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01/06/2020

IL DNA

L’acido desossiribonucleico o DNA è un biopolimero costituito da due


catene avvolte in una spirale a doppia elica. Ciascuna catena consiste in una
sequenza di nucleotidi, i deossiribonucleotidi, le unità fondamentali che
compongono il DNA, costituiti da un acido fosforico, un glucide
(deossiribosio) e una base. I nucleotidi sono collegati tra loro mediante un
legame fosfodiesterico. Il nucleotide trifosfato presenta in posizione 5’ tre
fosfati; per la formazione del legame fosfodiesterico il nucleotide perde due
fosfati (pirofosfato) e lega il singolo gruppo fosfato rimasto con il gruppo
ossidrilico (OH) presente in posizione 3’ del nucleotide successivo. L’energia
necessaria per attuare il legame deriva dalla rottura del legame fosfato tra
i fosfati, altamente energetico, con liberazione del pirofosfato. Le basi
possono essere puriniche
(adenina e guanina) o
pirimidiniche (timina e citosina).
Le purine si appaiono con le
pirimidine secondo l’ordine
adenina-timina e citosina-guanina.
Questa complementarietà crea la
spirale a doppia elica grazie alla
formazione di ponti idrogeno tra le
basi, mantenendo una distanza
sempre costante tra i due filamenti.
Le informazioni genetiche portate
dal DNA risiedono proprio nella
sequenza nucleotidica che vanno a formare ciascun filamento di DNA. Le
fondamentali informazioni conservate all’interno del DNA permettono al
nostro organismo di sintetizzare le catene di amminoacidi, elemento
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fondamentale per la sopravvivenza dell’organismo. Durante la duplicazione


cellulare, il DNA viene replicato in modo tale che la nuova cellula figlia possa
ottenere la stessa molecola di DNA della cellula madre. La duplicazione del
DNA è detta semiconservativa: durante la replicazione, la spirale di DNA
viene sciolta ottenendo due filamenti di DNA separati e su questi verrà a
costruirsi il filamento complementare. Le due molecole di DNA, identiche
tra loro previe mutazioni, avranno un filamento vecchio ed un filamento
nuovo. La sintesi dei filamenti complementari, però, non avviene nella
medesima maniera per ambedue i filamenti. Il DNA è detto antiparallelo
poiché i due filamenti hanno direzioni opposte: uno è in direzione 3’-5’,
l’altro in direzione 5’-3’. Ciò significa che mentre una estremità di un
filamento comincia con un gruppo ossidrile in posizione 3’ e termina con un
gruppo fosfato in posizione 5’ all’estremità opposta, il filamento
complementare comincerà con il gruppo fosfato 5’ e terminerà con il gruppo
ossidrilico in posizione 3’. Questo elemento è di grande rilevanza poiché la
direzione identifica i due filamenti come filamento veloce quello con
sequenza 5’-3’ e filamento lento quello 3’-5’. Ciò è dovuto alla direzione di
azione della DNA polimerasi, ovvero direzione 5’-3’. Il filamento di DNA
complementare al filamento veloce viene sintetizzato in continuo a partire
da un primer. La DNA polimerasi non è in grado di sintetizzare nuovi
filamenti dal nulla, ma è in grado solo di aggiungere nucleotidi a partire da
un filamento preesistente. A tal fine interviene la RNA Primasi che sintetizza
un primer complementare al filamento stampo; in questo modo la DNA
polimerasi comincia ad aggiungere nucleotidi e a formare il filamento
complementare in continuo, data la stessa direzionalità del filamento stampo
rispetto alla direzionalità d’azione della DNA Polimerasi. Per il filamento
lento, invece, la situazione è differente. La DNA Primasi deve sintetizzare
numerosi primer per permettere alla DNA Polimerasi di sintetizzare il
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filamento complementare rispettando la sua direzionalità 5’-3’. In questo


modo si ottengono numerosi frammenti denominati frammenti di Okazaki.
Attraverso la DNA Ligasi, i frammenti di Okazaki vengono successivamente
uniti ottenendo così il filamento completo. Una volta formatisi i due nuovi
filamenti, essi si appaieranno col rispettivo filamento complementare,
ripristinando la doppia elica a spirale. Si ottengono così due molecole di
DNA costituite da un filamento nuovo ed uno vecchio. La nuova molecola d
DNA sarà destinata alla cellula figlia.

Per la sintesi delle proteine, di fondamentale importanza è il ruolo che riveste


l’RNA. Esistono 3 tipi di RNA in tutti gli organismi cellulari: RNA messaggero
(mRNA), RNA di trasporto (tRNA), RNA ribosomiale (rRNA). Tramite l’RNA
polimerasi viene trascritto un filamento di mRNA a partire da una sequenza
nucleotidica specifica di un gene codificante per una determinata proteina.
Il gene è l’unità ereditaria fondamentale di tutti gli organismi viventi ed è
costituito da DNA. L’RNA è costituito dalle basi azotate adenina, uracile,
citosina e guanina poiché durante la trascrizione del DNA, la timina viene
sostituita con l’uracile. L’mRNA sintetizzato si dirige verso i ribosomi per
essere tradotto in proteina. L’mRNA si inserisce fra le due subunità inferiore
e superiore del ribosoma. La subunità superiore contiene tre siti: A, P, E. Nel
sito A si inseriscono i nuovi tRNA, nel sito P avviene la formazione del legame
peptidico tra il nuovo AA trasportato da un tRNA con il resto della catena
amminoacidica, il sito E permette la fuoriuscita dei tRNA. L’attacco tra il tRNA
e l’mRNA all’interno dei ribosomi è reso possibile dall’rRNA. Ma come
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avviene precisamente l’appaiamento


tra il tRNA e l’mRNA? Il tRNA è
costituito da tre braccia: D, A, T. Il
braccio T permette l’inserimento del
tRNA all’interno del ribosoma, il
braccio A contiene l’anticodone, una
regione costituita da tre nucleotidi
(tripletta) complementare ad una
specifica tripletta dell’mRNA. È per
questo motivo che ogni AA è
codificato da una tripletta: ogni AA è
trasportato da uno specifico tRNA, il
quale contiene un anticodone che è complementare ad una specifica
regione presente all’interno dell’mRNA. I vari tRNA si appaieranno all’mRNA
in sequenza in base alle rispettive triplette presenti. In questo modo viene
rispettata la corretta sequenza amminoacidica durante la sintesi della
proteina. Nel nostro corpo esistono 20 AA, 9 dei quali essenziali ed
assimilabili solo durante la nutrizione, in quanto il nostro organismo non è in
grado di sintetizzarli. Ogni AA, come già detto, è codificato da una tripletta
(sequenza di 3 nucleotidi) e nel nostro corpo sono presenti 4 differenti
nucleotidi in relazione alle 4 basi azotate esistenti. Ciò significa che esistono
43 = 64 possibili combinazioni e solo 20 AA esistenti. Pertanto più triplette
codificano per lo stesso amminoacido e 3 di queste codificano per un
codone di stop. Il codone di stop è una tripletta codificante per nessun AA e
blocca la traduzione del filamento di mRNA in proteina. Le proteine
sintetizzate, però, non sono ancora mature; il reticolo endoplasmatico ruvido
(RER) le impacchetta in vescicole per poi inviarle all’apparato di Golgi, dove
matureranno.
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Come già accennato prima, i geni sono le unità ereditarie fondamentali di


tutti gli organismi viventi; sono contenuti in strutture bastoncellari
denominate cromosomi, ove risiedono le informazioni genetiche. L’insieme
delle informazioni genetiche prende il nome di genoma. Il genoma è ciò che
caratterizza e differenzia ciascun individuo. Nell’uomo sono presenti 23
coppie di cromosomi.
Durante l’accoppiamento e la
fecondazione, viene unita la
metà del patrimonio genetico
proveniente dal maschio con
l’altra metà derivante dalla
femmina. Il crossing-over
permette di ricombinare il
materiale genetico, permettendo una praticamente illimitata varietà genica
di specie. I primi 22 cromosomi, autosomi, identificano i caratteri somatici
di ogni individuo, cioè l’aspetto estetico. La 23esima coppia, eterosomi, è
definita sessuale poiché identifica il sesso, maschio o femmina, a seconda se
i cromosomi sono XX (femmina) o XY (maschio). Le nostre cellule sono
definite diploidi (2n) data la presenza di coppie di cromosomi. I primi 22
sono omologhi e le coppie presentano gli stessi geni, nella 23esima coppia,
invece, i due membri sono differenti.

In conclusione si può affermare che il nostro corpo, pur essendo


enormemente complesso, è regolato da un numero relativamente basso di
geni, circa 20 000, di gran lunga inferiore ad altri organismi come ad
esempio topi o protisti come le amebe. Questo è dovuto al fatto che i nostri
geni possono dar origine ad una grandissima varietà di proteine differenti.
Durante la trascrizione del DNA, l’mRNA originato non è subito maturo (pre-
mRNA) ma presenta delle sequenze non codificanti per la proteina di
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interesse, denominate introni; la maturazione avviene mediante il processo


di splicing in cui le sequenze introniche vengono eliminate e le sequenze
nucleotidiche rimanenti dal taglio, dette esoni, vengono unite. L’unione
degli esoni genera il filamento di mRNA maturo, pronto per essere tradotto
in proteina dai ribosomi.
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Metodi di separazione e purificazione delle proteine

Esistono svariati metodi per la separazione delle proteine e sono sfruttati per
poter isolare specifiche proteine a fini di studio o diagnostici. Lo studio
dell’insieme delle proteine presenti all’interno della cellula, proteoma, è
definito proteomica. Il proteoma definisce la biochimica cellulare. La sua
definizione permette di incrementare la comprensione dei meccanismi del
funzionamento cellulare. Il riconoscimento delle componenti di un
proteoma decorre mediante l’uso di un insieme di tecniche di
riconoscimento detto profiling delle proteine o proteomica di
espressione.

Il profiling delle proteine si svolge in due fasi:

1. Separazione delle proteine di un proteoma,


2. Identificazione delle singole proteine separate.

La separazione avviene sfruttando principalmente l’elettroforesi


bidimensionale:

Viene usato il gel di poliacrilammide. Le proteine vengono separate in base


alla loro carica netta tramite isoelettrofocalizzazione. Tale tecnica sfrutta il
fatto che, avendo ogni amminoacido un punto isoelettrico differente e di
conseguenza una carica differente a seconda del valore del pH, ogni
proteina avrà pertanto una carica differente in relazione agli amminoacidi di
cui è composta. La seconda separazione avviene in base al peso molecolare
mediante elettroforesi SDS-PAGE. Sul gel di poliacrilammide, oltre ad
essere presenti le proteine, viene aggiunto un solvente chiamato sodio
dodecil solfato (SDS). Esso comprende una zona polare ed una apolare e
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permette di denaturare la proteina facendole acquisire di conseguenza una


carica negativa; in questo modo sia la forma che la carica originaria della
proteina non influiranno sul movimento della stessa. Durante la corsa
elettroforetica, le proteine verranno frenate dalla struttura della matrice a
setaccio del gel di poliacrilammide. In questo modo le proteine più grandi
percorreranno meno strada rispetto a quelle più piccole, separandosi.
Avendo carica negativa, le proteine, soggette ad un campo elettrico,
migrano dal catodo (l’elettrodo negativo) all’anodo (l’elettrodo positivo).
Nello specifico, il campo è elettro-magnetico: la presenza della carica del
flusso elettrico genera il campo elettrico e il campo magnetico è generato
dal moto della carica. Alla fine le proteine vengono colorate per potere
essere differenziate visivamente.

L’identificazione delle proteine avviene tramite spettrometria di massa.


Con questa tecnica si identifica un composto in base al rapporto
massa/carica (m/z) della sua forma ionizzata. Il processo si divide in 3 tappe:

1. Ciascuna proteina viene trattata con una proteasi che taglia in


posizioni specifiche (per esempio la tripsina che taglia dopo residui di
lisina). Si ottiene così una miscela di peptidi di lunghezza variabile tra
5 e 75 AA.
2. Determinazione della massa molecolare di ogni peptide.
3. Le masse molecolari dei peptidi rilevati vengono confrontate con le
masse molecolari dei peptidi catalogati e presenti all’interno delle
banche dati. In questo modo possiamo andare ad identificare le
proteine ed anche le eventuali forme attive ed inattive determinate
dalla presenza o meno per esempio del fosfato con conseguente
modificazione della massa peptidica.
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Altri metodi di separazione delle proteine sono:

Elettroforesi su gel di agarosio: l’elettroforesi su gel di agarosio è di per sé


molto simile a quella con il gel di poliacrilammide; la differenza sta nel fatto
che la rete di pori è più grande: 100-300 nm dell’agarosio a fronte dei 20-
150 nm della poliacrilammide. L’agarosio è un polimero polisaccaridico
(carboidrati formati da catene di unità di zucchero ripetute) derivante
dall’agar-agar (o agar), un composto usato come gelificante naturale per i
terreni di coltura. La poliacrilammide, invece, è un copolimero della
acrilammide, una neurotossina. Il copolimero è una macromolecola la cui
catena è composta da unità ripetitive di due o più specie differenti; il
copolimero della poliacrilammide è costituito da acrilammide e
N,N’-metilen-bis-acrilammide, un agente reticolante.kkkkkkkkkkkkkkllllllkk

Centrifugazione: nella centrifugazione viene sfruttata la forza centrifuga,


una forza newtoniana che tende a spingere verso il basso i materiali,
separandoli in base alla loro densità. Attraverso la modulazione della
velocità, si impostano i giri al minuto della centrifuga, aumentando o
diminuendo così la forza centrifuga. Per esempio, in una provetta è
presente un omogenizzato cellulare: modulando la velocità, otteniamo una
forza centrifuga adatta alla sedimentazione di tutte le particelle cellulari e
organuli (strutture fondamentali per la sopravvivenza della cellula eucariota)
ottenendo un sedimento misto e un sopranatante (fase superficiale
soprastante al sedimento) contenente le proteine da separare. Una volta
prelevato il sopranatante, si possono separare le varie proteine o per
centrifugazioni successive a velocità modulate ben precise, o attuando
metodi di separazione differenti. Le particelle cellulari e organuli si possono
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recuperare per essere usati in sistemi acellulari purificati, facendo


espletare la loro funzione in vitro per studi biochimici.

Cromatografia: È caratterizzata dalla presenza di due fasi principali dette:


fase stazionaria e fase mobile. Il diverso grado di polarità tra queste due
fasi determina il coefficiente di ripartizione, cioè il diverso grado di
suddivisione, tra le 2 fasi, che le molecole in esame subiscono per poter
essere isolate e studiate. Esistono varie tipologie di cromatografia:

- Su colonna: viene detta anche cromatografia liquida a bassa


pressione. All’interno di una
colonna di vetro con un rubinetto
(una buretta per esempio) è
contenuto un polimero poroso detto
fase stazionaria. All’interno di
questa colonna viene versato un
campione contenente le proteine
da separare. Per la separazione
delle proteine viene versato un
solvente detto fase mobile, che
trascina con sé le singole proteine. Durante il tragitto iniziale del
campione, in base alla diversa affinità di reazione delle proteine con la
fase stazionaria, esse scenderanno più o meno velocemente,
separandosi. Verranno a formarsi differenti fasi contenenti ciascuna
una specifica proteina. Attraverso l’ausilio del rubinetto e dei rilevatori,
le gocce della miscela fase mobile-proteine, verranno
scrupolosamente separate in provette differenti. I rilevatori emettono
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luce ultravioletta che viene assorbita dai legami ammidici delle


proteine; questo permette di capire il punto di inizio, massimo e fine
concentrazione delle proteine di ciascuna fase.

- Per filtrazione su gel: all’interno di una colonna è presente la fase


stazionaria, costituita da granuli di polisaccaridi porosi. Il campione
contenente le proteine da separare costituisce la fase mobile. In base
alla grandezza delle proteine, esse passeranno all’interno dei pori o
scivoleranno all’esterno dei granuli, attraversando più o meno
rapidamente la colonna. A seconda della porosità dei granuli del
polisaccaride possiamo andare ad identificare approssimativamente le
dimensioni delle proteine.

- A scambio ionico: una membrana polimerica costituisce la fase


stazionaria. Il polimero presenta sulla superficie delle cariche elettriche
che possono essere positive o negative, a seconda dei gruppi
funzionali presenti. In relazione al pH e alla natura delle proteine
derivante dalla loro costituzione amminoacidica, la fase mobile
presenterà in prevalenza cariche positive o negative. Scegliendo il
materiale polimerico della fase stazionaria e andando a lavorare sui
parametri di pH, si possono andare a rendere le proteine più o meno
affini alla fase stazionaria, influenzando l’avanzata dell’eluizione ed
andando a frazionare ed isolare le proteine di interesse. Per recuperare
le proteine legate alle resine, basta lavare queste ultime con una
soluzione basica o acida a seconda dei casi.
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- Di affinità: la fase stazionaria è costituita da granuli legati ad una


molecola, detta ligando, molto affine alla proteina che si vuole isolare.
Se la fase mobile è un enzima, il ligando può essere una molecola di
substrato affine, se invece stiamo andando ad isolare un antigene, il
ligando può essere il suo anticorpo. Dopo che la molecola di interesse
si è legata al ligando ed è stata separata dalle altre proteine, per
recuperarla basta aggiungere una soluzione contenente grandi
quantità di ligando in forma libera. In questo modo la proteina
ricercata romperà i legami con il ligando della fase stazionaria e si
legherà al ligando libero, recuperandola facilmente.

- HPLC: detta anche cromatografia liquida ad alte prestazioni. Attraverso


l’ausilio di una pompa viene spinta a forte pressione (fino a 500 bar) la
fase mobile in una colonna contenente la fase stazionaria. La fase
stazionaria è costituita da sfere si silice della grandezza variabile da 2 a
10 µm. In questo modo vi è una grande superficie di interazione tra
fase mobile e fase stazionaria e si riescono a frazionare le proteine più
rapidamente e più efficientemente rispetto alle altre tecniche.
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CAR-T

La terapia genica sfrutta la ricombinazione genica per curare patologie che


non sarebbe possibile “sconfiggere” con i metodi tradizionali. Attraverso
l’inserzione di transgeni all’interno di elementi biologici specifici, è possibile
conferire loro capacità curative che non hanno naturalmente. Una
importante terapia genica è la CAR-T. Il gene utilizzato è il gene CAR,
recettore antigenico chimerico. Tramite un vettore virale inattivato
(retrovirus), in laboratorio è possibile inserire il gene CAR all’interno del
genoma dei linfociti T. I linfociti T ingegnerizzati con questo gene sono in
grado di esprimere una proteina in grado di riconoscere il recettore CD19
presente sulla superficie dei linfociti B. Questa terapia è usata per la cura
della leucemia linfoblastica acuta, una patologia determinata da una
proliferazione neoplastica di una cellula staminale emopoietica. Questa
replicazione incontrollata causa un eccesso di globuli bianchi all’interno
dell’organismo ed una conseguente riduzione del numero delle piastrine e
dei globuli rossi. La terapia è in grado di distruggere tutti i globuli bianchi
che presentano il recettore CD19 sulla loro superficie, rendendola altamente
mirata e precisa. Successivamente al riconoscimento dei globuli bianchi da
parte dei linfociti T, inizia la risposta immunitaria cellulo-mediata. Il rilascio di
perforine da parte dei linfociti T causa la formazione di fori transmembrana
nei linfociti B e il successivo rilascio di Granzima B permette la distruzione
di quest’ultimo. Il Granzima B è una serina-proteasi in grado di andare ad
attivare le caspasi effettrici, delle proteine dette proteasi, che sono in grado
di andare a tagliare le proteine in prossimità di un residuo di acido aspartico.
Tali caspasi sono sintetizzate in forma inattiva dalle caspasi iniziatrici e
vengono attivate dal Granzima B andando ad eliminare dalla caspasi
effettrice un AA di serina. Ciò provoca la morte apoptotica della cellula. L’alta
aggressività della terapia, però, in alcuni casi ha portato alla morte del
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paziente per un eccesso di citochine liberate. La soluzione a tale problema è


stata l’inserzione di un gene suicida all’interno dei linfociti B. Tale gene
esprime l’informazione per la sintesi di una caspasi in grado di portare a
morte la cellula, la caspasi-9-inducibile (iCasp9), costituita dalla caspasi-9
e dalla proteina legante umana FK.

Tale iCasp9 è sintetizzata in


forma inattiva; l’attivazione di
tale proteasi è permessa da
un farmaco la cui molecola
ligando si inserisce in mezzo
ai due siti attivi di due FK,
creando un dimero di
iCasp9, che rappresenta la
forma attiva.
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Anticorpi monoclonali

Gli anticorpi sono una classe di


glicoproteine (proteine legate a una
catena di zuccheri) a carattere reattivo
difensivo presenti nel siero del sangue,
prodotti dai linfociti B; gli anticorpi
monoclonali sono anticorpi identici fra
loro, generati da un solo tipo di linfocita
B. Gli anticorpi sono di fondamentale
importanza nella risposta immunitaria:
costituiscono la risposta immunitaria
umorale (o anticorpo-mediata). Essi sono
in grado di rilevare gli agenti estranei
all’organismo legandosi all’antigene
specifico presente sulla superficie
cellulare del patogeno. Gli anticorpi sono sempre specifici rispetto agli
antigeni. Una volta legatosi, opsonizza il patogeno agevolando la sua
distruzione per lisi o fagocitosi. La produzione di anticorpi monoclonali
tramite l’uso di linfociti B non è però possibile a causa della loro breve vita in
vitro. Per questo motivo sono usati gli ibridomi. Gli ibridomi sono il prodotto
di fusione tra una cellula mielomatosa ed un linfocita B. Per fare ciò viene
innanzitutto indotto un mieloma in una cavia da laboratorio preventivamente
immunizzata nei confronti di un antigene, inoculandolo. Successivamente si
rimuove la milza dall’animale per estrarre i linfociti B e si estraggono anche
le cellule mielomatose. Attraverso il polietilenglicole i linfociti B e le cellule
mielomatose vengono fusi, formando gli ibridomi. Per isolare gli ibridomi
da linfociti B e cellule mielomatose liberi, la popolazione eterogenea viene
trasferita in una coltura detta miscela HAT, contenente ipoxantina,
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aminopterina e timidina. L’ipoxantina è il precursore delle purine, la timidina


è il precursore della timina e l’aminopterina è un veleno che inibisce l’enzima
diidrofolato reduttasi. La diidrofolato reduttasi riduce dapprima l’acido folico
ad acido diidrofolico e successivamente quest’ultimo a tetraidrofolato. Il
tetraidrofolato è coinvolto nelle reazioni di sintesi delle purine e della timina.
In questo modo, inibendo la diidrofolato reduttasi, si impedisce anche la
formazione delle basi azotate, rendendo impossibile alle cellule
mielomatose di riprodursi e sopravvivere. Gli ibridomi, però, contengono al
loro interno l’enzima HGPRT (ipoxantina-guanina fosforibosil transferasi),
presente all’interno dei linfociti B, in grado di sintetizzare le basi azotate a
partire dai loro intermedi. In questo modo gli ibridomi, grazie alla presenza
nella miscela HAT della ipoxantina e della timidina, possono sintetizzare le
basi azotate permettendo la loro replicazione. I linfociti B non fusi, essendo
privi della capacità di replicazione illimitata e della immortalità delle cellule
mielomatose, saranno in grado di sopravvivere nel terreno per un massimo
di due settimane prima di morire. Una volta isolati gli ibridomi, si passa alla
loro clonazione per la produzione degli anticorpi monoclonali. Per questa
operazione viene
utilizzato un
bioreattore. Il
bioreattore è
costituito da un
insieme di fibre
cave di materiale
polimerico
microporoso, poste orizzontalmente una sopra l’altra. Sulla superficie di
queste fibre vengono fatti aderire gli ibridomi. I parametri di pH,
temperatura, pressione osmotica (π), e tensione di O2 sono rigidamente
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controllati. La temperatura è mantenuta costante tra i 36°C e i 37°C e il pH


oscilla tra i valori 7,2 e 7,4. Il liquido nutritivo viene inviato dal basso e
fuoriesce esausto dalla parte alta del bioreattore. Esso deve contenere
glucosio, sali minerali, amminoacidi, vitamine e siero come sostanze
nutritive; inoltre è addizionato un antibiotico per prevenire le infezioni
batteriche. Il flusso di aria è tenuto sotto controllo (tensione di O2 controllata),
viene immesso lateralmente e fuoriesce dal lato opposto. Dal terreno
esausto, successivamente, si estrae la parte proteica tramite tecnica
cromatografica a scambio ionico mediante l’impiego di resine anioniche.
Successivamente si separano gli anticorpi monoclonali dalle altre proteine
tramite la cromatografia per affinità.