Mutazioni spontanee e resistenza agli antibiotici

Materiale : 1 piastra sterile, 1 fiala di Imipenem in polvere 15 mg /ml ,1 fiala di Streptomicina in polvere 4
mg/ml, sospensione di E. Coli e Pseudomonas , soluzione fisiologica

Scopo : rilevare la presenza di mutanti di E . Coli e di Pseudomonas e calcolare la frequenza di mutazioni di

mutanti resistenti rispettivamente alla streptomicina e all’imipenem.

Si prepara una sospensione concentrata 109 UFC/ml sia di E. coli che di Pseudomonas aeruginosa. Si
concrolla la carica microbica verificando l’assorbanza , se coincide a 0.15 si può procedere a preparare la
sospensione contenete l’antibiotico . Per la preparazione dell’antibiotico ,si è calcolato 15mg/dl di
steptomicina . Essendo lo stock di 200 𝜇𝑙 si considerano

15mg/ml: 1ml= 𝑋: 20ml 𝑋 =0.75mg/ml di streptomicina

6mg/ml:ml= 𝑋: 20𝑚𝑙 X= 0.3𝑚𝑔/𝑚𝑙 𝑑𝑖 𝑖𝑚𝑖𝑝𝑒𝑛𝑒𝑚 ( 1)diluizione 1:2 2)diluizione 1:3)

Si è poi considerato che la concentrazione dell’impenem fosse 4 .In conclusione si è aggiunto 20

𝜇𝑙 𝑑𝑖 𝑠𝑡𝑟𝑒𝑝𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎 al terreno , si è reso omogeneo e si è colato su una piastra sterile. Per l’imipenem si è
aggiunto 10 𝜇𝑙 al terreno caldo , si è reso omogeneo e si è colato su una piastra. Si è incubato. Il giorno
seguente la piastra non mostrava nessun mutante . I microorganismi, hanno la possibilità di modificare il
proprio patrimonio genetico sia, attraverso mutazioni spontanee sia, attraverso lo scambio genetico.
Quest'ultimo aspetto è molto importante poiché mediante i transposoni che catturano geni e i plasmidi che
possono veicolarli, i batteri hanno virtualmente a disposizione l'intero corredo cromosomico di tutte le specie
esistenti, sono infatti gli unici viventi che possono avere uno scambio di materiale genetico tra specie diverse.
Questa enorme possibilità consente ai batteri di adattarsi a qualsiasi ambiente incluso quello dominato dagli
antibiotici. Più in particolare i microorganismi hanno diverse alternative per evitare l'azione letale degli
antibiotici che si possono così schematizzare:
a) produzione di enzimi inattivanti gli antibiotici
b) alterazione della permeabilità dell'involucro
c) alterazione del bersaglio

Da ricordare che la concentrazione di antibiotico deve essere sempre superiore alla concentrazione minima
inibente. Deve inibire la crescita.

Meccanismo di resistenza agli antibiotici : produzione di un enzima inattivato.

La molecola si instaura tra il legame chimico e l’enzima, diminuendone l’attività. La 𝛽 −

𝑙𝑎𝑡𝑡𝑎𝑚𝑎𝑠𝑖 prodotta dai batteri è responsabile della loro resistenza ai 𝛽 lattamici. Tale enzima idrolizza
l’anello betalattamico .Cosi l’attività dell’antibiotico può essere persa in maniera reversibile o irreversibile.
Per porre rimedio a tale problema della resistenza insieme ai betallamici vengono somministrati dei principi
attivi che inattivano la 𝛽 − 𝑙𝑎𝑡𝑡𝑎𝑚𝑎𝑠𝑖. Per inibire questa si sono usati l’acido clavulanico associato ad
amoxicilina con ceftazidima , (ceftriaxone, cefotaxime) che sono cefalosporine di terza generazione
oppure fluorchinoloni (ad esempio ciprofloxacina ed ofloxacina).Ma vi sono ceppi batterici che possono
inibire in parte anche questi antibiotici che lavorano in sinergia. Si parla cosi di 𝛽𝑙𝑎𝑡𝑡𝑎𝑚𝑎𝑠𝑖 𝑎 spettro
allargato o ESBL. egli ultimi anni è aumentata in particolare la diffusione di ceppi batterici produttori
di beta-lattamasi a spettro esteso (ESBL), ovvero enzimi che conferiscono resistenza ai beta-
lattamici, farmaci di importanza critica nel trattamento delle infezioni umane.
Il test mediante doppio disco, si esegue come un classico test di diffusione in agar in cui dischi di
cefotaxime, ceftazidime, aztreonam e ceftriaxone sono posizionati intorno ad un disco di amoxicillina-
clavulanato posto al centro della piastra. La distanza centro-centro fra i dischi di β-lattamici e il disco con
l’inibitore è circa 20 mm. Il test è positivo quando compare una distorsione della zona che circonda il β-
lattamico in prossimità del disco di amoxicillina-clavulanato. Questo effetto si manifesta in genere come un
allargamento dell’alone di inibizione (immagine a farfalla). Il tipo di sinergia dipenda dalla distanza tra i
dischetti pertanto è difficile da standardizzare. Aspetti caratteristici di test positivi si è verificata per diversi
ceppi di E. coli dove cambiavano solo un gene all’interno della sequenza del Dna. E’ un test di
combinazione che consiste nel saggiare un β- lattamico da solo ed in presenza di un inibitore delle β-
lattamasi, in modo da valutare il recupero dell’attività del β-lattamico in presenza dell’inibitore.

Test di combinazione con EDTA un chelante . Le metallo betalattamasi sono inibite da agenti chelanti che
sequestrano lo Zn che lo usano per la loro attività. L’acido para ammino fenil boronico il quale va ad
inattivare in maniera poco specifica tutte le proteine . Prima era considerato tossico.

Per effettuare il test si applica un dischetto con a.para amminofenil boronico su una piastra di Mueller
Hinton Agar inoculata con il ceppo in esame. A un po’ di distanza dal bordo si applicano tre dischetti ( a
formare una sorta di triangolo ).Si pone su un discetto EDTA e sull’altro l’acido, il terzo funge da controllo.
Il test serve a verificare l’idrolizzazione delle carbapenemasi, ovvero la presenza di un enzima la
carbapenemasi,che è una beta. lattamasi che conferisce resistenza estesa ai ai beta lattamici compreso i
carbapenemi. I carbapenemi costituiscono una importante nicchia nel trattamento antibiotico dovuta al
fatto che questi farmaci possiedono attività nei confronti delle cefalosporinasi cromosomiche e delle beta
lattamasi a spettro esteso (ESBL) prodotte da molti batteri gram-negativi. L’emergenza di beta-lattamasi in
grado di idrolizzare i carbapenemi ha minacciato l’utilità di questa classe di antibiotici .