC4, XLF, LIG4 (fattori riparativi)
e. Via a bassa fedeltà (più importante negli umani)
2. HR, ricombinazione omologa
a. Inizio uguale alla precedente ma con reclutamento di
i. RAD51, RAD54, BRCA2
b. RAD 51
i. Lega prozioni a singolo filamento
ii. Riconosce danno processato e recluta RAD54 e BRCA2 e BRCA1
c. RAD54
i. Incaricato della ricerca dell’omologo
Uncapping
Niente più pseudocircolare
Riparazione prevalentemente attraverso NHEJ
End-to-end fusion → due estremità dei cromatidi fratelli che vengono uniti
Anafase Bridge nella fase successiva → traslocazione di un pezzo di cromosoma su un altro
Con l’accorciamento di queste sequenze ripetitive si perde la capacità da parte delle
proteine del complesso dello shelterin di legarsi a tali sequenze.
Telomero normale → normale reclutamento shelterin
Due proteine shelterin, TRF e POT1 inibiscono proteine nella risposta al dannno:
- ATM
- ATR
Inibite ATM e ATR → inibito processo di riconoscimento strand break
TELOMERO EROSO: niente più inibizione del riconoscimento del danno
Stabilizzazione p53 →
- produzione p21 MECCANISMO PRINCIPALE DI SENESCENZA
- Attivazione Rb → inibizione ciclo in più punti
- INK4a → p16INK inibitore speicifico erosione telomerica attraverso inibizione
CDK4/6 e impatta sulla funzione di Rb

Senescenza mediata da p53 e Rb

- Se la cellula muta p53 reverte la senescenza
- Rb induce eterocromatizzazione del DNA → processo irreversibile
o Anche se mutiamo, inattiviamo p16, ma la cromatina non viene
modificata
o Eterocromatizzazione → Trimetilazione istone 3 da SUV39 (HAT)
H3K9me3 (marker di senescenza)
Rb recluta HP1 che poi media l’eterocromatizzazione.
Trimetilazione → formazione di SAHF
Quindi: attivazione di RBtrimetilazione dell’istone H3 reclutamento di
HP1eterocromatizzazione della cromatina comparsa dei SAHFs (PROCESSO
IRREVERSIBILE : DNA reso inservibile ).
Pathway controllate da CKDN2A che codifica per due geni diversi per splicing alternativo
1. p16INK, inibitore el ciclo
2. p14ARF, spegne il circuito a feedback negativo che controlla p53 (+p53)

p16 → +pRb
p14 → +p53
Prevalentemente inattivazione epigenetica.

Paradosso dei telomeri

cellule tumorali con telomeri molto più corti delle cellule normali differenziate.

1. Cellule normali accorciano telomeri, ma non superano un certo punto perché arrivano a differenziazione
terminale, quindi sono abbastanza lunghi
2. Trasformazione neoplastica
a. Continua discesa nell’erosione dei telomeri
b. Il signalling attiva p53 che arresta la proliferazioner
3. Pressione selettiva
a. Vantaggio a cellule che mutano p53
i. Mutazione p53 → scendere sulla retta di erosione telomerica
4. Riparo ATM o ATR delle estremità
a. Fusioni cromosomiche, ponti anafisici rotture che porteranno al trasferimento di porzioni geniche da
un cromosoma all’altro
b. Alterazioni macroscopiche che inducono morte
c. Una quota sopravvive e riattiva la telomerasi

Altre vie che portano alla senescenza cellulare

1. Danno genotossico al DNA
a. Radiazioni, farmaci alchilanti
2. Stress ossidativo
3. Stress oncogenico
a. Ras mutato attività GTPasica compromessa introdotto nelle cellule
b. Stimolo mitogenico costante con proliferazione continua
c. Dopo un certo numero di proliferazioni, si raggiunge un plateau e le cellule vanno in senescenza

Perché iperstimolare con un oncogene implica danno al DNA e quindi senescenza?

Accelerazione eccessiva di sintesi di DNA.
Attivazione asincrona e disordinata delle ORI
- Amplificazione per mancato controllo per accensione incontrollata
- Delezione del gene per non accensione
Accensione eccessiva → DNA free-ends → Damage response
DDR → Senescenza
DDR → ATM/ADM in base a singolo o doppio filamento

Tumore benigno (soprattutto): cellule diventano senescenti. Marcate β-gal

Tumore maligno: senescenza superata.
1) mutazione di p53
 2) silenziamento di p16INK
a. manca così il meccanismo di blocco indotto da RB e prevengono l’attivazione della senescenza;
3) perdita di funzione della SUV39H1
a. metilasi istonica che serve a mediare il reclutamento di HP1 (Heterochromatin Protein 1) che è
importante per la formazione delle zolle eterocromatiniche.
RESISTENZA ALL’APOPTOSI

Alterazioni con guadagno di funzione di proteine antiapoptotiche:

LINFOMI FOLLICOLA Bcl-2, traslocazione cromosomica 14-18 z
Overespressione di IAP
Via PI3K/AKT → Akt → Bad proapoptotica viene fosforilata e inattivata

Alterazioni con perdita di funzione di geni proapoptotici:

1) PTEN
2) Bax e Bak
3) Difetto di espressione di caspasi-8 nei neuroblastomi (raro)
4) Mutazioni di apaf-1 nei melanomi
5) p53

Ruoli di Ras
1) Accelera fase S → + proliferazione
2) ARF → stabilizza p53
a. Arresto proliferativo e senescenza
b. ATM/ATR per stabilizzare p53
3) PI3K/Akt → Bcl2 e Bcl-XL
Senescenza ma non apoptosi
Ruoli di Myc
1) Entrata in ciclo
2) ARF e DNA-damage come Ras,
a. ATM/ATR
3) Proliferazione e apoptosi

Cooperazione tra oncogeni

Myc-Ras: + Proliferazione – Apoptosi
Adenocarcinomi duttali del pancreas:
Diversi gradi di trasformazione dovuti alla comparsa di mutazioni:
1) EGF-Receptor per il fattore di crescita epidermico;
2) k-RAS
3) E mutazioni di oncosoppressori (indicati in rosso, loss of function):
4) INK4A, inibitore del ciclo cellulare;
5) P53;
6) SMAD/DPC, agisce sulla via di segnalazione di TGF-beta;
7) BRCA2, coinvolto nelle neoplasie mammarie ereditarie ma in questo caso si tratta di geni mutati con perdita di
funzione in neoplasie non ereditarie ma sporadiche.
8) La telomerasi si riattiva in una fase tardiva quando, in virtù della stimolazione mitogenica, le cellule arrivano
a quel processo di erosione telomerica finale.
Adenoc. Dut. Inv. = 2 Oncogeni + 4 Oncosoppressori + Telomerasi

CONTROLLO DELL’APOPTOSI IN TERAPIA

TNF-α e Fas-L non hanno avuto buoni risultati perché vengono recepiti anche da cellule normali → danno massivo
TRAIL → Lega TRAIL-R1/R2 espressi principalmente sulle cellule
tumorali
Bcl2 → BH3 mimetics
SMAC/DIABLO → SMAC mimetics

Famiglia Bcl2 e sottofamiglia BH3-Only

Bcl2
Inibiscono apertura Bax-Bak
BH3
Inibiscono una o più proteine antiapoptotiche:
- TBid, Puma, Bim → inibizione ad ampio spettro
- Bad → inibisce Bcl2/XL/W
- Noxa -> Mcl-1 A1

LEUCEMIA LINFATICA CRONICA (CLL)

Utilizzo in terapia di farmaci BH3 mimetics.
- Derivata da linfociti B maturi
- Malattia ematologica più frequente nell’adulto, soprattutto dopo i 55
 - Accumulo di cellule B molto differenziate nel sangue periferico e midollo osseo
- Diagnosticata spesso per caso, per accumulo di linfociti B maturi
- Si trova asintomatica all’inizio e ha decorso lungo
- Indice replicativo Bassissimo MA elevatissima resistenza alla morte
Due forme
1. Good CLL: andamento molto lento, praticamente non trattato
a. I pazienti spesso muoiono di altre cause (50%)
2. Bad CLL: progressione rapida
a. Quadro di segni leucemico
i. Anemico, neutropenico, piastrinopenico
b. Accumulo di cellule

Distinzione Bad/Good
1. Ipermutazione geni Ig
a. Marcatore di differenziazione, dato che è l’ultimo step
della produzione dell’anticorpo
2. ZAP-70
a. Chinasi associata a TCR
b. Marcatore cellule T espresso anomalo nelle B
3. Survivina
a. IAP
b. Livelli elevati = prognosi cattiva
4. Alterazioni citogenetiche
a. Cromosomiche
b. Nella delezione del cromosoma 13 la regione colpita contiene mir15 e mir16
i. Tra i loro target c’è Bcl-2, rimuovendoli sale Bcl-2, associato a good CLL

Ruolo dei miRNA nelle patologie tumorali

Mir15 e Mir16 sono mutati nella CLL → Loss of Function

Bcl-2 è un oncogene, una proteina anti-apoptotica.
In base al target, il miRna può essere oncogene od oncosoppressore.
In questo caso è un oncosoppressore.

Farmaci
Abbot, ABT.
ABT-737 → Bad mimetico. Azione inibitoria sovrapponibile
a Bad, inibisce Bcl-2-Bcl-XL
Uccide in vitro cellule CLL anche a dosaggi bassi.
Trombocitopenia molto grave, perché la sopravvivenza delle
piastrine è legata a Bcl-XL.
Bortezomib o Velcade inibitore proteasoma per trattare
cachessia.

Mieloma multiplo
Terapia con Bortezomib (Velcade)
Plasmacellule di derivazione monoclonale accumulate e producono lo stesso anticorpo.
IG trovata nelle urine → Proteina di Bence-Jones

Meccanismo Velcade
1. Attivazione di NF-kB

2. Il clone leucemico produce grandi quantità di anticorpi, molti unfolded che porterebbero alla UPR → cascata
apoptotica
a. Le cellule del mieloma multiplo si liberano delle proteine anomale, se inibiamo il proteasoma
induciamo UPR
3. Alcune proteine pro-apoptotiche vengono tessuti a bassi livelli, tramite anche degradazione di p53

Anche TRAIL, BAX, Fas sono tenuti a bassi livelli nelle cellule tumorali

Risveglio p53 → SLIDE

GENI ONCOSOPPRESSORI CARE-TAKERS E NEOPLASIE EREDITARIE
Geni oncosoppressori care-takers
1. Rilevano il danno genetico
2. Riparano il DNA
3. Inattivano molecole mutageniche

Tipi instabilità
- Microsatellitare, MIN
o Tante piccole mutazioni puntiformi, delezioni, duplicazioni
- Cromosomica, CIN
o Accumulo di mutazioni di ampie dimensioni
o Può essere generata da accensione incontrollata delle origini di replicazione
MIN o instabilità di tipo microsatellitare
1. Tante piccole mutazioni per difetti del MMR
2. Errori incorporativi
3. Primo livello di controllo
a. Attività enzimatica delle polimerasi con attività esonucleasica 3’-5’
b. 10-5
4. MMR, secondo livello
a. 10-9
Meccanismo d’azione MMR Procarioti
Corregge gli appaiamenti alterati.
SISTEMA STRAND SPECIFIC: riconosce il filamento neosintetizzato da correggere.
Metilazione del DNA meccanismo sfruttato perché quello neoparentale è metilato quello neo no.
Quindi distingue così i due.
MUT → proteine della via riparativa
1. Le mut riconoscono la regione mismatch
2. Hanno attività endonucleasica
3. Fanno una doppia incisione nel filamento non metilato
4. Viene tagliato un pezzo di DNA più ampio dove c’è il mismatch, circa 50 nucl.
5. La DNA polimerasi risintetizza
6. La DNA ligasi riforma

Meccanismo d’azione del MMR negli eucarioti

Proteine MSH/MLH
Funzionano in maniera dimerica
- MUTS riconoscono il mismatch
- MUTL ripara ed escinde
Polimerasi risintetizzano e ligasi fanno l’ultimo legame fosfodiesterico.
Difetti MMR → Colon-retto, utero, ovaio, rene e stomaco.
Difetti ereditati o sporadici.

Pathways of dna repair: NER

GROSSI ADDOTTI SUL DNA → Aggiunta covalente di grossi gruppi alchilici del DNA o formazione di legami
covalenti tra nucleotidi adiacenti
- Proteina riconoscimento, XPC-R23, riconosce il dimero di pirimidina
- Elicasi → Separazione tramite TFIIH
- Incisione Bimodale, XPF, XPG → Tagliano via il filamento
- Escissione
- Risintesi
Altre proteine coinvolte
RPA, single strand binding protein, legano il DNA per tenerlo separato.
PCNA, fattore di processività della polimerasi, morsetto che pinza il filamneto stampo e si attacca alla polimerasi.
POL?/epsilon
- POL è la principale polimerasi
- Epsilon specializzata nella sintesi di pezzi di DNA da riparare
Mutazioni NER → XERODERMA PIGMENTOSO

CIN
1. Alterazioni cromosomiche generate dalla erosione telomerica
2. Attivazione riconoscimento strand breaks durante alterazioni della replicazione, errori del licensing
3. Alterazioni della fase mitotica, soprattutto dello spindle assembly checkpoint, SAC, assemblaggio del fuso

Spindle assembly checkpoint

SAC → Proteine che mediano attacco del centromero al fuso e controllano la separazione fra cromatidi fratelli.
Fattori
1. Mad, mytotic arrest deficient genes
a. 1/2 la loro mancanza rende incapaci le cellule di arrestare mitosi dopo alterazioni cromosomiche o del
fuso mitotico
2. Bub, budding uninhibited by benzimidazole genes
a. Distrugge il fuso e rende casuale la segregazione dei cromosomi
b. Loss → la mitosi va avanti anche se il fuso è distrutto
La funzione principale è inibire l’attivazione dell’APC/C, anaphase complex cyclosome da parte del CDC20.
SAC INIBISCE L’ANAFASE

APC media la degradazione proteosomiale di

- Securina
o Controlla separazione tra cromatidi fratelli
- Cyclin B
- Deve essere degradata per far uscire la cellula dalla mitosi e terminarla
- SAC attivo non solo blocca anafase, ma PROLUNGA FASE M
Cromatidi non attaccati al fuso ben orientato verso i due poli → SAC
attivo → segnale di attesa, coesina
- Coesina degradata da separasi se tutto va bene.
Securina →| separasi
APC →| Securina
Tensione fibre del fuso →| SAC →| CDC20 → APC →| Securina →|
separasi → Anafase
Meccanismi di correzione
Correggono errori per centromero che non ha legato il fuso.

AURORA CHINASI: responsabili della correzione

Mutazioni puntiformi → Perdita di funzione parziale
Mutazioni riscontrabili
- BUB2
- BUBR1
- MAD1
- MAD2
- ZW10
- ROD
Accumulo mutazioni nei tumori:
- Cariotipi aberranti
- Piccole alterazioni cromosomiche come traslocazioni nelle neoplasie ematologiche
Alterazioni funzionali di SAC
Riscontrabili in mutazioni di p53, Rb, BRCA1.
Tax porta ad alterazione di SAC, proteina di HTLV1. Può anche inibire Mad1. Infatti le leucemie dei linfociti T
dell’adulto tendono ad accumulare aberrazioni cromosomiche.
NB
IMPORTANTE
GENERALMENTE NEI TUMORI SPORADICI SI PARTE DA UN’ALTERAZIONE DI ONCOGENE.
NEI TUMORI EREDITARI SI PARTE DALL’INSTABILITà DI UN ONCOSOPPRESSORE.
NEOPLASIE EREDITARIE
Ereditarie:

- età di insorgenza giovane

- Storia familiare
- Origine multifocale
- Sindromi associate
- Mutazione inattivante gene oncosoppressore
- Mutazioni ad alta penetranza
Retinoblastoma, Gene Rb
1. Neoplasia dell’occhio che coinvolge i retinbolasti.
2. ESCLUSIVAMENTE PEDIATRICA
a. Perché i retinoblasti sono presenti solo in età finale e prima età pediatrica, poi si diffeeranziano in
coni
b. 107 cellule
3. La perdita di funzione è oncogenica solo nei retinoblasti
4. Macchiolina biancastra, facilmente diagnosticabile
5. Tendenza marcata a dare METASTASI
6. 1/20.000 bambini
7. Singolo tumore – Sporadico
8. Tumori multipli – Ereditario
9. MUTAZIONE AUTOSOMICA DOMINANTE
La penetranza di Rb è intorno al 100%. Il paziente nasce eterozigote e dal punto di vista funzionale perde l’eterozigosi
acquisendo la mutazione anche sul secondo allele. LOH → Lost of heterozygosity
Primo HIT germinale, secondo somatico.
Negli sporadici sono entrambi somatici.
Frequenza di mutazione in ciascun allele Rb 10-6
Probabilità di insorgenza, frequenza di mutazione * alleli in cui
deve mutare * cellule suscettibili
Sporadico, probabilità = 10-5
Ereditario: 10
Alta probabilità di tumore multifocale
Si può sviluppare osteosarcoma (10%)
- Tumore che dà metastasi ad alta frequenza in età
peripuberale, a livello di diafisi delle ossa e unghie

NEOPLASIE EREDITARIE  RB, p53, VHL, APC, HNPCC,

XP, ATM, BRCA1 e BRCA2

PRIMO HIT
Mutazioni puntiforme inattivante
SECONDO HIT
Trasformazione più ampia, spesso delezione, che può avvenire per
1. Ricombinazione mitotica

a. Durante la mitosi possono avvenire eventi di ricombinazione tra i due cromatidi, generando 2
cromosomi ibridi con uno wild-type e l’altro mutato Rb e si può avere
i. Due cellule figlie eterozigoti
ii. Non disgiunzione mitotica, per cui le copie mutate possono finire in una delle due cellule
figlie, perdendo il cromosoma con l’allele wild-type e lasciando quelli con gli alleli mutati
2. Conversione genica
a. Errore di replicazione che porta a strand transfer dal cromosoma omologo
3. Delezione di tutto o parte del cromosoma
a. Caso più comune
L’alta penetranza è legata al fatto che è oncosoppressore di tipo gatekeeper, controlla l’entrata nel ciclo.
Cromosoma 13, estesa eterogeneità delle mutazioni di questo gene.
NB Le mutazioni di Rb si trovano in molti altri tipi di neoplasie, anche se somatiche. Es. Microcitomi polmonari,
tumori mammari, glioblastoma multiforme e i carcinomi vescicali
E7, codificata da HPV, può inibire Rb.
E6 inibisce p53.
Altri meccanismi di inibizione:
1. Overespressione Ciclina D1 (linfomi mantellari) → iperfosforilazione di Rb, con conseguente inattivazione
a. Cancro alla mammella sempre overespressione di Ciclina D
2. Meccanismo contrario nella perdita di p16, inibitore specifico per CDK4/6, cicline del primo checkpoint
a. La perdita di p16 o di INK4a, locus di p14 e p16I, porta allo stesso risultato
b. Aumenta l’attività delle cicline per la transizione G1-S, iperfosforilazione di Rb con su ainattivazione
3. Rare mutazioni di CDK4
4. TGF-β/SMAD controlla l’espresssione di p27
a. Non è un’inibizione specifica delle ciclina, ma generale
b. Agendo sulle cicline influisce alla fine Rb
5. P53 stesso discorso per il suo controllo di p21
Altre neoplasie associate all’ereditarietà
LI-

FRAUMENI
- Eredità di p53 mutato
- Molto rara
- Pattern complesso di neoplasie possibili
- Stesso modello delle HIT di Knudson (retinoblastoma)
o Principalmente cerebrali, mammarie, sarcomi ossei e dei tessuti molli
o Meno frequentemente corteccia surrenalica, leucemie o linfomi
- Penetranza legata all’età
o Circa 50% nei primi 50 anni
o 90% entro i 90
Sindrome di Von Hippel Lindau, VHL
Angiomi localizzati, EMANGIOBLASTOMI in genere CEREBELLARI O RETINICI.
Carcinoma a cellule chiare del rene.
La penetranza di questi tumori è espressa in questo grafico, che presenta tre curve:

1. gli emangioblastomi cellulari (CHB)

2. gli emangioblastomi retinici (RET)

3. carcinoma renale (RCC)
Emangioblastomi precosi rispetto ai carcinomi a cellule chiare del rene.
RARAMENTE feocromocitomi.
Se c’è sospetto di Li-Fraumeni o VHL per angioblastoma, bisogna fare anamnesi familiare cercando qualcosa con
sintomi simili.
La VHL è legata al gene VHL, proteine molto importante per la risposta all’ipossia.
 1. NB VHL mutata sia ereditariamente che sporadica.
2. Metà dei carcinomi a cellule chiare del rene mutazione somatica di VHL
3. Metà degli emangioblastomi perdita di eterozigosi di VHL
FAP, poliposi adenomatosa familiare
- Malattia autosomica dominante
- Seconda terza decade disseminato di lesioni poliposiche
- Diventano poi adenocarcinomi
- Catena di eventi dipendente da APC
Evento → Acquisizione mutazione APC

Lesioni adenomatose e poi adenocarcinomatose

1. Mutazioni KRAS o BRAF
a. BRAF starebbe subito sotto RAS
2. Mutazioni di SMAD2/SMAD4
3. Mutazioni p53
Fenotipo = 2 APC + k-Ras e Braf + 2 p53* se non transdominanti
Le mutazioni convergono su APC, implicato nella via di trasduzione di β-catenina, la cui mutazione altera la funzione
oncosoppressoria di tale gene.
Iperplasia → Displasia → Carcinoma
Via di trasduzione
WNT → Frizzled → GSK3b → Destruction Complex →| β-catenina
β-catenina
- In membrana a formare giunzioni aderenti
- Controllo di geni tra cui Myc
APC ha funzione oncosoppressoria, dato che fa parte del complesso che distrugge β-catenina.
Β-catenina controllando espressione di Myc è oncogenica.
WNT permette la trascrizione di Myc.
APC, axina e conduttina sono oncosoppressori del complesso di distruzione.
Osservare grafico di espressione β-catenina e APC (i triangoli).

Senza APC si troverà β-catenina fortemente espressa anche verso l’apice del villo
Possiamo trovare questa mutazione in neoplasie del colon, epatoblastomi, carcinomi dell’endometrio, carcinomi della
prostata.
APC sia nelle sporadiche che ereditarie costituisce mutazioni inizianti.
APC controlla il legame dei centromeri al fuso mitotico. Forma un dimero con EB1 che facilita l’attacco del centromero
al fuso mitotico.
Difetto di β-catenina:
- Più difficoltoso attacco del cromosoma al fuso e + alterazioni cromosomiche

HNPCC: Carcinoma Ereditario del Colon di tipo Non Poliposico

o Sindrome di Lynch
- Perdita di funzione gene MMR
- 20% dei tumori sporadici del retto
- Sedi atipiche di insorgenza → colon ascendente e vicino al cieco
- Trasmessa come tratto autosomico dominante
- Tumore ereditario più frequente in assoluto
- Tipo I colon retto, Tipo II endometrio, ovaio, stomaco, rene, cute
GENI:
1. MLH1
2. MSH2
3. MSH6

ANTICIPAZIONE RISPETTO AL TUMORE SPORADICO. Nessun link con l’anticipazione da triplette, ma

rispetto all’età nel tumore sporadico.

Difetto MMR → Molte mutazioni spontanee

Coinvolte sequenze ripetitive come quelle dei microsatelliti
Errori del numero di ripetizioni.
Geni più colpiti, Loss of function
1. Recettore 2 TGF-β
2. Bax
Diagnosi
Criteri di Amsterdam, Europa, Criteri di Bethesda, USA
1. 3+ parenti con cancro da Sindrome di Lynch
2. Almeno un parente di primo grado
3. Parenti malati almeno due generazioni successive
4. Età anticipata, sotto i 50 anni
5. Esclusa forma poliposica all’endoscopia

-cancro all'ovaio;
-cancro all'endometrio;
-cancro allo stomaco;
-cancro al rene;
-cancro all'uretere;
-cancro al tratto biliare;
-cancro all' intestino tenue;
-cancro al pancreas;
-glioma cerebrale.

Si ricerca instabilità microsatellitare → Amplificazione PCR

Y → intensità di fluorescenza
X → Lunghezza del prodotto
Perché picchi intorno al principale e non unico picco?
La polimerasi fa errori. Amplificando in vitro una sequenza, si ottiene una banda più alta e fluorescente delle altre, che
rappresenta la vera lunghezza del microstaaellite.
Le altre si chiamano Stutter Bands.

Si analizzano Cinque microsatelliti diversi

Nel tumore c’è la seconda mutazione del mmr, che ha fatto comparire l’instabilità microsatellitare. Nelle cellule
normali, lunghezza microsatellitare NORMALE.

Preleviamo i linfociti → 1 allele mutato ma senza fenotipo

Microsatelliti del tumore, risultato valido → almeno 4/5
Nel sangue normale si può trovare più di un microsatellite, perché il paziente può essere eterozigote; quindi se
avessimo due valori nel tessuto normale, nel tumore troveremmo in terzo gruppo di bande, o anche un terzo e un
quarto?
Trovati microsatelliti tumore → Immunoistochimica per geni più frequentemente coinvolti, MLH1, MSH2/6
Immunoistochimica ci dice se c’è perdita, non se sia funzionalmente attivo → possibile mutazione inattivante
Se PCR e immunoisto negativi → sano
[Fai riferimento alla tabella]

Si sequenziano esoni e regioni adiacenti nella cellula sana, con sequenze splicing.
Positivo → Lynch
Negativo → Magari negli introni, si controlla altro
Possibili meccanismi
1. Silenziamento epigenetico di MLH1 → Sporadico
2. Mutazione BRAF → Sporadico
Se è positivo, vanno informati i pazienti di primo grado.
IL DECORSO CLINICO NEI LYNCH È DETTATO SOLO DALLO STADIO DEL TUMORE, CHE HA STESSA
PROGNOSI PER LYNCH E NON LYNCH.
Lynch → +rischio di sviluppare altri tumori

Controlli
- Donne → ovario/endometrio
- Si consiglia rimozione di ovaie ed utero alle donne

XP (Xeroderma Pigmentoso)
- Basalioma
 o Prognosi piuttosto favorevole
o Si diffonde solo localmente, con metastasi locali
o Lesioni evidenti simili a ferite che non guariscono mai
o Diretta correlazione tra esposizione al sole e sviluppo di basalioma, sia XP che non XP
- Carcinoma squamocellulare
o 20%
o Forte anticipazione d’età negli XP
o No anticipazione sporadici
NB Il Bas è il tumore più frequente nella popolazione.
Gli XP sono sensibili ala luce solare e non devono essere esposti a questa.
1. Sintomi neurologici
2. Ritardo mentale
3. Alterazioni retiniche

ATM, Atassia- Telangectasia

- Malattia autosomica recessiva
- Loss of Funcion ATM
- ATM → riparazione danno double strand breaks, DSBs
- Malattia rara
Sintomi e segni
1. Atassia
a. Compromessa produzione di movimenti alternati, parola
b. Alterazione delle fibre di Purkinjie del cervelletto
2. Teleangectasia
a. Dilatazione (ectasia) porzione terminale dei vasi oculari, visibile in sclera e cute
3. Insorgenza pediatrica
4. +tumori mammari e linfoidi
5. Difetti di maturazione linfocitaria → immunodeficienza

Fattori di rischio del tumore alla mammella

1. Sesso
a. Donne +
2. Età
a. Vecchi +
3. Fattori ormonali determinanti elevati livelli estrogenici → effetto mitogenico ghiandole
a. Menarca precoce/menopausa tardiva
b. Nulliparità/Gravidanza tardiva
4. Obesità post-menopausa
5. Terapia ormonale sostitutiva
6. Ereditarietà

BRCA1 E BRCA2
Riparazione DNA ad alta fedeltà, HR.
Cromosoma 17 → BRCA1
Cromosoma 13 → BRCA2
Vengono fosforilati da ATM nella ricombinazione omologa.
Domini BRCA1
- Ring finger domain
a. Capacità di ubiquitinare, legame a BARD1
- DNA binding domain
a. Esercita funzione di riparazione
- Domini leganti p53 e Rb
a. Mediano effetti arresto del ciclo
- Domini leganti ATM e RAD51
a. Protagonisti del processo di riparazione tramite HR
BRCA2 meno caratterizzato, ma anche lui sequenze NLS per spedirla nel nucleo e domini di legame a RAD51 per
riparare il DNA.

Mutazioni BRCA
Coprono l’80% delle mutazioni familiari.
Solo nel 3% delle sporadiche.
Neoplasie con mutazioni BRCA1
Mutazione → +50-80% di sviluppare neoplasia mammaria
Insorgenza in età precoce, multifocali e a volte bilaterali.
Anche +neoplasie ovariche (15-45%)

Neoplasie con mutazioni BRCA2

Probabilità uguale mammaria.
Minor rischio ovarico (10-20%)

NB +6% tumori mammari maschi, 7 volte neoplasie prostatiche

Stessi criteri diagnostici familiari di Lynch. [Guarda immagini]

BRCA1/2 sono enormi e privi di hotspot. Diagnosticare è molto

difficile e va fatto con sequenziamento automatico o massivo.
Aneddoto: il sequenziameto Sanger del gene a fini diagnostici è
stato brevettato da un americano che ha anche fondato la
Myriad e per molto tempo ha posto delle royalty da pagare per
eseguire il sequenziamento del gene.

Prevenzione:
- Chemioterapia adiuvante → dopo chirurgia
- Chemioterapia neoadiuvante → prima chirurgia
Terapia endocrina
Es. Cancro mammella → antiestrogeni
Si fa o no in base al numero di recettori estrogeni ER o progesterone PR.
Approcci terapia antiestrogenica
1. Ablazione ovarica
a. Castrazione (anche in pazienti prostata metastatica)
b. Chirugicamente con rimozione/Radioterapia
localizzata/agonisti LHRH
c. LHRH usato anche su prostata
2. Farmaci antiestrogenici
a. Tamoxifen
i. Competizione con gli estrogeni per il recettore
3. Inibitore aromatasi
a. Donne dopo menopausa gli estrogeni vengono prodotti nel tessuto adiposo per aromatizzazione
periferica
Resistenza alla terapia antiestrogenica
1. Acquisizione mutazioni e delezioni che rendono l’attivazione del recettore indipendente dal ligando
2. Metilazione di promotori di geni antagonisti
3. Attivazione vie di trasduzione alternative
Sindromi tumorali poliendocrine: MEN (multiple endocrine neoplasia)
MEN1/2

MEN1 (o sindrome di Wermer)

1:100k
Principali ghiandole coinvolte
- Paratiroidi
- Adenoipofisi
- Pancreas, tessuto neuroendocrino
3P → Paratiroidi, Pituitaria, Pancreas
Variabile da persona a persona
Le paratiroidi sono le ghiandole più frequentemente colpite → Alterazioni iperplastiche non maligne
Adenoipofisi → Adenomi
Tumori pancreas → Endocrini
a differenza degli ESOCRINI, più maligni e SOPRATTUTO SPORADICI
Maggior parte delle manifestazioni sono benigne, ad eccezione dei GASTRINOMI
Sintomatologia → Legata al profilo secretivo delle cellule tumorali
- Adenoipofisi → GH → Acromegalia
- Prolattinomi → Asintomatica nell’uomo/Donne infertilità
- Tumori pancreativi
a. PPomi
b. Insulinomi → Shock ipoglicemico
c. Gastrinomi
 i. Sindrome di Zollinger-Ellison, molte ulcere gastriche per aumento di gastrina
- Paratormone, PTH → Nefrolitiasi (calcolosi)
Patogenetica
Perdita di funzione del gene oncosoppressore MEN1, la cui proteina è Menin.
Menin →| JunD e NF-kB
Menin →| promotore di hTERT
Menin → TGF-β tramite SMAD3 → TGF-β sopprime hTERT
MEN2
3 Sottotipi
1. FMTC
a. Forma familiare carcinoma tiroideo
b. Carcinomi midollari deriva da cellule parafollicolari (5% della
tiroide)
2. MEN2A
a. Carcinoma midollare tiroideo 100%
b. Feocromocitoma 50%
c. Iperplasia paratiroidi, piccola percentuale
3. MEN2B
a. Carcinoma midollare tiroideo 100%
b. Feocromocitoma 50%
c. Ganglineuromi
d. Abito marfanoide
MEN2A → Gain of Function COSA MOLTO RARA, ABBIAMO VISTO SOLO
ONCOSOPPRESSORI FINO AD ORA
NB Oncogeni → Subito fenotipo
Patogenesi di RET
Mutazione del recettore tirosin-chinasico RET
- Espresso su cellule di derivazione neuronale
- GDNF ligando, glial derived neurotrophic factor
Composizione RET
1. Dominio ricco di cysteine vicino membrana
2. Porzione transmembrana
3. Porzione intra con domini tirosin-chinasici
Attivazione → Dimerizzazione → 3 Pathway
1. RAS-RAF
2. PI3K
3. NF-kB
Stimolo oncogenico!
Eterodimero RET-GFRα
Corecettore GFRα
- Lega il ligando
- Non è transmembrana
- Coda lipidica ancora GPI
Sindromi legate a RET
1. MUTAZIONE GERMINALE LOSS OF FUNCTION
a. Sindrome di Hirschsprung
b. Non neoplastica
c. Agenesia plessi mioenterico/sottomucoso del tratto terminale del crasso
d. Megacolon
e. Unica L.o.F.
2. MUTAZIONI DOMINIO EXTRACELLULARE
a. Dominio di cisteine → FMTC o MEN2A
b. Si trovano anche sporadiche
3. MUTAZIONI DOMINI INTRACELLULARI
a. MEN2B
b. Si trovano anche sporadiche
c. Si trovano anche in tumori benigni di derivazione neuronale
4. Riarrangiamenti Di Ret
a. Traslocazioni intracromosomiche
b. Si chiamano PTC i partner
 c. Associata a Carcinomi Papillari della Tiroide
d. Tumori sporadici dati da mutazioni somatiche
Mutazioni puntiformi

1. Solitamente ponti disolfuro INTRAcatena

2. Se muta, rimane cisteina spaiata
3. Si forma ponte INTERcatena
Le mutazioni dei domini tirosin chinasici sono sempre
attivatorie
- Cambiano residui aa nelle sequenze consesus adiacenti alle
tirosine fosforilate
Normalmente Fosforilazione tirosina → Legano domini SH2 →
Specificità dei legami con SH2 dettata da adattatore con dominio
SH2 e fosfotirosina → AA vicino alle fosfotirosine

Cambio AA consesus → fosfotirosina legata ad adattatori diversi

dal normale
Si attivano altre vie di segnale
Caratteristiche mutazioni RET
1. Mutazioni RET altamente penetranti
a. Tutti i bambini con RET mutato → carcinoma midollare tiroide
2. Cellule tumorali contenute in organo limitato che può essere rimosso entro i 6 o i 3 in base all’aggressività del
tumore
Diagnostica tramite sequenziamento di RET
Tumori sporadici tiroide
Carcinoma midollare, 5% degli sporadici della tiroide
Carcinomi più frequenti sono di derivazione follicolare
1. Papillare
2. Follicolare
3. Anaplastico
a. No differenziazione
Prognosi: maggior parte di PAPILLARI e FOLLICOLARI guaribili
(chirurgia).
MIDOLLARI I PIÙ AGGRESSIVI, ma i più letali sono gli
ANAPLASTICI
Carcinomi papillari → Sempre sporadici, con riarrangiamenti e
traslocazioni della porzione RET → proteine ibride
PTC! I partner di traslocazione, forniscono DIMERIZZAZIONE
COSTITUTIVA
NEOANGIOGENESI TUMORALE
Qui vedete un grafico che mostrail cambiamento di alcuni parametri in funzione della
distanza da un vaso che irrora un determinato tessuto:
- La tensione di ossigeno cade a una distanza di 90μm;
- Alla stessa distanza scende la concentrazione di glucosio;
- Scende il pH;
- La concentrazione di lattato sale in modo opposto.

Ipossia → HIF1α → Fattori proangiogenici → Formazione nuovi vasi da vasi già

esistenti

Fattori proangiogenici e inibitori

1. Proangiogenici
a. VEGF-A/B/C
b. FGF1/2
2. Inibitori
a. Interferone α/β
b. Endostatina
c. Angiostatina
d. Trombospondina
e. Frammenti collagene IV
VEGFR1/2 → VEGF-A/B
VEGFR3 → VEGF-C/D
Corecettori: neuropilina NRP1/2
Attivazione VEGFR1/2 → Vasculogenesi e neoangiogenesi
Vasculogenesi: Formazione ex novo
Neoangiogenesi: Gemmazione di vasi già esistenti
VEGFR3 → Linfoangiogenesi

VEGFR2 [Grafico]
Recettore tirosin-chinasico
Dimerizza
Attiva
1. Proliferazione
2. Migrazione
3. Survival
4. Permeabilità vascolare
La neoangiogenesi tumorale genera vasi strani, aberranti, con
permeabilità aumentata.
Terapia anti-angiogenica:
1. Bevacizumab (Avastin)
 a. BLOCCA VEGF – Il ligando
b. Usato anche per degenerazione maculare della retina
2. Sunitinib (Sutent)
a. BLOCCA RECETTORE
3. Gefitinib (Iressa)
a. BLOCCA RECETTORE*
b. Dovrebbe inibire sia crescita sia ulteriore rilascio di fattori pro angiogenici

Shrinkage → Più piccolo

Cavitazione → Area necrosi interna
Migliori effetti con terapia combinata, per esempio Avastin + IFL
IFL
- Irinotecan
o Inibitore della topoisomerasi
- 5-fluorouracile
o Antimetabolita
- Leucovorina
o Antimetabolita
I trattamenti allungano la vita ma non guariscono il paziente.
Viene mostrata questa tabella dove si vedono i risultati dei trial clinici di fase 3 conclusi:
Effetti collaterali
- + fenomeno trombotici

- Perforazioni gastrointestinale
- HIF1 α attiva MET → gene invasione metastatica

METABOLISMO TUMORALE

EFFETTO WARBURG
Cellule tumorali → Metabolismo glicolitico o anaerobico anche in presenza di concentrazioni di ossigeno normali
Glucosio → Lattato → 4 moli di ATP (resa globale perché parte del piruvato fa fosforilazione oss.)
Eccezioni: DLBCL
Conseguenze di questo metabolismo
1. Tumore aumenta consumo di glucosio per mantenere ATP costante
2. Acidificazione per produzione di più valenze acide sotto forma di lattato
a. Metastasi = +Acidificazione + Invasione
3. PET → Glucosio radiomarcato con fluoro18 per trovare il tumore, combinato
con la TAC
Cause
IPOTESI: la massa si adatta a un profilo glicolitico per via dell’importanza dell’ipossia
nel suo sviluppo.

HIF1-ALFA
La regolazione avviene sulla degradazione di HIF1-α.

N-TAD
Normossia → Idrossilazione di residui di prolina in idrossi-prolina
Idrossilato costituisce punti di attacco per pVHL e permette la degradazione di HIF-1α
C-TAD
Idrossilazione residui di asparagina in normossia.
Ipossia → Punto di attacco CBP/p300, coattivatore trascrizionale.
Normossia → Non può legare il coattivatore e degrada HIF-1α

Enzimi per adattamento metabolico.

1. Lattico deidrogenasi A, LDHA
a. Isoforma lattico deidrogenasi
b. L’acido lattico verrà estromesso dalla cellula
c. Sottrae il piruvato al possibile utilizzo
2. GLUT1 e GLUT3 (recettori)
3. Esochinasi che fosforilano G in G6P
Resistenza apoptosi
1. Anti-apoptotici per le condizioni limitate di glucosio o acidificazione intracellulare, per proteggersi

Angiogenesi

Invasione metastatica
1. C-Met
2. Protein-chinasi
3. Metallo proteasi
a. Distruggono proteine della MEC e invadono i tessuti circostanti

HIF-1α È UN MARCATORE PROGNOSTICO NEGATIVO

Terapie angiogeniche → Ipossia tumorale → più espressione di HIF-1 α → possibile insorgenza di metastasi
Va possibilmente ASSOCCIATO CON INIBITORI DI MET

PATTERN DELL’ESPRESSIONE DI HIF1-α

Cellule positive più lontane dal vaso

MUTAZIONI DI ENZIMI DEL CICLO DI KREBS
1. Succinico deidrogenasi, SDH
a. Succinato → Fumarato
2. Fumarato idratasi, FH
a. Fumarato → Malato
b. Leiomiomi
Mutazione germline in tumori rari
- Feocromocitoma
- Paragangliomi (glomi aortici e carotidei)
o Deputati all’oxyigen sensing, misurazione dei livelli di
ossigeno, con HIF molto espresso
La reazione di IDROSSILAZIONE di HIF è accoppiata a
conversione di α-chetoglutarato in succinato.
Poiché le reazioni sono accoppiate
Mancanza di enzimi → accumulo metaboliti → Ritardo Idrossilazione HIF1 α
Mutazioni mitocrondriali molto rare.
SIGNALING ONCOGENICO
Myc → Controllano enzimi del metabolismo intermedio
- LDH-A
- PDK1, piruvico deidrogenasi chinasi 1
Destino del piruvato
Se viene utilizzato attraverso la piruvico deirogenasi → Metabolismo ossidativo
Espulso dalla cellula da LDH-A → Convertito in lattato
1. Piruvico deidrogenasi chinasi indotta da Myc
2. Fosforila la PDH → Inibizione
3. LDH-A + → Favorita conversione in lattato

VIE ONCOGENICHE GLICOLITICHE

Regolazione positiva della glicolisi
- Via di AKT
- P53
o Tigar/AMPK → inibizione della glicolisi
o Assemblaggio elementi della catena respiratoria
- Utilizzo del glucosio nella via dei pentosi fosfosati e NADPH
o NADPH utile in rigenerazione di molecole scavenger
Esportazione tanto citrato fuori dai mitocondri.
A livello citoplasmatico è utilizzato per produrre Acetil-CoA → Biosintesi di lipidi
Si levano dalla via catabolica dei carboni per utilizzarli nella sintesi di di acidi grassi.
Mitocondri → Nuove forme di acidi contenenti carbonio per sopprimere perdita di citrato → Glutamminolisi
VIA ANAPLEROTICA
Glutammina usata in grandi quantità!
Glutammina → Glutammato → α-chetoglutarato che ripristina il ciclo di Krebs
Ipotesi 1: Fanno metabolismo glicolitico perché rapido anche se inefficiente.
Ipotesi 2, più verosimile: il metabolismo tumorale serve a reggere le vie anaboliche, permettendo una rapida biosintesi e
proliferazione.
NB Anche le cellule sane in rapida proliferazione presentano un fenotipo di tipo Warburg identico a quello
tumorale.
d
L’invasione metastatica
Metastasi, definizione: Presenza di cellule tumorali derivate da una massa tumorale primitiva e riscontrate in un
tessuto/oragno non contiguo a quello in cui è sorto il tumore primitivo.
Tutti gli stadi IV sono stadi in cui il paziente è M+
Un tumore T0, N0, se è M+ è in stadio IV
Determinazione della presenza di invasione:
1. Aspetto microscopico
a. Osservazione preparato istologico della biopsia
2. Aspetto clinico
a. Imaging che evidenzi la presenza in organi a distanza
Organotropismo
Mammella → Metastasi ossee ed ovariche, rare a milza e reni (che però sono + vascolarizzati)
Diffusione
1. Linfatica
a. Carcinomi
b. N parametro fondamentale
2. Ematica
a. Sarcomi, carcinomi prostata, carcinomi follicolari tiroide, carcinomi renali, carcinomi epatocellulari,
melanoma uveale
3. Cavità sierose
a. Colon retto, ovarici → peritoneale
b. Polmonari, mammari → pleura

Spiegazione organotropismo
1. Teoria circolatoria
a. Caratteristiche emodinamiche diversi organi
2. Teoria del Seed and Soil
a. Affinità tra cellule e alcuni organi
Tumori mammari → CXCR4, recettore chemochina
Ligando CXCL12 → polmonare.
Melanoma CCR10
Cute CCL27

Fasi dell’invasione metastatica

1. Espansione clonale
2. Subclone metastatico
3. Adesione e invasione della membrana basale
4. Passaggio attraverso la matrice
5. Intravasazione
6. Interazione con cellule linfoidi
 7. Embolo tumorale
8. Adesione alla membrana
9. Extravasazione
10. Deposito metastatico
11. Angiogenesi
12. Crescita

Il processo di deposito/colonizzazione è il collo di bottiglia.

Le cellule devono imparare a migrare EMT!

Le cellule in movimento sono di derivazione mesenchimale.
Poi dopo EMT fanno MET.

Tgf-beta ha funzione sia oncosoprressoria sia oncogena.

Oncosoppressoria:
- Inibisce la telomerasi.
- Attiva p27 e p15.

Oncogeno:
- EMT
- -TGF-β → MET

Trattate con TGF-β → EMT

- Meno caderine e citocheratine
- Più Vimentina
Transizione EMT
- Aspetto fusiforme
- Molto mobili
- Cominciano a secernere da sole TGF-β in modo autocrino
TGF-Β NECESSARIO E SUFFICIENTE IN ALCUNI TIPI A INDURRE EMT E PER MANTENIMENTO
DEL FENOTIPO MESENCHIMALE

TGF beta prodotto da:

- Stromali
- Infiammazione
- Mioepiteliali
- Macrofagi M2!

TRANSIZIONE EMT
Perdita progressiva catenina p120
Acquisizione MMP-2, metallo proteasi della matrice → Taglia le proteine delle matrice extracellulare

Unici tumori che non rispondono a TGF-β → Colon-retto, duttali pancreas

IMPORTANTE → NELLE CELLULE TUMORALI ALCUNE MUTAZIONI INATTIVANO PARTE DELLE

AZIONI DI TGF-β
Inattivazione pathway retinoblastoma, Rb!
Si toglie alla cellula la capacità di bloccare il ciclo.
Rb:
- Over-espressione di cicline
- Perdita di geni inibitori
- Attivazione p53

Inattivato Rb → p27 (TGF-β) non può agire dato che quello era il suo effettore
Amputazione del braccio citostatico di TGF-β con Rb inattivato!
Glioblastoma multiforme/Osteosarcoma → PDGF in risposta a TGF-β, stimolazione autocrina
PDGF → Azione mitogena
TGF-β → insorgenza metastasi osteolitiche
Snail, Slug, Twist → Repressori durante l’embriogenesi → Riattivati nell’EMT come effettori nucleari finali della
trascrizione

EMT esiste fisiologicamente in

- Embriogenesi
- Infiammazione
- Maturazione dei precursori ematopoietici
- Formazione e allungamento degli assoni
- Angiogenesi

Gene MET

Recettore Tirosin-chinasico, riconosciuto da HGF.

HGF, hepatocite growth factor o scatter factor può essere espresso in tutti i
tessuti
Scattering, simile alla EMT. Differenza → scoperto con HGF
Stimoli
1. Cellule si distaccano l’una dall’altra
2. Migrano
3. Proliferano
4. Resistenti all’anoikia
a. Anoikia: quando una cellula viene staccata dai suoi substrati, es. cellula epiteliale, viene attivato un
programma di apoptosi
5. Differenziazione fisiologicamente
a. Quando a distanza si riassemblano in strutture, riprendono strutture simili a quelle di origine
Altre proteine
- Semaforine e Plexine
- Macrofagi M1 e M2 per spostarsi, ma non solo queste cellule
o Semaforine → Ligandi
o Plexine → Recettori

Pathway di Met
Recettore tirosinchinasi ingaggiato da HGF
Ingaggio → Dimerizzazione → transfosforilazione tirosina del Multifunctional Docking Site (attacco adattatori)
Docking di:
Segnale mitogenico → Grab2/Sos/Ras
Segnale pro-survival → PI3K
Motilità → GRAB1/PI3K
Branching morphogenesis (formazione strutture di partenza)→ PLC- γ o Stat

Regolazione Met
Fosforilazione tirosine, Y1234, Y1235 → Attivazione
Fosforilazione serina S985 → Inibizione

Met è uno degli oncogeni più potenti!

Non conviene averlo sempre acceso, ma modularlo.
Meccanismo più comune → Overespressione di Met (pancreatici, ovarici, gastrici, esofagei, tutti i più aggressivi)
Stimolazione autocrina in Osteosarcomi, rabdomiosarcomi e alcuni carcinomi mammari

Evento critico attivazione → Dimerizzazione, che viene facilitata dal ligando che crosslinka i recettori O stocastica se
tanti recettori in membrana
+ recettori + attivazione

Oncogene Expdience: bisogno transitori di attivazione, a differenza dell’addiction, bisogno costitutivo.

Carcinomi gastrici e carcinomi della papilla renale, rari tumori ereditari
Mutazione monoallelica con perdita di funzione di oncosoppressore
Perdita di funzione si oncosoppressore ma eccezioni con mutazione di Met, appena vista, e Ret.
Mutazione con guadagno di Met si trova anche nel carcinoma della papilla renale sporadico e alcune forme pediatriche
di carcinoma epatocellulare.

Meccanismo frequente base di Oncogene Expedience → HIF1 α

HIF1 Α ATTIVA Met!!!
Promotore di Met lega HIF1 α e attiva costitutivamente Met

Farmaci anti-angiogenici possono attivare Met, effetto paradosso.

Stabilizzazione HIF1 α in ipossia → Met

Met Controlla PAI1 e COX2 → Processo emostatico

1. PAI1
a. Inibitori dell’attivatore del plasminogeno
i. La plasmina media la fibrinolisi, processo che rimuove i coaguli formati, tagliando la
fibrina
ii. Plasmina forma attiva di un enzima proteolitico attivato dal taglio proteolitico da parte del
plasminogeno
iii. AUMENTO DI COAGULI!
2. COX2
a. Cicloossigenasi
b. Adesione e aggregazione piastrinica +
c. Inibita da antiaggreganti (cardioaspirina o plavix)
d. +coaguli

Entrambi EFFETTO PROTROMBOTICO.

Aumento di trombi:
- Proteggere la cellula tumorale invasiva, nido trombotico
- Può guidare la metastasi una volta che la cellula va ad extravasare nella migrazione verso i tessuti adiacenti
Cfr. Tromboflebite migrante → Tipica del paziente metastatico
d

Proteine che mediano la motilità indotta da Met

- Diminuire adesioni omotipiche
- Favorire eterotipiche

-caderine +integrine
1. Caderine → tra epiteliali
a. Anche via di trasduzione che controlla fenomeni di motilità dell’actina
i. Tramite catenine e vinculine
b. Carcinomi metastatici → perdita di funzione o espressione caderine
c. Melanomi → switch del tipo di caderina, da E a N, che facilita adesione cellule stromali
d. Legame cellule adiacenti → antiproliferativo, inibizione da contatto
2. Integrine → stroma o matrice extracellulare
a. Catena α e β
i. β1 → Matrice extracellulare, laminina e collagene
ii. β2 → Cellule leucocitarie
iii. β3,5,6,8 → Recettori RGD (es. fibronectina)
b. Melanomi switch verso α4β1, interazione con derma e tessuti circostanti
c. Signalling
i. FAK, chinasi di adesione focale → paxillina e talina per riarrangiamenti citoscheletrici che
danno motilità alla cellula
ii. Ras/Raf/MAPK
iii. PI3K/Src
3. Proteasi della matrice → Digestione proteolitica matrice
a. Serin proteasi
i. Attivatori del plasminogeno, PA
ii. tPA tissutale
1. Fibrinolosi
iii. uPA urochinasico
1. Oncologico in corrispondenza degli
invadopodi e secreto dalle cellule
stromali
 2. Correlato a invasività dei tumori
iv. Inibitore Serpina
b. Metalloproteasi di matrice, MMP
i. Atomo di Zn

ii. Collagene IV
iii. Inibitori TIMP
iv. Rilascio di fattori di frescita
v. Smascheramento di siti di legame legati alla neoangiogenesi per es. angiostatina
vi. Distacco fra cellule epiteliali per clivaggio di E-Caderina
vii. Degradazione di CD44 → distacco di cellula tumorale dalla matrice
viii. Tramite MT1-MMP, membrane tater, degrada la membrana basale
c. Inibitori
i. Serpine (PAI)
ii. TIMP, inibitori tissutali delle metalloproteasi
iii. Gli invadopodi che legano queste metalloproteasi li concentrano su alcuni punti della
membrana plasmatica. Portano lattato o valenze acide di modo che in questi punti il pH sia
acido.

Disseminazione vascolare e formazione delle micrometastasi

Micrometastasi, definizione: colonie estremamente piccole e non visibile con le normali tecniche di imaging, a livello
soprattutto di midollo osseo e linfonodi locoregionali drenanti il territorio di sviluppo della massa primitiva.

1. Arresto in un vaso del microcircolo

2. MET → aggreggati piastrinici con adesione all’endotelio
3. Microtrombo nel punto di arresto
a. Attivazione della trombina cliva anche citoadesine
4. Membrana basale degradata

Selectine
1. Interazione eterotipica
2. Alcuni tumori esprimono specifiche selectine

CD44
1. Citoadesina espressa dai linfociti T
a. Marcatore di staminalità in tumori epiteliali
2. Interazione con componenti della matrice
a. Collagene, fibronectina, laminina acido ialuronico
3. Cellule di alcuni tumori al massimo grado di invasività overesprimono
spesso CD44 o varianti di splicing
 a. Le varianti possono essere usate come marcatori
4. Diverse isoforme → Diverso potere metastatico

Rilevazione
- Aspirato midollare (es. creesta iliaca)
- Biopsia linfonodale per cellule positive a EpCAM
o Istologico: dotti anomali
Rilevazione di micrometastasi nel midollo osseo metodica invasiva ma miglior fattore prognostico.
1/3 dei cancri della mammella micrometastasi da qualche parte anche se poche danno luogo a vere metastasi.

Perché tante micrometastasi a livello osseo?

- Ambiente protetto
- Meccanismo
o Il riassorbimento osseo rilascia serie di fattori nel microambiente che vengono captati dalla cellula
tumorale
 PDGF e IGF1 → Effetto mitogenico
 FGFs
 BMP
 Ca2+ e TGF-β
D

Neoplasie causate da agenti infettivi

1. Lungo periodo di latenza tra esposizione e insorgenza tumore

2. Cellule tumorali spesso non producono particelle virali per latenza
3. Patogeni ubiquitari, ma pochi sviluppano tumore
4. Agenti come cancerogeni indiretti

Sarcoma di Kaposi → HHV-8

POSTULATI DI KOCH

1. Patogeno deve essere isolato dalle lesioni cancerose

2. Coltivabile in vitro
3. Reinoculato in animale, deve portare patologia simile a quella umana
4. Nuovamente isolabile nel modello animale

IARC, Classe 1°
1. Helicobacter Pylori
a. Carcinomi gastrici e linfomi gastrici dal MALT
2. HPV
a. Carcinoma cervice uterina
3. HBV/HCV
a. Carcinoma epatocellulare
4. EBV
a. Linfomi non Hodgkin
b. Linfomi Hodgkin
c. Carcinoma naso-faringeo
d. Carcinoma gastrico
5. HTLV-1, virus della leucemia umana alle cellule T di tipo 1
a. Leucemia umana alle cellule T di tipo 1
6. HHV-8, KSHV
a. Sarcoma di Kaposi
7. Virus del carcinoma alle cellule di Merkel
8. Virus del polioma
9. Tumori associati a infezioni parassitarie

Caratteristiche
1. Infezione persistente
2. Strategie per evasione → latenza
HELICOBACTER PYLORI
30-50% nella popolazione globale
Sudamerica 90%
Europa 30%
Italia 50%

Ruolo patogenetico nelle ulcere gastriche

Mostra poca sopravvivenza in ambiente gastrico MA:
- L’ur
ea prodotta tampona l’acidità gastrica

Responsabile
1. 80% delle ulcere gastriche

Ruolo oncogenico di H. pylori e carcinoma gastrico

Prevalente in Cina e Giappone
Gastrite Acuta → Cronica → Atrofica → Metaplasia → Ipocloridia → Displasia → Carcinoma Gastrico

CAG, citotoxin associated gene:

1. Sistema secretorio di tipo IV
a. Serve a iniettare nelle cellule dell’epitelio di rivestimento gastrico
b. Tossina vacuolante VacA
Meccanismo oncogenico
1. Adesina batterica, CagL con α5β1 cellulare
2. CagA → Fosforilate dalle tirosin chinasi Src e Abl una volta inserite
3. FosfoCagA → Forma attiva della tossina, interagisce con domini SH2, dando avvia alla cascata di Ras e
MAPK
4. Rimanenti prodotti → Azione citotossica

Variabilità di CagA
Tipi A e B → Tutti i batteri
Variabili a livello consesus
Quelli asiatici sono più agressivi per la loro CagA molto più potente nel legare
SHP2 e attivare Ras

Altre fonti di variabilità

SNPs, single nucleotide polymorfisms, vicino al dominio RGD di CagL,
rendendola più o meno affine all’integrina

Hanno anche
1. Fosfolipasi
a. Distruggono membrana cellule epiteliali
2. Fattore attivante le piastrine
a. +adesione piastrinica
b. Microtrombi
c. Necrosi
3. LPS
a. Infiammazione

Diagnosi
1. Prelievo bioptico
a. Colorazioni
b. Ureasi
2. Urea Breath Test
a. Urea marcata con C14
b. Scissa dall’ureasi e troviamo CO2 radiomarcata
3. Ricerca Ig
Terapia
1. Tetraciclina, Amoxicillina, Metronidazolo

HTLV-1
Unico retrovirus in cui sia stata dimostrata l’oncogenicità

Tramissione → Contatto sessuale/Sangue infetto

HTLV-1 epidemiology: 15-20 mililion people infected

worldwide; endemic areas in central africa, southern-central
america, japan, iran, new guinea

Quadri patologici
1. Leucemia a cellule T dell’adult
a. Neoplasia estremamente maligna
b. Sia organi linfoidi sia sangue periferico
c. Localizzazioni nodulari più o meno diffuse a livello di cute
i. Micosi fungoide
ii. Sindrome di Sèzary, variante di neoplasia leucemica linfomatosa
iii. CD3+, CD4+, CD8- , CD25+, FOXP3+, simili alle T reg
d. Flower Cells → Nucleo multilobato che ricorda petali di fiore
Modalità di trasmissione e quadro clinico
Patologia si manifesta + con particolare modalità
Ci sono
1. Trasmissione sessuale
2. Sangue
3. Perinatale
a. Eliminare l’allattamento al seno, consigliando quello artificiale alle sieropositive
b. Prevalenza

2. TSP, tropical spastic paraparesis, HAM, HTLV-1 associated Myelopathy

a. Malattia degenerative su base autoimmune
b. 3% infetti anche qui, latenza clinica più breve, mesi o pochi anni
c. Prevalenza negli infettati in età adulta
i. Contatti sessuali
ii. Emoderivati (latte, linfociti del liquido seminale)
d. Dovrebbe poter infettare moltissimi tipi cellulari, ma in vivo c’è restrizione del tropismo
e. Possiamo trovare malattie infiammatorie croniche
i. Uveiti, dermatomiositi
f. Demielinizzante che interessa soprattutto midollo spinale toracico e probabilmente su base
autoimmune
g. Elevata presenza di linfociti T citotossici che riconoscono diverse proteine virali, tra cui TAX, che
stimola forte risposta CTL → Distruzione SNC
h. Difficoltà nel camminare, difficoltà nel controllo sfinterico, impotenza
Integrazione virus
Integrazione sotto forma di provirus in tutte le cellule leucemiche o linfomatose → integrazione monoclonale, stesse
posizioni → leucemia derivata da unica cellula trasformata, ma diverso tra pazienti

TAX
No v-onc propriamente detto, ma c’è TAX
TAX attiva a distanza molti geni
- NF-
kB
- CRE
B
TAX → Enhancing, stimolazione della trascrizione virale

Senza TAX il virus si trascrive a livelli molto bassi, quando TAX proteina viene prodotta questa ritorna insieme ad altri
cofattori sul promotore virale delle regioni LTR e attiva circa un migliaio di volte il rating di trascrizione virale. Quindi
c’è un effetto sulla trascrizione virale e questo è mediato dall’interazione tra questi attivatori CREB cellulari e i fattori
della via cellulare. L’Nf-kb è un'altra via attivata da TAX che non è importante per l’attivazione della trascrizione
virale, ma lo è per l’attivazione di vie oncogeniche nella cellula bersaglio.
Ci sono quindi degli effetti trascrizionali relativi all’attività di TAX che inducono l’espressione, a livello trascrizionale
di una serie di geni bersaglio, però ci sono degli altri effetti non trascrizionali che sono dovuti alla capacità di TAX di
interagire con altre proteine che non controllano direttamente l’espressione genica, ma controllano per esempio dei
checkpoint critici del ciclo cellulare, e di questi gli esempi più importanti sono quello di p-16 inibitore del ciclo
cellulare. TAX interagisce con p-16 inibendola, quindi ha un effetto di facilitazione del passaggio nel checkpoint G1/S;
essa interagisce mediante un effetto inibitorio con MAD1 (qui si intende MAD implicata nel checkpoint anafasico).
MAD 1 e MAD 2 sono due delle proteine che si assemblano a livello del centromero per costruire lo spindle assembly
checkpoint (SAC), esso attraverso una serie di reazioni di controllo con cleavage proteolitico media un controllo sulla
degradazione della coesina, che è quella proteina che tiene insieme i cromatidi fratelli.
TAX inibisce MAD 1 e rilassa questo controllo anafasico, permettendo la partenza dell’anafase anche quando non tutti i
cromosomi sono ben condensati, allineati. Quindi questa proteina oltre a riprogrammare l’espressione della cellula
bersaglio rende il ciclo più veloce: è così più facile per le cellule entrare in ciclo, e ha un effetto destabilizzante a livello
cromosomico perché i difetti del controllo anafasico si ripercuotono in aneuploidia. Non sono piccole mutazioni, ma
delle grosse aberrazioni cromosomiche che infatti sono presenti nelle cellule ATLL, che hanno un nucleo multilobato e
in genere un patrimonio genetico fortemente aneuploide. Dunque TAX induce aumento di proliferazione, ridotta morte
cellulare e aneuploidia, che facilita l’acquisizione di mutazioni ulteriori da parte delle cellule infettate.
HBZ
Dal punto di vista della trasformazione neoplastica ci sono molte proteine virali, due però sono quelle più importanti,
una è TAX l’altra è una proteina studiata più di recente che si chiama HBZ che è codificata sul filamento negativo del
virus, tutte le altre sono codificate dal filamento positivo ed espresse attraverso meccanismi soprattutto di splicing
alternativo; HTLV-1 genera una quindicina di messaggeri diversi con splincing alternativo. HBZ è espresso dal
filamento negativo, quindi in direzione antisenso, per questo motivo ha due funzioni:
1. come RNA non codificante, quindi già l’RNA trascritto da questo gene ha un effetto mitogenico e questo si
esercita soprattutto attraverso la stimolazione della via di E2F1;
 2. effetti di HBZ proteina che ha la capacità di attivare alcune vie mitogeniche sempre legandosi a questi fattori
trascrizionali AP1 della famiglia di Jun, e ha un effetto anche sull’espressione virale di inibizione della
capacità di TAX di attivare il promotore virale e il filamento positivo.
Questo è il genoma del virus, le due LTR, il promotore del filamento positivo che codifica tutte le proteine virali tranne
HBZ, e poi TAX che insieme ai fattori trascrizionali CREB dà questo effetto di potenziamento molto importante della
trascrizione virale. Quello che succede è che HBZ può formare anche dei complessi con CREB sottraendolo
dall’interazione con TAX, si tratta di un’interazione di tipo inibitorio. Quindi HBZ ha la capacità di silenziare
l’espressione di tutti i geni virali codificati dal filamento positivo. Per lo meno in una metà dei casi di ATLL, cioè di

cellule leucemiche in pazienti che sviluppano questa patologia, l’unico gene virale che è espresso è HBZ. Il significato
di tutto questo è ancora in corso di studio, ma un’ipotesi che è abbastanza accettata e consolidata è che questo sarebbe
un meccanismo che il virus ha per evadere la risposta immunitaria del paziente. Il sistema immunitario riconosce molte
proteine virali e reagisce in modo estremamente rigoroso a queste proteine che sono quasi tutte immunogeniche: quelle
strutturali e TAX sono estremamente immunogeniche, HBZ invece è molto poco immunogenico. Quindi questa
potrebbe essere una strategia che il virus ha per far propagare le cellule infettate, perché ha degli effetti mitogenici,
minimizzando la riconoscibilità immunologica di queste cellule infettate. È una specie di “meccanismo di latenza” in
cui il virus esprime invece di tante un’unica proteina, naturalmente non può fare particelle virali perché le proteine
strutturali sono tutte codificate sul filamento positivo. Effettivamente se si costruisce un topo transgenico in cui si
controlli l’espressione di TAX o HBZ con un promotore T cellulare, nel topo si sviluppa una leucemia linfoma a cellule
T che somiglia molto all’ATLL, quindi ciascuno dei due
protoncogeni da solo dà leucemia linfoma. Non c’ è dubbio
sul fatto che siano proteine con un grande potenziale
oncogenico.
Questa diapositiva indica una caratteristica molto importante
della strategia replicativa di questo virus che è la cosiddetta
propagazione mitotica. Quando si pensa ad un’infezione
virale e alla propagazione di un genoma virale in genere ci si
riferisce alla modalità infettiva, in cui un virus infetta una
cellula bersaglio, replica il proprio genoma tante volte e fa
particelle virali che escono da questa cellula infettata magari
anche uccidendola, andando poi ad infettare nuove cellule
bersaglio. L’HTLV usa una strategia molto atipica, ma che è
molto frequentemente riscontrata in questi virus oncogeni, ed è
la propagazione mitotica, nel senso che il virus infetta una
cellula bersaglio, si scapsida, il genoma virale viene retro
trascritto e si integra nel genoma della cellula. Fin qui tutto
normale, poi però la strategia replicativa del virus, invece che essere basata sulla generazione di nuove particelle virali
che andranno a infettare altre cellule, è basata sul fatto che questo retrovirus integrato stimola la proliferazione e la
sopravvivenza delle cellule infettate, e quindi usa la cellula infettata per propagare il proprio genoma.
E in effetti, questo modello è sostanziato dall’evidenza incontrovertibile che HTLV-1 fa pochissime particelle virali, sia
se lo si coltiva in vitro, sia se lo si va a vedere su un paziente. Questa modalità di propagazione mitotica, che quindi
utilizza l’apparato replicativo della cellula ospite, più che le polimerasi virali, ha la caratteristica di avere una bassissima
variabilità genetica, identica a quella del DNA umano, e questo perché il virus è replicato dalle polimerasi umane.
Invece un virus che è replicato attraverso il macchinario replicativo virale, soprattutto se è un retrovirus, avrà una
variabilità genetica molto elevata (es. HIV), si parla per questo di “quasi specie” nello stesso individuo. La diversità e
instabilità genetica è dovuta al fatto che le DNA polimerasi umane presentano 1 errore ogni 10^9 nucleotidi, mentre
nella trascrittasi inversa c’è un errore ogni 10^5 nucleotidi, con una differenza di 10^4 possibilità di errore tra una
trascrittasi inversa e una Dna polimerasi umana.
Per molti anni, molti gruppi di ricerca hanno dimostrato in modo molto solido che HBZ e HTLV-1 sono molto
oncogenici ed hanno chiarito i meccanismi con cui esprimono questo potenziale oncogenico. Tuttavia resta il fatto che
la leucemia insorge solo nel 3% degli individui infettati, e lo fa dopo decenni. Questo vuol dire che se è vero che se si
prende una proteina e la si mette in un topo transgenico provoca sempre la leucemia, nell’uomo ciò non succede, quindi
devono esserci dei meccanismi che in un modo o nell’altro controllano il potenziale oncogenico di queste proteine.
Infatti un’ipotesi portata avanti per anni è stata che l’Hallmark, cioè la caratteristica distintiva dell’infezione da HTVL-
1, non è l’oncogenicità, ma è la persistenza del virus nel paziente, per tutta la sua vita senza causare patologie. (Sul fatto
che causi l’ATLL non vi è dubbio, in quanto non esiste ATLL senza infezione virale)
Quindi su questa ipotesi si è “aperta la caccia” alle proteine anti-oncogeniche che possano effettivamente
controbilanciare il processo di patogenicità del virus.
Un esempio di queste proteine è la p13, chiamata così perché ha una dimensione di 13 KDa, ed è codificata dal genoma
virale.
La cosa intrigante di questa proteina è che si localizza a livello mitocondriale, in particolare a livello della membrana
interna del mitocondrio, dove, in maniera
ancora ignota apre un canale per K.
Naturalmente se si apre un canale per K
nei mitocondri energizzati, che sono
negativi (hanno una matrice negativa
rispetto all’esterno) si avrà un flusso di
K+ dentro il mitocondrio. Questo flusso
di K+ depolarizza, attivando
automaticamente la catena respiratoria
che, bruciando più substrati trasporta più
elettroni e esclude più protoni dalla
matrice.
Riassumendo, alla fine il mitocondrio ha
questo “buco” nella membrana interna,
all’inizio il flusso di K+ è compensato
dalla catena respiratoria, perché si
dispone di substrati che mantengono così
il potenziale di membrana stabile (entra 1
K+ ed esce un protone). Tutto questo
avviene a spese di una maggiore attività respiratoria della catena respiratoria, la quale produce, di conseguenza, più
specie reattive dell’ossigeno. Il trasporto di elettroni lungo la catena respiratoria è associato ad uno scivolamento di
elettroni che, con un rating del 10-15% finiscono sull’ossigeno molecolare generando un superossido. Tra le specie
reattive dell’ossigeno (ROS) la più abbondante è l’H2O2, perché è più stabile rispetto agli altri ROS ed attraversa le
membrane cellulari passando da un comportamento all’altro e anche nell’ambiente extracellulare. In genere, le ROS
sono considerate specie tossiche, ma a bassi livelli funzionano come dei secondi messaggeri cellulari, cioè prendono
parte al signalling intracellulare. Questo si esplica soprattutto nel controllo della formazione di ponti disolfuro e
proteine, le ROS intervengono andando a modificare lo stato di multimerizzazione di una proteina o la sua
conformazione.
I meccanismi di questo tipo più importanti sono l’attivazione della via dell’NF-kB (via di survival soprattutto nei
linfociti) e l’inattivazione di PTEN per ossidazione. PTEN è una fosfatasi che converte PiP3 in PiP2, così viene
bloccata la via dell’AKT.
L’ossidazione dunque a volte ha effetto attivatorio per certi pathways, altre volte inattivatorio.

TEORIA DEL REOSTATO = teoria sulla funzione dei ROS

 Il reostato è uno strumento
elettronico che controlla la
resistenza di un circuito che
viene utilizzato comunemente
in tutti gli strumenti in cui
bisogna regolare volumi (es.
radio, tv). A seconda dei
livelli di settaggio delle specie
reattive dell’ossigeno, che
sono omeostaticamente
regolati in modo molto preciso
in diversi tipi cellulari,
possono mediare diversi
fenomeni biologici.
Generalizzando, nella maggior
parte delle cellule normali
differenziate e quiescenti ci
sono dei livelli molto bassi di
ROS. Se si alzano
leggermente questi livelli di
ROS si induce un effetto di
tipo mitogenico.
Nelle cellule tumorali, invece si riscontrano elevati livelli di ROS rispetto ai livelli delle cellule normali da cui il tumore
deriva, infatti leucemia T ha livelli più elevati rispetto ai linfociti normali. Un ulteriore aumento di questi livelli è in
genere associato all’attivazione di una via di morte cellulare per apoptosi. Questo vuol dire che per varie ragioni le
cellule tumorali hanno questo set point di ROS molto alto, vicino a quel limite oltre il quale la cellula muore.
Se tutto questo modello risulta vero si potrebbe fare delle predizioni sulla funzione di questa proteina virale in funzione
del tipo cellulare su cui si esprime.
In pratica l’espressione di p13 sui linfociti T normali dovrebbe avere effetto attivatorio mitogenico, mentre invece
teoricamente la sua espressione su cellule neoplastiche dovrebbe avere effetto pro-apoptotico.
Il significato di questo effetto riguarda proteine virali come TAX e HBZ che hanno effetto mitogenico e anti-apoptotico,
esse favoriscono l’espansione del pool di linfociti infettati, però soprattutto TAX ha anche un effetto che induce
instabilità genomica, inducendo quindi l’insorgenza di cellule trasformate leucemiche, e la funzione di p13 potrebbe
essere, nel contesto di linfociti normali, un effetto cooperativo con quello di TAX, favorendo un’espansione mitotica
delle cellule infettate. Se a causa dell’effetto mutagenico di TAX, una cellula o alcune cellule con mutazioni genetiche
diventano leucemiche, quindi con un livello di settaggio ROS più elevato, l’espressione di p13 sarebbe come la valvola
di sicurezza di una pentola a pressione, ed eliminerebbe queste cellule. In effetti questo potrebbe contribuire a spiegare
quello che si vede nella maggior parte dei pazienti infettati che non hanno leucemia o linfoma, ma hanno un pool
monoclonale o oligoclonale di cellule infettate con il virus dentro.
Aumentando i ROS si induce l’apoptosi della cellula. Se i ROS vengono mantenuti a livelli bassi si ha la via di survival
e si attivano vie mitogeniche.
La cellula viene eliminata se è eccessivamente proliferante.

HPV: Human PapillamaViruses

 Trasmissione sessuale.
 Verruche o carcinoma all’utero.
 Piccoli virus a DNA
 Non-envelope
 Epitelio Tropici, diverso epitelio in base al tipo
1, 2, 4, 7 verruche
16-18-31-33 Carcinoma cervice uterina
Infezione strati basali → switch di proteine prodotte quando le cellule salgono →
La displasia è divisibile in 3 gradi, CIN
Grado 1  Grado2  Grado 3  Carcinoma
Grado 2 può diventare 1
1 può sparire
grado 3, invece si ha una tendenza maggiore a produrre carcinoma
No strumenti per distinguere chi
- Da 3
a carcinoma
- Da 3
a2
DNA doppio filamento circolare
Forma episomica nella maggior parte delle lesioni
I pattern di integrazione sono tutti uguali nello stesso paziente, ma diversi in pazienti diversi, stesso concetto vale anche
per i punti di rottura.
Nella maggior parte dei casi colpiscono tutti un gene virale, che è la proteina E2
I geni di HPV sono tutti indicati con una lettera
E (Early), fasi precoci
L (Late), tardive
L, capsidiche strutturali che sta ad indicare se quei geni sono espressi nelle fasi precoci (strato basale epitelio) o tardive
(strati differenziati superficiali). Le proteine E sono tutte regolatorie, mentre le L sono proteine capsidiche strutturali. La
rottura del gene E2 dà un vantaggio selettivo alla cellula, perché E2 è regolatoria e funziona reprimendo l’espressione di
altri due proteine regolatorie del virus, che sono E6 e E7. Queste sono proteine virali oncogeniche che inibiscono gli
oncosopressori cellulari.
È stato evidenziato che l’inibizione di RB da parte di E7 di per sé sarebbe insufficiente a spingere il processo di
trasformazione tumorale, perché le cellule con RB inattivato funzionalmente dall’E7 hanno un fenotipo di elevata
proliferazione; le cellule entrano in fase S facilmente, non vi è più quel meccanismo di controllo della transizione alla
fase S, e non rendono più necessaria l’attivazione dei meccanismi di controllo sulle cicline. Questa proliferazione
elevata ha un effetto di stress replicativo, così viene innescata la via di riconoscimento del danno al Dna (DDR), che
attiva ATM che fosforila p53. Stabilizzando p53, questa andrà a bloccare il ciclo di queste cellule ed eventualmente le
porterà in apoptosi.
Quindi il blocco della risposta oncosoppressiva richiede l’inattivazione sia di RB da parte di E7 che di p53 da parte di
E6. Addirittura i diversi tipi di HPV sono oncogenici o non se i loro E6 e E7 lo sono o meno.

Poi ci sono altri fattori, per esempio:

 Polimorfismi della p53: polimorfismo
sul codone 72, al posto di una prolina
c’è un’arginina, rendendo così p53 più
suscettibile alla degradazione da parte di
E6.

Altri fattori di rischio, evidenziati a livello

epidemiologico, per lo sviluppo del cancro alla
cervice uterina sono:
- il fumo di sigaretta;
- seppur poco compreso, anche la risposta
immunitaria è fondamentale come fattore
di rischio, perché anche nelle pazienti infettate con HPV ad alto rischio nella maggior parte regrediscono e non
sviluppano cancro alla cervice uterina.
Da ricordare che questi HPV ad alto rischio lo sono anche per lo sviluppo, con una penetranza molto minore, del
cancro del pene nell’uomo.
Vaccinazione
Si può pensare di eradicare questo tipo di tumore con un approccio di tipo vaccinale. Quelli più ampiamente utilizzati
sono basati sulla produzione di VLP, virus like particles, prodotte in vitro costruendo particelle strutturali del virus
come L1. Questa ( L1) viene prodotta con tecnologie del DNA ricombinante in laboratorio e può essere assemblata in
capsidi che somigliano ai capsidi virali. Quindi si immunizza il paziente utilizzando capsidi vuoti contenenti solo la
proteina L1.
La composizione dell’L1 varia nei due vaccini che vanno per la maggiore:
- il GARDASIL, attualmente in uso nel nostro paese è un vaccino quadrivalente che oltre ad avere i due famigerati
HPV 16 e 18 che sono i più rischiosi, ha anche gli HPV 6 e 11 che hanno una certa diffusione nella popolazione;
- il CERVARIX più usato nel Regno Unito, ha soltanto gli HPV 16 e 18.
- Il GARDASIL 9 non è ancora nella pratica di routine, ma ha addirittura la L1 di nove tipi diversi di HPV. Questo
perché è stato evidenziato come la copertura vaccinale ottenuta con questi vaccini è molto potente ma è tipo
specifico, motivo per cui le compagnie farmaceutiche stanno sviluppano vaccini sempre più complessi con una
protezione sempre più ampia per vari tipi di HPV ad alto rischio.
La vaccinazione viene fatta in un’età compresa fra i 9 e i 13 anni perché il concetto è che sia effettuata prima che inizi
l’attività sessuale.
In conclusione il punto di intervento più precoce è la vaccinazione, in modo da far sviluppare una risposta immunitaria
che blocchi la primissima fase in cui il virus infetta le cellule dell’epitelio basale. Se da un lato è chiaro il ruolo
protettivo nei confronti dell’infezione, dall’altro non ci sono ancora i dati di tipo epidemiologico di queste campagne
vaccinali sulla frequenza del cancro alla cervice uterina. Questo è dovuto alla latenza clinica di molti anni tra l’infezione
e lo sviluppo di cancro, quindi si dovrà aspettare ancora 15-20 anni per vedere a livello epidemiologico quanto calerà la
frequenza di cancro alla cervice uterina.
Lo screening che ha funzionato, pur essendo così primitivo e semplice, in modo egregio dagli anni 30 ai giorni nostri
(nel senso che ha prodotto dei risultati epidemiologici molto significativi) è mirato a decretare cellule esfoliate dagli
strati superficiali del paziente.

L’ultimo approccio usato tutt’ora, poco efficace mirato al trattamento

del carcinoma è una terapia essenzialmente di tipo chirurgico o
chiurgico-radioterapica, pur restando la prognosi dei pazienti con
cancro al collo dell’utero, in genere, non favorevole.

EBV o VIRUS DI EPSTEIN-BARR

Il virus di Epstein-Barr o EBV è stato il primo virus oncogeno umano
ad essere scoperto ed è un virus herpetico, delle gamma herpesvirinae.
Il genoma è lineare a doppio filamento con genoma di 172 kb e
tropismo ristretto all’uomo. La prevalenza dell’infezione è altissima: oltre il 90 % della popolazione adulta è EBV
positivo; la trasmissione è molto facile ed efficace, avviene tramite la saliva o tramite sangue o emoderivati, ma
quest’ultima modalità è molto meno frequente. I picchi di infezione sono due: uno in età pediatrica e una in quella
adolescenziale.
Come tutti i virus herpetici ha la caratteristica di entrare in latenza anche per tutta la vita del paziente in un particolare
tipo di cellula, che nel caso dell’EBV sono i linfociti B.
Che cosa causa l’infezione da EBV?
La manifestazione patologica dopo l’infezione asintomatica è la mononucleosi infettiva, una malattia caratterizzata da
proliferazione policlonale di linfociti B di elevate proporzioni. Infatti dal punto di vista clinico, questa malattia ha molte
caratteristiche che possono portarla ad essere confusa con una leucemia acuta o con un linfoma perché il paziente
sviluppa una sintomatologia similare rappresentata da febbre, sudorazioni notturne estremamente profuse e perdita di
peso molto cospicua. Possono svilupparsi, inoltre, fenomeni come linfoadenopatie, linfonodi ingrossati, milza
ingrossata, tutte manifestazioni che assomigliano moltissimo a dei linfomi o a leucemie.
Infatti la diagnosi a volte è possibile solo perché il paziente sviluppa una reazione rappresentata dall’emoagglutinazione
di emazie di cavallo: il siero di questi pazienti agglutina gli eritrociti di cavallo perché vengono attivati talmente tanti
cloni che a un certo punto questi iniziano a produrre anticorpi contro qualche antigene presente sulle emazie di cavallo
per pura combinazione.
Questa proliferazione policlonale a un certo punto scompare e il paziente guarisce, perché il sistema immunitario
sviluppa CTL specifiche per le cellule infettate, uccidendole.
Quindi il virus ha fondamentalmente un effetto mitogenico e immortalizzante: infatti viene utilizzato tutt’ora per
immortalizzare i linfociti B normali di un paziente che si vuole studiare. I linfociti B vengono isolati dal sangue
periferico e messi in vitro, però in questa condizione morirebbero subito, quindi vengono infettati con particelle di
EBV, si immortalizzano e crescono in modo indefinito.
La mononucleosi infettiva è una malattia in cui la neoplasia è eradicata dal sistema immunitario, mentre gli altri sono
esempi di malattie francamente neoplastiche in cui il sistema immunitario non eradica le cellule tumorali e il paziente
sviluppa la neoplasia. Questi sono il linfoma di Burkitt, il carcinoma naso-faringeo, DTLD che sono malattie
linfoproliferative nei pazienti trapiantati e il linfoma di Hodgkin che è associato in una metà dei casi a infezione con
EBV.
Linfoma di Burkitt
Scoperto soprattutto in determinate aree equatoriali e subequatoriali caratterizzate dall’elevata frequenza
epidemiologica di questo tipo di neoplasia, si manifesta in questi paesi soprattutto in età pediatrica. Si presenta in
associazione con l’elevata incidenza del parassita della malaria per cui si denota una coincidenza geografica tra linfoma
di Burkitt e malaria, considerata cofattore essenziale.
Questo linfoma di Burkitt, noto come linfoma endemico ha delle caratteristiche peculiari ed è quasi sempre positivo a
EBV. Questo implicitamente fa intendere come il linfoma di Burkitt non è presente solo in queste regioni dell’Africa e
del Sud America, ma c’è anche un po’ in tutti i paesi, dove però è molto più raro e non è una neoplasia esclusivamente
pediatrica, anzi è più frequente negli adulti: linfoma di Burkitt sporadico e questa è la situazione in Europa e negli Stati
Uniti.
I linfomi di Burkitt sporadici europei e americani sono positivi a EBV solo in circa un terzo dei casi, quindi la maggior
parte sono EBV negativi.
Quindi, come è possibile che, se è vero che più del 90% della popolazione è positiva per EBV, i linfomi di Burkitt sono
EBV positivi soltanto nel 25-30% dei casi? Questi Burkitt sono quasi sempre EBV negativi, però insorgono in pazienti
EBV positivi. Quindi perché il linfoma è EBV negativo?
Il paradosso è più che altro di tipo semantico: parlare di paziente EBV positivo vuol dire che il paziente ha dei linfociti
B infettati da EBV, ma non vuol dire che tutti i linfociti B sono infettati. Mentre il linfoma di Burkitt è monoclonale,
cioè deriva da un’unica cellula originaria che può anche risultare da una cellula B EBV negativa che c’è in un paziente
EBV positivo. Questa associazione è molto forte in Africa, dove quasi tutti i Burkitt sono EBV positivi mentre quelli
sporadici sono in prevalenza EBV negativi. Questo perché c’è sicuramente una pressione selettiva che favorisce questa
associazione. L’EBV non causa un linfoma di per sé, ma causa un’attivazione policlonale in quanto mitogeno e
immortalizzante.
Se si prendono dei linfociti B in laboratorio immortalizzati con EBV questi possono crescere anche per trent’anni, però
se queste cellule immortalizzate venissero prese e messe in un topo immunodeficiente, queste non provocherebbero
tumori perché sono immortalizzate ma non trasformate o tumorigeniche. Per trasformarle sono necessari dei cofattori,
che in Africa è rappresentato, fra i tanti, dal plasmodio della malaria, mentre in Europa e Stati Uniti non sono noti.
Altro concetto fondamentale è che è vero che l’EBV può esserci o può non esserci nei Burkitt, a seconda delle aree
geografiche, ma in tutti c’è la traslocazione cromosomica tra il protoncogene e c-Myc che risiede sul cromosoma 8 e
viene a trovarsi in un contesto cromatinico attivamente trascritto sul cromosoma 14, in una zona subito adiacente alla
sequenza enhancer del gene che codifica per le heavy chains delle Ig.
Alcune indicazioni sulla patogenesi di questi fenomeni sono legate alle scoperte del tipo di riarrangiamento a livello
molecolare: i punti di rottura sui myc possono essere diversi, ma sui geni delle immunoglobuline sono sempre in VDJ o
nei punti di switch, il che suggerisce che queste traslocazioni siano generate da errori di ricombinazione del linfocita.
Quindi sicuramente c’è in tutti i casi una specie di stress riarrangiativo: il sistema immunitario è stimolato
cronicamente a riarrangiare immunoglobuline di linfociti B e questo è facilmente spiegabile nel caso del plasmodio che
ha la caratteristica di assomigliare un po’ all’HIV per variabilità genetica, tanto da cambiare continuamente gli epitopi
delle proteine di superficie, così che il sistema immunitario è sottoposto a una pressione immunogenica costante:
appena il sistema immunitario riesce a fare anticorpi contro un epitopo, il plasmodio l’ha già cambiato.
I linfomi di Burkitt sono molto più frequenti nei pazienti HIV ma qui il discorso è più complesso perché oltre alla
variabilità antigenica c’è anche immunosoppressione.
Questa tabella mostra le differenze principali fra i Burkitt con EBV e senza EBV.
Viene evidenziata la questione dei punti di traslocazione e viene specificato come le ig siano coinvolte sempre, ma il
punto di rottura è per qualche ragione diverso: negli endemici c’è una rottura prevalentemente sulla regione VDJ,
mentre in Europa prevalgono le rotture sulla regione switch e su myc, su quest’ultimo le rotture sono tra esone 1 e esone
2, nei Burkitt africani invece le rotture sono a monte del primo esone.

Malattie linfoproliferative post trapianto

Sono malattie linfoproliferative di tipo policlonale che si osservano nei pazienti immunodepressi, quindi pazienti
trapiantati o HIV non trattati.
Sono proliferazioni policlonali dovute al fatto che il sistema immunitario non è in grado di eliminare, come fa
normalmente questi cloni di linfociti B stimolati da EBV. Successivamente una quota di queste proliferazioni
policlonali progredirà a un linfoma vero e proprio di tipo monoclonale.
Queste patologie possono essere trattate con la chemioterapia esattamente come il Burkitt linfoma, oppure come nel
caso dei pazienti trapiantati possono essere a volte risolti in modo molto efficace semplicemente abbassando la quota
dei farmaci immunosoppressivi. Quindi al paziente si riduce il dosaggio di ciclosporina per raggiungere una specie di
compromesso tra il non fargli rigettare l’organo e far regredire il PTLD (Post Transfert Linfoproliferative Disease).
Carcinoma naso-faringeo
È una neoplasia completamente diversa dalle precedenti perché è una neoplasia di derivazione epiteliale ed è un
carcinoma che insorge a livello del rinofaringe o dell’orofaringe. È una neoplasia estremamente aggressiva che si trova
in determinate aree geografiche, per ragioni non ben comprese, soprattutto in Cina ed estremo oriente e in alcune
popolazioni eschimesi. È associato all’EBV, quindi i pazienti con carcinoma naso-faringeo sono sempre EBV positivi,
però ci sono anche sicuramente dei fattori geografici per spiegare questa grandissima differenza di incidenza.
Linfoma di Hodgkin
È una malattia istologicamente complessa caratterizzata da un tipo di lesione in cui si ritrova qualsiasi tipo di cellula:
granulociti, linfociti, macrofagi, fibroblasti, cellule endoteliali e cellule binucleate che hanno un nucleo speculare che si
chiamano cellule di Reed-Stenberg. Queste sono patognomoniche perché si trovano solo in questa lesione del linfoma
di Hodgkin.
Questa è una neoplasia di derivazione quasi sempre B cellulare. Le cellule neoplastiche di questa lesione sono le cellule
binucleate di Reed-Stenberg che non somigliano morfologicamente ai linfociti B, perché hanno tutte le Ig riarrangiate,
ma sono state identificate di derivazione B cellulare in base ad analisi di tipo molecolare. In una rilevanza dei casi gli
Hodgkin sono di derivazione T cellulare: ne conservano le caratteristiche istologiche ma le cellule di Reed-Stenberg
hanno il TCR riarrangiato anziché il BCR.
Il linfoma di Hodgkin è differenziato da tutti gli altri anche clinicamente, perché in genere insorge come un’unica
lesione su un unico linfonodo in genere a livello mediastinico e poi si diffonde per continuità alle strutture linfonodali
adiacenti, al contrario di tutti gli altri linfomi non Hodgkin che hanno una diffusione saltatoria. È un linfoma che oggi si
riesce a curare con un buon successo con un accoppiamento di chemioterapia associata in alcuni casi all’irradiamento,
quando si tratta di linfonodi mediastinici.
La percentuale di guarigione a 5 anni è del 90% nei primi due stadi 1 e 2 A, ma anche negli stadi avanzati la percentuale
di guarigione a 5 anni è di oltre il 50%.
Dal punto di vista istologico ci sono diversi sottotipi classificati dall’OMS a seconda del numero di linfociti, della
componente infiammatoria acuta presente. Questo per sottolineare come la percentuale di EBV positività di questi
Hodgkin varia a seconda dell’istotipo.

In conclusione, cosa genera il diverso outcome clinico? Perché lo stesso virus non dà niente in alcuni pazienti, mentre
provoca in alcuni il linfoma di Hodgkin e in altri il Burkitt?
Ci sono sicuramente molti fattori, alcuni sicuramente anche nell’ospite, ma uno dei fattori determinanti è il tipo di
espressione che il virus ha nelle cellule tumorali, cioè il pattern di latenza virale.

Le cellule di Burkitt linfoma hanno un pattern di latenza zero, cioè esprimono soltanto due geni virali che sono EBER1
ed EBER2, che sono due RNA non codificanti virali che hanno la funzione di inibire la via PKR, questa attiva la via
degli interferoni di tipo alfa e beta che mediano una risposta antivirale.
Possono esserci dei Burkitt linfoma, con pattern di latenza 1, in cui c’è anche un’altra proteina che si chiama antigene
nucleare di Epstein-Barr o EBNA 1 che ha la funzione di favorire la replicazione dell’episoma virale. Infatti nella
stragrande maggioranza dei casi l’EBV non si integra nel genoma della cellula bersaglio, ma viene replicato grazie a
questo EBNA1 che serve a garantire la replicazione del genoma virale.
In altre patologie come il carcinoma naso-faringeo e il linfoma di Hodgkin si nota un pattern di latenza 2 in cui
vengono espresse anche delle proteine di membrana come LP1 che attiva in modo anomalo la via del CD40,
normalmente attivata dal CD40 ligando presente sui linfociti T-Helper. Quindi da un segnale sia di sopravvivenza che
mitogenico a queste cellule, come anche LP2 che va ad attivare anch’essa una via di sopravvivenza. Le proteine
mitogeniche sono soprattutto le proteine di membrana come LP1 e LP2.
Il pattern di latenza 3 si trova in altre malattie come la mononucleosi infettiva o in PTLD che sono quelle malattie dove
il virus va un po’ più a ruota libera nell’espressione degli antigeni virali. Questo o perchè nella mononucleosi il sistema
immunitario non è ancora attivo contro il virus, o come nelle PTLD perché il sistema immunitario è soppresso dalla
terapia antirigetto o dall’HIV e quindi il pattern di espressione è molto più ampio.
Questo pattern di espressione non si trova solo in diversi tipi di patologie, ma anche in diversi tipi di linfociti B in cui il
virus può essere presente. Quindi nei linfociti B memoria o in divisione si trova il pattern di latenza 0-1, nei linfoblasti
attivati il pattern di latenza 2, mentre nei linfociti B naive, che sono i primi ad essere infettati, si trova un pattern di
espressione un po’ più ampio.

TUMORI AL PANCREAS

k-Ras – EGFR – p53 – p16 – SMAD4 – BRCA

Neoplasia mammaria
Sindrome di Lynch
Xeroderma
Von hippelindau
Atassia teleangiectasia
Li fraumeni
APC – Colonretto
Endocrine multiple men1 men2

Tumori mammella:
- 20% familiari
- 80% sporadici
Familiari:
- 80% BRCA
Sporadici:
- 3% BRCA
HER2:
- 33%
Federica Sabatelli 02-12-2016
Eleonora Targhetta Esercitazione di Oncologia, Lezione 43
Laura Vona Prof. S. Indraccolo

NEOPLASIE POLMONARI
Oggi faremo una presentazione sugli aspetti di ricerca e di pratica clinica che riguardano la genetica del cancro e in
particolare delle neoplasie polmonari. Ci saranno alcune diapositive introduttive per spiegarvi le principali
conoscenze circa le mutazioni più frequenti nei tumori, quali sono i geni drivers per questo tipo di neoplasie e poi tutta
una serie più ampia di diapositive per mostrarvi un aspetto più pratico, ovvero qual è la traduzione di queste
informazioni nella pratica diagnostica e molecolare, quali sono i riflessi di queste conoscenze sulla terapia dei pazienti
affetti da carcinoma del polmone.
Molte delle informazioni che vi dirò oggi sono state ricavate da una serie di reviews che vi lascio.
Parlando di neoplasie del polmone, inizio con una diapositiva che non c'entra propriamente con le neoplasie polmonari
ma proviene da uno studio di B. Vogelstein pubblicato in Science qualche anno (nel 2013) che mostra come c’è stato un
avanzamento impressionante della nostra capacità di sequenziare il genoma umano negli ultimi 10 anni, per cui ora il
costo e la rapidità del sequenziamento sono vertiginosamente ridotti rispetto a 10 anni fa e in questo modo sono stati
possibili studi di genotipizzazione del genoma di moltissimi tumori umani.

Questa diapositiva vuole rappresentare essenzialmente il numero di mutazioni somatiche, di tipo non sinonimo, che
determinano un cambiamento della sequenza della proteina codificata dal gene, che si sono trovati come sorta di
metanalisi in tutti gli studi fatti fino a quel momento nelle neoplasie umane. Sono rappresentati: i tumori pediatrici, i
tumori liquidi (leucemia, fondamentalmente), tutta una serie di tumori solidi e poi un altro gruppo di tumori solidi ad
elevato carico mutazionale. Quello che si vede sostanzialmente è l’andamento di questa distribuzione:
 i tumori pediatrici sono tumori geneticamente semplici da questo punto di vista, nel senso che hanno un
numero di mutazione per esone inferiore a 25, molto spesso
5, 6 o 7, potrebbero esserci altri meccanismi di oncogenesi
in questi tumori però il sequenziamento ci ha indicato che
sono tumori con poche mutazioni;
 la situazione non cambia molto nelle leucemie dell’adulto,
che sono tipi di tumori con una relativa semplicità delle
alterazioni genetiche, questo ha avuto anche dei riflessi,
infatti molte delle terapie a bersaglio molecolare si sono
rivelate più efficaci in termini di sopravvivenza proprio in
tumori di questo tipo.
 nel caso dei tumori solidi dell’adulto, quindi nei
carcinomi, abbiamo essenzialmente una quantità di
mutazioni decisamente maggiore rispetto alle altre due
categorie, che varia da 25 a circa un centinaio per genoma.
Tumori come i tumori del polmone del tipo “non small cell lung
cancer” nei non fumatori hanno un numero di mutazioni ancora
relativamente basso; la stessa neoplasia quando invece la si ritrova
nei fumatori ha decisamente un numero di mutazioni che è molto più
alto. Dunque, la stessa istologia ma con meccanismi di origine
diversi, porta ad un accumulo di mutazioni molto elevato.
In questa categoria di cancri con elevato tasso mutazionale troviamo
non solo i tumori del polmone, specialmente nei fumatori, ma anche
il melanoma, il microcitoma (in inglese spesso chiamato “small
cell lung cancer”), e i carcinomi colon-rettali caratterizzati da
instabilità dei microsatelliti (in questo ultimo gruppo abbiamo un
numero di mutazioni che si avvicina intorno alle 1000).
N.B. Non è che si possa dire che la malignità clinica dei tumori sia
direttamente proporzionale al numero di mutazioni che essi mantengono, però esso è una rappresentazione di quanto
eterogenea possa essere la complessità genetica dei tumori con i quali spesso ci troviamo a che fare e anche del tipo di
impatto che certi carcinogeni, specialmente nel caso dei tumori del polmone, hanno sul genoma delle cellule tumorali.
Un altro concetto di introduzione è il fatto che naturalmente all’interno di questi geni mutati, siano essi pochi o tanti,
troviamo molto spesso - non solo, ma sicuramente sono importanti nella patogenesi dei tumori - due classi di geni che
sono: gli oncogeni e gli oncosoppressori. Le mutazioni in queste classi di geni associati al tumore sono distribuite in
modo diverso:
1) tipicamente negli oncogeni quali PIK3CA, IDH1 (in caso dei gliomi) si tratta di mutazioni ricorrenti, cioè c’è
un’altissima concentrazione delle mutazioni attorno ad un cosiddetto hotspot mutazionale. Questa è
 un’informazione abbastanza importante anche ai fini della diagnostica molecolare, perché in situazioni di
questo tipo quando di fronte a un caso ci chiediamo se c’è o no la mutazione del gene, ad esempio di IDH1,
non occorre che sequenziamo tutto il gene, ma possiamo restringere la nostra attenzione attorno all’hotspot
mutazionale;
2) al contrario, nel caso di RB1 e VHL (rispettivamente geni del retinoblastoma e della sindrome di Von Hippel
Lindau), tipicamente le mutazioni che vanno a inattivare l’oncosoppressore sono distribuite lungo tutta la
coding sequence del gene. Questo significa che, invece, in questo caso, dobbiamo sequenziare praticamente
l’intero gene.

Nel caso del

carcinoma
del polmone
queste
informazioni
preliminari
si sono
molto introdotte nel management di laboratorio di
questo tipo di neoplasie perché sono ben state studiate
dal punto di vista molecolare e già da parecchio tempo è
nato il concetto che sottogruppi di questi tumori,
soprattutto “non small cell lung cancer”, che è poi anche
quello prevalente, con alterazioni molecolari particolari potrebbero beneficiare di terapie specifiche e mirate appunto
alle vie disregolate in questo tipo di tumore.
La grossa suddivisione nelle neoplasie polmonari è in:

1) carcinomi a piccole cellule o small cell lung cancer o microcitoma (sono tutti sinonimi) che sono tumori di
origine neuroendocrina, ad alto grado di malignità, sono entità che istologicamente sono formate da cellule
piccolissime e rappresentano approssimativamente 10% dei casi di carcinomi polmonari. Sono un tipo di
tumore altamente aggressivo, tipicamente metastatico già alla diagnosi che è inizialmente sensibile alla
chemioterapia a base di platino con risposte complete nel 70% dei casi ma purtroppo la durata della risposta è
transitoria e quando la neoplasia ritorna, spesso dopo 6-9 mesi, 1 anno, a quel punto spesso è resistente al
platino quindi poi diventa di difficile trattamento.
2) l’altro gruppo, quello più frequente, si chiama “non small cell lung cancer” (NSCLC) e comprende entità
istologiche diverse. Le due principali sottoentità sono: l’adenocarcinoma polmonare e il carcinoma a cellule
squamose. Questo è importante saperlo. Dei due, tutti e due associati al fumo, il carcinoma a cellule squamose
è molto più raro trovarlo nei non fumatori, mentre l’adenocarcinoma polmonare si trova sia nei fumatori che
nei non fumatori. Negli ultimi anni direi che in 100 casi di NSCLC almeno 80 sono adenocarcinomi
polmonari, quindi il tipo di neoplasia polmonare più frequente nella popolazione italiana è l’adenocarcinoma
polmonare, che è quello su cui concentreremo il resto del discorso.
Lo studio, mediante il sequenziamento del genoma o dell’esoma, dei tumori di questo tipo ha rivelato una distribuzione
delle mutazioni dei geni.
Questi sono nomi di una serie di geni, alcuni già da voi ben conosciuti come p53 o kRas e altri meno come STK11 o
EGFR (epidermal growth factor receptor). In ordinata vi è il numero di casi che presentavano la mutazione di questi
geni all’interno del gruppo di studio. Vedete che c’è questa specie di picco iniziale, che sarebbero i geni altamente
mutati in un certo tipo di tumore, e poi c’è una lunga coda, che indica i geni che si trovano mutati ma con una frequenza
molto più bassa, spesso attorno al 5%. Allora la gran parte degli sforzi si concentrano sui geni più frequentemente
mutati, che nel caso del tumore del polmone non a piccole cellule (NSCLC), sono:
- p53
- KRAS
- STK11
- EGFR
L’ EGFR si trova mutato in circa il 15% dei casi di tumore al polmone, nella nostra esperienza.
Attenzione! in figura è riporta 30-40, ma non è una percentuale, è il numero di casi mutati trovati in questo particolare
studio. Quindi la percentuale reale di mutazioni di EGFR nell’adenocarcinoma del polmone è del 15%. KRas è il
doppio, attorno al 30% e p53, che non viene ricercata comunemente, è simile a kRAs come percentuale di riscontro.
Quindi si tratta di mutazioni che si trovano abbastanza frequentemente.
Struttura e attivazione di EGFR
EGFR fa parte di una classe di recettori transmembrana con una struttura molto comune anche ad altri membri di
questa famiglia, sono tipicamente composti da una componente extracellulare, che è “ligand binding” (lega il
ligando), una componente transmembrana piccola e una coda intracitoplasmtica che contiene il dominio con attività
tirosinchinasica e un dominio regolatorio. Si tratta di un gene non dei più semplici, nel senso che ci sono 28 esoni,
però appartiene alla classe degli oncogeni, quindi le mutazioni sono concentrate in alcuni esoni.
Quando il recettore EGFR viene ingaggiato dal suo ligando, essenzialmente avviene una eterodimerizzazione di EGFR,
alterazione strutturale della componente esterna, e l’attivazione dell’attività tirosinchinasica della porzione
citoplasmatica che si traduce in un’autofosforilazione delle code citoplasmatiche. Questo è l’evento che scatena il
signaling a valle di questo recettore, che a sua volta si traduce in attivazione di alcune vie di signaling intracellulari
ulteriori, come la via delle MAP chinasi, che determina aumento della fosforilazione di ERC, che a sua volta è un
importane fattore che coordina la trascrizione di molti geni coinvolti nella proliferazione. A valle di EGFR c’è anche
l’attivazione della via del signaling di Akt, che molto spesso nelle cellule tumorali si associa alla regolazione della
proliferazione ma anche dell’apoptosi. EGFR è un recettore espresso nella sua forma non mutata anche nelle cellule
epiteliali normali, ad esempio a livello dei cheratinociti; se voi incubate cellule normali con il ligando di questo
recettore e poi andate a misurare - ad esempio con dei Western blot con le forme fosforilate di Akt o di ERC- cosa
succede all’interno della cellula, dopo pochi minuti vedete una massiva attivazione di queste vie del segnale.

Distribuzione e frequenza delle mutazioni a carico di

EGFR
EGFR è un oncogene e le mutazioni sono, almeno nei
tumori del polmone, concentrate in 4 esoni che sono gli
esoni 18, 19, 20, 21, quindi nella regione associata
all’attività tirosinchinasica del recettore. Possiamo
quindi risparmiarci, nei tumori del polmone, il
sequenziamento di tutti e 28 gli esoni, ma ci concentriamo
su questi quattro esoni.
All’interno di questi quattro esoni: il 45 % delle mutazioni si
concentrano nell’esone 19, sono una serie di piccole delezioni, e
un altro 45 % dei casi nell’esone 21, il rimanente 10% dei casi si
trova nell’esone 18 e talvolta nell’esone 20.
Queste mutazioni, segnate in rosa qui sotto, sono mutazioni rilevanti per la gestione del paziente con adenocarcinoma,
in particolare per la scelta della terapia, perché sono mutazioni “associated with drug sensitivity”, si intende la risposta
non alla chemioterapia, ma la risposta a inibitori specifici dell’attività tirosinchinasica di EGFR. Non tutte le mutazioni
che troviamo all’interno di questi 4 esoni sono di questo tipo. Una piccola parte di mutazioni, rappresentate nei riquadri
in giallo qui sopra, sono invece “associated with drug resistence”, sempre agli inibitori di EGFR. Questo tipo di
alterazioni di EGFR è molto tipico dell’adenocarcinoma del polmone, non si trovano invece nel carcinoma a cellule
squamose e nel microcitoma. Quindi l’istologia vi dà già l’indicazione se è il caso o no di cercarle. Al momento in Italia
è obbligatorio cercarle, non è facoltativo, negli adenocarcinomi polmonari. Ci sono altri tumori, uno in particolare, in
cui le mutazioni di EGFR sono comuni, ma non cadono in questi quattro esoni ed è il glioblastoma. Nel glioblastoma è
più alterata la porzione extracellulare del recettore. È una delezione di alcuni esoni che fa si che il recettore sia nella
configurazione attivata anche in assenza del ligando, quindi poi il risultato all’interno della cellula è molto smile a
quello che si trova nei tumori del polmone, cioè un recettore costitutivamente attivato in assenza di ligando. Purtroppo
però nel caso del gliobastoma, dove peraltro questo tipo di mutazioni si chiama “EGFRV3” ed esse sono molto
frequenti giacché si trovano anche nel 50% dei casi di gliobastoma, non disponiamo di farmaci mirati che abbiano
rivelato adeguata attività.
Incidenza delle mutazioni di EGFR in vari gruppi di
pazienti
Quali sono i pazienti in cui è più probabile trovare le mutazioni
di EGFR? Fino a poco tempo fa, dato che era più complesso e
costoso, bisognava cercare subito quelli giusti. Si utilizzava
l’istologia: queste mutazioni sono più comuni negli
adenocarcinomi e sono più frequenti nei non fumatori, perché
nei fumatori invece la mutazione dominante è quella di kRas, e
questa è una mutazione mutualmente esclusiva con EGFR.
Quindi all’interno dello stesso tipo istologico, che è
adenocarcinoma, c’è una buona associazione tra kRas e
abitudine al fumo e se kRas è mutato, non lo è EGFR. L’altra
associazione è col sesso: tipicamente le mutazioni di EGFR
erano più frequenti nelle donne, ma questo secondo me perché prima le donne fumavano meno. L’altro elemento è che
per qualche motivo sono molto più frequenti nella popolazione asiatica che in quella caucasica: nella popolazione
italiana la frequenza è di circa il 15%, negli asiatici almeno il doppio.

Tipologie di farmaci EGFR-targeted

Le mutazioni di EGFR nell'adenocarcinoma del polmone portano all'attivazione costitutiva dell'attività tirosin-chinasica
associata al dominio intracellulare del recettore con aumentato e persistente signaling.
L'industria farmaceutica nel corso degli anni ha sviluppato Small molecules chiamate TKI (Tyrosin-Kinase
Inhibitors), ossia pillole che si prendono per via orale, le quali vanno ad
occupare, all'interno della struttura tridimensionale della coda citoplasmatica del
recettore, il posto dell' ATP (importante per il triggering del signaling del
recettore). Quindi avviene un displacement dell'ATP e i TKI bloccano in questo
modo il signaling del recettore.
Naturalmente bloccano anche il signaling del recettore normale, quindi non sono
del tutto privi di effetti collaterali. Consideriamo, però, che i tumori che hanno
mutazioni in EGFR diventano oncogene-addicted, cioè per loro la via di EGFR
diventa fondamentale, quindi l'interruzione del signaling di EGFR, nelle cellule
tumorali portatrici di mutazioni attivanti di EGFR, ha spesso dei risultati molto
più catastrofici rispetto a quello che ha nelle cellule normali e viene sfruttata
questa differenza.
L'oncogene-addiction capita anche con altri tipi di oncogeni. Quando un
oncogene è mutato quella via tende a essere dominante all'interno delle cellule, quindi se voi trovate un farmaco che
riesce a intercettare la via potete creare un disturbo notevole alle cellule tumorali almeno per un po'.
Oltre a questi inibitori di EGFR della classe dei TKI, che per il tumore del polmone sono i più usati, esiste anche la
possibilità di bloccarlo con anticorpi. Questi però riconoscono il dominio extracellulare di EGFR e quindi possono solo
bloccare l'interazione del recettore col suo ligando. Nel caso del tumore del polmone gli anticorpi non sono molto utili
perché il recettore (EGFR) è attivato per conto suo a causa di mutazioni che capitano al suo interno, quindi a lui è
abbastanza indifferente se noi blocchiamo le interazioni all'esterno della cellula tra il recettore e il legando. Questi
anticorpi, tuttavia, sono importanti in un altro tipo di tumore molto comune che è il carcinoma colon-rettale, in cui
EGFR non ha mutazioni ma è spesso overespresso, quindi attivo, e allora gli anticorpi possono essere terapeuticamente
vantaggiosi.
Le mutazioni di EGFR e le terapie a bersaglio molecolare: una rappresentazione temporale

La storia dell' EGFR, delle sue mutazioni e dei farmaci connessi inizia nel 1978, anno della scoperta del gene, e si
estende fino ai giorni nostri. Tutta questa ricerca più che trentennale è fondamentalmente legata proprio allo sviluppo di
questi farmaci che sono ancora oggi molto usati e che ancora oggi sono in miglioramento. Questi inibitori dell'attività
tirosin-chinasica di EGFR prendono il nome di Gefitinib; Erlotilib; Afatinib e altri... Questi farmaci, che rientrano nel
capitolo della targeted therapy. ci hanno aiutato a migliorare la sopravvivenza dei pazienti con adenocarcinoma del
polmone.

Diapositiva dell'oncologa medica Laura Bonanno (non reperibile)

L'immagine mette insieme quelli che sono i risultati sulla
sopravvivenza (in ordine di anni dalla diagnosi) dei pazienti con
adenocarcinoma del polmone. Risultano divisi in tre categorie:
 A (nera) – mediana di sopravvivenza intorno ai 2 anni (2,4
precisamente). C'è una mutazione driver (per esempio la
mutazione di EGFR) però, per qualche motivo, il paziente
non ha ricevuto la terapia a bersaglio molecolare
 B – sopravvivenza di 2,1 anni (85% dei casi). Qui il
tumore non ha mutazione nel gene driver
 C – (blu) sopravvivenza 3,5 anni. Il paziente ha una mutazione driver ed è stato trattato con la targeted therapy
Adesso grazie ad altri nuovi farmaci la sopravvivenza è spostata di un ulteriore anno (si parla di pazienti con
adenocarcinoma al polmone in stadio avanzato a cui è precluso l'intervento chirurgico, che sono il 70 % dei pazienti alla
diagnosi mentre, se il paziente è fortunato, il tumore è operabile e si guadagna molto in termini di sopravvivenza).
Quindi è molto importante fare in modo che i pazienti che hanno il gene driver vengano riconosciuti e trattati perché
così gli si regala un anno, forse più, di vita e anche con una buona qualità di vita.
Vi è un'altra alterazione genetica, meno comune, ma utile a fini terapeutici che è il riarrangiamento di ALK, un'altra
chinasi per cui esiste un altro inibitore, chiamato crizotinib. Questa seconda alterazione genetica si riscontra nel 3- 5%
dei casi, quindi è meno impattante globalmente rispetto alla mutazione di EGFR.

Nel tempo sono state scoperte diverse tecniche per studiare queste mutazioni. La scelta della tecnica dipende anche da
come si presenta il campione.

- Caso 1) paziente operatorio dove il chirurgo ha asportato un lobo polmonare e il patologo lo ha sezionato e poi,
in previsione di un ritorno della malattia, ha chiesto al laboratorio di cercare mutazione EGFR. Nel caso
operatorio si ha abbondanza di materiale da studiare.

È necessario estrarre il DNA dal tumore, non dal tessuto

normale altrimenti troveremo EGFR normale.
In questi casi la metodica classica è il sequenziamento di
Sanger, la tecnica di dNTP,

Dall'immagine si vede come si dimostra una mutazione

nell'esone 19 di EGFR. Vedete fino a un certo punto una
serie di picchi (ogni picco rappresenta una base del DNA e i
colori cambiano a seconda della base), da un certo punto in
poi non si ha più un solo picco ma una sovrapposizione di
due picchi perché all'interno del DNA studiato c'è una
componente normale e una con una piccola delezione per cui
la sequenza salta un certo pezzo dando una sovrapposizione
di due sequenze.
L'altro tipo di esempio è quello di una mutazione puntiforme che è tipica dell'esone 21 di EGFR. Qui si notano una serie
di picchi tipici e, a un certo punto, si notano due picchi, perché c'è sia la base normale che la base mutata.

Oggi abbiamo anche tecniche più sensibili usate per casi più complicati per
esempio:

- Caso 2) biopsia dove la quota tumorale è rappresentata solo dagli

isolotti blu scuro, il patologo contorna l'area che giudica tumorale, bisogna cercare di estrarre il DNA da quella
zona e analizzarlo, ma questo avrà una componente non tumorale maggiore, quindi ecco che servono tecniche
più sensibili.

- Caso 3) abbiamo alcune cellule tumorali (con nucleo più grosso e più scuro) mescolate a tutta una serie di altre
cellule non tumorali che però danno fastidio perché hanno DNA normale e quindi diluiscono l'eventuale DNA
mutato.

Questo tipo di casi si affronta con metodiche più avanzate tra cui il sequenom e la spettrometria di massa.

Il sequenom prevede:
- una fase di amplificazione dove si eseguono delle PCR attorno alla regione dove si sa dalla letteratura che ci
potrebbero essere le mutazioni;
- dopo di che si fa un annealing del prodotto di PCR con un primer che ha un’estensione a livello della base
normale oppure con un nucleotide terminale complementare a un'eventuale base mutata e questi due primers
per la fase dell'annealing hanno due ancore diverse;
- poi con la spettrometria di massa si riesce a separare questi primers che si sono appaiati al DNA sulla base del
loro peso molecolare.

Il risultato può dare un unico picco quando non si ha l'allele mutato oppure due picchi con un peso diverso se c'è
mutazione, in questo modo si può scendere con la sensibilità della detection della mutazione fino al 5% di allele mutato
all'interno del campione, mentre con il sequenziamento di Sanger il limite è intorno al 20/30% di allele mutato.

C'è una terza tecnica ancora più sensibile: la PCR quantitativa basata sull'amplificazione selettiva degli alleli mutati.

Possiamo chiederci se, nel caso di paziente metastatico, la parte ricavata dalla biopsia che abbiamo sia davvero
rappresentativa della situazione di tutto il paziente, così che se esso viene, per esempio, trattato con TKI sappiamo se
risponderà solo nella lesione che noi abbiamo studiato perché magari il resto del tumore non ha la mutazione.
Possiamo chiederci se ci sia o meno eterogeneità genetica all'interno del
tumore, naturalmente che ci sia eterogeneità tra pazienti diversi è chiaro
(inter-patient tumor heterogeneity). Però ci può essere anche eterogeneità
intra-tumorale. In un tumore localizzato al polmone facendo una biopsia in
una certa regione si possono trovare mutazioni diverse da quelle che si
potrebbero trovare facendo una biopsia in un'altra regione (questo per alcuni
geni, tra cui non EGFR).
Poi si può avere anche eterogeneità inter-metastatica, cioè rispetto a un
tumore del polmone, che poi si è disseminato nel cervello (come capita nel
50% dei casi) o nel fegato, le metastasi potrebbero essere geneticamente un
po' diverse.
Per EGFR la maggior parte degli studi sostengono che la mutazione sia comune, quindi presente nel tronco genetico
della neoplasia, ossia una mutazione che si presenta fin dalle origini della neoplasia; ci sono anche altre mutazioni che
vengono acquisite strada facendo e quindi si possono
trovare in un ramo (in una sede o in porzione del tumore)
ma non nell'altro.
Ciò è anche sostenuto dal fatto che la maggior parte dei
pazienti con mutazione di EGFR, se ha lesioni multiple,

inizialmente risponde agli inibitori di EGFR, mentre se le

mutazioni di EGFR fossero di un solo ramo avremmo delle
risposte empiriche che sarebbero solo molto parziali. Vi è
però un'eccezione a ciò, che vi farò vedere con un esempio
di un caso clinico.

Caso clinico

Una signora di 71 anni con performance status molto buono

(non aveva mai fumato, aveva una leucemia linfatica
cronica) nel Marzo 2011 ha scoperto di avere una lesione
polmonare e quindi ha subito una lobectomia del lobo medio di destra.

Imaging prechirurgia
Nella tac si vedevano, oltre alla lesione operata, anche lesioni a vetro smerigliato sospette per la densità radiologica
differente da quella del parenchima polmonare normale, ma senza caratteristiche radiologiche tali da rendere subito
necessaria un'operazione.

La lesione operata è poi stata studiata dal patologo che ha riportato l'esistenza di un adenocarcinoma del polmone in
stadio T1b senza linfonodi coinvolti, quindi in una stadio1A con pattern di crescita lepidico e positività per uno dei
tipici marcatori dell'adenocarcinoma del polmone che è TTF1, all'immunoistochimica.
Durante il follow-up uno dei due noduli nel polmone di
sinistra (quelli a vetro smerigliato) si è addensato e quindi è stato suggerito l'intervento anche lì.

Nel Marzo 2012 il chirurgo ha recuperato due noduli dal polmone di sinistra, uno di 1,5 cm e l'altro di 2,5 cm, e il
patologo li ha studiati e ha trovato cancro in entrambi con aspetti diversi perché il nodo numero 1 ha caratteristiche
acinali, mentre il numero 2 ha caratteristiche papillari. Quindi abbiamo una paziente che in un anno e mezzo è finita due
volte sotto il tavolo operatorio, sono stati asportati tre noduli polmonari con degli aspetti istologici leggermente diversi,
in tutti e tre i casi adenocarcinomi però il primo era a pattern di crescita lepidico, gli altri due erano uno acinale e uno
papillare.
Dopo un altro po' di tempo la
signora ha sviluppato, nel
dicembre 2014,
metastasi epatica
che è stata
biopsiata e si è
potuto confermare
che anche lì c'era
una metastasi di
adenocarcinoma.
È stato fatto lo
studio genetico di
tutti e 4 i
campioni
studiando le mutazioni di EGFR. Questi risultavano molto
diversi infatti il primo presentava una delezione dell'esone 19
di EGFR, nei due noduli del secondo intervento uno era una
mutazione di EGFR ma nell'esone 21, l'altro non aveva alcuna
mutazione di EGFR, la metastasi epatica aveva una mutazione
dell'esone 21 come il nodulo numero 1 del lobo polmonare
sinistro. Quindi qui abbiamo un esempio di eterogeneità
tumorale all'interno dello stesso paziente per EGFR che
sembra contraddire quello che si diceva sul fatto che le
mutazioni di EGFR appartengono al tronco del tumore. Il
motivo è che molto probabilmente questo tipo di tumore era un
tumore multifocale.
I tumori multifocali sono rari e sono di fatto dei tumori indipendenti, stavamo studiando un caso singolare in cui una
signora non fumatrice ha avuto nell’arco di un paio di anni 3 tumori polmonari indipendenti, quindi dovrà avere
qualcos’altro che la predispone.
Approfondendo il caso con delle tecniche di sequenziamento avanzato come il next generation sequencing, che ci dà
l’opportunità di sequenziare una trentina di geni altri geni di EGRF coinvolti nella patogenesi molecolare
dell’adenocarcinoma del polmone (con gli stessi costi di studiare un gene solo) abbiamo trovato una serie di mutazioni
aggiuntive.
Per i 30 geni sequenziati, si individua il profilo genetico dei diversi noduli tumorali:
Nodulo del polmone di destra: EGFR (la mutazione nota); EPHA3A; MET
Noduli 1 del polmone di sinistra: EGFR (esone 21 confermando i risultati del test monogene precedente); PIK3CA;
p53
Nodulo 2 del polmone di sinistra: PTEN
Metastasi epatica: fotografia del nodulo 1 del polmone di sinistra, quindi possiamo dire che questa metastasi è figlia di
quel tumore.

Quindi si può tracciare, con un sequenziamento massivo, l’origine dei tumori e delle loro metastasi. Si evidenzia così
una complessità, perché, usando gli inibitori di EGFR, la paziente potrebbe avere cellule residue del tumore che non
presenta mutazioni in quel gene, che potrebbero sfuggire al controllo terapeutico.

Il next generation sequencing permette di fare un identikit del tumore con costi che si avvicinano a quelli impiegati per
studiare un gene solo. Quindi nei prossimi 5 anni diventerà routine fare il profilo genetico completo del tumore per
studiare tutte le mutazioni e quindi fare in modo che per ognuna di queste ci sia un trattamento.

Nella curva di sopravvivenza si vede come la target terapy aumenti l’aspettativa di vita del pz di circa 1 anno e mezzo.
Questo perché i TKIs funzionano bene e sono ben tollerati (non essendo chemio ma pastiglie che si prendono a casa e
quindi non avranno tutti gli effetti collaterali della chemio, ma solo un po’ di disturbi gastrointestinali come diarrea o a
volte rush cutanei perché si interferisce con EGFR a livello di cheratinociti), infatti sono dei farmaci che possono essere
dati ad un pz con malattia molto avanzata e lo rimettono in piedi nell’arco di 3 settimane dandogli anche una buona
qualità di vita, ma dopo circa 13 mesi si svilupperà una resistenza.

Resistenza ai TKI
La resistenza, quando compare, è dovuta a vari meccanismi:
- Il meccanismo prevalente (60% casi), in cui vi sarà una
seconda mutazione in EGFR chiamata T790M o
mutazione di resistenza. Si trova nell’esone 20 di EGFR e
rende inefficaci gli inibitori di EGFR di prima generazione
- Amplificazione del gene MET da solo o in combinazione
della T790M
- Dalla sbobina dell’anno scorso: Altri meccanismi di
resistenza sono basati sull’overespressione di VEGF, per
cui si sta pensando di combinare inibitori del VEGF,
fattore neoangiogenico, con inibitori di EGFR

- Trasformazione del tumore in un altro tipo istologico, ad

esempio il microcitoma. A volte capita di avere
inizialmente un tumore con la mutazione in EGFR, lo
trattiamo per questa mutazione e nella recidiva il tumore sarà un microcitoma.
Si pensa che una componente minoritaria di cellule di microcitoma (con T790M mutato), nella maggior parte dei casi,
sia già presente all’inizio dell’insorgenza dell’adenocarcinoma. Quando facciamo il trattamento per quest’ultimo,
riduciamo di molto la dimensione delle cellule con EGFR mutato, mentre le cellule di microcitoma con T790M mutato
verranno selezionate avendo il vantaggio di essere resistenti al trattamento. Alla fine del trattamento queste, rimaste
vitali, amplificheranno e sarà molto più facile evidenziarle nella recidiva, infatti alla diagnosi iniziale erano in un
numero troppo limitato per poter essere messe in evidenza.

Cercare la mutazione T790M è importante perché recentemente è stato creato un inibitore di terza generazione (in
studio a Verona e non ancora in commercio), l’AZD 9291 e Rociletinib, il quale riesce a bloccare anche i tumori mutati
in T790M. L’indicazione per poter dare questo farmaco, che dà un ulteriore guadagno di vita di un anno, è che il pz
abbia già la mutazione in T790M. Quindi non si può dare questo farmaco a tutti, anche sapendo che il 60% dei tumori
trattati con gli inibitori di prima e seconda generazione, svilupperà successivamente una resistenza dovuta a T790M (il
farmaco è molto costoso).
Quindi il laboratorio dovrà indagare se il paziente in progressione ha o meno questa mutazione. È difficile ottenere una
seconda biopsia per l’analisi genetica da un pz in progressione (che l’ha già fatta in prima diagnosi e le cui condizioni
sono peggiorate), quindi, una seconda biopsia sarà fatta solo se il paziente è giovane.

TECNICHE DI RICONOSCIMENTO DI T790M, la biopsia liquida

A causa delle problematiche riscontrate nell’ottenere una biopsia nei pz in progressione, si è cercato di trovare tecniche
alternative.
Abbiamo detto di avere la Real-time PCR e una sua variante ancora più sensibile, la Digital Droplet PCR. Queste non
verranno più fatte direttamente sul tumore, ma cercando le mutazioni nel sangue. Nel plasma esiste una piccolissima
quota di DNA circolante che è in parte derivato dal tumore, il CT-DNA (circulating Tumor DNA), che deriva da cellule
tumorali circolanti lisate e da cellule tumorali in apoptosi. L’idea è quindi quella di fare la biopsia liquida, ovvero lo
studio del tumore in un prelievo di sangue.
Nel tumore del polmone ciò si applica soprattutto per la ricerca della mutazione T790M nei pazienti in progressione
dopo trattamento con farmaci di prima linea o, a volte, in pazienti anziani in corso di trattamento che non possono
sottoporsi alla biopsia o che hanno fatto la biopsia ma questa era poco rappresentativa del tumore. La ricerca di
mutazioni di EGFR nel plasma non è sensibile quanto la ricerca di mutazioni di EGFR nel tumore. Si calcola una
sensibilità del 60-70%, ovvero, presi 100 pazienti con adenocarcinoma polmonare che hanno sicuramente la mutazione
e prelevato il sangue di questi pazienti prima del trattamento, si troverà la mutazione solo in 60-70 di loro. La specificità
però è molto elevata, quindi non troveremo la mutazione in pazienti che non ce l’hanno.

EMULATING STUDY
Lo IOV ha iniziato qualche anno fa uno studio pilota che voleva evidenziare la capacità del laboratorio in cui lavora il
prof. Indraccolo di trovare mutazioni di EGRF nel plasma. È uno studio in cui si fa, prima del trattamento, sia l’analisi
delle mutazioni nel tumore e, previo consenso informato, anche la ricerca della mutazione nel sangue. Si usano tecniche
come la real time PCR che ha una Sensibilità fino al 2% di trovare l’allele mutato nel campione.
Nelle real-time PCR per la ricerca di una mutazione specifica, si usa un parametro chiamato ciclo soglia: i risultati sono
considerati positivi se superano questa soglia (linea rossa nel grafico sottostante). Nel campione ci sarà sempre un
controllo che dovrà necessariamente risultare positivo (curva di amplificabilità). Nel caso in cui la mutazione non è
evidenziata, avremo solo la positività per il controllo; nel caso in cui verranno identificate delle mutazioni, ad esempio
nell’esone 19 e 20, si osserveranno 3 curve di positività, ovvero la curva di amplificabilità e le due curve per le due
mutazioni di EGFR.

Fin ora si sono studiati 102 campioni, alcuni provenivano dalla diagnosi, altri dalla progressione.
Immagine non reperita
Per cercare di migliorare il riscontro delle mutazioni nel sangue si utilizza una tecnica ancora più sensibile, la digital
droplet PCR, che fa la PCR in goccioline in emulsione. Ogni puntino sul grafico corrisponde ad una gocciolina. Si conta
il numero di puntini sul grafico. Per l’allele di controllo vengono fuori grafici in cui le ogni mutazione è all’interno di
un determinato quadrante. Ci saranno quadranti in cui le mutazioni riscontrate nel sangue sono abbondanti, in altre sono
presenti in numero minore, e questo (in verde nell’immagine) corrisponde ad EGFR non mutato.
Ci sono poi casi dubbi con 5 goccioline positive su un numero totale molto abbondante, e quindi una sensibilità, una
frequenza di allele mutato dello 0,3%. In altre situazioni avremo addirittura solo 2 goccioline. In questi casi avremo il
dubbio se la positività molecolare avrà o meno un riscontro clinico. Usando questa tecnica possiamo scendere molto al
di sotto dell’1% di sensibilità e avremo un guadagno del 26-28% rispetto alla tecnica real-time.
Potremo usare entrambe le tecniche nella biopsia liquida. Molto spesso vengono utilizzate in serie perché la Digital
droplet è una tecnica più sperimentale rispetto alla real-time.

Risultati dello studio

Su 14 campioni che presentavano la mutazione L858R nell’esone 21 nel tumore, usando la tecnica più sensibile, siamo
riusciti a trovarla anche nel sangue di 9 campioni, mentre negli altri 5
non la trovavamo.
Studiando l’esone 19 in 15 casi positivi nel tumore, ne troveremo 8
positivi e 7 no nel sangue.
Infine per la mutazione T790R avremo una situazione meno favorevole,
ma comunque troveremo la mutazione. (ovviamente trovare questa
mutazione è una buona notizia per il paziente, perché avrà la possibilità di
usare il nuovo farmaco).

Quindi adesso, nel 2016 è possibile fare la ricerca per le mutazioni di

EGFR non solo nel tessuto tumorale ma anche nel plasma attraverso
tecniche altamente sensibili.
Ci sono alcune cose da migliorare, come la stabilità del campione che
deve essere processato entro un’ora dal prelievo, quindi il paziente dovrà andare allo IOC a fare il prelievo visto che è
solo in quella sede che si esegue l’analisi. Per evitare questo disagio si cerca di fornire alle varie aziende ospedaliere dei
tubi stretch che permettono di conservare il campione di sangue anche per qualche giorno che quindi potrà arrivare al
laboratorio di analisi tramite corriere.
Grazie alla biopsia liquida il paziente potrà ripetere numerose volte le analisi senza il disagio della biopsia sul tessuto.
Alcune volte la biopsia liquida si fa anche prima di fare una biopsia su tessuto, ad esempio in persone in cui la biopsia è
rischiosa. Se il risultato del prelievo sarà negativo si farà anche la biopsia, mentre se è positivo già in biopsia liquida, si
evita quella più invasiva.

Domande:
la paziente del caso clinico è ancora viva? No, è stata trattata con TKI ma dopo un po’ è andata in progressione. È
stata ricercata la mutazione T790M ma è risultata negativa, è deceduta perché quando si va in progressione su una
malattia metastatica del polmone, si muore dopo alcuni mesi.
Perché nonostante i farmaci sviluppati contro la mutazione T790M, alla fine il tumore ricompare? Perché si
sviluppano degli adattamenti continui tra farmaco e il tumore. si avrà un’ulteriore mutazione, la C797S che
consentono di bypassare il blocco del signalling dovuto agli inibitori di terza generazione. C’è una continua modifica
del recettore che è sottoposto a tante mutazioni che vengono selezionate. Ci mette un po’ ad adattarsi, ma alla fine ce
la fa. È una rincorsa continua alla nuova mutazione e alla ricerca del farmaco. Un altro vantaggio che ha il nuovo
farmaco è che è molto attivo nelle metastasi cerebrali (che si presentano nel 50% dei tumori al polmone), a differenza
degli altri. Al momento il centro in cui lavora il prof. Indraccolo è l’unico che fa il referto di mutazione, e lo IOC di
Verona è l’unico che ha il farmaco che per ora testa su pazienti gratuitamente, con la speranza, però, che entro l’anno
prossimo verrà approvato.

I costi di questi farmaci sono sempre supportabili dall’azienda ospedaliera? Un anno di vita significa 40000 euro di
costi per paziente. Per ora si è in grado di portare a 2/3 anni la sopravvivenza del pz, il che significa 120.000 euro. E
quindi non è scontato che l’ospedale riesca a sostenere la spesa farmaceutica che non viene aumentato per
l’introduzione di nuovi farmaci. La chemioterapia costa circa 1/10. Quindi alcune asl potrebbero trattare i pazienti in
maniera meno ottimale per ragioni economiche, o può avvenire che vengano mandati in altre aziende ospedaliere.