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I MARCATORI TUMORALI

I marcatori tumorali sono tutte quelle sostanze biologiche (come ormoni, enzimi e proteine)
che vengono prodotte dal tessuto tumorale o dall’organismo stesso in risposta alla crescita
neoplastica.
In presenza di una neoplasia maligna spesso le concentrazioni ematiche di marcatori sono
molto superiori alla norma e pertanto questi sono a volte usati come indicatori indiretti dello
stato della malattia e della sua possibile progressione. Il sistema immunitario per riconoscere la
cellula neoplastica utilizza i marcatori tumorali. Proprio questo meccanismo ha permesso di
sviluppare nuove ed efficaci metodiche di analisi.
I marcatori tumorali si dividono in due tipi principali:
- circolanti: si possono individuare nel sangue, nelle urine, nelle feci o in altri fluidi corporei;
- tissutali: presenti sulle cellule tumorali ed identificabili nei tessuti prelevati con biopsia o
dopo asportazione chirurgica.
Il marcatore ideale dovrebbe avere le seguenti caratteristiche:
- produzione esclusiva e precoce da parte della cellula tumorale.
- concentrazione correlata allo stadio della malattia.
- non misurabile in soggetti senza tumore.
- variazioni di concentrazione in relazione all’efficacia della terapia e all’andamento della
malattia.

Nella diagnosi precoce di neoplasia o nell’identificazione di soggetti a rischio di ammalare di


tumore, il marcatore tumorale deve essere:
1) sensibile, cioè deve essere presente in tutti i pazienti con una determinata neoplasia.
2) specifico, cioè deve essere una caratteristica peculiare del tumore.

Un marcatore tumorale ideale per essere usato nello screening dovrebbe avere una sensibilità e una
specificità del 100% per evitare dei valori falsamente negativi (un marcatore tumorale è negativo in
soggetto neoplastico) o dei valori falsamente positivi (un marcatore tumorale è positivo in soggetto
con patologia benigna).
I valori falsamente positivi dei marcatori possono essere dovuti a cause non neoplastiche diverse,
tra le quali:
- abitudini di vita (fumo o alcool)
- sport estremi
- manovre diagnostiche
- interventi chirurgici.
- la presenza di patologie benigne acute o croniche
I valori falsamente negativi dei marcatori invece possono essere dovuti a:
- un tumore molto piccolo
- un tumore molto grosso, ma poco vascolarizzato
- prevalenza nel tumore di cellule che non rilasciano il marcatore

I marcatori tumorali sono sostanze normalmente assenti o presenti nel plasma in basse
concentrazioni in persone che non hanno un tumore.

I marcatori tumorali si usano in caso di:


- screening  I marcatori tumorali non devono essere usati in programmi di screening
di massa per la loro sensibilità e specificità limitata. In alcuni casi i marcatori possono
essere utilizzati per screening di popolazioni selezionate con maggiore rischio di
tumore (PSA nei maschi adulti dopo i 60 anni).
- diagnosi di tumore primitivo  Generalmente i marcatori tumorali non possono
essere di aiuto diagnostico per la loro limitata sensibilità e specificità . Fanno eccezione
alcuni marcatori dotati di alta specificità tissutale che possono essere usati in alcune
particolari patologie.
- tumore primitivo già diagnosticato  Nei tumori primitivi già diagnosticati il
dosaggio dei marcatori deve essere fatto per:
- avere un valore basale prima della terapia;
- avere indicazioni indirette sulla estensione della malattia (i valori ematici dei
marcatori sono proporzionali alla massa del tumore)
- avere indicazioni aggiuntive circa l’istotipo (tipo di cellule presenti in un determinato
tessuto) per i tumori nei quali diversi istotipi producono marcatori diversi;
- avere indicazioni prognostiche aggiuntive.

- monitoraggio a breve termine dopo la terapia primaria  Con il monitoraggio a


breve termine dopo la terapia primaria:
- I livelli elevati e persistenti dopo una terapia suggeriscono la possibile presenza di
malattia residua
- La riduzione dei livelli possono indicare la capacità del tumore di esprimere il
marker;
- Il marcatore può incidere sulle decisioni cliniche in modo critico.
- monitoraggio a lungo termine dopo la terapia primaria  Con il monitoraggio a
lungo termine dopo la terapia primaria:
- L’incremento di un livello di un marcatore tumorale può suggerire la ripresa della
malattia;
- L’incremento del livello del marcatore può precedere di parecchi mesi l’evidenza
clinico-strumentale della ripresa della malattia;
- Nel caso di neoplasie curabili in fase avanzata il marcatore può incidere in modo
critico sulle decisioni cliniche.

- monitoraggio della terapia nella malattia avanzata  Con il monitoraggio della


terapia nella malattia avanzata i marcatori sono indicatori di risposta o di fallimento
della terapia.

Il dosaggio dei marcatori è molto importante per verificare l’efficacia delle terapie oppure per
rivelare con anticipo la presenza di una eventuale ripresa della malattia nei pazienti già
trattati, in qualche caso anche per scegliere le cure più adatte.
Il dosaggio dei marcatori tumorali può avvenire attraverso:
- metodi immunometrici: utilizzano anticorpi che riconoscono
in modo specifico un dato marcatore (anticorpi monoclonali) attraverso un tracciante
(radioisotopo, enzimi, sostanze fluorescenti o chemioluminescenti) che vi è legato.
- anticorpi monoclonali: hanno la caratteristica di essere prodotti in quantità
illimitate, di essere identici tra loro e quindi di garantire la ripetibilità dei risultati, per
lo meno all’interno di ogni tipo di kit commerciale.
Il dosaggio dei marcatori difficilmente può aiutare il medico a formulare una diagnosi precoce.
Negli stadi iniziali di malattia le concentrazioni degli indicatori biologici circolanti sono spesso
troppo basse perché il test risulti utile.
Dal punto di vista della specificità tissutale sono riconoscibili:
- marcatori tumorali con elevata specificità d’organo, tra cui PSA.

L’ANTIGENE PROSTATICO SPECIFICO


L’antigene prostatico specifico (PSA) è una proteina sintetizzata dalle cellule della prostata.
Piccole concentrazioni di antigene prostatico sono normalmente presenti nel siero di tutti gli
uomini e si possono valutare tramite un semplice esame del sangue.
L’aumento dei valori del PSA totale non è fortunatamente sempre indicatore della presenza di
un tumore, ma il riscontro di un suo valore patologico è sinonimo di malattia alla prostata
implicando quindi ulteriori accertamenti: infatti variazioni dei valori del PSA nel sangue
possono essere determinati oltre che da un tumore della prostata anche da infiammazioni
prostatiche, traumi, ingrossamento prostatico benigno, attività fisica intensa e alimentazione
scorretta.
La scoperta che il PSA circola nel sangue in forme molecolari differenti (PSA complessato e
libero) rappresenta il progresso più recente per la diagnostica del carcinoma prostatico.
L’utilità di questo testo nasce dall’osservazione per cui in condizioni benigne, come l’ipertrofia
prostatica, aumenta prevalentemente la quota libera, mentre il tumore alla prostata produce
soprattutto un amento del PSA legato.
Il dosaggio del PSA è molto utile per il rilievo di ripresa di malattia e per controllare
l’andamento della terapia. Il PSA viene generalmente considerato in condizioni standard per
valori inferiori o uguali a 4 nanogrammo su millilitro, valori entro i quali si trova la maggior
parte della popolazione maschile tra i 50 e 75 anni. È possibile individuare la presenza di
cellule tumorali anche con un PSA totale inferiore a 2 g.
La presenza di valori di PSA totale inferiore a 4 nanogrammo su millilitro permette di rilevare
un significativo numero di tumori prostatici in fase ancora iniziale.

- marcatori tumorali correlati quantitativamente con un dato tipo istologico, tra cui CEA
e AFP.

L’ANTIGENE CARCINO-EMBRIONALE
L’antigene carcino-embrionale (CEA) è una glicoproteina così chiamata poiché riscontrata per
la prima volta nei tessuti carcinomatosi del colon e nel tessuto intestinale dei feti.
Tuttavia, è stato dimostrato che il suo aumento può verificarsi anche in molte altre forme
tumorali, tra cui neoplasie al polmone, alla mammella, al fegato, al pancreas e allo stomaco.
Pur non rappresentando un parametro specifico la sua determinazione, associata ad altre
indagini, è molto utile per la diagnosi di pazienti con sospetti tumori maligni.
Il valore dell'antigene carcinoembrionario è più alto in presenza di patologie neoplastiche
diffuse, ma va tenuto presente che tale valore può innalzarsi anche a causa di malattie non
tumorali, come epatite, colite, polmonite ed enfisema. Inoltre, nei fumatori, questo parametro
è, di solito, più elevato rispetto a chi non fuma.
L’antigene carcino-embrionale viene utilizzato soprattutto per individuare in modo precoce
eventuali recidive (ovvero parti della neoplasia che si sono ripresentate dopo una prima cura
o un intervento chirurgico) e la presenza di metastasi.

L’ALFA-1-FETOPROTEINA
L’alfa-1-fetoproteina è una globulina che viene principalmente prodotta dal fegato del feto.
La sua concentrazione è tipicamente elevata alla nascita. Dopo la nascita, i livelli di
alfafetoproteina cominciano a scendere sensibilmente, sino a raggiungere i valori
caratteristici dell'adulto sano (inferiori a 5 ng/mL).
L’alfa-1-fetoproteina come molti altri marcatori tumorali viene prodotta anche in condizioni
di assoluta normalità .
Nel tumore del fegato l’AFP viene utilizzato nella fase della diagnosi, in quella del
monitoraggio delle cure e per una valutazione prognostica.
Oltre alla gravidanza e al parto, le lesioni epatiche ed alcuni tipi di tumore possono
incrementare significativamente la concentrazione di AFP.
L'AFP è anche un marcatore di alcuni tumori del testicolo e dell’ovaio: in queste patologie ha
grande importanza clinica, essendo indispensabile sia per la progressione del tumore sia
per valutare l'effetto delle cure. Questo marcatore si può dosare per immunodiffusione radiale
e tramite tecnica ELISA.

LA PROTEINA C REATTIVA
La proteina C reattiva (PCR) è una beta-proteina che compare nel sangue in conseguenza
di molti processi infiammatori. Essa aumenta in condizioni infiammatorie croniche o acute
(come infezioni batteriche, virali).
Il suo nome deriva dalla capacità di precipitare, in presenza di ioni calcio ,il polisaccaride C
dello pneumococco.
Pur non essendo un indice specifico permette di seguire l'evoluzione della malattia ,in quanto
compare precocemente e scompare dopo la remissione.
L'esame della PCR misura la quantità di proteina nel sangue, al fine di rilevare uno stato
infiammatorio o monitorare la progressione di una malattia infiammatoria cronica.
La PCR può essere rilasciata in circolo entro poche ore da un danno tissutale, dall’inizio
dell’infezione o dall’insorgere di altre cause di infiammazione. 
Un aumento importante si osserva dopo un trauma o un attacco cardiaco, in presenza
di patologie autoimmuni, oppure in presenza di un’infezione batterica grave.
La PCR non è diagnostica, ma fornisce informazioni sull'eventuale presenza o assenza di uno
stato infiammatorio. Questa informazione può essere usata insieme ad altri dati come
i segni e sintomi o i esami, per la diagnosi di una patologia infiammatoria acuta. 
Dato il suo potere antigenico è possibile allestire specifici antisieri utilizzati per la sua
individuazione nel siero in esame .
Con questi antisieri (immunoglobuline ,cioè anticorpi anti PCR) vengono sensibilizzate
particelle di lattice di polistirolo che verranno agglutinate dalla PCR eventualmente presente
nel siero del paziente.
Per poter allestire specifici antisieri bisogna eseguire diversi passaggi:
- Utilizzare siero intero o siero diluito in tampone specifico

- Mescolare 1goccia di siero intero con una goccia di reattivo al lattice su vetrino a fondo
scuro
- Ruotare lentamente il vetrino e osservare l'eventuale agglutinazione dopo un minuto

- Ripetere l'operazione con il siero diluito


La determinazione della PCR si può effettuare in modo semi-quantitativo, utilizzando
diluizioni progressive del siero. Il risultato è espresso dalla più alta diluizione del siero ancora
in grado di dare agglutinazione.
LA VELOCITA’ DI ERITROSEDIMENTAZIONE (VES)
La velocità di eritrosedimentazione (VES) è un test che misura indirettamente il grado di
infiammazione presente nell’organismo.
L’esame consiste nel misurare la velocità con cui gli eritrociti (globuli rossi; rappresentano la
parte corpuscolata del sangue) impiegano a precipitare (sedimentare) in un campione di
sangue posto in un tubo verticale di altezza standard, alto e stretto.
Il risultato di tale esame è riportato in millimetri di fluido (plasma) presenti nella porzione
superiore del tubo dopo un’ora. Il valore viene espresso con un indice di Katz e si ottiene
sommando il valore letto alla prima ora alla metà del valore letto dopo due ore, e dividendo il
risultato per due.
In condizioni normali tale indice è di 4-10 nell’uomo e di 5-15 nella donna.
LA PET
La PET, definita tomografia ad emissione di positroni, è un’indagine non invasiva che si
esplica fondamentalmente nella iniezione endovenosa di una piccola quantità di una sostanza
radioattiva (radiofarmaco) e successivamente nella rilevazione della sua distribuzione
corporea attraverso un apparato di scansione. Ciò ha lo scopo di indagare una specifica
funzione tessutale o d’organo e valutarne eventuali anomalie patologiche. La PET trova
impiego prevalentemente in ambito oncologico, neurologico e cardiologico. L’esame viene
eseguito con un apparecchio che combina la scansione PET a quella TAC (tomografia
computerizzata). Quest’ultima, a seconda del quesito clinico, può essere
eseguita senza o con mezzo di contrasto.

L’emissione di positroni è una forma di radioattività , in cui un protone all’interno di un nucleo


atomico trasformato in un neutrone.
Il positrone è una particella che ha stessa massa e spin dell’elettrone ma carica opposta: viene
messo dal nucleo con energie variabili da zero fino all’energia massima caratteristica di
ciascun nucleo.

Un tomografo ad emissione di positroni si basa sulla rivelazione in coincidenza della radiazione di


annichilazione generata dall’interazione tra il positrone e messo da un nucleo radioattivo ed un
elettrone della materia circostante.

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DELLA PET


Un isotopo tracciante con breve tempo di vita e legato ad una molecola metabolicamente attiva (in
genere uno zucchero), viene iniettato (solitamente per via endovenosa) nel soggetto da esaminare. Il
radiofarmaco viene assimilato dal corpo come se fosse glucosio semplice, concentrandosi
maggiormente nelle zone che hanno un metabolismo più accelerato (le regioni che consumano
glucosio in maggior quantità sono le cellule tumorali, i reni e le zone attive del cervello). Quando la
molecola metabolicamente attiva raggiunge una determinata
concentrazione all’interno del tessuto interessato, il paziente viene posizionato all’interno di uno
scanner.

TOMOGRAFIA COMPUTERIZZATA
La tomografia computerizzata, detta anche TAC, è una tecnica radiologica, non invasiva, che
fornisce una serie di immagini in sezione e tridimensionali del corpo consentendo di distinguere i
vari organi e tessuti in base alla loro densità. Questa tecnica sfrutta le radiazioni ionizzanti (o raggi
X) per ottenere immagini dettagliate.
 L'apparecchiatura per la TAC comprende:

 L'unità di scansione a forma di grande ciambella, chiamata gantry. È la sorgente


radioattiva;
 Il generatore;
 Il supporto su cui posizionare il paziente. In genere, è un lettino scorrevole;
 Un elaboratore elettronico;
 Una console di comando per la visualizzazione delle immagini tridimensionali;
 Un sistema di registrazione dei dati acquisiti.
La TAC è un valido supporto all'individuazione di:

 Tumori, sia benigni che maligni

 Malattie e malformazioni vascolari


 Stati infiammatori 
 Metastasi;
 Malattie e condizioni dell'apparato scheletrico 
 Conseguenze di infezioni o di importanti infortuni traumatici (es: emorragie).

La TAC, inoltre, è una procedura che può servire da:

 Guida nella pianificazione della radioterapia per un tumore;


 Guida nella pianificazione degli interventi chirurgici a un dato organo o vaso
sanguigno, o a una certa struttura ossea;
 Strumento per il monitoraggio di certe malattie (es: tumori) e per la valutazione
dell'esito di un determinato intervento chirurgico 
L’IMMAGINE DELLA TOMOGRAFIA COMPUTERIZZATA
RISONANZA MAGNETICA
La risonanza magnetica è un esame diagnostico che permette di visualizzare l'interno
del corpo umano esponendolo soltanto a campi magnetici non pericolosi.
La risonanza magnetica fornisce immagini tridimensionali chiare e dettagliate dei
cosiddetti tessuti molli (nervi, muscoli, legamenti, adipe, vasi sanguigni ecc.) e dei
cosiddetti tessuti duri (ossa e cartilagini);ciò la rende un test di assoluta rilevanza in
numerosi campi della medicina: dalla traumatologia all'oncologia, passando per l'ortopedia, la
gastroenterologia, la cardiologia.
La risonanza magnetica sfrutta le potenzialità di una grande magnete, per produrre una serie
di campi magnetici atti a modificare l'orientamento degli atomi di idrogeno presenti nelle
singole cellule del distretto anatomico di interesse.
RADIOGRAFIA
Esistono vari tipi di esami di diagnostica per immagini potenzialmente utili per la diagnosi
delle patologie muscolo-scheletriche, tra cui le radiografie.
La radiografia è la tecnica che consente di ottenere immagini del contenuto di un solido mediante
impressione di un elemento sensibile da parte di radiazioni ionizzanti tra cui raggi X o raggi
gamma.
Il meccanismo di formazione dell’immagine è legato al differente assorbimento delle radiazioni nel
pezzo in funzione della variazione di spessore, dei diversi costituenti chimici, della presenza di
difetti o di eventuali fenomeni di scattering.
L’informazione ottenibile da un singolo controllo radiografico è bidimensionale e, come tale, deve
essere integrata con altre radiografie o con altri metodi volumetrici affinché la discontinuità possa
essere completamente caratterizzata.
Però ti ho grafia e sono molto utili per individuare anomalie delle ossa e vengono effettuate per
esaminare le aree dolorose e deformate.
Le radiografie possono aiutare spesso a diagnosticare fratture, tumori, lesioni, infezioni e deformità.
Le radiografie non mostrano i tessuti molli, come i muscoli, legamenti, tendini o nervi. Per
accertare la presenza di un’eventuale lesione articolare, il medico può
richiedere una radiografia standard (senza carico) o una radiografia eseguita mentre l’articolazione
viene sollecitata in determinate posizioni (radiografia sotto carico).
Gli esami diagnostici di medicina nucleare forniscono mappe di localizzazione dei radio isotopi
somministrati ai pazienti che danno indicazioni sulla funzionalità degli organi. Per evidenziare un
particolare organo, il radioisotopo deve essere somministrato nella forma di un agente chimico
(radio farmaco) che viene accumulato di preferenza nell’ organo in esame (per esempio lo iodio
nella tiroide) o viene usato nelle sue funzioni fisiologiche. La differenza di concentrazione di
radioisotopo tra gli organi di interesse e quelli adiacenti è in generale piccola e genera poco
contrasto.

SCINTIGRAFIA OSSEA
La scintigrafia ossea è una procedura di diagnostica per immagini talvolta utilizzata per
la diagnosi delle fratture, soprattutto quando altri esami, come le normali radiografie, la
tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica per immagini (RMI), non le
evidenziano. La scintigrafia ossea comporta l’uso di una sostanza radioattiva che viene
assorbita da tutte le ossa in fase di guarigione. La procedura può essere eseguita anche
quando si sospetta un’infezione ossea o un tumore che si sia diffuso da un cancro
presente in un’altra parte del corpo. Anche se una scintigrafia ossea può rivelare un
problema all’osso, potrebbe non indicare se si tratta di una frattura, di un tumore o di
un’infezione. La sostanza radioattiva è iniettata in vena (per via endovenosa) ed è
rilevata da un dispositivo scintigrafico, che crea un’immagine dell’osso, osservabile
sullo schermo di un computer.

LA DESINTOMETRIA OSSEA

L’ECOGRAFIA
ARTOSCOPIA

ALLESTIMENTO DI UN CAMPIONE
Le tecniche istologiche rappresentano quell'insieme di tecniche e operazioni che
permettono la preparazione di un tessuto biologico per l'esame al microscopio.
L’allestimento di preparati microscopici implica una serie di operazioni che consistono in:
 Prelievo;
 Fissazione;
 Inclusione;
 Sezionamento;
 Montaggio;
 Colorazione.

PRELIEVO
La prima fase dell’allestimento è il prelievo dei campioni che prevede l’estrazione di
determinati tessuti.
Questa fase deve avvenire molto rapidamente, in modo da evitare i traumi che
sopraggiungono in seguito alla morte cellulare. Prima di effettuare il prelievo, l’organismo
deve essere anestetizzato.
FISSAZIONE
La fissazione è una delle fase più importanti poiché prevede l’inibizione dell’attività vitale di
un tessuto, preservando tutte le caratteristiche morfologiche e strutturali.
La fissazione consiste nel sottoporre il tessuto ad agenti chimici e fisici che denaturano
rapidamente le proteine e rendono insolubili i costituenti per le successive fasi di
disidratazione, inclusione e colorazione. I fissativi più efficaci sono quelli che permettono la
precipitazione delle proteine per far sì che la morfologia non venga modificata.
I fissativi devono essere necessariamente preparati con isotoniche e a pH 7.4, per
impedire il rigonfiamento dei campioni, dovuto agli stress osmotici.

La fissazione è considerata la fase più importante della tecnica istologica poiché:


- consente al preparato di sopportare gli stress fisici e chimici che avvengono nelle
successive fasi (disidratazione, inclusione e sezionamento).
- protegge dall'azione dei microrganismi che invadono il materiale biologico, nutrendosi
delle strutture non più in grado di proteggersi;
- minimizza la degradazione dei tessuti, in seguito alla variazione di temperatura e di
pH;

Lo scopo della fissazione è quella di:


- interrompere i processi autolitici che si sviluppano nella cellula e nei tessuti non più
nutriti
- preservare il campione dall’attacco di agenti patogeni come muffe e batteri che
possono danneggiare le strutture della cellula
- conservare la morfologia strutturale del tessuto e della cellula

La fissazione favorisce l’osservazione e la colorazione, consente ai coloranti di penetrare nei


tessuti e di fissarsi a particolari strutture.
La scelta dei fissativi dipende:
- dalla dimensione del campione

- dal grado di preservazione strutturale

- dalla natura dei costituenti chimici della cellula da conservare (es: strutture proteiche)

La fissazione ha una durata che varia in base al campione biologico, alla velocità di
penetrazione del fissativo. In genere dura da pochi minuti fino a 24-48 ore a seconda della
grandezza del frammento.

I fissativi utilizzati si distinguono in fissativi fisici e fissativi chimici.


La fissazione fisica può avvenire per rapido riscaldamento, in cui il campione viene
essiccato eliminando l’acqua e denaturando la componente proteica, oppure
tramite congelamento.

I fissativi chimici sono suddivisi in:


- fissativi coagulanti, in grado di coagulare le proteine, come acido acetico o alcool
etilico;
- fissativi non coagulanti , in grado di denaturare le proteine, come la formaldeide (un
fissativo aldeidico che usato in soluzione acquosa viene chiamata formalina). La
formalina è un gas incolore solubile in acqua che possiede un elevato grado di
penetrazione e non provoca l’indurimento dei tessuti. I tessuti fissati in formalina
hanno maggiore affinità per i coloranti basici piuttosto che per quelli acidi poiché i
gruppi idrofili aumentano l’acidità delle proteine.
- fissativi semplici che contengono il composto primario e i sali
Si possono anche utilizzare miscele fissative costituite da acqua, sali e uno o più fissativi
chimici.  Tra le miscele ricordiamo il liquido di Bouin.

LAVAGGIO
Dopo la fissazione i preparati devono essere lavati accuratamente in acqua corrente. Tale
operazione si effettua per eliminare l’eccesso di fissativo che è rimasto all’interno dei
campioni e potrebbe interagire con i reattivi utilizzati nelle fasi successive, come le sostanze
usate per la colorazione dei campione.

DISIDRATAZIONE
La disidratazione è un processo che serve ad eliminare l'acqua presente nel campione
affinché il mezzo d’inclusione possa penetrare nel tessuto.
Il processo di disidratazione prevede l'esecuzione di una serie di passaggi ordinati, con
passaggio in alcoli crescenti che, in altre parole, aumentano il loro volume durante il corso
del tempo.
La disidratazione necessita dei passaggi in alcoli (etanolo concetrato) crescenti per evitare
qualsiasi tipo di danno alla cellula, compresa la lisi cellulare.
Il protocollo prevede l’utilizzo di:
- alcol etilico 50°

- alcol etilico 70°

- alcol etilico 80°

- alcol etilico 95°

- alcol etilico 100°

INCLUSIONE
I tessuti biologici prelevati hanno perso la loro consistenza, quindi devono essere inclusi
all’interno di materiali più resistenti, in modo tale da acquisire una maggiore rigidità , ideale
per il successivo sezionamento. L’inclusione non è necessaria se è avvenuta la fissazione fisica.
Per effettuare l’inclusione possono essere usate diverse sostanze tra cui la paraffina, resine
idrofile, resine epossidiche o metacrilati.
La paraffina è una miscela di idrocarburi alifatici ed è apolare, ossia non miscibile con etanolo
e l’acqua, proprio per questo è importante effettuare la disidratazione.
La paraffina, prima dell’uso, deve essere sciolta alla temperatura di circa 57-59 °C, e poi
filtrata per eliminare eventuali impurità .
Le resine idrofile sono valide per tessuti decalcificati e richiedono un tempo di
polimerizzazione variabile da 1 a 20 ore a seconda della temperatura.

Le resine epossidiche consentono il taglio di sezioni più sottili di quanto non sia possibile con
l’inclusione in paraffina. Esse polimerizzano in modo omogeneo producendo un’eccellente
conservazione dei dettagli strutturali.
I metacrilati sono tendono a polimerizzare in modo non uniforme.

L’Inclusione prevede due fasi:


- Infiltrazione del mezzo di inclusione  consiste nell’immergere il pezzo disidratato nel
mezzo d’inclusione allo stato liquido per un periodo lungo in modo tale da consentire
la penetrazione del campione.

- Indurimento del mezzo di inclusione  permette di includere il campione in un


materiale omogeneo in modo tale da poter essere tagliato in sezioni di spessore <10
micrometri.

Il mezzo d’inclusione è costituito da tre componenti:

- Componente A: resina pura a base di idrossietilmetacrilato;

- Componente B: benzoil perossido (in bustine da 0,6g);

- Componente C: induritore liquido contenente tetrametilina;

Il protocollo d’inclusione prevede i seguenti passaggi:

- prima infiltrazione con resina pura

- seconda infiltrazione in resina I ottenuta addizionando 100 ml di resina pura ad una


bustina da 0,6 g di benzoil perossido.

- terza inclusione con resina II (base ottenuta addizionando 7,5 ml di resina I a 0,25 ml
d’induritore).

Per ottenere una buona inclusione, è necessario che le due infiltrazioni durino
complessivamente almeno 48 ore .

Al fine di agevolare la penetrazione del mezzo di inclusione, nel campione, è consigliato usare
uno strumento, denominato “pompa da vuoto”, che grazie all’azione di un motore aspirante,
consente di ottenere il vuoto all’interno di una campana ad esso collegata.

SEZIONAMENTO
Il sezionamento consiste nella riduzione del campione, incluso in un blocchetto solidificato.
Il blocchetto di paraffina ottenuto deve essere sezionato ricavando fette estremamente sottili,
circa 5-7 µm , in modo tale che la luce possa attraversarle e, dopo la colorazione, siano ben
visibili al microscopio. Prima del sezionamento, con un bisturi, il blocchetto deve essere
sagomato, si elimina la paraffina in eccesso e si riduce così il suo spessore.
Lo strumento usato in questa fase è il microtomo.
l sezionamento di un tessuto è una delle procedure più importanti per lo studio istologico.
Perché un tessuto sia analizzabile tramite microscopio ottico, deve essere tagliato in fette
molto sottili, in modo da permettere alla luce di attraversarlo. Con un microtomo, si riescono a
realizzare sezioni di meno di 10 µm di spessore, in media 4. Le sezioni ottenute vengono poi
montate sul vetrino portaoggetti, sul quale devono essere incise le informazioni riguardanti il
campione.
Esistono diverse sostanze adesive da porre sul vetrino per consentire il montaggio delle
sezioni, solitamente si utilizza albumina glicerinata

COLORAZIONE
La colorazione è un procedimento che aumenta il contrasto presente tra diverse strutture
cellulari, tale da permetterne il riconoscimento delle sezioni istologiche.
I coloranti sono molecole organiche aromatiche e ionizzabili, si usano generalmente in
soluzione. I coloranti usati in microscopia sono:
- naturali se si trovano in natura d’origine animale o vegetale (l’ematossilina è vegetale,
ricavata dal legno di campeggio);
- sintetici se si distinguono in basici e acidi.
Sono basici (es. ematossilina, blu di metilene, blu di toluidina) se legano molecole acide
come il DNA.
Sono acidi (es.: eosina, Trypan Bleu, blu pirrolo) se legano molecole basiche come gran
parte delle proteine citoplasmatiche e sostanze connettive.

Le colorazioni possono essere:

- Dirette, quando le sezioni prendono direttamente il colorante dalla soluzione;

- Indirette quando il colorante si unisce al substrato grazie all’intervento di sostanze


dette mordenti che hanno il compito di rendere possibili i legami tra colorante e
tessuto e di fissare stabilmente il colore. La maggior parte dei mordenti sono forti
ossidanti o allumi:

- Progressive quando si lascia agire il colorante nelle sezioni fino a che non si è
raggiunto il giusto grado di colorazione; -

- Regressive quando la sezione viene in un primo tempo sovraccolorata per poi


asportarne l’eccesso;

- Semplici, quando prevedono l’utilizzo di un solo colorante. A seconda della struttura


colorata sono dette nucleari o citoplasmatiche. Per la natura del colorante sono invece
distinte in monocromatiche se le strutture colorate hanno la stessa tonalità del
colorante, e colorazioni metacromatiche se le strutture fanno variare le tonalità del
colore secondo il principio della metacromasia. I coloranti che possiedono questa
proprietà di viraggio tintoriale sono detti metacromatici, mentre le sostanze che
subiscono il fenomeno, sono dette cromotrope. I principali coloranti metacromatici
sono basici ed appartengono al gruppo del triaminofenilmetano (es. Violetto di metile,
Cristal violetto), al gruppo delle azine (es. Rosso neutro, Safranina) e al gruppo delle
tiazine (es. Blu di toluidina, Azzurr A, Tionina, Blu di metilene). Esempi di sostanze
cromotrope sono: la cartilagine, l’amiloide, le mastzellen, i mucopolisaccaridi solfati,
l’ac. Jaluronico per cui nell’allestimento di un preparato sono colorati con coloranti
metacromatici;
- Combinate, complesse quando prevedono l’impiego di più coloranti in successione.
Ogni colorante agisce per proprio conto fissando determinate strutture.

L’azione di un colorante dipende da fattori insiti nel tessuto: affinità chimica fra colorante e
costituenti del tessuto; concentrazione dei costituenti e la loro permeabilità .

Gli scopi della colorazione sono:

 Per aumentare il contrasto dei vari componenti morfologici del tessuto favorendone
l’identificazione morfologica le strutture; è la colorazione istologica;
 Per identificare la composizione chimica cellulare dei tessuti; è la colorazione
istochimica.

COLORAZIONE CON EMATOSSILINA- SAFRANINA SU SEZIONI IN ISTORESINA:

 Si immerge il vetrino, in emallume acido di Mayer per 15 min;


 Si elimina l’eccesso di colorante su carta assorbente, prima di mettere a contatto con
acqua di fonte per 5 min (l’alcalinità debole dell’acqua di fonte consente il viraggio di
colore dei nuclei da rosso a blu violetto);
 Si pone il vetrino nella vaschetta contenente safranina per 10 min;
 Si elimina l’eccesso di colorante su carta assorbente;
 Si disidrata in alcool 95°, 100° (2 cambi nell’alcool 100°) eseguendo passaggi di 2’
ciascuno;
 Si chiarifica in xilolo per 4 minuti

CHIUSURA VETRINO
A colorazione terminata, si versa una o due gocce di soluzione “montante” sul vetrino
portaoggetti e lo si copre con il vetrino coprioggetti imbevuto di xilene. Si attende che il
montante si sia distribuito uniformemente tra i due vetrini, eventualmente esercitando una
lieve pressione, si lascia asciugare a temperatura ambiente.