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Fonti di Energia:
Il terreno contiene:
Indicatore redox: resazurrina
Agente riducente: tioglicolato
Formazione di derivati tossici dell'ossigeno
Enzimi che agiscono sui composti tossici dell'ossigeno
naturali
Terreni colturali
ricchi o massimi
o complessi BATTERI
sintetici MUFFE
(pronti o minimi o LIEVITI
da preparare) minerali
Esempi di terreni sintetici
Terreno ricco o massimo o completo “Tryptic Soy Agar” (o TSA)
studi metabolici e
cinetici
Terreni
colturali Isolamento delle
colture pure e
conteggio cellulari
(piastre Petri)
solidi
(+AGAR 1.5% w/v)
(piastre, strisci, infissi)
Mantenimento
dei ceppi
colture pure e miste
Le singole cellule rimangono nella sede di inoculo e la crescita batterica si manifesta
con la comparsa di colonie batteriche nella posizione corrispondente
Identificazione:
a) Caratterizzazione fenotipica
E/O genotipica (analisi
sequenza 16S rDNA
dell’isolato…).
Caratterizzazione fenotipica
1. CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE (forma, dimensione, disposizione delle cellule, presenza di
endospore; aspetto della colonia; colorazione di Gram, mobilità)
2. METABOLISMO ENERGETICO (respirazione aerobia, fermentazione; è anaerobio facoltativo…)
fonte di carbonio; esistono in commercio kit per poter testare rapidamente numerose
fonti di carbonio in contemporanea, come ad esempio il sistema di gallerie API
(Analytical Profile Index).
Oltre alla tipologia di fonte di carbonio possono essere studiate: la fonte di azoto, i
fattori di crescita (vitamine), i parametri ambientali (pH, temperatura).
ALLINEAMENTO E
COSTRUZIONE CONFRONTO DELLA SEQUENZA
DELL’ALBERO CON QUELLE CONTENUTE IN SEQUENZIAMENTO DEL
FILOGENETICO GenBank GENE 16S rRNA
Caratterizzazione di colture coltivabili e non
SEPARAZIONE DELLE MOLECOLE
ESTRAZIONE DEL AMPLIFICAZIONE DEL AMPLIFICATE
DNA GENE 16S rRNA
Campione da
caratterizzare
Librerie
Miscela di DGGE geniche
Miscela
di ceppi prodotti PCR
SEQUENZIAMENTO
DEI GENI 16S rRNA
ALLINEAMENTO E CONFRONTO DELLE
COSTRUZIONE DELL’ALBERO SEQUENZE CON QUELLE
FILOGENETICO CONTENUTE IN GenBank
Caratterizzazione di colture coltivabili e non
Dal punto di vista prettamente tecnico, la differenza tra analisi di ceppi puri e di comunità è:
1) COLTIVABILI: Separazione (con piastramenti) -> POI -> PCR ed analisi
2) INCOLTIVABILI: PCR -> POI -> Separazione (con clonaggio o su gel) -> POI -> analisi
ESTRAZIONE AMPLIFICAZIONE DEL SEPARAZIONE DELLE MOLECOLE
DEL DNA GENE 16S rRNA AMPLIFICATE
Campione da
caratterizzare
Librerie
Miscela Miscela di geniche
DGGE
di ceppi prodotti PCR
Caratterizzazione di colture coltivabili e non (DGGE)
1. Si amplificano i 16S dell’intera comunità con primer universali; uno di questi primer ha in
posizione 5’ una estensione di GC; es: cgcgcgcccccggccgcgcgccctgctgtatataaatc
3. Si separano i frammenti in un elettroforesi con un gel particolare; la parte iniziale del gel
(presso i pozzetti) è normale; la parte finale invece è satura di urea e
formammide, due composti fortemente denaturanti, cioè che fanno separare le due
eliche del DNA
4. Scendendo lungo il gel, attirati dal campo elettrico, i frammenti incontrano una
concentrazione sempre maggiore di denaturante ed iniziano a denaturarsi
5. A basse concentrazioni di denaturante si iniziano a separare le coppie AT, debolmente
legate tra loro e solo a concentrazioni maggiori le coppie GC
6. Al termine della corsa i frammenti sono tutti denaturati eccetto la coda GC che è
estremamente resistente; le eliche denaturate si avvolgono su se stesse bloccando
l’avanzata del frammento
Caratterizzazione di colture coltivabili e non (DGGE)
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
Caratterizzazione di colture coltivabili e non: librerie geniche
Un altro metodo prevede il clonaggio dei prodotti PCR presenti in una miscela complessa
Trasformazione : inserire il
Geni 16S rRNA E’ possibile legare ogni singolo vettore in una cellula batterica
amplificati con frammento di DNA amplificato in recipiente (Escherichia coli) in
primer universali
un DNA circolare (plasmide) detto stato competente
vettore
infisso
Determinazione della concentrazione cellulare: conteggio colony
(es. 1g di suolo + 9 ml forming units (CFU) in piastra
di soluzione
fisiologica)
Metodo di Lowry
Metodo di Bradford:
blue
Coomassie
Proteina + Brillant blue
G250 Amax=595nm
Determinazione della concentrazione cellulare: misura
della concentrazione delle proteine nel brodo
Retta di taratura
0,45
0,40
0,35
ABS (750nm)
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12
BSA (mg/ml)
2. COLTURA CONTINUA
brodo
CONCENTRAZIONE
TEMPO
= [ biomassa] (mg/mL o CFU/mL)
= [substrato] (mg/mL, etc)
Coltivazione in batch (coltura discontinua o a lotti) (b)
dX
=µ*X
lnX dt
µ= velocità specifica di crescita (h-1);
X= conc. biomassa (mg/l o CFU/ml)
dX = µ dt lnX = lnX0 + µt
X
a b c d e
tempo
µ
µmax
µmax [S]
µ=
µmax Ks + [S]
2
Ks [S]
[S] nel tempo durante la coltivazione in batch
[S]f=0 [S]i
µ<µmax : fase di decelerazione µ=µmax : fase di crescita esponenziale
PRODUTTIVITA’ MASSIMA
PRODUTTIVI TA' =
[PRODOTTO ] / l
TEMPOdiFER MENTAZIONE
Coltivazione in continuo (a)
MEDIUM
BRODO esausto
COLTURA BATCH
F
MEDIUM F
BRODO esausto
V COLTURA CONTINUA
Coltivazione in continuo (b)
Coltivazione in continuo (c)
Parametro chiave: velocità di diluizione D = F/V (h-1)
Si opera una diluizione del brodo di coltura con medium fresco in modo da
raggiungere un equilibrio, o stato stazionario, tale che la concentrazione
cellulare e la composizione del brodo di coltura nel fermentatore
(concentrazione di substrati e di prodotti) rimangono costanti.
dX FX 0 FX dX FX
= − + µX poichè X0 = 0 =− + µX
dt V V dt V
Cellule nuove
F
=0 , quindi µ = =D
Allo stato stazionario dX
dt V
Cinetica della crescita microbica in continuo (d)
il rapporto tra la portata F
dX FX dX
=− + µX = µX − DX (V/t) e il volume residente V
dt V dt è chiamato velocità di
Biomass Biomass diluizione D= F/V [h-1]
growth removal
allora:
1. La biomassa diminuirà
2. La [S] aumenterà
3. La velocità specifica di crescita del microorganismo
aumenterà
allora:
1. La biomassa diminuirà
2. La [S] aumenterà
3. La velocità specifica di crescita del microorganismo
non può aumentare, poiché µ=µmax
µmax< D
Wash out
Coltivazione in continuo (f)
0 0
0 0,2 0,4 0,6 0,8
D (h-1)
Andamento dei parametri della fermentazione continua
in funzione della velocità di diluizione
Coltivazione in continuo (g)
Principali vantaggi delle colture in continuo rispetto alle colture batch
Incremento della produttività e riduzione dei tempi morti dovuti a pulizia del
fermentatore, preparazione e sterilizzazione del substrato e del fermentatore…
Maggiore riproducibilità;
Controllo accurato della velocità specifica di crescita e della concentrazione di
biomassa nel reattore;
Studio delle costanti cinetiche di crescita, energia di mantenimento, rese in prodotto
e delle condizioni ottimali per lo sviluppo di biomassa e la formazione di prodotto.
pH
Sostanze chimiche
Crescita Pressione
microbica osmotica
Temperatura
Radiazioni
(X, γ, β, α, UV)
Parametri chimico-fisici che controllano la crescita
microbica: pH
attività enzimi
stato di dissociazione
metaboliti e nutriliti
stato chimico-fisico
della membrana
Parametri chimico-fisici che controllano la crescita
microbica: temperatura (ii)
Parametri chimico-fisici che controllano la crescita
microbica: pressione osmotica
Attività dell’acqua (aw) Disponibilità dell’acqua
presente in un mezzo per
reazioni chimiche o
Legge di Raoult biochimiche o per
cambiamenti di stato
n2
aw =
n1 + n2
p
aw =
p0
RH
aw =
100
Parametri chimico-fisici che controllano la crescita
microbica: pressione osmotica
Meccanismo di resistenza
a bassi valori di aw
STRATEGIA GENERALE
accumulo
intracellulare di soluti
Parametri chimico-fisici che controllano la crescita
microbica: pressione osmotica
3 (ambienti 33
marini) (saturazione)
(% w/v)
Soluti compatibili prodotti da
microorganismi alofili, xerofili
e osmofili
Parametri chimico-fisici che controllano la crescita microbica:
sostanze chimiche
Effetto microbiostatico o microbicida; dipende dalla concentrazione, tipologia
di microbi, durata del contatto e dal mezzo in cui avviene
a) membrana cellulare (alterazione del doppio strato lipidico della membrana e/o sua
perforazione):
- detergenti cationici, anionici, non ionici
- fenolo e suoi derivati alchilati, clorurati e nitrati
- solventi organici (cloroformio, toluene, alcoli a catena corta) toluene
- agenti alchilanti
O O H
(c,d)
(a, b, c)
(b,e)
Parametri principali:
• Temperatura
• Durata del
trattamento.
Operatività:
a) con calore secco:
170°C per 5 h, in
stufa
b) con calore umido:
121°C per 20 min.
oppure 110°C per 30
min
Metodi di sterilizzazione: calore umido