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RIASSUNTO

SVILUPPO DI UN VETTORE LENTIVIRALE COME STRUMENTO 
PER LA REALIZZAZIONE DEL KNOCK­DOWN shRNA­MEDIATO 
DELLA FRACTALCHINA IN COLTURE CELLULARI DI NEURONI 
GANGLIARI DELLE RADICI DORSALI

Lorenzo Berlincioni
Introduzione: Il dolore e la sua percezione sensoriale sono eventi di
fondamentale importaza evolutiva per allertare l’organismo del rischio
di potenziali stimoli nocivi e danni tissutali. Il dolore può essere
suddiviso in due categorie generali: “dolore acuto” e “dolore cronico”.
Il primo viene scatenato da una lesione o un danno definiti e si
conclude con la risoluzione del danno e la guarigione del soggetto; il
secondo è originato da varie cause non ancora ben conosciute,
possibilmente una lesione ai nervi del SNP, e si mantiene nel tempo
oltre la risoluzione del danno. Mentre il valore adattativo del primo è
ben compreso, come meccanismo di preservazione dell’integrità
tissutale, quello del secondo non sembra essere ben chiaro, anzi esso
viene spesso considerato come una forma di maladattamento del
sistema nocicettivo. Le cellule microgliali sono i macrofagi del SNC e
vengono consistentemente attivate nelle corna dorsali del midollo
spinale dopo una lesione ad una afferenza periferica.
La loro attivazione conduce al rilascio di numerosi modulatori
dell’infiammazione che contribuiscono all’induzione e al mantenimento
della segnalazione del dolore neuropatico alterando le funzioni
neuronali.
Uno dei meccanismi di cross-attivazone fra il neurone e la glia è
rappresentato dalla via di segnalazione Catepsina S – Fractalchina fra
il neurone e la microglia nel midollo spinale. La microglia attivata in
seguito ad un evento infiammatorio rilascia la Catepsina S (CatS),
enzima proteolitico che opera un taglio sul dominio extracellulare del
fattore di membrana Fractalchina (FKN) presente sui neuroni del
midollo spinale, liberando un frammento solubile (sFKN).
La sFKN (CX3CL1) è una chemochina che va a legarsi ai recettori
CX3CR1 presenti sulla superficie della microglia promuovendo, tramite
la via della MAPK p38, la sintesi e il rilascio di mediatori
dell’infiammazione. Queste molecole con attività proalgesica fanno
sentire il loro effetto sui neuroni circostanti inducendone l’attivazione
e quindi promuovendo un’ulteriore segnalazione del dolore.

• Scopo della Tesi: Il fine di questo studio è volto a verificare se


l’abbassamento della Fractalchina tramite la tecnica di RNA-
Interferenza porti ad una riduzione dell’attivazione delle cellule
microgliali e della loro produzione di mediatori della flogosi, risultando
in un abbassamento della segnalazione del dolore ed in un effetto
neuroprotettivo.

• Materiali e Metodi: E’ stato prodotto un vettore lentivirale


ingegnerizzato per la trasfezione dei neuroni gangliari delle radici
dorsali contentente sequenze shRNA mirate alla riduzione
dell’espressione del gene della Fractalchina ed e’ stato verificato
l’effetto del trattamento sui neuroni efficentemente trasfettati
tramite indagine Real Time-PCR per misurare i livelli di
espressione genica e indagine immunochimica per la
visualizzazione del prodotto proteico.

• Risultati: L’effetto del trattamento di silenziamento della


Fractalchina in colture cellulari dei neuroni gangliari tramite
utilizzo di sequenze shRNA e’ stato indagato mediante RT-PCR,
una metodica che permette di quantificare i livelli di espressione
di mRNA di un gene target, raffrontando i valori ottenuti per i
campioni trattati con quelli di controllo.
Non e’ stato possibile visualizzare un effetto di silenziamento
significativo tale da poter affermare che le sequenze RNA-interferenza
prescelte abbiano funzionato correttamente.
Analogo e’ il risultato non positivo ottenuto dagli esperimenti di
immunochimica in cui sono stati raffrontati i valori di fluorescenza della
Fractalchina marcata con un Ab specifico delle cellule trasfettate con
vettore lentivirale shRNA e quelle non trasfettate.

Discussione: Il principale elemento a cui e’ stato attribuito un ruolo


importante nel determinare l’inefficienza delle sequenze shRNA nel
produrre il silenziamento della Fractalchina e’ la presenza di alcuni mis
match fra gli shRNA scelti e l’mRNA della Fractalchina di ratto messi in
evidenza successivamente tramite indagine di allineamento delle
sequenze.
Una prima scelta di utilizzare il sistema murino come modello per
condurre esperimenti in vitro sui neuroni gangliari delle radici dorsali
ha portato alla progettazione di sequenze shRNA che fossero
complementari al gene della Fractalchina di topo. Successivamente,
per motivi di natura tecnica, e’ stato cambiato modello passando dal
topo al ratto, tenedo conto dell’alta omologia generale che esiste fra
questi due animali. Purtroppo la quantita’ di tempo allocata a questo
esperimento non ha permesso di riprogettare nuove sequenze shRNA
che fossero specifiche contro il gene della Fractalchina di ratto,
obbligando all’uso sul ratto delle sequenze progettate per il topo.
Non è stato quindi raggiunto lo scopo di ottenere uno strumento che permettesse 
un efficiente knock­down della Fractalchina in vitro,  per poter indagare gli effetti 
della   riduzione   di   questa   chemochina   sul   meccanisimo   di   cross­tralk   fra   le 
microglia   ed   i   neuroni   e   sulla   segnalazione   dell’impulso   dolorifico   ai   centri 
superiori.
È perciò importante ed auspicabile che vengano portati avanti ulteriori indagini 
in questa direzione, cercando di ottimizzare  la progettazione e la scelta delle 
sequenze RNA interferenza per ottenere un’efficace ed effettiva riduzione 
dell’espressione genica.