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STERILIZZAZIONE

La sterilizzazione consiste in qualsiasi processo chimico o fisico che porti


all'eliminazione di ogni forma microbica vivente, sia patogena che non, comprese le
spore e i funghi. Un materiale è considerato sterile quando la probabilità di trovarvi
un microrganismo è inferiore ad uno su un milione.
La sterilizzazione è utilizzata in campo farmaceutico nella preparazione di iniettabili,
colliri e nella preparazione di materiali di medicazione.
Indipendentemente dal metodo utilizzato è necessari tener presente che:
•Qualsiasi metodo impiegato non dà certezza di ottenere la sterilità, ma si hanno solo
delle probabilità più o meno elevate;
•I processi di sterilizzazione possono avere effetti dannosi sui prodotti trattati, così
bisogna raggiungere un compromesso per avere l’effetto maggiore con il minimo danno.
Nelle attività farmaceutiche, un dato prodotto è considerato sterile quando la probabilità di
trovare una unità non sterile in un lotto sterilizzato sia di 10-6, quando cioè una unità su un
milione può non essere sterile. In altri termini c’è la probabilità che sia sopravvissuto non più
di un microrganismo vivente in 106 unità sottoposte a sterilizzazione.
Questo concetto è espresso in termini di LAS (livello di assicurazione di sterilità).
Il LAS di un prodotto viene stabilito con appropriati studi di convalida. Tale valore esprime
la possibilità di trovare meno di un elemento difettoso su un milione di elementi trattati. Per
assicurare valori di LAS superiori i prodotti dovranno subire una sterilizzazione detta
terminale, cioè effettuata sul prodotto finale.
Per assicurare la qualità del prodotto in termini di sterilità bisogna controllare ogni stadio del
processo produttivo:

• Materiale di partenza con bassa carica batterica;


•Le procedure di sterilizzazione devono essere convalidate per assicurare efficacia e
riproducibilità;
•Tutte le procedure di fabbricazione devono rispettare le GMP (caratteristiche dei locali,
sterilità dell’ambiente, attrezzature, contenitori, ambiente di stoccaggio);
• Anche il personale gioca un ruolo fondamentale nel condurre e controllare le varie fasi del
processo.
PARAMETRI DI STERILIZZAZIONE
Tempo di decadimento decimale (D)
Indica il tempo necessario per ridurre una popolazione microbica di una unità logaritmica
(es. da 106 a 105). Esso rappresenta il tempo, espresso in minuti, necessario per ottenere ad una
data temperatura, la riduzione del 90% della popolazione microbica. Il valore di D è noto per
molte specie microbiche ed è determinato sulla base di diverse condizioni, quali temperatura di
trattamento, concentrazione di gas sterilizzante, pH, formulazione, superficie di contatto con il
microrganismo ecc.

Valore z
Rappresenta l’aumento di temperatura richiesto per ridurre il valore di D (tempo di
decadimento decimale) di una unità logaritmica (o del 90%). Esso è dato dall’espressione:

T2 − T1 dove T2 e T1 sono le temperature in °C e D1 e D2 sono i


Z=
⎛ D2 ⎞ valori di D corrispondenti a quelle temperature
log ⎜ ⎟
⎝ 1⎠
D
Fattore di inattivazione o grado di sterilità
Indica il grado di riduzione di una popolazione microbica. E’ dato dal rapporto tra la
popolazione microbica iniziale e popolazione microbica finale in seguito ad un processo
di sterilizzazione..
Esprime l’efficacia di un trattamento di sterilizzazione nel distruggere una popolazione
microbica

F.I.= N° microbi iniziali/ N° microbi finali

t
F .I . = 10 D
dove t è il tempo di trattamento in minuti.
CINETICA DI DEGRADAZIONE MICROBICA

Ogni processo di sterilizzazione procede nel tempo secondo cinetiche ben precise. I processi di
riduzione della popolazione microbica e di inattivazione delle spore seguono una cinetica del I
ordine:


log t = K ( t − t ° ) dove N° e Nt rappresentano le
microbiche al tempo 0 e al tempo t.
popolazioni
N

a: sterilizzazione in condizioni più


severe

b: sterilizzazione in condizioni più


blande

log Nt=logN°-KT
RESISTENZA MICROBICA

La resistenza dei microrganismi alle sollecitazioni energetiche, in particolare quelle termiche,


dipende da:

‰ Specie microbica: i microrganismi più sensibili sono i batteri non sporigeni, i virus più
grandi, le muffe, i lieviti. Sono più resistenti i piccoli virus e le spore. Le spore sono sempre
più resistenti delle forme vegetative.

‰ Numero di germi: più numerosa è la colonia batterica inizialmente presente, più lungo sarà
il tempo necessario per distruggerla

Le rette a e b rappresentano 2 colonie


ugualmente resistenti ma diversamente
popolate.
La retta c indica una specie microbica più
resistente.
‰ Temperatura: il tempo necessario per distruggere una specie microbica è inversamente
proporzionale alla temperatura impiegata. La durata del riscaldamento va riferita al tempo in
cui la massa o il contenitore primario è stato soggetto a quella temperatura. In queste
operazioni è opportuno tracciare un grafico che indichi l’andamento effettivo della
temperatura all’interno del materiale.

‰ Ambiente in cui sono i germi: la resistenza microbica dipende fortemente dall’ambiente.


La presenza di acqua ed il % di umidità sono molto importanti. Le spore di tetano sono
distrutte in ambiente umido in 15’ a 120°C ed in 3 ore a 150-160°C in ambiente secco. Sono
importanti anche il pH e la presenza di terreni favorevoli.
STERILIZZAZIONE

La sterilizzazione trova impiego nella preparazione di iniettabili, colliri, materiali di


medicazione.
Può essere definita come l’eliminazione di qualsiasi forma di vita anche allo stato latente.

Vi sono due cose da tener presente:

o Qualsiasi metodo impiegato non dà certezza di ottenere la sterilità, ma si hanno solo delle
probabilità più o meno elevate;

o I processi di sterilizzazione possono avere effetti dannosi sui prodotti trattati, bisogna
raggiungere un compromesso per avere l’effetto maggiore con il minimo danno.
ƒ Antisettico
sostanza che arresta o previene la crescita dei microrganismi attraverso l’inibizione della
loro attività, senza necessariamente provocarne l’inattivazione;
ƒ Battericida
Agente che inattiva i microrganismi;
ƒ Batteriostatico
agente che arresta o ritarda la crescita dei microrganismi;
ƒBioburder
numero di microrganismi presenti all’inizio del processo di sterilizzazione;
ƒDisinfezione
termine che riguarda gli oggetti. E’ quel processo che riduce la probabilità di infezione
attraverso l’inattivazione dei microrganismi;
ƒGermicida
agente che inattiva i microrganismi, ma non necessariamente le spore;
ƒConvalida
atto di verifica che una procedura è capace di produrre il risultato atteso in tutte le possibili
circostanze,
ƒProcedimento asettico
operazioni condotte in completa assenza di microrganismi.
SECCO

CALORE Vapore fluente


UMIDO Vapore sotto
MEZZI pressione
Tindalizzazione
FISICI
RAGGI UV
RADIAZIONI RAGGI γ

METODI
DI FILTRAZIONE ADSORBENTE
STERILIZZAZIONE STERILIZZANTE
SETACCIANTE

AGGIUNTA BATTERICIDI
MEZZI OSSIDO DI ETILENE
CHIMICI FORMALDEIDE
β -PROPIOLATTONE
ACIDO PERACETICO
MEZZI FISICI
METODI TERMICI
Sono basati sul trasferimento di calore da un fluido (l’aria o il vapore) agli oggetti da
sterilizzare. Il calore denatura le proteine dei microorganismi determinandone l’uccisione.
L’efficace dei trattamenti termici dipende dalla quantità di calore che possono trasferire ai
microrganismi. Nello specifico, dipende da:
ƒTemperatura a cui si trova il fluido
ƒCalore specifico del fluido (Cp)
ƒCalore latente che può liberare in seguito a cambiamento di stato (vale solo per il vapore
saturo)

Sterilizzazione con calore secco


la si usa per fiale, vetreria, polveri, oli, soluzioni oleose. Viene eseguita con stufe elettriche a
doppia parete munite spesso di ventilatori per ottenere più rapidamente una temperatura
uniforme. Il calore secco è poco efficace poiché l’aria ha basso Cp, richiedendo tempi
lunghi e temperature elevate. Il materiale soggetto a trattamento con calore secco dovrà
necessariamente essere stabile a elevate temperature. Durante la sterilizzazione ci sarà
un’espansione del materiale , per cui i contenitori in vetro non devono essere chiusi
ermeticamente e la quantità di materiale nei contenitori dovrà considerare l’espansione.
l’applicazione di calore secco risulta efficiente nelle seguenti condizioni:
•160°C per almeno 2 ore.
•170°C per almeno 1,5 ore.
•180°C per almeno 45 minuti
Il calore secco può essere utilizzato anche per la depirogenazione (speci per i contenitori in
vetro) a 230°C per 60-90 minuti o 250°C per 30-60 minuti.

Sterilizzazione con calore umido


la si usa per fiale contenenti soluzioni acquose (già chiuse), tappi e tubi di plastica
(termoindurente), filtri sterilizzanti, garze. Non è usata per polveri e soluzioni oleose. Il calore
umido è più efficace rispetto al calore secco nell’inattivare i microrganismi in quanto
trasportando una quantità di energia molto maggiore. Infatti il vapore saturo, oltre ad avere
capacità termica maggiore rispetto a quella dell’aria, condensando libera una quantità di
energia termica pari al suo calore latente di vaporizzazione (oltre 500 cal/gr contro 1 cal/gr
per aria secca).
‰ Vapore saturo:
Il termine vapore saturo indica vapore acqueo saturato con acqua liquida. Tale condizione è
possibile solo quando la fase liquida è in equilibrio con quella gassosa. A pressione
ambientale ciò avviene solo a 100°C, tuttavia può teoricamente avvenire a qualsiasi
temperatura purchè la pressione sia appropriata.
Si effettua in autoclave. In questa apparecchiatura si adopera vapor
acqueo che presenta il vantaggio di un'alta capacità termica unita alla
facilità di penetrazione tra le fibre dei tessuti e nei corpi porosi.
L'autoclave è costituita da un contenitore in acciaio, dotato di un
portello che può essere chiuso ermeticamente dall'esterno. Posto nel
contenitore il materiale da sterilizzare e serrato il coperchio, si fa
penetrare all'interno, attraverso appositi condotti, il vapore acqueo
proveniente da una caldaia e spinto nell'autoclave da una pompa. L'aria
inizialmente contenuta nell'autoclave viene fatta uscire fino a che nel
suo interno rimane unicamente vapore acqueo sotto pressione. La
pressione che si raggiunge all'interno è circa 2 atm cui corrisponde una
temperatura del vapore saturo di 121 °C. Va tenuto presente che tutte
le forme di batteri, muffe, lieviti muoiono dopo soli pochi minuti di
esposizione a 100 °C, e che le spore più resistenti (ad es. quelle del
bacillo del tetano) muoiono a 115 °C in 15'. Normalmente una
buona sterilizzazione viene protratta per 20'. Si ha così la garanzia
che tutte le forme patogene e non, di qualsiasi tipo sono morte e quindi
il materiale all'interno dell'autoclave è perfettamente sterile.
‰ Vapore fluente: è vapore non compresso che raggiunge i 100°C. Per riscaldamento
di almeno un’ora si eliminano tutte le forme vegetative, ma non tutte le spore. Da una
caldaia si genera vapore che investe una camera di sterilizzazione.

‰ Tindalizzazione: esistono situazioni per le quali è importante mantenere basse le


temperature di esposizione, come nel caso dei materiali degradabili da eccessive
temperature. La tindalizzazione consiste nel riscaldare tramite vapore sostanze
termolabili a temperature di 100°C in modo discontinuo, ad intervalli regolari (24 ore)
per un’ora, per più giorni consecutivi. Alla base del procedimento sta l’osservazione
che le forme microbiche vegetative vengono uccise a 65°-100°C. Lasciando riposare a
30° le spore si aprono e le forme vegetative sviluppatesi vengono uccise dal
riscaldamento successivo. Questo metodo non dà garanzia di sterilità.
RADIAZIONI

Raggi UV
Hanno un elevato potere sterilizzante. Il basso potere di penetrazione <1 mm limita però
il campo di applicazione. La luce germicida è prodotta da una lampada a vapori di mercurio
ed emessa ad una lunghezza d’onda di 254nm. Sono inoltre assorbite da vari materiali:
vetro, plastica, liquidi torbidi. La possibilità di sterilizzare polveri o soluzioni è molto scarsa
e quindi la loro applicazione è limitata alla sterilizzazione dell’aria o le superfici in
ambienti da sterilizzare. L’azione germicida deriva dalla creazione di specie reattive
(radicali) all’interno della cellula batterica, con modificazioni delle reazioni biochimiche
fondamentali causando, quindi, nei microrganismi morte o incapacità di riprodursi.
L’effetto germicida è in funzione dell’intensità della radiazione e del tempo di esposizione
(dose).
Una controindicazione all’utilizzo di queste radiazioni è che i raggi ultravioletti possono
provare gravi danni agli occhi, per cui sono necessarie precauzioni da parte degli operatori.
Raggi γ
Sono radiazioni ad alta energia dotate di sufficiente potere di penetrazione. Gli isotopi
radioattivi utilizzati a questo scopo sono il cobalto-60 e il cesio-137. Il meccanismo di azione
suppone la formazione di radicali liberi •OH con formazione di H2O2, modificazioni
enzimatiche ed alterazioni del DNA (mutazione letale).
Queste onde elettromagnetiche sono molto penetranti e sono fermate da lastre di piombo
piuttosto spesse. Il loro impiego può risultare pericoloso. La loro lunghezza d’onda è compresa
tra 10 e 10-3 Ǻ e il dosaggio viene misurato in Megarads. Una dose di 2-2,5 Megarads è
considerata adeguata per assicurare la sterilità .
Questo tipo di sterilizzazione è utile per oggetti di gomma e plastica, ferri chirurgici, garze,
siringhe, aghi ed in particolare materiale preconfezionato in buste di plastica saldate.
L’applicazione ai prodotti farmaceutici è ridotta dal fatto che molte sostanze subiscono
alterazioni più o meno spinte.
FILTRAZIONE STERILIZZANTE

Ha lo scopo di rimuovere fisicamente i microrganismi. E’ il metodo utilizzato per la


sterilizzazione di soluzioni non stabili, che non sopportano altri tipi di sterilizzazione.
Per essere efficace il filtro deve rimuovere i microrganismi dalla soluzione, permettendo il
passaggio dei componenti la soluzione .
Per la filtrazione sterilizzante si dovranno usare materiali particolari che permettano la
rimozione di tutti i microrganismi.
I filtri devono essere validati con saggi che mostrino la loro capacità di ritenzione batterica di
un ceppo di riferimento (Pseudomonas diminuta).

Considerando che le spore hanno mediamente un diametro di 0,5 micron mentre i batteri in
fase vegetativa sono inferiori ad 1 micron, i filtri sterilizzanti dovranno avere dimensioni dei
pori in grado di trattenere questo tipo di impurezze (in genere si utilizzano filtricon diametro
pari 0.22µm)

Sebbene la sterilizzazione di per se non è particolarmente efficiente, è comunque sempre


eseguita prima del riempimento dei vari contenitori. E’ infatti l’unico metodo che rimuove
fisicamente i microrganismi riducendo la possibilità di inquinamento da pirogeni.
MEZZI CHIMICI

Molte prodotti non sopportano le condizioni di sterilizzazione dei processi termici, non sono
sterilizzabili con UV e non possono essere filtrati. Prodotti con queste caratteristiche sono i
material termoplastici o i presidi medico chirurgici. In questi casi si sterilizza a freddo
sfruttando l’azioni di gas o vapori.

La sostanza più utilizzata per questi scopi è l’ossido di etilene. Viene utilizzato per i materiali
che non sono sterilizzabili in autoclave (PVC, polietilene, alcune gomme, siringhe
preconfezionate, ecc.). Come le radiazioni ionizzanti, può essere utilizzato per prodotti sigillati
nel loro contenitore definitivo (se permeabile al gas), con il vantaggio di poter essere utilizzato
negli stabilimenti farmaceutici e nei centri ospedalieri. D'altra parte, può formare miscele
esplosive con l'aria e quindi viene utilizzato unitamente ad anidride carbonica o con idrocarburi
cloro-fluorurati;.
PIROGENI

Sono sostanze che inducono la febbre.


I pirogeni endogeni sono interni all’organismo e connessi con i meccanismi di regolazione
della temperatura corporea.
I pirogeni esogeni stimolano la risposta pirogenica di quelli endogeni.
Sono essenzialmente lipopolisaccaridi (endotossine).
Sono di origine batterica, largamente diffusi in natura e generati da fonti microbiche e non
microbiche.
Sono prodotti del metabolismo cellulare dei microrganismi o del disfacimento dei
microrganismi morti.
Dopo 1 ora dall’iniezione producono un notevole rialzo termico, brividi, dolore, stato di
malessere, vasocostrizione cutanea, aumento pressorio.

Hanno P.M. elevato (≈ 60000).


Sono attivi in quantità piccolissime (< 1 mg).
Sono solubili in acqua.
Passano attraverso i filtri sterilizzanti.
Resistono a temperature molto più elevate di quelle usate nei processi di sterilizzazione.
Perdono la loro specificità se riscaldati a 200°-250°C.
Non sono inattivati dai battericidi.
Non sono volatili.
PERICOLOSITA’ DEI PIROGENI

La presenza di pirogeni in un iniettabile diventa un fattore molto serio quando il volume


dell’iniettabile è notevole per tre motivi:
Iniettabili di grande volume contengono quantità corrispondentemente elevate di pirogeni;
Iniettabili di grande volume vengono di solito somministrati per endovena e, di conseguenza, i
pirogeni hanno più rapido effetto;
I pazienti soggetti a trattamenti con liquidi perfusionali sono spesso in gravi condizioni ed un
rialzo termico può essere pericoloso.

DETERMINAZIONE DEI PIROGENI

‰ Metodica riportata in Farmacopea (iniezione nella vena marginale dell’orecchio del coniglio);
‰ Saggio per la ricerca delle endotossine batteriche (Farmacopea) con lisato di amebociti di
limulus poliphemus (L.A.L. test).
METODI DI DEPIROGENAZIONE

™ Assorbimento con carbone attivo;


™ Membrane microporose in nylon, caricate positivamente in superficie.
™Calore secco a temperature superiori a 220°C

MA

La migliore garanzia per l’esclusione dei pirogeni da un preparato iniettabile è


escludere ogni possibile inquinamento durante il suo allestimento.