Universidad de Guadalajara

Centro Universitario de la Ciénega

División de Desarrollo
Biotecnológico
Academia de Ingeniería Química
“Introducción a la Biotecnología”

Cultivo de Tejidos In Vitro

Nombre del alumno:
 Juan Manuel Hernández Reyes Código: 210648823
 Laura Guadalupe González Salazar Código: 212713177
 Luis Gerardo Barajas García Código: 212710968
Nombre del Profesor:
Dr. Rojas Bravo Daniel

Ocotlán, Jalisco, México a Noviembre del 2017

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Índice

Introducción..................................................................................................................................... 4
1.-Objetivos ...................................................................................................................................... 5
1.1.-Objetivo general ................................................................................................................. 5
1.2.-Objetivos particulares ....................................................................................................... 5
2.-Marco teórico .............................................................................................................................. 6
2.1.-La biotecnología ................................................................................................................. 6
2.1.1.-Campos o áreas de la biotecnología ..................................................................... 6
2.2.-Antecedentes....................................................................................................................... 7
2.2.1.-Los inicios de la biotecnología ............................................................................... 7
2.2.2.-La biotecnología moderna ........................................................................................ 8
2.2.3.-La última generación de la biotecnología ............................................................ 8
2.3.-Aplicaciones de la biotecnología ................................................................................... 8
2.4.-El cultivo In-Vitro en la biotecnología ......................................................................... 18
2.4.1.- Las bases biológicas del cultivo de tejidos: la totipotencialidad celular . 19
2.4.2.- La micropropagación .............................................................................................. 20
2.5.-Patogenos que atacan los cultivos ............................................................................. 21
2.5.1.-Hongos......................................................................................................................... 21
2.5.2.- Origen y diseminación de las enfermedades causadas por hongos ......... 22
2.6.- Virus fitopatógenos ........................................................................................................ 22
2.7.- Bacterias fitopatógenas ................................................................................................ 24
2.7.1.-Reproducción............................................................................................................. 24
2.7.2.-Sobrevivencia de las bacterias ............................................................................. 25
2.7.3.-Síntomas mostrados por las plantas atacadas por bacterias ...................... 25
3.-Materiales y métodos.............................................................................................................. 26
3.1.-Para la preparación del medio ...................................................................................... 26
3.2.-Para el cultivo In-vitro ..................................................................................................... 27
3.3.-Para el segundo medio ................................................................................................... 27
4.-Experimentación ...................................................................................................................... 29
4.1.-Secuenciación de la práctica ........................................................................................ 29
4.1.1.-Día 1 Preparación del medio MS ........................................................................... 29
4.1.2.-Día 8 Cultivo In-Vitro ................................................................................................ 31

2
 4.1.3.-Tercer día después del cultivo .............................................................................. 34
4.1.4.-Octavo día después del cultivo ............................................................................. 34
4.1.5.-Día 12 después del cultivo (Aparición de brotes) ............................................ 35
4.1.6.-Día 27 después del cultivo (Brotes casi listos para cambiar de medio) .... 36
4.1.7.-Preparación de segundo medio ............................................................................ 36
5.-Resultados................................................................................................................................. 38
6.-Conclusiones ............................................................................................................................ 41
7.-Bibliografía ................................................................................................................................ 42

3
Introducción

La biotecnología es una ciencia que en los últimos años se ha encargado de innovar

diferentes mecanismos industriales y de investigación en el que se involucran
diferentes disciplinas y ciencias (química, biología, bioquímica, genética, virología,
agronomía, ingeniería, medicina y veterinaria entre otras) con el fin de utilizar
organismos vivos, o partes de los mismos, para obtener o modificar productos,
mejorar plantas o animales o desarrollar microorganismos para objetivos
específicos (Prieto E., Jordan Z., Barrueto Cid, R. Cordeiro, & Durzan, 2005).
Al paso de los años el ser humano ha logrado hacer una gran variedad de
innovaciones tecnológicas y el impacto causado que ya no se traten de promesas o
perspectivas futuras; los productos y procesos biotecnológicos forman parte de
nuestra vida cotidiana. Se trata que esta ayude al mejoramiento de diversos
productos, que cumplan con cualidades aún mejor que los productos anteriores,
como en el caso del maíz, que en los últimos años ha tenido muchísimas
características genéticas que le han ayudado al agricultor para que sus cultivos
puedan resistir o mejoren a ciertas circunstancias que se desean (Muñoz de
Malajovich, 2012).
Con el conocimiento y con la importancia que ha logrado mencionado
anteriormente, ha crecido el uso de ella a nivel mundial. Como en el caso de China
e India que cuenta hoy con una industria de biotecnología avanzada y diversificada,
y los demás países cuentan con ella pero en ciertas áreas que se clasifican dentro
de ella. Sin embargo esto no quiere decir que por ser usada mundialmente, esta ha
sido aceptada por todo los habitantes, es así que esta se ha tenido que enfrentar a
diferentes partidos y opositores que ocurre en el sector de pasiones políticas,
religiosas e ideológicas, pero se olvida que en la actualidad estamos rodeada de
un sinfín de productos (Segretín, 2011).

Es por eso que el presente protocolo esta desarrollado para dar una idea de la
importancia que tiene y sus diversas aplicaciones, es por eso que se llevara un
propagación del Lilium spp en la que se llevará un desarrollo para conocer en qué
manera la biotecnología puede involucrarse en el desarrollo de esta
experimentación y el impacto que logra tener.

4
1.-Objetivos
1.1.-Objetivo general
 Realizar el cultivo In-Vitro de la flor Lilium spp para la obtención de una propagación
masiva.

1.2.-Objetivos particulares
 Adecuar nuestros medios para el cultivo de nuestro explante.
 Obtener la menor cantidad de explantes contaminados
 Diagnosticar las variables de contaminación de los cultivos in-Vitro.
 Visualizar la formación de brotes en cada explante, así como obtener una
gran porcentajes de estos mismos.
 Lograr llevar cada uno de nuestro explantes al cultivo ex vitro.
 Profundizar la importancia que tiene la biotecnología.

5
2.-Marco teórico
2.1.-La biotecnología
Podemos entender por biotecnología la serie de procesos industriales que implican
el uso de organismos vivos, bien sean plantas, animales o microorganismos. La
biotecnología es la nueva revolución industrial. La idea que subyace en ella es
sencilla: por qué molestarse en fabricar un producto cuando un microbio, un animal
o una planta (los verdaderos protagonistas de la biotecnología) pueden hacerlo por
nosotros. Así, se pueden lograr desde combustibles a medicinas, pasando por
plásticos, alimentos, vacunas, recursos minerales, etc. Millones de años de
evolución les capacitan para ello. Existen microorganismos para todo: los hay que
son capaces de vivir en agua hirviendo, y los que habitan hielo, pasando por los que
existen en el interior de la corteza terrestre. Son capaces de comer petróleo,
madera, plástico, e incluso rocas sólidas (Romero Vázquez, 2008).
La biotecnología en si tiene un sinfín de significados, que para muchos
biotecnologos no podrían en si determinar que es la biotecnología, por lo que puede
llegar a abarcar (Romero Vázquez, 2008).

2.1.1.-Campos o áreas de la biotecnología

 ADN recombinante (ingeniería genética). Esta técnica es la base de los
procesos de obtención de enzimas, hormonas, anticuerpos, vacunas, etc.
(CAR/PL, 2003).
 Cultivo de células vegetales y proteínas unicelulares. Esta técnica se utiliza
en la producción de sustancias químicas como esteroides, alcaloides,
proteínas unicelulares para la producción de biomasa, etc. (CAR/PL, 2003).
 Fermentaciones industriales. Esta técnica es muy antigua, pero hoy en día
estamos en condiciones de controlarla e incluso dirigirla hacia donde más
interese. Mediante la fermentación se obtienen alimentos, antibióticos y
productos químicos (CAR/PL, 2003).
 Biocatálisis. Esta técnica está en alza y tiene un amplio espectro de
aplicaciones; por ejemplo, con biocatalizadores se obtienen alimentos y
sustancias químicas. Los biosensores y algunos equipos de diagnóstico
utilizan también biocatalizadores. Además, actualmente se aplican
biocatalizadores para conseguir tecnologías más limpias en sectores como
las industrias textil, papelera, de curtidos, etc. (CAR/PL, 2003).
 Biorremediación. En el tratamiento y reutilización de residuos se aplica cada
vez más la biotecnología. De hecho, es el campo que presenta una gama
más amplia de aplicaciones. Así, se utilizan métodos biotecnológicos en la
detoxificación de tierras contaminadas por herbicidas, en el tratamiento de
aguas residuales, en la recuperación de residuos industriales —por ejemplo,
el suero de quesería o los residuos de celulosa—, etc. (CAR/PL, 2003).

6
  Ingeniería de procesos. Alrededor de las aplicaciones biotecnológicas se ha
desarrollado una industria que aplica los métodos de la ingeniería química a
los procesos biotecnológicos. Por ejemplo, encontramos la ingeniería de
procesos en la filtración y pretratamiento de efluentes, reciclado de aguas,
extracción de productos, recuperación de catalizadores y microorganismos,
etc. (CAR/PL, 2003).

En definitiva, una definición práctica de biotecnología es muy amplia y, además,

cambia con el tiempo debido al rápido desarrollo de nuevas técnicas en este campo
y a nuevos descubrimientos en biología molecular, que abren constantemente
nuevas perspectivas (CAR/PL, 2003).

2.2.-Antecedentes
El antecedente de la biotecnología es la biología moderna. Ésta ha realizado un
gran avance en las técnicas de
manipulación de organismos
complejos y ha mejorado el
conocimiento de muchos procesos
tradicionales en los que los agentes
biológicos se utilizaban de una forma
poco controlada y deliberada. No
obstante, no puede decirse que la
industria moderna de la biotecnología
fermentativa sea la versión
Fig. 1 La biotecnología Fuente: http://infoagro.com/mexico/la- actualizada de los antiguos procesos
biotecnologia-en-la-agricultura/
fermentativos de la obtención de vino
o queso, ni tan siquiera se puede decir
que esté relacionada con los descubrimientos de la microbiología del siglo XIX. Se
trata más bien del resultado de la aplicación de microorganismos seleccionados y
manipulados para fines específicos (CAR/PL, 2003).

2.2.1.-Los inicios de la biotecnología

En muchos sentidos la biotecnología es una ciencia antigua. Así, sin saber ni
entender los principios de la fermentación o de la genética, la humanidad ha estado
utilizando algunos procesos biotecnológicos desde tiempos antiguos, por ejemplo
en la producción de queso, pan, vino, cría selectiva de animales y plantas, etc.
(CAR/PL, 2003).

En cuanto al término biotecnología, fue acuñado por Karl Ereky en 1919 para
describir la interacción entre biología y tecnología; no obstante, la biotecnología no
es solamente biología y tecnología, sino también un esfuerzo multidisciplinar de la
humanidad desde hace al menos 5.000 años. Cuando se empezaron a cultivar

7
plantas o criar animales, a elaborar cerveza o vino o a producir queso, se estaban
aplicando los principios de la biotecnología en sentido amplio (CAR/PL, 2003).

2.2.2.-La biotecnología moderna

El interés actual de la biotecnología reside en el potencial que supone la unión de
procesos y métodos biológicos —antiguos y nuevos— con las técnicas de la
ingeniería química y la electrónica. De una forma gráfica, podríamos representar la
biotecnología moderna como un árbol que tiene por raíces las ciencias biológicas
(microbiología, genética, biología molecular, bioquímica) y cuyas ramas son la
ingeniería química de procesos en su acepción más amplia. El nacimiento de la
biotecnología moderna se asocia con el desarrollo, a escala industrial, de los
procesos de fabricación de penicilina (CAR/PL, 2003).

Más tarde, la moderna industria biotecnológica se planteó como objetivo el uso de

enzimas. Las enzimas son los principios activos de los microorganismos y en
realidad los responsables de las biorreacciones (CAR/PL, 2003).

2.2.3.-La última generación de la biotecnología

La biotecnología empieza a considerarse una ciencia moderna en los años setenta
por los avances en biología molecular y genética. Estos avances desembocaron en
las técnicas de clonación y ADN recombinante que permitieron a los científicos un
mejor conocimiento de las funciones celulares y sus componentes en los seres vivos
e hicieron posible el desarrollo de nuevos métodos para aislar células madre y
genes de los organismos vivos para producir in vitro productos de su metabolismo
que antes sólo podían obtenerse a partir del organismo vivo (CAR/PL, 2003).

2.3.-Aplicaciones de la biotecnología
La biotecnología industrial es una disciplina
de carácter horizontal que combina amplios
conocimientos científicos y tecnológicos e
implica la utilización de diversas técnicas:
ADN recombinante, bioprocesos, cultivo de
células y tejidos, etc. en la intervención en
la solución de problemas asociados a
productos y procesos de múltiples sectores
de actividad: agropecuario, alimentos, textil,
Fig. 2 Aplicaciones de la biotecnología Fuente:
salud, celulosa y papel, medio ambiente, http://biotecnologialasalle.blogspot.mx/2013/11/la-
entre otros. Para ello es necesario contar biotecnologia-en-medicina.html
con conocimientos específicos de los
diferentes procesos tecnológicos y los problemas asociados que atañen a los
sectores productivos en materia biotecnológica. La utilización de las biotecnologías
reporta múltiples beneficios en simplificación de procesos, mejoras en la calidad de
los productos, menor impacto ambiental, y ahorro de costos. También han permitido

8
el desarrollo de nuevos productos. Por ejemplo, las tecnologías de ADN
recombinante han permitido la producción de proteínas terapéuticas, que serían
económicamente inviables de obtener por métodos extractivos (CAR/PL, 2003).

 La biotecnología y los alimentos

 La biotecnología y la industria textil
 La biotecnología y la salud
 La biotecnología y la industria del papel
 La biotecnología y el medio ambiente
 La biotecnología y la energía
 La biotecnología y la química
 La biotecnología y el agro
 La biotecnología y los animales

 La biotecnología y los alimentos

La biotecnología relacionada con el sector de alimentos es la más tradicional, los

más conocidos son los procesos de fermentación en productos panificados, bebidas
alcohólicas (vino, cerveza) y lácteos (quesos, yogures) (Muñoz de Malajovich,
2012).

Los cultivos microbianos asociados a estos tienen una larga tradición de utilización
y pueden ser mejorados utilizando métodos de ingeniería genética. Estas
modificaciones pueden introducir cambios deseados en los productos mejorando
por ejemplo parámetros de calidad sensorial, la capacidad para producir
compuestos antimicrobianos, etc. (Muñoz de Malajovich, 2012).

Diferentes enzimas naturales y

recombinantes se aplican en
procesos y productos alimenticios
(Muñoz de Malajovich, 2012):

 En la industria del almidón y

del azúcar, en la fabricación de
jarabes de glucosa y fructuosa de
maíz y dextrosa;
 En la producción de quesos,
para romper la caseína de la leche
Fig. 3 La biotecnología y los alimentos fuente: y permitir su coagulación, para
http://biojaga02.webcindario.com/8.html resaltar el sabor y para acelerar la
maduración; - para la elaboración
de leche deslactosada;

9
  En panificación, para blanquear la harina, facilitar la acción de la levadura,
mejorar la estructura de la masas, etc; - en la clarificación de jugos de frutas,
para evitar su turbidez;
 Para la optimización del proceso de extracción y refinación de aceites;
 En enología, para acelerar el tiempo de prensada, acelerar el proceso de
maduración, la liberación de aromas, y mejorar el color y sabor. También para
remover la urea producto de la fermentación y (urea) y contrarrestar los beta
glucanos producidos por Botrytis cinerea;
 En la industria de la carne, para favorecer su tiernización, facilitar la remoción
de la carne de los huesos y en la producción de hidrolizados de proteínas.
 En la elaboración de cerveza, para evitar su enturbiamiento durante el
almacenamiento.

Los aportes que las biotecnologías han realizado en los últimos años a procesos y
productos de la industria alimentaria incluyen (Muñoz de Malajovich, 2012):

 Productos con mayor valor nutricional y organoléptico (nutrientes, poder

antioxidante, etc.)
 Nuevos alimentos funcionales para la prevención de enfermedades según
los diferentes grupos de consumidores (alimentos hipoalergénicos, para
diabéticos, etc.)
 Nuevas fuentes de materias primas (algas, invertebrados, etc.) por medio de
la introducción y expresión de genes específicos que incrementan el
contenido de sustancias de interés para la industria alimentaria (pigmentos,
proteínas, etc.)
 Uso de biosensores para control de procesos (PH, detección de
contaminantes, etc.)
 Enzimas con características específicas (termorresistentes, mayor velocidad
de reacción) para su utilización en procesos de fermentación en distintos
sectores.

 La biotecnología y la industria textil y curtiembre

El uso de enzimas en la industria textil ha tenido un fuerte impacto en los procesos

productivos, en la producción de hebra; el hilado, tejido; acabado y fabricación del
producto (Muñoz de Malajovich, 2012).

En la industria textil las enzimas se pueden aplicar tanto al tratamiento de fibras

proteicas naturales (lana y seda), como en fibras celulósicas (algodón, lino y
cáñamo) y en fibras sintéticas (Muñoz de Malajovich, 2012).

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Algunas de las enzimas utilizadas son
las amilasas, para el tratamiento de la
fibra, actúan extrayendo el almidón que
la recubre (proceso llamado
desengomado), las pectinasas para
extraer pectinas de la pared de las
células primarias del algodón, las lipasas
para el desgrasado de las fibras, las
catalasas para descomponer en oxígeno
y agua el peróxido de hidrógeno residual Fig.4 la biotecnología y la industria textil Fuente:
después del blanqueo de las fibras de https://www.inti.gob.ar/biotecnologia/
algodón, las peroxidasa para eliminar los
restos de peróxido de hidrógeno utilizados en la etapa de blanqueo, las celulasas
para hacer a los tejidos más lisos y blandos, las lacasas para la oxidación de
colorantes fenólicos utilizados en la preparación de telas para pantalones (Muñoz
de Malajovich, 2012).

En el proceso de elaboración del cuero las enzimas son utilizadas en los procesos
de remojo, pelambre enzimático y rendido o purga (lipasas, proteasas) (Muñoz de
Malajovich, 2012).

 La biotecnología y la salud
En el área de la salud humana, la biotecnología tiene diversas aplicaciones.

 Nutrición y salud. La biotecnología moderna puede contribuir a paliar los

problemas de desnutrición, atenuando al menos las carencias nutricionales
y mejorando la salud de las personas afectadas. También puede contribuir a
solucionar problemas específicos que afectan a grupos de personas, como
es el caso de determinadas alergias o enfermos diabéticos, o reducir el
contenido de compuestos tóxicos en productos de consumo habitual en la
población (Muñoz de Malajovich, 2012).
 Diagnóstico. Una de las aplicaciones de mayor impacto de la tecnología del
ADN es el desarrollo de nuevas técnicas para diagnóstico clínico. Esto ha
permitido contar con tecnologías más eficientes para el reemplazo de las
pruebas serológicas clásicas, y nuevos métodos para el diagnóstico de
enfermedades infecciosas y genéticas (Muñoz de Malajovich, 2012). Entre
éstas se encuentran:

Las técnicas de base inmunológica basadas en la reacción antígeno-cuerpo. Los

anticuerpos monoclonales tienen la propiedad de unirse al antígeno de forma muy

11
específica con lo cual los métodos de análisis y diagnóstico desarrollados a partir
de ellos son muy precisos (técnica ELISA, citometría de flujo, inmunofluorescencia,
etc.) (Muñoz de Malajovich, 2012).

Las técnicas de base genética como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

que permite amplificar pequeñas fracciones de ADN para su posterior análisis
(Muñoz de Malajovich, 2012).

 Biofármacos. Entre los biofármacos, se encuentran aquellos que cumplen

una función de reemplazo de moléculas naturales como en el caso de
hormonas, interferones, factores de coagulación sanguínea, etc y
medicamentos de diseño como la estreptoquinasa, la uroquinasa, los
anticuerpos monoclonales y los antígenos para inmunoterapias.
 Vacunas. La tecnología de ADN recombinante han permitido el surgimiento
de una nueva generación de vacunas: las vacunas recombinantes y las
vacunas de ADN. En las vacunas recombinantes, los genes que codifican
para las proteínas que provocan la respuesta inmune (el antígeno) son
aislados y clonados y se introducen mediante técnicas de ingeniería genética
en un huésped alternativo no patógeno (bacterias, levaduras o células de
mamíferos) para que lo produzca en cantidad en el laboratorio.
En las nuevas vacunas de ADN desnudo se utiliza una porción de ADN
purificado que codifique para la proteína que estimula la respuesta inmune.
El gen se introduce directamente en el individuo y son las propias células del
individuo las que sintetizan el antígeno.
También se aplican técnicas de
ingeniería genética para eliminar o
inactivar selectivamente, los genes
de virulencia de un agente
infeccioso manteniendo la
habilidad de provocar una
respuesta inmune.
 Nuevos antibióticos. A partir de la Fig. 5 La Biotecnología y la salud Fuente:
http://www.testotis.com/industry-
identificación de sustancias solutions/language=en/7828/biotech-life-sciences
producidas por microorganismos,
plantas y animales con propiedades antibióticas con relevancia clínica, es
posible incrementar su acción antibiótica, alterando su composición
molecular.
 Nuevos tratamientos. Las inmunoterapias se basan en el control de la
respuesta inmune a través de la aplicación de anticuerpos monoclonales
para la prevención de enfermedades virales, en el tratamiento de

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 enfermedades autoinmunes y contra el cáncer, para reducir la respuesta
inmune evitando el rechazo al transplante, etc.
Las terapias génicas buscan inhibir la expresión de un gen o la inactivación
de su producto o sustituir un gen inactivo por una copia funcional que se
exprese y sintetice la proteína necesaria.

 La biotecnología y la industria del papel

La utilización de tecnologías enzimáticas en la industria de pulpa y papel tiene

amplias perspectivas a futuro; en la medida que se avance en las investigaciones,
su incorporación puede traer aparejado importantes beneficios en cuanto a mejoras
en productos y procesos; reducción de costos y disminución del impacto ambiental
(menores requerimientos de energía y químicos) (Muñoz de Malajovich, 2012).
Las aplicaciones más frecuentes se dirigen a (Muñoz de Malajovich, 2012):

 La reducción del uso de agentes químicos contaminantes en la etapa de pre

blanqueo. (xilanasas).
 Blanqueamiento de pulpa. (xilanasas; celulasas).
 Reciclado de fibras. (endoglucanasas para mejorar la velocidad de drenaje
de fibras recicladas; celulasas para incrementar la densidad de la hoja de
papel y reducir su rusticidad; alfa amilasas para mejorar las propiedades del
drenaje y para el destintado de fibras recicladas, etc.).
 La disminución de residuos y contaminantes en el proceso de reciclado.
(esterasas para el control de stickies, amilasas y proteasas para la remoción
del lodo; lipasas para controlar la acumulación de lodo).
 Modificación de fibras. (celulasas para incrementar la flexibilidad de las fibras,
celulasas, xilanasas y lacasas para incrementar la densidad de las hojas,
etc.)
 Tratamiento de efluentes de la industria (enzimas y biodispersantes)

 La biotecnología y el medio ambiente

Las biotecnologías pueden cumplir un importante rol en el cuidado del ambiente

desde sus posibilidades de prevenir y remediar los problemas ambientales
derivados de las actividades productivas (Muñoz de Malajovich, 2012).

 Tecnologías más limpias. Las “biotecnologías blancas” buscan reemplazar

las tecnologías contaminantes en procesos industriales disminuyendo a la
vez la emisión de residuos. Por ejemplo, las tecnologías enzimáticas

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 permiten reemplazar o reducir la utilización de sustancias químicas agresivas
con el ambiente en procesos más limpios y seguros.
 Biorremediación. Consiste en la utilización de microorganismos, enzimas,
hongos o plantas especializados capaces de degradar deshechos peligrosos
para remover los contaminantes orgánicos (efluentes y residuos sólidos
domésticos e industriales, petróleo, pesticidas, etc.), inorgánicos (mercurio,
plomo, cobre, cianuros, etc.) y gaseosos (metanos, compuestos volátiles,
etc.) del medio ambiente. A partir de la modificación genética es posible
incrementar su capacidad de degradación de los contaminantes.

 La biotecnología y la energía
Un área de gran relevancia y rápido desarrollo de la biotecnología es la producción
de energía a partir de recursos renovables (biomasa) para generar fuentes de
energías limpias, base de un desarrollo sustentable (Muñoz de Malajovich, 2012).

Entre los combustibles de origen biológico se encuentran (Muñoz de Malajovich,

2012):

 Bioetanol. El bioetanol se obtiene a partir de la fermentación de la biomasa.

La producción biotecnológica de etanol se basa en la acción fermentativa de
las levaduras sobre un sustrato adecuado. Se ha empleado la ingeniería
genética para obtener microorganismos más productivos y tolerantes al
etanol, o capaces de fermentar diferentes materias primas.
 Biodiesel. El biodiesel se produce por transformación química de aceites
vegetales. El biodiesel es un combustible formado por ésteres (etílicos o
metílicos) producidos a partir de la reacción química entre aceites vegetales
y el alcohol. El biodiesel puede usarse sólo o mezclado con biodiesel
convencional.
 Biogas. El gas producido por la digestión microbiana de la materia orgánica
en un biorreactor (o biodigestor) pueden ser utilizado como fuente de energía
térmica, eléctrica o como combustible para transporte automotor. El proceso
fermentativo (biodigestión) se desarrolla sobre residuos rurales, agro-
industriales, domésticos, municipales y sobre plantas. Una vez finalizado el
proceso de biodigestión, el biogas puede usarse directamente o almacenarse
tanto para consumo doméstico como para generar energía eléctrica.
También puede purificarse y ser almacenado para su utilización en el
encendido de motores de automóviles.

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  La biotecnología y la química

La biotecnología se puede utilizar para reemplazar la síntesis química por

microorganismos capaces de realizar la secuencia de reacciones necesarias entre
el sustrato y el producto final. La fermentación es utilizada corrientemente en
procesos de producción farmacéutica, agroquímica, de aditivos alimentarios,
aminoácidos, vitaminas y enzimas. Además, el mejoramiento de las cepas
industriales por ingeniería genética permite
aumentar la eficiencia de los procesos
biotecnológicos y obtener productos nuevos
(Muñoz de Malajovich, 2012).

Los biotecnólogos han focalizado su

atención sobre productos clásicos de la
industria química como los plásticos. Los
plásticos convencionales representan un
problema ambiental desde el momento en
que son obtenidos a partir de combustibles
fósiles y no son biodegradables. Por esto la Fig. 6 La biotecnología y la química Fuente:
búsqueda se ha orientado al desarrollo de http://recombinaccion.blogspot.mx/2013/01/que-
puede-hacer-la-biotecnologia-por-la.html
plásticos biodegradables a partir de
materias primas renovables, derivadas de plantas y bacterias (plásticos a partir de
almidón, bacterias o plantas modificadas genéticamente) (Muñoz de Malajovich,
2012).
 La biotecnología y el agro

Las técnicas de ingeniería molecular aplicadas al mejoramiento de cultivos y las

biotecnologías incorporadas al manejo agrícola permiten un importante incremento
en la productividad y la extensión de las fronteras agrícolas de manera
ambientalmente sustentable (Muñoz de Malajovich, 2012).

Los aportes de la biotecnología al agro incluyen técnicas de cultivo y propagación;

nuevas variedades (organismos genéticamente modificados); biocidas y
biofertilizantes, métodos de detección de enfermedades y plagas, etc (Muñoz de
Malajovich, 2012).

 Técnicas de cultivo y propagación. Se conoce como micropropagación al

conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para la
multiplicación asexual de plantas. La micropropagación se utiliza
principalmente para multiplicar plantas nuevas (creadas por ejemplo por
ingeniería genética) o para obtener plantas libres de enfermedades.
La multiplicación vegetativa puede realizarse por métodos relativamente
sencillos como la propagación por gajos o por técnicas más complejas como

15
 el cultivo in vitro o la propagación por apomixis (propagación por semilla sin
fecundación de la gameta femenina, dando lugar a plantas genéticamente
iguales a la planta madre)
 Nuevas variedades. Tradicionalmente en el agro se han aplicado técnicas de
mejoramiento de cultivos: cruzamiento selectivo entre diferentes variedades
vegetales para obtener nuevas variedades de mayor rendimiento,
hibridación. Hoy en día, las técnicas de ingeniería genética permiten saltar
las barreras entre especies y obtener plantas mejoradas en sus propiedades
agronómicas, o en su calidad nutricional o industrial:
o Plantas tolerantes a herbicidas, de amplio espectro que asociados a sistemas
de siembra directa evitan las tareas de labranza que erosionan los suelos.
o Plantas resistentes a enfermedades y plagas, como el algodón BT y el maíz
BT a las que se les ha transferido el gen que codifica para una toxina
proveniente de Bacillus thurigiensis que provoca la muerte de las larvas de
insectos.
o Plantas tolerantes a estrés abiótico que pueden sobrevivir mejor en suelos
salinos, a bajas temperaturas o en climas con lluvias escasas.
o Plantas con calidad nutricional mejorada: puede implicar el mejoramiento de
la calidad de la planta como alimento (por ejemplo modificación en la
proporción de nutrientes y vitaminas), la reducción de alérgenos, la
modificación del tiempo de conservación, de las características
organolépticas, etc. Por ejemplo, el arroz dorado es una variedad de arroz a
la que se le han introducido dos genes provenientes del genoma del narciso
y otro gen bacteriano. Estos genes codifican pasos de la ruta de síntesis de
la provitamina A, lo que las variedades convencionales de arroz no tienen.
Este arroz con provitamina A, permitiría paliar en gran medida los problemas
de avitaminosis.
o Plantas con propiedades nuevas: desarrolladas para trabajar como
biofábricas produciendo fármacos, vacunas y plásticos. Por ejemplo, la
producción de anticuerpos monoclonales humanos para combatir el virus de
la hepatitis B (VHB) a partir de células transgénicas de la planta del tabaco.
 Biofertilizantes: Bacterias como Rhizobium (presente en los suelos agrícolas)
son utilizadas como biofertilizantes para facilitar la asimilación de nitrógeno
en los cultivos de leguminosas. La inoculación de las semillas antes de la
siembra con bacterias y otros ingredientes permiten aumentar su población
y, en consecuencia, la capacidad de fijación de nitrógeno atmosférico. De
esta manera se reduce la necesidad de aplicar fertilizantes nitrogenados
evitando la contaminación asociada.
 Biocontrol: Los métodos de control biológico de plagas y enfermedades
incluyen la utilización de microorganismos como Azotobacter, bacterias del

16
 género Bacillus y Streptomyces que compiten por los nutrientes con los
patógenos u otorgan resistencia a las plantas, por su capacidad de producir
sustancias con propiedades antimicrobianas. El Bacillus thuringiensis (BT)
produce unos cristales constituidos por proteínas que tienen propiedades
insecticidas. Estas endotoxinas forman parte de formulaciones comerciales
de bioinsecticidas.

 La biotecnología y los animales

En esta área, las biotecnologías se aplican tanto a la producción animal (acuicultura,

piscicultura, marcadores de mejora, Organismos Geneticamente Modificados –
OGMs-, feromonas, técnicas reproductivas) como a la alimentación y salud de los
animales (Muñoz de Malajovich, 2012).

 Producción animal. La ingeniería genética permite modificar genéticamente

animales transfiriéndose genes de una especie a otra diferente, integrarse a
su genoma, ser funcional y transmitirse a la descendencia. La transgénesis
animal puede tener objetivos diversos como el estudio de enfermedades
humanas; como fuente de tejidos y órganos para transplantes en humanos,
el mejoramiento del ganado (aumento de la tasa de crecimiento corporal,
modificación de la relación carne/grasa, resistencia a enfermedades, etc.) o
la producción de moléculas de interés para diferentes industrias, como la
farmacéutica, la alimenticia, la química, etc.
Proteínas recombinantes de interés farmacológico se obtienen a partir de la
leche de animales transgénicos de granja (ovejas, vacas, cerdos, cabras,
etc.). De esta manera, las proteínas se pueden producir en grandes
cantidades, su purificación es relativamente sencilla, su producción no
interfiere con la biología del animal y tanto su impacto ambiental como su
costo es muy bajo.
Una vez obtenido el animal transgénico, éste puede ser clonado para obtener
una descendencia importante genéticamente idéntica que producirá también
la nueva molécula de interés.
Entre los animales transgénicos
utilizados para la producción de
proteínas de interés farmacológico
se encuentran ovejas
transgénicas que producen la
proteína alfa1proteinasa así como
los factores de coagulación VII y Fig. 7 La biotecnología y los animales Fuente:
IX y vacas que producen la http://apuntesbiotecnologiageneral.blogspot.mx/2015/0
6/biotecnologia-y-naturaleza-i-el-adn.html
hormona de crecimiento humano.

17
  Alimentación y salud animal.. Técnicas biológicas aplicadas a ensayos de
diagnósticos y vacunas para patologías animales; suplementación con
enzimas (amilasas, beta-glucanasas, xylanasas) para mejorar la
digestibilidad de las mezclas nutricionales para animales, empleo de fitasas
exógenas para mejorar la biodisponibilidad de fósforo en las dietas.

2.4.-El cultivo In-Vitro en la biotecnología

El término genérico “cultivo de tejidos vegetales” involucra a diferentes técnicas de
cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células
desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas.
Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de
microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales
controladas. También se lo conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse
en recipientes de vidrio (hoy también de otros materiales) (Segretín, 2011).

Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se

remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: la
germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las
plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas,
y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias)
(Segretín, 2011).
Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones (Segretín, 2011):

 Propagación masiva de plantas, especialmente para especies de difícil

propagación por otros métodos, o en vías de extinción
 Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables
durante todo el año
 Obtención de plantas libres de virus
 Producción de semillas sintéticas
 Conservación de germoplasma (conjunto de individuos que representan la
variabilidad genética de una
población vegetal)
 Obtención de metabolitos
secundarios
 Producción de nuevos
híbridos
 Mejora genética de plantas
(incluyendo obtención de
plantas transgénicas)
 Germinación de semillas. Fig. 8 Cultivos In-vitro Fuente:
http://plantas.facilisimo.com/blogs/plantas/cultivo-in-vitro-de-
 Producción de haploides. frutales_898244.html

18
  Estudios fisiológicos diversos.

2.4.1.- Las bases biológicas del cultivo de tejidos: la totipotencialidad celular

La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que,
en general, varias células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria
para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que
medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametas. Esta capacidad se
denomina totipotencialidad celular, y es característica de un grupo de células
vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en los distintos
órganos de la planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de
conducción, epidérmica, etc.) para generar tejidos nuevos y eventualmente un
organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa
célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de
cultivo a las que se la someta. Las células vegetales crecidas en condiciones
asépticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden
dividirse dando dos tipos de respuesta (Segretín, 2011):

 Una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da

lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo
las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones
somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión, pero
que no se originaron por unión de gametas) (Segretín, 2011).
 Una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos
(organogénesis) o embriones (embriones somáticos) (Segretín, 2011).

La primera respuesta se conoce como organogénesis o embriogénesis indirecta

(mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta se considera
organogénesis o embriogénesis directa (Segretín, 2011).

El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se

denominará explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento
de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio
nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o
muchas plantas (Segretín, 2011).

La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado

(callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir
semillas artificiales (Segretín, 2011).

El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión

de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su
condición meristemática. A tal fin, debe inducirse primero la desdiferenciación y

19
luego la rediferenciación celular. Un proceso de este tipo sucede durante la
formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de
yemas adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana
o peperonias mediante porciones de hojas. Uno de los factores más importantes a
tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada es la composición
del medio de cultivo (Segretín, 2011).

No existen dudas que en todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in

vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie,
y que está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del
órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese
balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción
de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del
crecimiento, y se emplean en los medios de cultivo para conseguir la
micropropagación de una planta (Segretín, 2011).

La totipotencialidad celular es clave en el desarrollo de plantas genéticamente

modificadas o transgénicas. Una vez realizada la transformación, ya sea por
Agrobacterium o por el método de biobalística, el paso siguiente es el cultivo in vitro,
con el fin de obtener, a partir del explanto inicial transformado, plántulas que lleven
el transgén en todas sus células (Segretín, 2011).

2.4.2.- La micropropagación
La propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada en cultivos de
importancia económica. Permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas,
embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. Los cultivos son realizados
por personal especializado en medios específicos (hormonas, minerales, vitaminas,
fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y condiciones ambientales
controladas (temperatura, humedad y luz). Una vez ajustados los protocolos para la
especie o cultivo de interés, es posible automatizar el proceso de modo de llevarlo
a mayor escala de producción (Segretín, 2011).

La micropropagación (propagación
clonal por cultivo in vitro)
constituye uno de los métodos
biotecnológicos que mayores
logros ha aportado al desarrollo de
la agricultura, ya que se la usa en
la producción masiva de especies
hortícolas, aromáticas,
medicinales, frutícolas,
ornamentales y forestales
Fig. 9 La micropropagación Fuente: http://www.invisa-bio.com/
(Segretín, 2011).

20
Entre las ventajas de la micropropagación se pueden mencionar:

 Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.

 Permite controlar las condiciones ambientales, debido a su independencia de
los mismos (luz, temperatura y humedad controlada).
 Permite estudiar diversos procesos fisiológicos.
 Evita el riesgo de contaminación con patógenos, ya que se realiza en medios
esterilizados.
 Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos.
 Permite la obtención de individuos uniformes.
 Facilita el transporte del material.
2.5.-Patogenos que atacan los cultivos
Las enfermedades en los cultivos son provocadas por agentes bióticos que alteran
las funciones fisiológicas de las plantas, afectando su normal funcionamiento,
reduciendo generalmente los rendimientos y en casos extremos provocándoles la
muerte. Los agentes bióticos (vivos) causales de enfermedades son conocidos
como patógenos (ejemplo bacterias, hongos, virus, nematodos y fitoplasmas). A
continuación, se presenta información sobre los principales patógenos que afectan
a las plantas (PROMIPAC, 2009).
.

2.5.1.-Hongos
Son organismos pequeños, generalmente microscópicos, que se reproducen
principalmente a través de esporas. Las esporas son el equivalente a las semillas
en las plantas. La mayoría de los hongos tiene un cuerpo vegetativo filamentoso
llamado micelio. El micelio da a los hongos una apariencia algodonosa. Ésta es una
característica utilizada en el
campo para distinguir las
enfermedades causadas por
hongos de aquellas causadas por
bacterias. Se nombran los
distintos grupos de hongos, con
sus respectivos ejemplos, para
enfatizar que no todos los hongos
son controlados por la totalidad de
los fungicidas, sino que es
indispensable conocer el grupo de
hongo al que pertenece una
enfermedad en particular para Fig. 10 Hongos en cultivos In-vitro
poder seleccionar y utilizar el
fungicida apropiado para su control químico (PROMIPAC, 2009).

21
  Ascomycetes: pudrición del tallo o cáncer (Ceratocystis sp.), mildiu polvoso
o blanco (Erysiphe sp.), sigatoka o mancha foliar del plátano (Mycosphaerella
sp.).
 Basiodiomyccetes: roya del maíz (Puccinia sp.), mustia hilachosa del frijol
(Thanatephours cucumeris).
 Oomycetes: tizón tardío (Phytophthora infestans), mildiu velloso
(Peronospora sp.), mal del talluelo (Phytium sp.).
 Deuteromycetes: Tizón temprano (Alternaría solant), moho gris (Botrytis
sp.), Antracnosis (Colletotrichum sp.), Fusarium (Fusarium sp.) (PROMIPAC,
2009).
2.5.2.- Origen y diseminación de las enfermedades causadas por hongos
Las enfermedades no son de aparición espontánea sino que tienen fuente de origen
(hospederos alternos, material infectado en descomposición, esporas latentes en el
suelo, etc.). (PROMIPAC, 2009) Debido a que las esporas de hongos son muy
pequeñas y livianas, éstas pueden diseminarse por:
1. El viento.
2. El agua (salpique por lluvia, riego por aspersión o escorrentías).
3. Los organismos pequeños como insectos y ácaros.
4. El movimiento de gente, maquinaria o animales.

2.6.- Virus fitopatógenos

Los virus no tienen órganos reproductivos, sino que utilizan a las plantas que
infectan para replicarse. Los virus tienen una estructura sencilla compuesta
únicamente de ácido nucléico (ADN o ARN) y una capa proteica, y son tan pequeños
que no pueden ser vistos utilizando microscopios convencionales (PROMIPAC,
2009). Las características más importantes de los virus son las siguientes:

Los virus son tan pequeños que se necesitan técnicas especiales para su detección.
Para el diagnóstico de los virus
se necesitan métodos de
análisis de laboratorio de mayor
sensibilidad (análisis ELISA,
PCR y de inoculación de
plantas sensibles a
determinados virus) que los
utilizados con otros tito
patógenos como bacterias y
hongos.
Fig. 11 Virus en plantas

22
Los virus pueden ser de transmisión mecánica o necesitar vectores para su
diseminación y transmisión. Los virus no pueden moverse y/o penetrar tejido de una
planta por sí solos, por lo que necesitan de un vector que los transporte o disemine.
Los insectos son los vectores de virus más importantes y, entre ellos, los áfidos son
responsables de la transmisión de alrededor del 60% de todos los virus de plantas
transmitidos por insectos (PROMIPAC, 2009).

Los animales y el hombre transmiten virus mecánicamente (por contacto y uso de

herramientas). El material vegetativo obtenido de plantas enfermas (esquejes,
injertos, cormos, rizomas) y utilizados para reproducción de plantas es un medio
muy común y efectivo para la transmisión de virus (PROMIPAC, 2009).

 Los virus son parásitos obligados. Para multiplicarse o sobrevivir

necesitan de un hospedero vivo. Los virus que necesitan de un vector
sobreviven únicamente en plantas infectadas o en sus respectivos vectores
mientras éstos vivan o permanezcan infectados (mosca blanca o thrips), pero
no pueden sobrevivir en material vegetal muerto. Esto implica que la
eliminación de plantas con virus de transmisión por vector dentro de una
plantación no necesita de arreglos especiales como el uso de desinfectantes,
la quema o entierro de plantas viróticas (PROMIPAC, 2009).
En contraste, los virus de transmisión mecánica son muy estables y pueden
sobrevivir, aunque sin reproducirse, fuera de un ser vivo, como en el suelo,
en material vegetal en descomposición, herramientas, citgarrillos, cabuya y
estacas durante mucho tiempo. Por ello, debe disponerse de las plantas
viróticas apropiadamente y desinfectar a los operarios que trabajan en la
plantación. Los virus de transmisión mecánica (Tobamovirus} son específicos
de las solanáceas (tomate, chile, papa, tabaco, berenjena) (PROMIPAC,
2009).
 Los síntomas causados por virus son de tipo sistémico. Es decir se
presentan en todos los brotes, en contraste con la mayoría de síntomas
causados por otros fitopatógenos que suelen ser localizados. El ácaro blanco
causa síntomas muy parecidos a aquellos causados por virus en chile y en
otras solanáceas, pero su daño raras veces afecta todos los brotels.
Adicionalmente, una vez controlado el ácaro, el crecimiento de los brotes
vuelve a ser normal, no así en la virosis. Los virus causan enfermedades que
no pueden curarse y causan pérdida en rendimiento. A diferencia de la
mayoría de las enfermedades causadas por otros fitopatógenos, toxicidad
por químicos, daños de ácaros, nematodos, insectos y deficiencias
nutricionales, las plantas infectadas por virus tienen reducciones en
rendimiento y síntomas que no pueden revertirse (no pueden curarse). Al no
tener alternativas curativas para el control de virus, es necesario manejar los
virus de manera preventiva. Las reducciones en rendimiento pueden ser muy

23
 severas si la infección ocurre a temprana edad de la planta (antes de
fructificación) (PROMIPAC, 2009).
 Los virus son específicos. Suelen atacar plantas con características
similares: hojas anchas anuales o herbáceas, hojas angostas o zacates,
plantas perennes, pero rara vez un virus es capaz de atacar más de un grupo
de plantas. Para utilidad práctica, esto implica que los virus que atacan
cultivos de importancia económica, como tomate, chile, melón, sandía,
pueden ocurrir 13n plantas solanáceas o cucurbitáceas, en otras herbáceas
cultivadas o no, de otras familias, pero no en maíz, sorgo, zacates o árboles
de los alrededores. Esta característica permite prevenir posibles fuentes de
virus antes de la siembra, identificar el posible origen de las enfermedades
virales en la vecindad del cultivo e inclusive planificar medidas de manejo de
virosis, como el uso de barreras de sorgo, maíz o zacates en perímetros de
cultivos (PROMIPAC, 2009).

2.7.- Bacterias fitopatógenas

Entre los principales géneros de bacterias que
atacan a los cultivos se encuentran: Xanthomonas,
Pseudomonas, Erwinia, Agrobacterium y Ralstonia
(PROMIPAC, 2009).

2.7.1.-Reproducción
Las bacterias son organismos unicelulares que se
reproducen por fisión binaria (una célula se parte y
se convierte en dos células idénticas) y generalmente
necesitan de un medio de crecimiento rico en
proteínas y con ambiente de alta humedad relativa
para su infección, reproducción y diseminación. Bajo
condiciones ambientales favorables de temperatura,
humedad y nutrientes, las bacterias pueden dividirse
cada 20 minutos. Sin embargo, este exagerado ritmo
de crecimiento puede verse limitado por la falta de
nutrientes, acumulación de desechos metabólicos y
otros factores limitantes (PROMIPAC, 2009). Fig. 12 Bacteria en Cultivos In-Vitro

Las bacterias se diferencian de los hongos por no ser capaces de penetrar

directamente tejidos de las plantas, sino que necesitan de heridas provocadas por
insectos, pájaros, nematodos y por los humanos durante prácticas culturales como
el trasplante, poda, etc. Las aberturas naturales de las plantas también son puerta
de entradas aprovechadas por las bacterias (PROMIPAC, 2009).

24
2.7.2.-Sobrevivencia de las bacterias
La mayoría de las bacterias fitopatógenas se desarrollan dentro de sus plantas
hospederas, en la superficie de las plantas, en rastrojos de y en el suelo. En el suelo,
las bacterias viven preferiblemente en material vegetal y con menor frecuencia libre
o saprofíticamente. Las bacterias pueden también sobrevivir dentro o sobre semillas
o en insectos encontrados en el suelo (PROMIPAC, 2009).

2.7.3.-Síntomas mostrados por las plantas atacadas por bacterias

Las bacterias fitopatógenas tienden a atacar follaje y frutos (por ejemplo mancha y
peca bacteriana en solanáceas como chile) o a ser problema en raíces (por ejemplo
Ralstonia en tomate). A diferencia de los hongos, producen lesiones (manchas,
pecas, podredumbres húmedas que despiden un mal olor, chancros, moteados,
roñas y costras), pero nunca presentan micelios y son predominantes únicamente
bajo condiciones de alta humedad relativa o encharcamiento del suelo.
Adicionalmente, con condiciones favorables (alta humedad relativa o
encharcamiento), el avance de las enfermedades causadas por bacterias puede ser
sumamente rápido debido a su extremadamente rápida multiplicación (minutos). Por
esa misma razón, el uso de antibióticos para su control debe tener una frecuencia
de aplicación más corta (no mayor a 4 días) que la normalmente acostumbrada para
fungicidas o insecticidas (alrededor de 7 días) (PROMIPAC, 2009).

25
3.-Materiales y métodos
Para la realización de la experimentación del presente trabajo necesitamos del
permiso del maestro Rojas para poder acudir a las instalaciones del laboratorio de
biotecnología en donde se llevara a cabo todo el proceso del cultivo In-vitro.

Pero para poder realizar la experimentación necesitamos de diversos materiales

que se necesitaran a lo largo de todo el trabajo, el cual se presenta a continuación:

3.1.-Para la preparación del medio

 Agua bidestilada
 Tres vasos de precipitado de 1 litro
 Matraz Erlenmeyer de 1 litro
 Papel aluminio
 Frascos con tapa (de 20 a 30)
 8 vidrios de 18 x 18
 Termoagitador
 Potenciómetro
 Traje de cirujano
 Papel periódico y papel filtro
 30 gramos de azúcar
 Jabón
 Mosca magnética
 Autoclave
 3 Pinzas de disección
 Tres bisturís
 Vidrio de reloj
 5 magentas
 Carrito de acero inoxidable
 Plástico adherible vitafilm
 Perilla
 Pipeta graduada 10 y 20 ml
 Las siguientes sustancias se agregan por 1000 ml de solución
 a)25 ml de macronutrientes
 b) 1 ml de micronutrientes
 c) 2.9 ml de Cloruro de calcio
 d) 1 ml de Yoduro de potasio
 e) 10 ml de EDTA
 f) 2 ml de Thiamina
 g) Azúcar 30 g/L
 h) Phytagel 3.5 g/L

26
  i) 10 mg de adenina
 j) 2.5 mg de 6 BAP
 k) 2 ml de Ac. Indolacetico
 l) 50 mg de adenina


3.2.-Para el cultivo In-vitro

 Agua bidestilada
 3 Pinzas de bisección
 3 Bisturí
 Hipoclorito de sodio (NaClO)
 Aspersor
 Alcohol
 Traje de cirujano
 Cubre bocas
 Guantes de látex
 Cubre zapatos
 3 Pinzas de disección
 Tres bisturís
 Navajas de bisturí
 5 magentas
 Carrito de acero inoxidable
 Plantas de lilys jóvenes
 Tijeras
 Campana de flujo laminar
3.3.-Para el segundo medio
 Agua bidestilada
 Tres vasos de precipitado de 1 litro
 Matraz Erlenmeyer de 1 litro
 Papel aluminio
 Frascos con tapa (de 20 a 30)
 8 vidrios de 18 x 18
 Termoagitador
 Potenciómetro
 Traje de cirujano
 Papel periódico y papel filtro
 30 gramos de azúcar
 Jabón
 Mosca magnética

27
  Autoclave
 3 Pinzas de disección
 Tres bisturís
 Vidrio de reloj
 5 magentas
 Carrito de acero inoxidable
 Plástico adherible vitafilm
 Perilla
 Pipeta graduada 10 y 20 ml
 Las siguientes sustancias se agregan por 1000 ml de solución
 a)25 ml de macronutrientes
 b) 1 ml de micronutrientes
 c) 2.9 ml de Cloruro de calcio
 d) 1 ml de Yoduro de potasio
 e) 10 ml de EDTA
 f) 2 ml de Thiamina
 g) Azúcar 30 g/L
 h) Phytagel 3.5 g/L
 i) 10 mg de adenina
 j) 0.5 mg de AIB
 k) 2 ml de Ac. Indolacetico
 l) 50 mg de adenina

Para plantar los bulbos se necesitan los mismos materiales que para el cultivo In-
Vitro. Solamente se ocuparan para la preparación de la sustancia protectora lo
siguiente.

a) ½ litro de agua estéril destilada

b) 250 mg de eritromicina
c) 250 mg de Tetraciclina
d) 250 mg de Captan

28
4.-Experimentación
4.1.-Secuenciación de la práctica
4.1.1.-Día 1 Preparación del medio MS
Orden de preparación del medio
1.-Lavamos un matraz Erlenmeyer de 1 litro.
2.-Lavamos el matraz con jabón y agua.
3.-Enjuagamos con agua bidestilada.
4.-Colocamos un colchón de agua bidestilada

5.-Se le agrego un agitador magnético, se puso en el termo agitador magnético y

encendimos.
6.-Agregamos las soluciones en el siguiente orden:
a) 25 ml de macronutrientes
b) 1 ml de micronutrientes
c) 2.9 ml de Cloruro de calcio
d) 1 ml de Yoduro de potasio
e) 10 ml de EDTA
f) 2 ml de Thiamina
g) Azúcar 30 g/L
h) Phytagel 3.5 g/L
i) 10 mg de adenina
j) 2.5 mg de 6 BAP
k) 2 ml de Ac. Indolacetico
l) 50 mg de adenina
7.-Aforamos a 1 litro con agua bidestilada.
8.-Agregamos 30 gramos de azúcar

9.-Medimos el pH hasta 5.6. Al inicio nuestro pH fue como de 3.9 pero agregamos
varias gotas de hidróxido de potasio para llegar hasta ese punto.

10.-Ya que se midió el pH, se tapó el matraz con papel aluminio y se inició a calentar
y en ese tiempo se agregaron 3 gramos de phytagel.

29
11.-Dejamos así hasta que hirviera, ya para cuando inicio la ebullición la solución
estaba casi transparente, en nuestro caso no estuvo completamente transparente
porque el azúcar era muy morena.
12.-Ya que hirvió retiramos el matraz e iniciamos con el llenado de frascos.

13.-En caliente, agregamos aproximadamente 50 ml de solución en cada frasco y

tapamos cada uno inmediatamente, a cada uno lo etiquetamos para que no se
mezclen con los demás cultivos que pudieran estar en la incubadora.

14.-Terminando el vaciado, preparamos 5 magentas con agua bidestila,

etiquetamos y tapamos

15.-Preparamos 8 vidrios con papel filtro y periódico, los vidrio utilizados medial
alrededor de 20 cm de largo por 15 cm de ancho.

16.-Todo el material lo metimos a las autoclaves (desde bisturí, los vidrios, los medio
ya preparados hasta el traje de cirujano), de tal modo que acomodamos el material
dentro de ellas, cerramos e iniciamos a calentar hasta que alcanzo una presión de
14 psi o 121°C. Contamos 20 minutos y apagamos la autoclave.

17.-Dejamos enfriar la autoclave hasta 40°C y es hasta entonces cuando pudimos

abrir el equipo para sacar todo el material.

18.-En caliente, tomamos cada uno de los frascos y sellamos cada uno de ellos con
el plástico adherible.

19.-Todo el material autoclaveado fue puesto en un carrito y lo metimos al transfer,

de ahí nos fuimos al otro lado y depositamos las cosas en otro carrito para pasar a
la zona 9 o zona estéril, y dejamos reposar para que gelifico, por lo menos se debe
dejar tres días y entonces se pueden usar para llevar a cabo nuestros cultivos.

30
 Laboratorio de Biotecnología 14 de septiembre del 2017

Fig. 13 Mezcla de Fig. 14 Aforado de Fig. 15 Medición de pH a Fig. 16 Calentamiento de

sustancias solución 5.6 solución

Fig. 17. Autoclave para

esterilizar

4.1.2.-Día 8 Cultivo In-Vitro

 Descontaminación de la planta

Para la descontaminación de la planta se llevó a cabo el siguiente procedimiento:

31
1.-Primeramente debimos de ver seleccionado una planta en buen estado y joven,
con los botones aun sin abrir y verdes.
2.-Lavamos la planta con agua y jabón completamente.
3.-Cortamos la planta en pequeños trozos de un tamaño alrededor de 5 cm.
4.-Preparamos una solución de jabón en un vaso de precipitado de 1 litro.

5.-Pusimos en otro baso de precipitado los trozos de la planta y un agitador

magnético.
6.-Agregamos agua jabonosa hasta sumergir los trozos, agitamos en un lapso de
10 minutos, después paramos y enjuagamos las plantas.
7.-Repetimos el proceso del punto 6 dos veces para dejar los trozos limpios.
8.-Preparamos una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 1%.

9.-Pusimos los trocitos lavados en un vaso de precipitado y los llevamos al transfer,

junto con el NaClO y la plancha termo agitadora.

10.-Nos vestimos con nuestro traje de cirujano y pasamos a la sala 9, la zona donde
realizaremos nuestro cultivo.

11.-Recogimos las cosas que habíamos dejado en el transfer y de ahí las llevamos
a la zona, donde se encuentra la campana de flujo laminar.

12.-El vaso con los trocitos lo pusimos en la mesa de trabajo y agregamos solución
de NaClO hasta hundir, lo dejamos con el agitador y así dejamos por 20 minutos.

12.-Mientras se cumplía el tiempo, nos organizamos, limpiamos y quitamos el

plástico de los frascos del medio, dentro de la campana. También preparamos la
solución de alcohol al 70% dentro de la campana.

13.-Ya pasados los 20 minutos, trasladamos el contenido a la campana y lavamos

los trozos por lo menos tres veces en agua bidestilada, limpia y estéril.
14.-Trabajamos en la campana haciendo los cortes de la planta en los segmentos
que el NaClO quemo la planta con el bisturí encima de un vidrio previamente
esterilizado, con las pinzas tomábamos la planta de tal forma que se incrustara en
el gel, la boca del frasco siempre se mantuvo de forma que le diera el aire de la
campana, sin mover la boca de tal forma que estuviera volteando hacia el interior
(En cada frasco de cultivaron alrededor de tres plantas en cada uno), después de
cada plantación se volvió a tapar cada uno de los frascos.

32
15.-Ya que se cultivó en cada uno de los frascos, volvimos a sellar con plástico vita
film, y los llevamos a la zona de incubación, en donde crecerá cada uno de los
cultivos.

 21 de septiembre del 2017 Zona 9 Laboratorio de biotecnología

(realización del cultivo in-vitro).

Ilustración 2 Ilustración 1

Fig. 18 Equipo antes de entrar a la realización del cultivo Fig. 19 Cultivo In-vitro

Ilustración 4 Ilustración 3

Fig. 20 Cultivo en el Fig. 21 Campana de flujo laminar Fig. 22 Corte de plantas

medio

33
 Fig. 23 Vasos con Fig. 24 Acomodo de Fig. 25 Acomodo de
cultivo vasos en carrito vasos en incubadora

4.1.3.-Tercer día después del cultivo

25 de septiembre del 2017 Observación de contaminación de nuestros cultivos en
la incubadora

Fig. 26 Observaciones Fig. 27 Hongo en Fig. 28 Cultivo Sano

de cultivos cultivos

4.1.4.-Octavo día después del cultivo

28 de septiembre del 2017

34
 Fig. 29 Nuevos Cultivos Fig. 30 Cultivo con Fig. 31 Cultivo
contaminados hongo contaminado

4.1.5.-Día 12 después del cultivo (Aparición de brotes)

02 de octubre del 2017

Fig. 32 Aparición de nuevo brote Fig. 33 Cultivo Fig. 34 Cultivo sano

contaminado

35
4.1.6.-Día 27 después del cultivo (Brotes casi listos para cambiar de medio)
17 de octubre del 2017

Fig. 35 Brotes de buen tamaño

4.1.7.-Preparación de segundo medio

Para la realización de este medio se utilizó el mismo procedimiento que se hizo para
la preparación del primer medio, solo que en esta ocasión en vez de agregar el 6
BAP, lo quitamos y agregamos 0.5 mg de AIB

Fig.36 Vasos con segundo medio

 Segundo Cambio de medio

09 de noviembre del 2017
Primeramente se preparó un herbicida para que la planta no fuera atacada tan
fácilmente como en la primera ocasión y existan menos botes contaminados, para
la preparación de la sustancia fueron mezclados los siguientes compuestos
e) ½ litro de agua estéril destilada
f) 250 mg de eritromicina
g) 250 mg de Tetraciclina
h) 250 mg de Captan

36
Después en la campana el bulbo que estaba pegado a los tallos de la planta fue
separado y fueron puestos en la sustancia para que la planta no se contamine al
cambiar de medio y se dejaron por un lapso de 15 minutos. Ya que se llegó el
tiempo se sacaron y fue puesto el bulbo en el bote.
Después se dejaron nuevamente en la incubadora para dejar crecer la raíz del
bulbo pasar después pasar a tierra para seguir con el procedimiento Ex-vitro.

Fig. 37 Tallo con brote Fig.38 Corte del bulbo de Lily Fig. 39 Separación de bulbo
del tallo

37
5.-Resultados
Tabla 1 Tabla de los días transcurridos, No. De contaminados, No. De brotes y observaciones

Día No. De No. De Observaciones

contaminados brotes
3 5 0 La planta tenía alrededor de ella una especie de
capa blanca, muy parecido a las características
del algodón
8 6 0 En este día aparecieron una serie de vasos
contaminados, logrando así el 50% de
contaminación de nuestros cultivos
9 0 0 En este día no se observó ningún cambio en
nuestros cultivos.
10 No hubo observaciones
11 No hubo observaciones
12 5 2 La mayoría de nuestros frascos se encuentran
con un hongo que tiene un parecido al algodón,
en esta vez apareció un cultivo con un hongo de
color rosa. Y dos frascos tienen pequeños puntos
blancos
13 2 2 Apareció un bote más contaminado con un
pequeño hongo blanco alrededor de la planta y
un cultivo que está seco.
14 0 1 Nos quedan 3 botes sin contaminar, lo único
bueno es que ya un bote tiene dos brotes de 1
cm
15 0 0 Los brotes comienzan a crecer como a 1.5 cm en
un bote
16 0 0 Se está analizando volver a sembrar un cultivo y
se está analizando del porque se contaminaron
tantos botes, el brote ya tiene un tamaño de 2
cm.
17 No hubo observaciones
18 No hubo observaciones
19 0 1 En uno de los botes el brote tiene un tamaño de
3.5 cm
20 0 0 Los brotes en los tres botes siguen creciendo
21 0 2 Los botes ya tienen un total de 6 brotes y se
sigue teniendo un bote con dos brotes que llevan
ventaja a los demás cultivos
22 0 0 No hubo cambios
23 0 0 Los brotes tienen en promedio un tamaño de 4 a
5 cm

38
 24 No hubo observaciones
25 No hubo observaciones
26 0 0 Los brotes ya tienen un tamaño de 6 cm
27 0 0 No hay cambios
28 0 0 Un bote no tiene botes pero no está contaminado
29 0 0 El tamaño de los brotes es casi el necesario para
cambiarlo de medios
30 2 0 Dos botes más aparecieron contaminados

Días Vs Contaminación
7

6
Contaminación de frascos

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Días Transcurridos

Fig. 40 Días transcurridos Vs Número de contaminación

Días vs Número de brotes

2.5

2
Número de brotes

1.5

0.5

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Días Transcurridos

39
Como indican las tablas y las gráficas lamentablemente se obtuvo una mayor
cantidad de botes contaminados que botes sanos y con brotes, lamentablemente
se pudo tener solo 2 botes sanos lo que es un porcentaje del 9% de los cultivos que
realizamos.
La mayoría de los contaminantes fueron a causa de un hongo que le salió alrededor
de la planta, que es un hongo que por no descontaminar muy bien la planta este
hongo sigue adherido a ella, lo que provoca ese como bellito blanco alrededor de la
planta como lo muestran algunas figuras que están mostradas en el desarrollo de
práctica, solamente 2 tenían una bacteria de color rosa que esta bacteria también
ya se encuentra en la planta pero solo que esta se encuentra en las células.
Otra de nuestras observaciones fue que al preparar el medio el color de nuestra
sustancia era de color mayormente café comparado con los de otros equipos, y esto
fue por lo del azúcar.
Algunas de nuestros vasos sanos tenían la planta seca, como si se hubiera
quemado por algunas de las sustancias que fueron agregadas no le hubiera gustado
a la planta para poderse desarrollar.
La mayoría de los cultivos realizados de la mayoría de los equipos lamentablemente
la mayoría se encontró contaminada.

40
6.-Conclusiones
Con los resultados obtenidos podemos concluir que no se pudo lograr la menor
cantidad de botes contaminados, ya que la época del año afecta considerablemente
al hacer el cultivo In-vitro, ya que si fuera por la culpa de no ver tenido las
prevenciones necesarias antes de realizar el cultivo y una limpia al realizar nuestra
práctica, si realmente no hubiera sido la correcta solamente nuestro equipo hubiera
sido el que no llevo a cabo la experimentación de la manera adecuada, sin embargo
con los demás equipos ocurrió lo mismo.
Ya después se optó por ponerle a la planta una sustancia protectora la cual con esta
se pudo tener mejores resultados y el número de contaminación resulto menor, que
cuando solo lavamos y desinfectamos la planta con cloro.
Otra de las cosas que concluimos es que para el explante, afecta el tipo de azúcar
que se utilice, ya que la azúcar utilizada fue mascabado de azúcar, la cual es más
café y menos fina que la comercial. Esta desde la introducción del explante al medio
propicio que la sustancia se encontrara más dura y lo que genero después de un
tiempo que varios explantes se secaran.
Pero al final esto nos ayudó a entender de lo complejo que puede llegar a ser la
biotecnología, sino se tiene un verdadero cuidado y manejo de lo que queramos
obtener y las variables que se pueden encontrar para obtener un producto después
de realizada la experimentación, para que después pueda ser industrializada y
saber las variables que se deben de cuidar.

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7.-Bibliografía

CAR/PL. (Octubre de 2003). Aplicaciones de la biotecnología en la industría. Obtenido de

Aplicaciones de la biotecnología en la industría:
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Muñoz de Malajovich, M. A. (2012). Biteclogía. Bernal, Buenos Aires: Axcel Books do Brasil
Editora.
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Biotecnología Vegetal. Santiago, Chile: PROGRAF Impresores.
PROMIPAC. (Septiembre de 2009). Manual de Sanidad Vegetal. Obtenido de Manual de
Sanidad Vegetal:
file:///C:/Users/hp/Downloads/mANUAL%20sANIDAD%20vEGETAL.pdf
Romero Vázquez, G. M. (2008). Biotecnología: generalidades, riesgos y beneficios.
Obtenido de Biotecnología: generalidades, riesgos y beneficios:
http://www2.uned.es/experto-biotecnologia-
alimentos/TrabajosSelecc/GloriaRomero.pdf
Segretín, M. E. (2011). Los cultivos celulares y sus aplicaciones II (cultivos de células
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células vegetales):
http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pd
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