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CARATTERISTICHE DEI MICRORGANISMI

INDUSTRIALI
Le biotecnologie microbiche si basano su cinque importanti
caratteristiche dei microrganismi

1.

Un alto rapporto tra volume e area superficiale che facilita lacqisizione di


nutrienti necessari per assicurare unelevata attivit metabolica e biosintetica e
quindi unalta velocit di crescita.

2.

Lenorme variet di reazioni che i microrganismi sono in grado di fare, cui


corrisponde una grande variet di attivit enzimatiche

3.

La capacit di ottenere eniantiomeri

4.

Ladattabilit ad un ampio spettro di ambienti diversi (compresi quelli di


laboratorio) e di condizioni di crescita

5.

La facilit con cui si possono effettuare manipolazioni genetiche per aumentare


la produttivit e modificare i prodotti ( un concetto relativo).

MANIPOLAZIONI GENETICHE
la ferramenta dellingegnere genetico

-Plasmidi ricombinanti
- Per clonaggio e sequenza
- Per lespressione di geni
- Per la mutagenesi con trasposoni
- Per la mutagensi sito diretta
- Plasmidi shuttle, che si replicano in ospiti diversi (es. E.coli e S.cerevisiae)
- trasposoni (per mutagenesi)
- ricombinazione omologa
- TRASFORMAZIONE
- CONIUGAZIONE
- TRASDUZIONE

Sistemi per il clonaggio del


DNA: lo screening blu-bianco

MCS= Mul(-cloning site


bla= -la3amasi
rep= replicazione
lacZ= subunit della -gala3osidasi

MCS di pUC18

Gram-negativi dinteresse biotecnologico


Ambientale
degradazione composti inquinanti, tossici, xenobiotici impiegati nel biorisanamento
ambientale.
Geomicrobiologia
microrganismi che riducono composti inorganici ossidati utilizzati nelle miniere per
lestrazione di metalli (bio-leaching)
Medico/Farmaceutico
Identificazione bersagli molecolari per lo sviluppo di nuovi farmaci
Industriale
Escherichia coli importante per costruire DNA ricombinante per lo studio e il
miglioramento dei ceppi industriali e per la produzione di proteine eterologhe.

Escherichia coli
E lorganismo in cui si costruiscono plasmidi ricombinanti
lorganismo pi frequentemente usato per la produzione di proteine
ricombinanti
Il batterio Gram negativo pi studiato a livello fisiologico e molecolare
Genoma completamente sequenziato
Disponibili mutanti e mutanti in geni essenziali (condizionali)
Cresce su terreni semplici e economici
Facile da manipolare geneticamente
Usato nelle fermentazioni industriali da decenni

GRAM POSITIVI DI INTERESSE BIOTECNOLOGICO: Firmicutes e Actinobacteria

Firmicutes a cui appartengono microrganismi il cui DNA presenta un basso contenuto di G


+C (Bacillus, Clostridium e Staphylococcus);
Da un punto di vista biotecnologico i Firmicutes pi importanti sono quelli appartenenti ai
generi
1) Bacillus:
formano endospore. Genere eterogeneo da un punto di vista metabolico (aerobi, anaerobi
facoltativi, alcalofili, acidofili, mesofili, termofili, psicrofili)
Utilizzato per la produzione di enzimi: proteasi, amilasi, glucosio isomerasi, che
costituiscono i tre quarti di tutta la produzione di enzimi industriali.
Sono inoltre molto importanti per la produzione di antibiotici peptidici (es. bacitracina)
ed endotossine proteiche utilizzate come insetticidi.
2) Clostridium:
formano endospore, anaerobi obbligati.
Importanti per la produzione di acetone/butanolo.

Genere Bacillus
Sono in grado di secernere proteine nel mezzo extracellulare
Sono al secondo posto dopo E. coli per il loro utilizzo come ospiti per la
produzione di proteine eterologhe .
Il genere Gram positivo pi studiato a livello fisilogico e molecolare
Cresce su terreni semplici e economici
Per molti, genoma completamente sequenziato
Facile da manipolare geneticamente
Usato nelle fermentazioni alimentari dal medioevo (Giappone-B.subtilis
natto), da decenni nelle fermentazioni industriali

Poche specie patogene per uomo (anthracis, cereus)
Molte specie del genere Bacillus (e.g. licheniformis, subtilis) sono
GRAS (Generally Regarded as Safe) dalla FDA degli USA
PRODUZIONE DI ENZIMI (proteasi, amilasi), METABOLITI PRIMARI,
ANTIBIOTICI.
Le spore di alcune specie patogene per insetti (thuringensis, sphaericus)
sono usate come insetticidi
Le spore delle specie clausii (Enterogermina) e pumilus (Biosubtyl), sono
usate come probiotici

ATTINOMICETI

Actinobacteria, pi di 30 famiglie, a cui appartengono microrganismi il cui DNA contiene


unalta percentuale di G+C.

microrganismi unicellulari o filamentosi con micelio pi o meno sviluppato, che nel


corso del ciclo vitale differenzia un micelio aereo che produce spore vegetative.
La modalit di formazione e lorganizzazione delle spore variano nei diversi gruppi
e sono usate come carattere tassonomico

Da un punto di vista biotecnologico gli attinobatteri vengono utilizzati:

--stagionatura dei formaggi (Brevibacteria, Corynebacteria, Microbacteria,


Propionibacterium)
--produzione di aminoacidi (Corynebacterium glutammicum, Brevibacterium
flavum)
--produzione di metaboliti secondari (antibiotici): (Streptomyces,
Actinoplanes,Amycolatopsis, Micromonospora e Saccharopolyspora)

La produzione di metaboliti secondari (antibatterici, erbicidi, fungicidi,


antimicotici, immunosoppressori) la caratteristica pi importante degli
attinomiceti. Streptomyces coelicolor lattinomicete pi studiato
Possibilit di strumenti genetici come plasmidi episomali e integrativi
Trasformazione possibile mediante formazione di protoplasti con lisozima (vedi
oltre)

GENOMA di S.coelicolor


Genomi degli streptomice(
Lineari (con poche eccezioni) e plasmidi lineari e circolari
Vari genomi sequenzia(.
In blu, genoma core 5Mb e in celeste le braccia di 1,5 e 2,3 Mb (lanalisi
sta(s(ca ha mostrato che il core molto conservato tra gli aOnomice( e
con(ene sopra3u3o funzioni essenziali e poche funzioni del metabolismo
secondario

terreno solido

Funghi filamentosi

eucarioti e chemoeterotrofi.
Crescono formando un micelio costituito da ife che possono essere ife
cenocitiche (assenza di setti) nei funghi meno evoluti (zigomiceti) o ife settate
(ascomiceti e basidiomiceti). Le ife settate contengono nella maggior parte dei
casi due nuclei, ma possono contenere uno solo nucleo o numerosi nuclei.

Generalmente aploidi

Le ife possono allungarsi velocemente crescendo allapice (crescita apicale) con un


continuo flusso di protoplasma dalle porzione pi distali a quelle apicati.

La parete cellulare costituita da uno scheletro fibrillare immerso in una matrice


amorfa. Le fibrille sono costituite da chitina e glucani e la matrice amorfa da
polisaccaridi solubili e da glicoproteine.
Chitina: polimero lineare della -1,3-N-acetilglucosamina
Glucani: polimeri ramificati del glucosio con legami -1,3 e -1,6.
Manipolazione genetica abbastanza difficile(relativamente agli altri
microrganismi di interesse industriale). Bassa efficienza di trasformazione.
Esistono plasmidi episomali, ma sono pi usati quelli integrativi.

Funghi filamentosi-Applicazioni biotecnologiche

Produzione di enzimi industriali


Amilasi, proteasi, lipasi, enzimi lignolitici (laccasi).
Molti enzimi vengono utilizzati in processi di biotrasformazione per la
modificazione di sostanze chimiche nella produzione di farmaci.

Produzione di acidi organici: acido citrico (Aspergillus niger)

Produzione di vitamine: riboflavina

Produzione di antibiotici (penicilline e cefalosporine), antifungini

Pennicillium

Aspergillus

Pennicillium

Aspergillus

PRODUZIONE DI PROTOPLASTI

Lesempio si rifersce a spore


fungine, ma con piccole
modiche, lo stesso metodo
viene usato anche per altri (pi
di microrganismi.
Nel caso di procario(, si usa
lisozima invece che chi(nasi o
carboidrasi

Lieviti (ascomiceti)

I lieviti possono essere considerati funghi in cui prevale la forma


unicellulare.

Molte specie unicellulari che si dividono per gemmazione (la maggior


parte dei lieviti) o per scissione binaria (Schizosaccharomyces),
possono, in condizioni particolare dar luogo a forme pseudomiceliari, cos
chiamate perch le ife miceliari sono in realt costituite da catene di
cellule pi o meno allungate che, dopo la divisione cellulare, non si
staccano luna dallaltra.

I lieviti in natura sono in genere diploidi

Kluyveromyces lactis (GRAS) cresce su lattosio (possibilit di


utilizzo di scarti dellindustria casearia)
Pichia pastoris e Hansenula polymorfa (metilotrofi)
Usati per la produzione di proteine eterologhe

Saccharomyces cerevisiae
GRAS (Generally Recognized As Safe)
Primo eucariote per il quale il genoma stato sequenziato
Sistemi ingegneria genetica ben sviluppati
Ottima conoscenze in campo fermentazioni industriali
Semplice da coltivare
La parete cellulare costituita per oltre il 50% da glucani, per il 2% da chitina e
per il 40% da manno-proteine (utilizzo del metodo dei protoplasti per la
trasformazione).
Alterna cicli aploidi e diploidi . La meiosi d luogo a 4 spore-racchiuse in un asco
(ascomiceti), caratteristica utililizzata per studi di genetica formale
E usato come sistema modello per lo studio di tumori o malattie neurovegetative
La fortuna biotecnologica di questo lievito legata alla capacit di fermentare
lo zucchero anche in presenza di ossigeno, e alla elevata resistenza allalcol.
Oltre alla sua importanza nella produzione di bevande alcoliche e nella panificazione
viene utilizzato per la produzione di bio-etanolo e per la produzione di proteine
eterologhe (possibilit di glicosilazione)

gemmazione

YEp = yeast episomal plasmids


Derivano dal plasmide 2 mm, un plasmide criptico naturale di lievito
con origine replicazione autonoma, una sequenza di circa 6.3 kb che
conferisce elevato numero di copie ( 50/cellula).
Segregazione non equa tra cellula madre e cellula figlia, ma dato
lelevato numero di copie pi difficile che la progenie perda il
plasmide.
Inoltre si usa come marcatore LEU2. Gene per la sintesi di leucina,
ma privo di promotore forte. Il plasmide esprime bassi livelli di
LEU2, quindi in un terreno povero di leucina cresceranno solo le
cellule con elevato numero di Yep (fino a 300/per cellula),
assicurando elevata espressione gene ricombinante.