29-30

DIFFERENZIAMENTO
E CELLULE STAMINALI

lezioni di Biologia Cellulare

prof.ssa Marina Marini
 L’evolversi di organismi
pluricellulari ha comportato:
 diversificazione dei tipi cellulari
 coordinamento della loro formazione
 regolazione del numero e della dimensione delle
cellule
 organizzazione delle cellule in tessuti funzionali
 eliminazione di cellule estranee o invecchiate
 nuove e più raffinate modalità di segnalazione
 specializzazione di una linea germinale, separata
dalla linea somatica
 Lo sviluppo di un organismo
pluricellulare
• procede attraverso divisioni mitotiche successive, che
originano genealogie cellulari
• esse tracciano l’ordine di nascita delle cellule, la restrizione
progressiva del loro potenziale differenziativo e il loro
differenziamento in tipi cellulari specializzati
• le genealogie cellulari sono controllate da fattori intrinseci
alle cellule stesse (interni), che sono forgiati dalla storia della
cellula e da meccanismi interni di regolazione, e da fattori
estrinseci alle cellule (esterni), come segnali cellula-cellula e
informazioni provenienti dall’ambiente
• una genealogia cellulare ha inizio con cellule staminali,
cellule non specializzate che hanno il potenziale di
autoriprodursi all’infinito e di generare cellule maggiormente
specializzate.
Esempio di genealogie cellulari nel C. elegans. In
questo schema è messa in evidenza l’origine
policlonale delle componenti della faringe
Dallo zigote totipotente all’organismo
pluricellulare con cellule differenziate
Cellule totipotenti, pluripotenti,
multipotenti, unipotenti
 Cosa è il differenziamento?
Con questo termine si intende il processo che porta
una cellula a un fenotipo “maturo” e funzionale,
ossia che la porta a svolgere le sue funzioni
specifiche, che di norma sono dipendenti
dall’acquisizione di una specifica morfologia e
localizzazione corporea.
 DIFFERENZIAMENTO COME
ESPRESSIONE DIFFERENZIALE DI GENI

Il differenziamento viene trasmesso alle cellule

figlie in quanto i segnali influiscono
sull’espressione genica della cellula, per lo più
agendo su a) stato della cromatina; b) fattori di
trascrizione o repressori
In ultima analisi, il differenziamento deriva
dall’espressione differenziale dei geni che
determinano una specializzazione della cellula
stessa
 Il differenziamento stabilisce un
pattern di espressione genica
La regione di controllo dei geni specifici del
differenziamento può comprendere numerosi siti di
legame con fattori di trascrizione e con regolatori negativi
Per mantenere lo specifico pattern di espressione genica, i
regolatori devono essere sempre espressi (la regolazione
comprende un feedback positivo)
Il differenziamento può comportare l’inattivazione di
alcune regioni di cromatina (metilazione del DNA, ecc.)
Le cellule figlie ereditano tale pattern di espressione e di
repressione
 Cosa sono le cellule staminali?
Sono cellule dotate di capacità di
autorinnovamento, in grado di differenziare
dando luogo a uno o più tipi di cellule mature
Le cellule staminali embrionali derivano da
blastocisti (stadio precoce pre-impianto) e sono
toti- o pluri-potenti
Le cellule staminali adulte o somatiche derivano
da tessuti adulti e sono pluri- o multi-potenti
Entrambi i tipi di cellule possono essere
coltivati in vitro e indotti a differenziare
La staminalità viene mantenuta grazie alle DIVISIONI
ASIMMETRICHE che sono possibili sia nelle cellule
staminali sia nei progenitori
1 = divisione simmetrica
2 = divisione asimmetrica

A = cellule
staminali
B = cellule
progenitrici
C = cellule
differenziate
 LA NICCHIA DELLE CELLULE STAMINALI
 Le cellule staminali sono localizzate in sedi specifiche (nicchie), che
regolano numerose funzioni vitali: sopravvivenza, mantenimento,
auto-rinnovamento, controllo della proliferazione, repressione del
differenziamento.
 La nicchia è un’unità fisiologica, le cui componenti sono le cellule e
i segnali, solubili e non solubili, presenti in tale sede.
 Anche la divisione asimmetrica necessita della informazione
topografica fornita dalla nicchia.
 La nicchia protegge le cellule staminali dall’esaurimento e allo
stesso tempo protegge l’ospite dalla loro eccessiva proliferazione.
 La nicchia integra i segnali che mediano la risposta bilanciata delle
cellule staminali alle necessità dell’organismo.
 Aberrazioni dei segnali della nicchia possono essere alla base di
patologie, dalle patologie tumorali alle aplasie.
 La nicchia può quindi essere vista anche come punto di partenza
per gli approcci terapeutici.
 L'ipotesi del filamento
immortale
(Lark, 1966; Cairns,
1975)...

http://www.pubmedcentral.ni
h.gov/articlerender.fcgi?tool
=pubmed&pubmedid=17121
966
Sta raccogliendo conferme
sperimentali
Rallenta l'accumularsi di
mutazioni casuali
Ha profonde implicazioni
per quanto riguarda cancro,
invecchiamento,
differenziamento
 Differenziamento e proliferazione
L’acquisizione del differenziamento è di norma un processo
a più passaggi, che porta a un progressivo restringimento
delle potenzialità differenziative di una cellula pluripotente
(ossia con molteplici potenzialità differenziative)
Di norma tale processo è accompagnato da una
progressiva perdita di potenziale moltiplicativo

differenziamento

proliferazione
 Facciamo il punto
Il differenziamento è un processo a tappe: la cellula staminale è in grado di
autorinnovarsi o di procedere verso il differenziamento.
Quando la cellula staminale entra nel compartimento proliferante ha già perso
la capacità di autorinnovarsi come cellula staminale e va incontro a un
progressivo differenziamento, acquisendo competenza per una o più linea
differenziativa (commitment). Con il progressivo restringimento delle
potenzialità differenziative, la cellula perde anche in genere potenzialità
proliferativa.
Progenitore a
Precursore m cellula differenziata m

cellula staminale Progenitore b

Precursore n cellula differenziata n

perdita della telomerasi

committment differenziamento
cellula differenziata terminale
Un esempio: le cellule staminali emopoietiche
del midollo osseo
ESEMPIO: Le tappe differenziative delle cellule
emopoietiche
 IL DIFFERENZIAMENTO AVVIENE
PER TAPPE SUCCESSIVE
L’acquisizione del differenziamento è di norma un
processo a più passaggi
In genere ogni tappa corrisponde a variazioni nelle
molecole deputate alle interazioni cellula-cellula

Alcune tappe del

differenziamento
di un neurone
 DIFFERENZIAMENTO E SEGNALI
Questo processo è governato da segnali che
provengono da altre cellule dell’organismo (segnali
solubili, ormoni o fattori di crescita), da cellule vicine
(segnali cellula-cellula) o dalla matrice extracellulare
Di norma i vari passaggi del differenziamento sono
governati da diversi segnali
Spesso la cellula risponde con altri segnali: il
differenziamento embrionale è un processo di
progressiva acquisizione di specializzazione di tutta la
regione interessata e si attua in loco
 Cosa sono i fattori di crescita
Sono glicoproteine con funzione di segnale,
sintetizzate da cellule o tessuti non definiti come
ghiandole e diffusi per via endocrina o paracrina.
I fattori di crescita hanno spesso più funzioni:
•Segnale proliferativo
•Segnale differenziativo
•Segnale di sopravvivenza
Lo stesso fattore può svolgere più ruoli in momenti diversi
nel corso del differenziamento di una data filiera
In altri casi, la cellula, differenziando, acquisisce recettori
per fattori diversi
Un esempio di fattore di
crescita (segnale di
differenziamento solubile) è
il G-CSF (Granulocyte-
Colony Stimulating Factor).
Il suo recettore ha due
domini intracellulari.
Quando il G-CSFsi lega al
recettore, verrà stimolata la
proliferazione o il
differenziamento a seconda
che nel citoplasma la cellula
esprima molecole che legano
le regioni 1 e 2 o la regione3.
In genere, la fase di
proliferazione precede e si
sovrappone a quella di
maturazione.
 Anche segnali paracrini e
iuxtacrini possono essere segnali
di differenziamento
Un esempio di segnale
paracrino: l’interazione tra
cellule linfoidi
 Dalle giunzioni
cellulari e
dall’ECM
originano segnali
che regolano
anche il
differenziamento

La via di Notch è un esempio di segnale

iuxtacrino nel differenziamento
Nel corso dello sviluppo embrionale si osservano segnali paracrini che
inducono il differenziamento dei tessuti vicini: le molecole implicate
sono spesso definite morfogeni e il fenomeno per cui un tessuto
influisce sul differenziamento di un altro viene definito induzione.
 Differenziamento e apoptosi
In alcuni casi, si formano più cellule staminali di
quelle che sono necessarie nell’organismo maturo “a
regime”.
In condizioni di equilibrio, l’eccesso è destinato a
morire per apoptosi. Tuttavia, in caso di necessità, tali
cellule “in più” costituiscono una preziosa riserva.
L’organismo regola la sopravvivenza, la
proliferazione e il differenziamento di tali cellule
attraverso la DISPONIBILITÀ LIMITATA dei fattori
di crescita.
Le cellule staminali COMPETONO TRA LORO per
assicurarsi un apporto sufficiente di tali fattori.
 apoptosi

Proliferazione e differenziamento

Stato stazionario: i fattori di crescita non bastano per tutte le cellule

 apoptosi

Necessità di ampliare il numero delle cellule differenziate secondo una data

filiera: aumenta la produzione dei fattori di crescita specifici e ulteriori
cellule si salvano dall’apoptosi, entrando in ciclo e differenziandosi
 L’IRREVERSIBILITÀ DEL
DIFFERENZIAMENTO

Il differenziamento viene trasmesso alle cellule figlie ed è

(quindi) relativamente irreversibile .
Esamineremo alcune “eccezioni”, che dimostrano che di
fatto vi è una certa plasticità del differenziamento
(transdifferenziamento, reversibilità) e ci fanno capire come il
differenziamento viene modulato.
 “eccezioni -1”
• le cellule cancerose spesso “fanno un passo
indietro”, nel senso che perdono alcuni aspetti
terminali del differenziamento, divenendo
morfologicamente poco riconoscibili e perdendo
funzionalità, mentre acquisiscono nuovamente
capacità illimitate di proliferazione
Una cellula di un
tumore mammario

Cellule normali della

ghiandola mammaria
“eccezioni -2” • È noto che gli
anfibi hanno
grandi capacità
di rigenerare
arti e organi, a
partire da
cellule pre-
esistenti che
“de-
differenziano”
e non da cellule
staminali.
Questa via è
percorribile nei
mammiferi?
 “eccezioni-3”
•La clonazione riproduttiva delle pecora Dolly (e, in
seguito, di altri mammiferi) è stato eseguito
sostituendo il nucleo di una cellula somatica
differenziata (una cellula mammaria) al posto del
nucleo di una cellula uovo matura.
•Se si fanno fondere globuli rossi di pollo (nuclei
presenti ma inattivi) con cellule umane cancerose, le
cellule ibride cominciano ad esprimere proteine di
pollo precedentemente non espresse
Questi esperimenti dimostrano che il
differenziamento è regolato da elementi (proteine,
RNA) presenti nel citoplasma
La clonazione
riproduttiva:
la storia della
pecora Dolly
 Cosa ci ha insegnato la
clonazione riproduttiva
È stato il contesto del citoplasma dell’ovocita a riprogrammare il
nucleo della cellula somatica differenziata, rendendolo totipopente.

Questo significa che il citoplasma di un ovocita contiene molecole

(proteine, RNA non tradotti) in grado di indurre uno stato di
staminalità

QUINDI I GENI DELLA TOTIPOTENZA, ESPRESSI DAL

NUCLEO DELL'OVOCITA, SONO STATI TRASCRITTI E
TRADOTTI PRIMA DELLA FECONDAZIONE IN PRODOTTI
GENICI CHE RISULTANO DETERMINANTI PER
CONSENTIRE LO SVILUPPO EMBRIONALE
Nucleo e citoplasma
collaborano
 cellule staminali per fini di
rigenerazione
Dopo la pecora Dolly, la clonazione riproduttiva
è stata applicata con un certo successo in
veterinaria. Ma, più che alla clonazione
riproduttiva, la medicina moderna è
interessata alle cellula staminali per fini di
rigenerazione.
 Per ottenere cellule staminali, attualmente si
stanno percorrendo queste strade:

1.Manipolazione di embrioni umani (problemi etici e

giuridici, risultati scientifici ancora preliminari)
2.Trasferimento di un nucleo di una cellula somatica nel
citoplasma di un ovocita (permesso recentemente concesso in
Inghilterra a tale sperimentazione)
3. Isolamento di cellule staminali da tessuti adulti o fetali (es
amnios), unitamente a metodiche che ne consentano la
moltiplicazione e il differenziamento.
4.Individuazione di geni della staminalità, che si potrebbero
attivare nelle cellule differenziate per riprogrammarle
(iPSC).
Manipolazioni di embrioni

Questa è una
blastocisti.
Nei mammiferi,
questo stadio
corrisponde a
quello
dell’impianto
nell’utero.
Nel corso dello sviluppo embrionale,
dalla massa cellulare interna alla
blastocisti si differenzieranno i
“foglietti embrionali” e, da lì, le varie
cellule
specializzate
che
compongono
i tessuti del
corpo.
 Le cellule
della massa
cellulare
interna si
possono
prelevare e
coltivare in
vitro.

cellule in coltura
derivanti da una blastocisti di
topo: si possono far differenziare
in diversi tipi cellulari
La “clonazione terapeutica” consiste infatti nel manipolare degli
embrioni umani per far differenziare in coltura un dato tipo di cellula,
ad esempio dei
cardiomiociti, da
usare in terapia
cellulare per
ripopolare o
sostituire un
organo
danneggiato.
 Le cellule staminali adulte per la terapia
cellulare
•Sono meno problematiche delle cellule staminali embrionali in quanto:
Non richiedono la distruzione di embrioni
Differenziamento meglio controllabile
Non carcinogeniche
Più facilmente disponibili

•Anche se eterologhe, sembra che non diano problemi di rigetto

•Numerose le fonti disponibili, anche se non in tutte si trovano cellule

allo stesso livello di staminalità

•Possibilità di manipolare le cellule staminali adulte

 coltivandole per moltiplicarne il numero
 inducendo differenziamento e/o transdifferenziamento
 Yamanaka e le cellule staminali
indotte
Il problema dell’approvvigionamento di cellule staminali umane
potrebbe essere stato risolto di recente da Yamanaka, che ha
individuato i geni della staminalità ed è riuscito a farli ri-esprimere
in cellule differenziate, riportandole a livello di cellule staminali
pluripotenti.

John Gurdon e Shinya Yamanaka, Premi Nobel 2012 per la Medicina

Cosa sono le «cellule staminali indotte» e come
si ottengono da esse cellule specializzate?

Fonte immagine: http://www.rndsystems.com/cb_detail_objectname_cb09i2_induced_pluripotent_stem_cells.aspx

 Come si possono utilizzare nella ricerca?

http://www.eurostemcell.org/story/stem-cell-adventure
Fonte immagine: http://www.eurostemcell.org/
 Un esempio «fatto in casa»

http://www.dimes.unibo.it/it/risor
se/files/cardiomyocytes-derived-
from-
hipscs/at_download/file/Cardiom
yocytes%20derived%20from%20
hiPSCs.mpeg