BIOTECNOLOGIE: insieme di tecniche che permettono di produrre beni (sostanze, microrganismi, ...

) e
servizi (depurazione, analisi,...) mediante l’impiego di organismi viventi, loro enzimi e loro costituenti. In
alcune applicazioni vengono utilizzati, anziché i microrganismi, gli enzimi da essi estratti, in modo da
catalizzare la reazione biologica desiderata senza la necessità di mantenere le condizioni ottimali per le
funzioni vitali dei microrganismi viventi stessi.

Lo sviluppo delle bioteconolgie si può dividere in due fasi di diversa durata:

una prima fase contraddistinta da un uso inconsapevole delle biotecnologie che va dall’antichità fino a
circa 2 secoli fa e una seconda fase scientifica, che continua anche oggi e che vede le biotecnologie
in piena crescita.
Già i Sumeri e i Babilonesi, prima del 6000 a.C., erano capaci di produrre la birra mediante il lievito; più
tardi, intorno al 4000 a.C., gli Egiziani scoprirono che l’anidride carbonica prodotta dall’azione del
lievito di birra, poteva far lievitare il pane.
Solo a partire dal 1857 Louis Pasteur evidenziò come i processi di fermentazione fossero il risultato
dell’azione di specifici microrganismi.
Lo sfruttamento industriale delle fermentazioni ha inizio nei primi decenni del XX secolo con i primi
tentativi di produzione industriale di etanolo, acetone, glicerina, butanolo ed acido citrico (1923), ma
dopo la Seconda Guerra Mondiale, con l’accresciuta disponibilità di petrolio, molti processi furono
abbandonati perché antieconomici rispetto a quelli di sintesi. Al declino dei processi di produzione di
sostanze chimiche si contrappose però, a partire dagli anni ’40, la rapida ascesa dei processi di
produzione di antibiotici, tra cui la penicillina (ottenuta dalla muffa Penicillium notatum), la cui
efficacia i era stata sperimentata da Alexander Fleming nel 1928.
La penicillina segnò l’inizio dell’era degli antibiotici: ricerche successive portarono alla scoperta di
numerosi nuovi tipi. Da allora si è avuta una vera e propria proliferazione di processi di
fermentazione industriale e di prodotti economicamente attuabili: la via biotecnologica si rivelò più
vantaggiosa rispetto alla sintesi chimica per un gran numero di prodotti.
VANTAGGI
specifità, le condizioni non estreme per cui P e T in valori modesti, ex. T fra 0 e 100°C, utilizzo substarti
naturali e basso impatto.
SVANTAGGI
brodo di fermentazione eterogeneo, concentrazione del prodotto basse (alcool al 13% si blocca la
fermentazione) substrato spesso di natura stagionale.

é utile classificare le biotecnologie in:

Red biotechnology: È il settore applicato ai processi biomedici e farmaceutici. Alcuni esempi sono
l'individuazione di organismi in grado di sintetizzare farmaci o antibiotici, oppure lo sviluppo di
tecnologie di ingegneria genetica per la cura di patologie.
White biotechnology È la branca che si occupa dei processi biotecnologici di interesse industriale. Ad
esempio, la costituzione di microrganismi in grado di produrre sostanze chimiche.
Green biotechnology È il settore applicato ai processi agricoli. Tra le applicazioni, figura la modificazione
di organismi per renderli in grado di crescere in determinate condizioni ambientali o nutrizionali. Lo
scopo di questo settore è quello di produrre soluzioni agricole aventi un impatto ambientale minore
rispetto ai processi agricoli classici
Schema di un processo fermentativo
► produzione in batch – discontinuo: per produzioni su piccola e media scala, come è il caso di molti
prodotti farmaceutici e di qualunque produzione in cui si realizzano piccole quantità di prodotto di
elevato valore commerciale. I reattori utilizzati nella produzione discontinua (reattori batch) vengono
sterilizzati prima dell’avviamento del processo, che può avere una durata variabile da uno-due giorni
ad una settimana. In questo modo è necessario ripetere frequentemente l’operazione di pulizia e
sterilizzazione del reattore, ma così facendo sono assicurate, d’altra parte, le condizioni di asetticità
del processo per tutto il ciclo di lavorazione.
► processo continuo: il ciclo di lavorazione può durare parecchi giorni, ma può essere più difficile
mantenere le condizioni di asetticità e la stabilità delle colture ed è necessario assicurare la sterilità
dei materiali introdotti.
Qualunque processo biotecnologico può essere suddiviso in varie parti:
1. preparazione del substrato
2. sterilizzazione di tutto ciò che entra
3. La fermentazione vera e propria
4. Stadi successivi alla fermentazione, ossia tutte le operazioni di separazione dei prodotti di
reazione dal substrato residuo (brodo di fermentazione esausto) e dalle cellule (biomassa)

Materie prime
Le materie prime utilizzate nei processi biotecnologici sono in genere o prodotti di origine vegetale
(cereali, frutta, latte e derivati, ecc.) o scarti di lavorazione e sottoprodotti dell’industria
agroalimentare (melasso, acque di macerazione del mais (corn steep liquor), acque di vegetazione,
ecc.).
dato che andiamo a sfruttare l’anabolismo e catabolismo, il SUBSTRATO deve contenere principalmente
carbonio insieme ad azoto(CLS o NH4OH) , fosforo (PO4--), vitamine x cellule eucariote e
micronutrienti. La fonte di carbonio primaria sono i carboidrati, semplici e complessi.
Il materiale di partenza deve essere preparato per essere utilizzato come substrato dai microrganismi. E’
importante infatti lavorare con materiale fluido o semifluido per agevolare una serie di funzioni del
reattore come la distribuzione omogenea dei reagenti e dei prodotti, la diffusione dell’ossigeno o di
altri gas, il trasferimento di calore. Anche l’acqua utilizzata deve essere trattata, in particolare deve
essere priva di microrganismi e sostanze quali metalli pesanti, altamente tossici per le cellule
impiegate nel processo.
I pretrattamenti sulle materie prime comprendono: macinazione, cottura, filtrazione, centrifugazione ed
altri ancora. Inoltre poiché il materiale di partenza potrebbe essere contaminato da organismi
competitori, può essere necessaria una sterilizzazione o sanificazione (abbasso concentrazione
microbica, ex. lievito di birra che è veloce a duplicare)
Sterilizzazione
Puo essere termica o per filtrazione, quando il substrato è particolarmente puro per cui si usa un filtro
0,22 micron.
Tutti i microrganismi possiedono un range di temperatura ottimale per cui, a temperature più basse, il
loro metabolismo viene bloccato, mentre, ad alte temperature, vengono uccisi. Su questo si basa la
sterilizzazione termica, che consiste nell’esporre il mezzo da sterilizzare a temperature elevate per
un tempo sufficiente a ridurre la carica batterica entro valori accettabili. Pertanto al di sopra di una
temperatura massima, caratteristica di ciascun microrganismo, si osserva l’arresto dell’attività
metabolica, poi della moltiplicazione, seguono danni irreversibili e quindi la morte. Nell’ordine la
resistenza aumenta da psicrofili, mesofili, termofili.
I fattori che influenzano la resistenza al calore, oltre al tipo di microrganismo, sono: • Temperatura
ottimale di moltiplicazione • Tempo e temperatura del trattamento • Presenza di forme vegetative e/o
di spore • Fase di crescita nella quale si trovano i microrganismi (fase di moltiplicazione logaritmica)
• Numero iniziale di microrganismi (si osserva infatti che una maggiore resistenza al calore e ad altri
agenti dannosi con una popolazione microbica numerosa per la formazione di agglomerati) •
Caratteristiche del substrato: contenuto in grassi, proteine, carboidrati, Sali, pH, valore aW, presenza
di additivi e antimicrobici influenzano la termoresistenza dei microrganismi (ad esempio il grasso
crea un ambiente protettivo tipo quello del calore secco, la presenza di polifosfati aumenta la
termoresistenza di Enterococcus faecalis) • Il tipo di trattamento termico: a parità di temperatura,
l’efficacia della riduzione della popolazione microbica è maggiore con calore umido rispetto al calore
secco (ad esempio con calore umido in 4-10’ a 120 °C si ha la distruzione delle spore di C.
botulinum, mentre con calore secco occorrono 120’)

Si è visto sperimentalmente che il decremento del numero di microrganismi (e di spore) con la

temperatura (se questa corrisponde ad un valore letale) segue una cinetica
del I° ordine:

N=n° microrganismi all’istante t

K costante di estinzione specifica x ogni microganismo e diepndente dalla
temperatura⇒+K+T

−𝑘𝑡*𝑡
𝑁 = 𝑁0 * 𝑒 VELOCITà DI RIDUZIONE DELLA CARICA (+ KT, - popola<ione§)

CARATTERISTICHE GENERALI: - reazioni biotecnologiche:

Substrato + cellule →prodotti + nuove cellule
𝑑𝑁
- velocità di reazione = generazione di nuove cellule: v = 𝑑𝑇 = variazione concentraz. delle cellule/tempo
che porta a generazione di nuovo prodotto o scomparsa di substrato.
- accrescimento batterico = variazione del numero di cellule N°c nel tempo
REATTORE TIPO BATCH (chiuso) –;
L’equazione della velocità, relazione tra velocità di sviluppo e variare della concentrazione del substrato,
è data dalla equazione di Monod:
μ = μmax x Cs/(Km + Cs) - Kd ; km= costante affinità substrato e microrganismi
- fase di crescita esponenz. illimitata:
-grande disponibilità di substrato- Cs >>Ks, e sarà Cs /(Ks + Cs)=1 (v. di accresciemtno e decadimento
costante) da cui: μ = μmax;
µ𝑚𝑎𝑥*𝑡
da = 1/N dN/dt sarà N = No 𝑒

Una grandezza caratteristica relativa all’accrescimento è il tempo di generazione, tempo

necessario a raddoppiare la concentrazione delle cellule nella fase di crescita esponenziale.
𝑙𝑛2
𝑡𝑔 = µ𝑚𝑎𝑥
specifica x microrganismo in base al sub.
- fase rallentamento: disponibilità substrato= fattore limitante la crescita; per basso Cs, Km diventa dello
stesso ordine di grandezza, si ha Cs /(Ks + Cs) << 1; vale l’equazione di Monod μ = μmax x Cs/(Ks
+ Cs)- Kd ; DESCRESCE Kd costante di decadimento
- fase stazionaria: si ha μmax x Cs/(Ks + Cs) =Kd; μ=0 , con n° cellule che rimane costante.
- fase decadimento: μ = μmax x Cs/(Ks + Cs) – kd < 0; Kd: costante di decadimento;

FERMENTATORI
I reattori utilizzati nei processi biotecnologici sono chiamati bioreattori o fermentatori.
Sono costruiti in acciaio al carbonio con un rivestimento interno resistente alla corrosione e, in
particolare, nelle produzioni farmaceutiche sono fabbricati in acciaio inossidabile. Per evitare effetti
tossici sui microrganismi, non è possibile utilizzare materiali come rame e le sue leghe per la
costruzione dei fermentatori. Nei processi di tipo discontinuo (in modo, tra l’altro, da consentire il
mantenimento delle condizioni di sterilità per tutta la durata del processo), il fermentatore più
utilizzato è il reattore BATCH. ;
FUNZIONI E DISPOSITIVI:
I fermentatori deve presentare una serie di funzioni tali da consentire:
1. miscelazione del sistema (con agitatore e buffols; per processi aerobici anche agitati dall’aria
immessa) e controllo della schiuma
2. controllo T: mantenimento del calore prodotto con un jacket; + microrg. + T
3. sia nei processi aer. che anaer. misuro O2 con ossimetro (relazione fra O2 e corr. elettrica);
nei processi aerobici l’O2 è in funzione dell’agitazione e aria che entra (aria max. 2 Vol/ vol
brodo/ min)
4. reagenti additivi (antischiuma) e nutrienti aggiunti durante il processo;
5. controllo del pH: i microrganismi sono molto sensibili alle variazioni di pH (che si verificano
durante la reazione);
6. per portare il pH ai valori desiderati, si aggiunge nel fermentatore dei correttori, basico:
Ca(OH)2 o H3PO4/H2SO4 (20%), entrambe accuratamente sterilizzate;
7. monitoraggio concentrazioni di reagenti, prodotti e crescita microrganismi.
8. pressione di lavorazione leggermente superiore a quella atmosferica per mantenere
condizioni di sterilità, e evitare la contaminazione da parte dell’aria esterna.

CICLO PRODUTTIVO: inizia con

- operazioni di pulizia e di sterilizzazione del reattore: introduzione attraverso apposite aperture di
detergenti e vapore (che viene fatto passare anche attraverso le camicie di raffreddamento).
- carica di substrato e inoculo;
- inizio della reazione e avanzamento con diminuzione della concentrazione di substrato e aumento
della concentrazione di cellule e di prodotti.
- il reattore lavora nelle condizioni di reazione, coi controlli di processo previsti. -
scarico e processi di separazione brodo-biomassa.
RESA di fermentazione= g prodotto secco/dm3 coltura %
RESA di conversione = g prod.secco/g substrato puro %

CHEMOSTATO E TURBIDOSTATO
I bioreattori utilizzati in continuo possono essere di due tipi diversi a seconda della tipologia di
controllo che viene eseguita. Per esempio nel chemostato la velocità di crescita del biocatalizzatore
è controllata attraverso la velocità di immissione del terreno di coltura. Mentre la densità della
popolazione cellulare viene regolata dalla concentrazione di un nutriente che agisce come fattore
limitante. Un esempio di fattore limitante può essere la fonte di carbonio che viene monitorata
attraverso la misura della densità ottica. Il sistema mantiene costante il volume e l’aerazione
(quando necessaria).
Il secondo tipo di bioreattore usato in continuo è il turbidostato. In questo caso tutti i nutrienti
vengono forniti in eccesso e il controllo viene esercitato sull’effluente. Infatti viene misurata la sua
torbidità che è indice della massa microbica, attraverso una fotocellula.

BIOETANOLO
L’etanolo può essere prodotto x via chimica e x via fermentativa: a questo punto si è arrivata non
tanto x convenienza economica ma x ridurre l’impatto ambientale.
La concentrazione massima di etanolo non può superare il 10% perche avrebbe un effettore inibitore
sui lieivit.

Il bioetanolo è un alcol che si ottiene dalla fermentazione di biomasse dedicate o anche di scarto. In particolare, si
utilizzzano cereali amidacei come il mais e colture zuccherine come la canna da zucchero.
IL processo è diverse in basse alla materia prima utilizzata.

Nel caso delle colture zuccherine, si procede selezionando le parti della pianta contenenti zucchero. A queste viene
aggiunto del lievito di birra, per stimolare la fermentazione degli zuccheri che porta alla produzione di alcol e di
anidride carbonica. L'ultima fase di lavorazione prevede la distillazione della parte liquida per la produzione dell'etanolo
vero e proprio.

Nella lavorazione della canna da zucchero, il processo lascia come residuo la parte fibrosa della pianta, la
cosiddetta "bagassa". Si tratta di un prodotto di scarto che viene ottimamente valorizzato attraverso la
combustione e la produzione di elettricità e calore.

Nel caso dei cereali, invece, si procede innazitutto separando e selezionando i semi, per poi macinarli. Viene quindi
aggiunta dell'acqua e il composto viene sottoposto ad una breve cottura ad alte temperature (la "gelatinizzazione"), per
essere poi raffreddato. Dopo questa fase di pre-trattamento, vengono aggiunti particolari enzimi (le amilasi) che
trasformano gli amidi in zuccheri semplici, adatti alla fermentazione alcolica. A questo punto, si procede alla
centrifugazione, poi distillazione (n° piatti elevato) e al vero e proprio etanolo.

Dal processo di lavorazione dei cereali, dopo la centrifugazione, si ricavano buoni quantitativi di sottoprodotti utilizzabili
come mangimi animali.

IL processo biochimco della produzione dell’alcol etilico inizia con la glicolisi, con cui dal glucosio
otteniamo 2 moli di piruvato, 2 ATP e 2 NADH2+.
Il NADH prodotto deve essere rioassidato x essere nuovamente disponibile come NAD+, questa è
legata al destiono del piruvato che in condizioni anaerobiche viene inizialmente trasformato in
acetaldeide + CO2 e poi in alcool etilico.

ACIDO LATTICO
Materie prime più utilizzate:

1. Glucosio o sciroppo di glucosio da amido idrolizzato (saccarificazione dell'amido con malto

d'orzo o con amilasi batteriche e/o glucoamilasi fungigne)
2. Maltosio (amido saccarificato)
3. Saccarosio da molasse (molto usato con diversi organismi, tranne che L. bugaricus e L.
helveticus: economico ma con elevati costi di purificazione downstream)
4. Lattosio da siero di latte: basso costo ma bassa produzione (concentrazione del lattosio
bassa) ed elevati costi downstream
Bioreattori fino a 100 m3 in acciaio (l'acido lattico è corrosivo) con agitazione convenzionale

Dopo la sterilizzazione, la temperatura si abbassa (40-45°C), si completa il terreno, si inocula

(scaling up 10%) e si inizia il processo. Non c’è bisogno di areazione.

La tamponatura con CaCO3 mantiene il pH = 5,5-6. Il processo dura 2-6 giorni con dei valori di
conversione del 85-95%. In certi processi la solubilità del lattato di calcio è il fattore limitante.
downstream:

Alla fine del processo si recupera l’acido lattico trattando con H2SO4.

L'acido lattico viene passato:

su carboni attivi (eliminazione impurità e decolorazione)
esacianoferrato (eliminazione metalli)
resine a scambio ionico

oppure:
esterificazione con metanolo
distillazione frazione volatile
idrolisi dell'estere

si ottiene acido lattico 80%

ANTIBIOTICI
con il termine antibiotici si indicano quelle sostanze prodotte da microrganismo che hanno la
capacità di inibire o distruggere microganismi, anche a piccole dosi.
Gli antibiotici possono essere prodotti esclusivamente x fermentazone o x via semisintetica, ovvero
modificando x sintesi chimica sostanze prodotte e isolate x via biotecnologica.
Nel 1928 Alexander Fleming scoprì il primo anitbiotico, la penicillina, prodotto dalla muffa Penicillium
facente parte degli Aspergillus.

Le penicilline sono una famiglia di composti avente un anello di 4 atomi, Beta lattamico ossia un
ammide chiusa sul carbonio Beta e sull’alfa è presente un altro ammide legato al gruppo R, e un
anello eterociclico in cui è presente lo zolfo.
Alcuni microrganismi hanno sviluppato enzimi in grado di idrolizzare il legame amminico, per cui
sono antibiotici resistenti e quando avviene si va a funzionalizzare R, arrivando alla 4° generazione
di antibiotici.

Gli antibiotici beta lattamici si legano agli enzimi transpeptidasi , che servono alla formazione delle
catene polipeptidiche, impedendo la stratificazione dei peptidoglicani e x cui la parete cellulare non
può accrescersi in spessore e la cellula praticamente muore.

L’unica penicillina prodotta x via esclusivamente fermentativa è la penicillina G. Il microganismo

usato è la muffa Penicillium ed è stata oggetto di miglioramento del ceppo tramite mutagenesi e
manipolazione genetica che hanno alzata la concentrazione del brodo di fermetanzione.

Dato che la penicilllina G è un metabolita secondario, prodotto in maniera difensiva, la sua crescita è
significativa in fase stazionaria.
Nella fase di crescita le muffe realizzano un catabolismo completo che si compone della:
1. GLICOLISI, ottenendo il piruvato+ 2 ATP + 2 NADH
2. DECARBOSSILAZIONE del piruvato in ACETILCOA + 2 CO2 + 2 NADH
3. CICLO DI KREBS,complesso di reazione avviene all’interno dei mitocondri, ottenendo 4
CO2, 6 NADH+, 2 FADH2, 2 ATP e 2 coA.
4. FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA e riossidazione dei coenzimi ridotti, realizzata all’interno
dei mitocondri tramite la catena di trasporto degli elettroni.
5. OTTENENDO 36/38 moli di ATP.
Raggiunta la fase stazionaria, dopo 3 gg circa, il catabolismo inizia a rallentare e inizia la fase di
produzione di penicillina che sfrutta due intermedi della glicolisi, il 3 fosfoglicerato e il piruvato, e un
intermedio del ciclo di Krebs, l’ alpha chetoglutarato.

PREPARAZIONE INOCULO E PRODUZIONE

La produzione è effettuata in fermentatori discontinui con un ciclo produttivo della durata di 5/7 gg, a
PH neutro e una temperatura di circa 23-30°.
Nel fermentatore viene posto l’inoculo costituito da ceppi di penicillium, sottoposto a fase di
vegetazione, ossia attivazione e accrescimento.
questo costitutisce meno del 10% del brodo, in cui sono presenti fonti di carbonio (zuccheri§) zolfo e
eventualmente un precursore specifico( acido fenilacetico)
ACIDO CITRICO
L’acido c. delle cellule dei tessuti animali non è di origine alimentare, ma si forma localmente da altri
composti; esso concorre alla regolazione fisiologica dell’equilibrio acido-base nell’organismo ed è un
prodotto intermedio della catena di reazioni metaboliche detta ciclo dell’acido c. (o ciclo di Krebs).
Questo porta all’ossidazione di frammenti a due atomi di carbonio, che entrano nel ciclo come
acetilcoenzima A (➔ coenzima) e provengono dal metabolismo dei glucidi, degli acidi grassi, di
alcuni amminoacidi e da altre reazioni del metabolismo intermedio; il ciclo avviene nella matrice dei
mitocondri, in quasi tutti i tessuti e organismi ed è essenzialmente unidirezionale; l’acido c. (a 6
atomi di carbonio) si forma per condensazione dell’acido ossalacetico (a 4 atomi di carbonio) con il
gruppo acetile dell’acetilcoenzima A, a opera della citratosintetasi.
è necessario bloccare l’enizima aconitasi che catalizza la reazione successiva, tramite aggiunta di
EDTA che sequestra il Fe(II), cofattore dell'enzima aconitasi, oppure per aggiunta di Cu(II), che si
lega all’enzima meglio del ferro.

estrazione da agrumi: resa massima <9%;

- per via fermentativa aerobica da materie prime saccarosiche, con l’impiego delle muffe Aspergillus
niger.
FASI DEL PROCESSO:
1. ● PREPARAZIONE inoculo e accrescimento da spore germinate, 1-2 settimane;
2. ● PURIFICAZIONE delle materie prime [brodo di coltura]: filtrazione e scambio ionico
(eliminazione ioni Mn [da’ac.ossalico] Mg Zn Fe, cofattori di enzimi coinvolti in altri cicli
metabolici che abbassano la resa totale);
3. ● STERILIZZAZIONE del brodo;
4. ● FERMENTAZIONE: brodo di coltura + inoculo,
microrganismo aerobio che richiede forte aerazione ottenuta tramite agitazione; pH iniziale
<4, in seguito pH <3; processo fortemente esotermico, regolato a T30°C; uso di oli come
antischiuma; resa 80% rispetto al carboidrato iniziale; tempo variabile, a seconda della
carica, t=5÷14day; al termine si precipita con calcio l’acido ossalico che è un sottoprodotto;
5. ● FILTRAZIONE del brodo coltura/biomassa;
6. ● PRECIPITAZIONE a 80° e pH 7: liquido + Ca(OH)2 [opp.CaCO3]→ Ca-citrato↓ [+CO2];
FILTRAZIONE per separare precipitati e contaminanti;
7. ● DISSOLUZIONE del precipitato in ac.solforico a T<60°C: Ca-citrato + ac.solforico →
soluzione ac.citrico + Ca-solfato↓; FILTRAZIONE per eliminare Ca-solfato;
8. ● TRATTAMENTI FINALI: PURIFICAZIONE del liquido ac.citrico con Carbone attivo e
Scambio Ionico; CONCENTRAZIONE – CRISTALLIZZAZIONE – CENTRIFUGAZIONE –
ESSICCAMENTO – STOCCAGGIO -

DEPURAZIONE ACQUE

Un IMPIANTO di DEPURAZIONE è costituito da una serie di trattamenti, volti alla rimozione degli
inquinanti presenti nelle acque di scarico; a seconda dell’origine, scarichi domestici, scarichi
industriali di vario genere, scarichi di provenienza agricola, cambiano le tipologie di trattamento. In
questa sezione si analizza i trattamenti di acque reflue URBANE.